CN105349533A - 构建链特异性转录组文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种构建链特异性转录组文库的方法，包括：步骤1)mRNA片段化处理；步骤2)反转录：片段化的mRNA？3ˊ端连接已知序列的R3接头；采用RT？primer与R3接头退火配对进行反转录，合成cDNA第一链；步骤3)cDNA？3ˊ端标记：去除RNA后，采用TdT对cDNA？3ˊ端添加多个dC碱基，并采用ddCTP进行末端封闭，然后与F5G引物进行配对，在聚合酶作用下复制cDNA第一链；步骤4)PCR扩增；步骤5)质检。本发明的片段化mRNA先连接接头再合成，以提高cDNA合成效率、cDNA均一性；cDNA第一链合成后，采用TdT在其3ˊ端添加多个dC碱基及ddCTP进行封闭，然后与含多个dG碱基的F5G引物配对，在聚合酶的作用下进行复制cDNA第一链，如此可有效降低自连二聚体的产生、提高文库均一性。

Description

构建链特异性转录组文库的方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种构建链特异性转录组文库的方法。
背景技术
转录组二代测序作为近年来新发展起来的高通量测序技术，为大规模转录组学研究提供了一种全新的且更为有效的方法。该技术能在单核苷酸水平上全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。与其他转录组学技术相比，其具有高通量、低成本、高灵敏度等明显的优势，同时可以获得低丰度的表达基因。
目前各大生物公司及文献报道了多种文库构建的方法：从起初需全长mRNA进行建库到目前采用片段化处理mRNA再进行建库，极大降低了全长mRNA建库带来的末端偏好性及合成全长cDNA引入的错误等问题，提高了文库的均一性及后续数据分析的效率。当前市场上主要存在两种方法：第一种方法—也是目前最普遍采用的方案，先合成双链cDNA，然后经末端修饰、连接测序接头、PCR扩增即得到转录组PE(pairend)文库。第二种方法，链特异性建库或方向性建库，是通过反转录将P7测序接头序列引入到cDNA第一链。与第一种建库方法相比较，后者优势明显，主要表现在：1)建库周期大大缩短，仅仅一天就可以完成文库构建；避免了合成cDNA第二链而引入的错误信息；2)可以确定两条链的转录方向性(正义或反义链)，为基因的进一步注释和功能分析提供更准确的信息；3)可以挖掘转录组中的non-codingRNA信息及反义(antisense)转录本；4)还可以进行基因结构的研究，例如原核生物操纵子鉴定，为基因网络调控的研究提供有力支持。但目前该链特异性建库存在一些缺陷，如cDNA合成效率低、副产物多等。
链特异性建库如Epicentre公司的ScriptSeqTMv2RNA-Seq法(如图1所示)是通过末端延伸的方法，将测序接头序列引入到cDNA两端，最后通过PCR扩增得到含有P5/P7测序接头序列的链特异性文库，具体为：1)mRNA片段化处理：在fragmentbuffer作用下，85度加热处理，得到目标片段大小主要集中在300bp左右的RNA；2)反转录：采用R6N进行反转录，合成cDNA第一链；3)cDNA3'端标记：去除RNA后，采用F6N与cDNA3'端进行退火配对，在聚合酶作用下对cDNA进行延伸；4)PCR扩增：采用含不同标签的引物进行扩增(一次性可以处理多个样本)，产物经磁珠纯化后即得到链特异性转录组文库；5)质检：电泳检测及Agilent2100检测文库大小及质量。
v2RNA-Seq法缺陷如下：1)cDNA第一链合成效率低：采用随机碱基引物进行反转录，引物与模板mRNA随机进行匹配退火，导致cDNA第一链长度差异很大，产生较多的短片段，并且因偏好性问题导致cDNA不均一，造成cDNA合成效率低，最终影响文库的质量，不利于后续数据的分析。2)副产物影响：采用R6N/F6N末端都是随机碱基，极易形成自连产物，降低了文库构建的效率，影响文库质量，甚至导致文库构建失败，造成后续数据分析的困难。3)cDNA3'端标记效率低：用于延伸的引物F6N的3'末端6个N碱基后直接采用C3spacer处理，因空间位阻，会影响6N与cDNA末端退火配对，并且极易互相配对，降低了反应中F6N的有效浓度，最终影响cDNA3'端延伸。
发明内容
本发明针对现有技术v2RNA-Seq法中的cDNA3'端标记效率低的技术问题，目的在于提供一种新的构建链特异性转录组文库的方法。在该方法中，cDNA第一链合成后，采用TdT末端转移酶在cDNA3'端添加多个dC碱基(即同聚物dCTP)及ddCTP进行末端封闭终止反应，然后与含多个dG碱基的F5G引物(即带5个G的第二链合成引物)配对，在聚合酶的作用下进行cDNA二链合成，通过延伸固定碱基序列克服了原有步骤的缺陷，极大程度的提高了末端延伸的效率，降低偏好性及自连产物的产生，从而提高cDNA3'端标记效率。
本发明的构建链特异性转录组文库的方法如下步骤：
步骤1)mRNA片段化处理；
步骤2)反转录：合成cDNA第一链；
步骤3)cDNA3'端标记：去除RNA后，采用TdT末端转移酶对cDNA3'端添加多个dC碱基，并采用ddCTP进行末端封闭终止反应，然后与带5个G的第二链合成引物(简称F5G引物)进行配对，在聚合酶作用下复制cDNA第一链；
步骤4)PCR扩增。
为了解决现有技术中cDNA第一链合成效率低的技术问题，本发明的构建链特异性转录组文库的方法在步骤2)反转录之前，片段化的mRNA3'端连接已知序列的R3接头；在步骤2)反转录中：再采用cDNA逆转录引物(简称RTprimer)与R3接头退火配对进行反转录，合成cDNA第一链，如此可有效减少了短片段产生，提高了cDNA均一性，从而显著地提高cDNA第一链合成效率。
在本发明一较佳实施例中，在步骤2)反转录之前，每1μg片段化的mRNA3'端连接5～12pmol优选8～10pmol已知序列的R3接头；步骤2)反转录：采用25～60pmol优选40～50pmolRTprimer与R3接头退火配对进行反转录，合成cDNA第一链。
在本发明另一较佳实施例中，步骤3)cDNA3'端标记：去除RNA后，针对1μg片段化的mRNA3'，cDNA合成后采用30～50U优选40UTdT对cDNA3'端添加多个dC碱基，并采用4～6nmol优选5nmolddCTP进行末端封闭，然后与80～120pmol优选100pmolF5G引物进行配对，在聚合酶作用下复制cDNA第一链。
本发明为了解决现有技术中极易形成自连产物的技术问题，较佳地是，去除RNA后，先用50pmol的封闭引物(简称Cover-Primer)对剩余的RTPrimer进行封闭，再用TdT对cDNA3'端添加多个dC碱基，如此极大地降低了自连二聚体的产生。
步骤1)每1μg的mRNA用30～50μL的Dynabeadsoligo(dT)25(即寡聚脱氧腺苷酸磁珠)进行富集后再进行片段化处理。
步骤4)PCR扩增：采用含不同标签的引物进行扩增，产物经磁珠纯化后即得到链特异性转录组文库。
本发明的构建链特异性转录组文库的方法还可包括步骤5)质检：用0.6～1倍优选0.8倍体积的Ampure磁珠纯化回收目的区域片段，然后采用8％PAGE胶或1％琼脂糖凝胶电泳及Agilent2100检测文库大小及质量。
在本发明中，所述的Cover-Primer的序列为AAANNNNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC-C3Spacer。所述的F5G引物的序列为CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGGGH；所述R3接头的序列为TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；所述的RTprimer的序列为GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。
在本发明中，术语“TdT”是指末端转移酶；术语“ddCTP”是指双脱氧胞嘧啶；术语“F5G”也称“Trans-F5G”是指带5个G的第二链合成引物；术语“RTprimer”是指cDNA逆转录引物；术语“R3接头”是指连接到mRNA3'端的接头；术语“Cover-Primer”是指封闭引物，即封闭多余R3接头序列的引物。
本发明的积极进步效果在于：如图2所示为本发明的构建链特异性转录组文库的示意图，将测序接头序列(如R3接头)直接连接到RNA的3端引入到引物序列中，通过反转录及末端标记含多个dC碱基，通过含多个G的第二链引物，实现DNA两端分别含有测序接头序列，最终通过PCR扩增得到链特异性文库。并在此基础上进行了优化：在cDNA合成完成后，采用Cover-Primer封闭剩余的RTprimer，减少自连二聚体的产生；mRNA先连接R3接头再进行cDNA合成，以提高cDNA合成效率、cDNA均一性；三种方案可以有效降低接头二聚体的产生、提高文库均一性及文库质量，便于后续的数据分析。
附图说明
图1为现有技术中ScriptSeqTMv2RNA-Seq法构建文库的示意图。
图2为本发明的构建链特异性转录组文库的示意图。
图3为实施例1和对比实施例1获得的目的区域片段用1％琼脂糖凝胶电泳的结果图。
图4为实施例1和实施例3获得的目的区域片段用1％琼脂糖胶电泳的结果图。
具体实施方式
实施例1
mRNA片段化处理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabeadsoligo(dT)2550μL与1μg总RNA混合纯化mRNA。取7μL5×(即5倍)fragmentbuffer加入到28μLmRNA中，94℃5min，然后立即冰上。加入65μLddH2O(即双蒸水)、20μg糖元、1/10体积3MpH5.2NaAc、2.5倍体积无水乙醇，混匀，存放-80℃20min；高速离心，沉淀溶解于13μL去离子水。
连接R3接头：mRNA溶解于5μLddH2O中，加入1μL10μM的R3接头，70℃2min，冰上1min。加入1.5μLligationMix、200UT4截短型RNA连接酶2K227Q(T4RNAligase2TruncatedK227Q)，ddH2O补至15μL，混匀，22℃1h。
cDNA合成：加入1μL50μM的RTprimer，65℃5min，冰上放置1min；加入4μLRTMix、20UMMLV逆转录酶、ddH2O补至20μL，混匀，然后25℃10min，42℃40min，4℃保存。
cDNA末端标记：加入20mgRNaseA，37℃15min，降解RNA/DNA杂合体的RNA。加入2μL50μMCover-Primer；65℃5min，缓慢降温至20℃。加入2.5μL10×末端转移Buffer、0.5μL10mMdCTP、40UTdT，ddH2O补至25μL，37℃30min。加入0.5μL10mMddCTP，37℃15min；磁珠纯化，20μLpH＝8.0TE(10mMTris-HCl和1mMEDTA)洗脱。加入1μL100μM的F5G，65℃2min，冰上1min；加入3μLKlenowfragment酶缓冲液、1uldNTP(10mM),0.5μLKlenowfragment(10U/μL)(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段)，ddH2O补充至30μL，37℃60min。采用1.8倍体积Ampure磁珠进行纯化DNA，30μLTE洗脱。
PCR扩增：上述纯化的DNA14μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、2×PCR聚合酶混合液12μL混匀后，94℃5min、94℃10s、62℃15s、72℃30s，共15个循环，4℃保存。
采用0.8倍体积Ampure磁珠纯化回收目的区域片段，并采用8％PAGE胶或1％琼脂糖凝胶电泳和Agilent2100检测。
实施例2
mRNA片段化处理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabeadsoligo(dT)2530μL与1μg总RNA混合纯化mRNA。取7μL5×fragmentbuffer加入到28μLmRNA中，94℃5min，然后立即冰上。加入65μLddH2O、20μg糖元、1/10体积3MpH5.2的NaAc、2.5倍体积无水乙醇，混匀，存放-80℃20min；高速离心，沉淀溶解于13μL去离子水。
连接R3接头：mRNA溶解于5μLddH2O中，加入0.5μL10μM的R3接头，70℃2min，冰上1min。加入1.5μLligationMix、200UT4RNAligase2TruncatedK227Q，ddH2O补至15μL，混匀，22℃1h。
cDNA合成：加入0.5μL50μM的RTprimer，65℃5min，冰上放置1min。加入4μLRTMix，20UMMLV逆转录酶，ddH2O补至20ul，混匀，然后25℃10min，42℃40min，4℃保存。
cDNA末端标记：加入20mgRNaseA，37℃15min，降解RNA/DNA杂合体的RNA。加入1μL50μMCover-Primer，65℃5min，缓慢降温至20℃。加入2.5μL10×末端转移Buffer、0.5μL10mMdCTP、40UTdT，ddH2O补至25μL，37℃30min。加入0.5μL10mMddCTP，37℃15min，磁珠纯化，20μLpH＝8.0TE洗脱。加入1μL100μM的F5G，65℃2min，冰上1min；加入3μLKlenowfragment酶缓冲液、1uldNTP(10mM),0.5μLKlenowfragment(10U/μL)(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段)，ddH2O补充至30μL，37℃60min。采用1.8倍体积Ampure磁珠进行纯化DNA，30μLTE洗脱。
PCR扩增：上述纯化的DNA14μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、2×PCR聚合酶混合液12μL混匀后，94℃5min、94℃10s、62℃15s、72℃30s，共15个循环，4℃保存。
质检：采用0.8倍体积Ampure磁珠纯化回收目的区域片段，用8％PAGE胶电泳或1％琼脂糖凝胶电泳及Agilent2100检测。
表1构建链特异性转录组文库所有的引物序列
表2各种缓冲液成分及比例
实施例3
mRNA片段化处理：提取合格的RNA，采用life-tech公司的Dynabeadsoligo(dT)2550μL与1μg总RNA混合纯化mRNA。取7μL5Xfragmentbuffer加入到28μLmRNA中，94℃5min，然后立即冰上。加入65μLddH2O、20μg糖元、1/10体积3MpH5.2NaAc、2.5倍体积无水乙醇，混匀，存放-80℃20min；高速离心，沉淀溶解于13μL去离子水。
连接R3接头：mRNA溶解于5μLddH2O中，加入1μL10μM的R3接头，70℃2min，冰上1min。加入1.5μLligationMix、200UT4RNAligase2TruncatedK227Q，ddH2O补至15μL，混匀，22℃1h。
cDNA合成：加入1μL50μM的RTprimer，65℃5min，冰上放置1min；加入4μLRTMix、20UMMLV逆转录酶、ddH2O补至20μL，混匀，然后25℃10min，42℃40min，4℃保存。
cDNA末端标记：加入20mgRNaseA，37℃15min，降解RNA/DNA杂合体的RNA。加入2.5μL10X末端转移Buffer、0.5μL10mMdCTP、40UTdT，ddH2O补至25μL，37℃30min。加入0.5μL10mMddCTP，37℃15min；磁珠纯化，20μLTE洗脱。加入1μL100μM的F5G，65℃2min，冰上1min；加入3μLKlenowfragment酶缓冲液、1uldNTP(10mM),0.5μLKlenowfragment(10U/μL)(大肠杆菌DNA聚合酶I大片段)，ddH2O补充至30μL，37℃60min。采用1.8倍体积Ampure磁珠进行纯化DNA，30μLTE洗脱。
PCR扩增：上述纯化的DNA14μL、正向引物0.5μL、反向引物0.5μL、2×PCR聚合酶混合液12μL混匀后，94℃5min、94℃10s、62℃15s、72℃30s，共15个循环，4℃保存。
采用0.8倍体积Ampure磁珠纯化回收目的区域片段，采用8％PAGE胶或1％琼脂糖凝胶电泳及Agilent2100检测。
对比实施例1ScriptSeqTMv2RNA-Seq方法构建文库
如下操作所用试剂均来自ScriptSeqTMv2RNA-Seq实验室制备试剂盒。
mRNA片段化：9μLmRNA、1μLRNA片段化溶液、2μLcDNA逆转录引物；85℃反应5分钟，结束后放置于冰上。
cDNA合成：向上步mRNA片段化后的溶液中加入3.0μLcDNA逆转录预混液、0.5μLDTT(二硫苏糖醇100mM)、0.5μL逆转录酶(StarScriptAMVReverseTranscriptase)，25℃反应5分钟，42℃反应20分钟；然后加入1μL终止反应液，37℃10分钟，95℃3分钟，25℃保存。
合成第二链及添加3端接头：向上步cDNA合成的反应液中加入7.5μL末端延伸试剂、0.5μLDNA聚合酶，25℃反应15分钟，95℃反应3分钟后4℃保存。
磁珠纯化：采用AMPureXP磁珠纯化。
PCR扩增：22.5μL纯化的cDNA、1μL正向引物、1μL反向引物、PCR聚合酶0.5μL、25μL反应预混液混匀后，94℃5min、94℃10s、62℃15s、72℃30s，共15个循环，4℃过夜。
电泳效果实施例1
将本实施例1和对比实施例1获得的目的区域片段用1％琼脂糖胶电泳的结果如图3所示，其中，泳道A是对比实施例1获得的目的区域片段电泳；泳道B是实施例1获得的目的区域片段电泳；M：100bpDNAMarker。
由图3白色亮度可见，实施例1得到的文库结果比对比实施例1的得到的亮度高2倍以上。
电泳效果实施例2
将本实施例1和实施例3(无Cover-Primer封闭RTprimer)获得的目的区域片段用1％琼脂糖胶电泳的结果如图4所示。其中，泳道A是实施例3获得的目的区域片段电泳；泳道B是实施例1获得的目的区域片段电泳。
由图4上白色亮度可见，采用Cover-Primer封闭RTprimer的实施例1获得的文库结果在图中箭头附近的接头二聚体浓度比未采用Cover-Primer封闭的实施例3的文库有显著降低，降低超过50％。

Claims (10)

1.一种构建链特异性转录组文库的方法，该方法包括如下步骤：
步骤1)mRNA片段化处理；
步骤2)反转录：合成cDNA第一链；
步骤3)cDNA3'端标记：去除RNA后，采用TdT末端转移酶对cDNA3'端添加多个dC碱基，并采用ddCTP进行末端封闭终止反应，然后与带5个G的第二链合成引物进行配对，在聚合酶作用下复制cDNA第一链；
步骤4)PCR扩增。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在步骤2)反转录之前，片段化的mRNA3'端连接已知序列的R3接头；步骤2)反转录：采用cDNA逆转录引物与R3接头退火配对进行反转录，合成cDNA第一链。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：在步骤2)反转录之前，每1μg片段化的mRNA3'端连接5～12pmol优选8～10pmol已知序列的R3接头；步骤2)反转录：采用25～60pmol优选40～50pmolcDNA逆转录引物与R3接头退火配对进行反转录，合成cDNA第一链。
4.如权利要求或1或3所述的方法，其特征在于：步骤3)cDNA3'端标记：去除RNA后，针对1μg片段化的mRNA3'，cDNA合成后采用30～50U优选40UTdT末端转移酶对cDNA3'端添加多个dC碱基，并采用4～6nmol优选5nmolddCTP进行末端封闭终止反应，然后与80～120pmol优选100pmol带5个G的第二链合成引物进行配对，在聚合酶作用下复制cDNA第一链。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤3)cDNA3'端标记：去除RNA后，先用50pmol的封闭引物对剩余的cDNA逆转录引物进行封闭；再采用30～50U优选40UTdT末端转移酶对cDNA3'端添加多个dC碱基，并采用4～6nmol优选5nmolddCTP进行末端封闭终止反应，然后与80～120pmol优选100pmol带5个G的第二链合成引物进行配对，在聚合酶作用下复制cDNA第一链。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)每1μg的mRNA用30～50μL的寡聚脱氧腺苷酸磁珠进行富集后再片段化处理。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤4)PCR扩增：采用含不同标签的引物进行扩增，产物经磁珠纯化后即得到链特异性转录组文库。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：还包括步骤5)质检：用0.6～1倍优选0.8倍体积的磁珠纯化回收目的区域片段，然后用8％PAGE胶电泳检测及Agilent2100检测文库大小及质量。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的封闭引物的序列为AAANNNNNNTGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTC-C3Spacer。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的带5个G的第二链合成引物的序列为CTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGGGH；所述R3接头的序列为TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；所述的cDNA逆转录引物的序列为GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。
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