CN107385516A - 一种构建植物中pri‑miRNA‑3’RACE‑seq文库的方法 - Google Patents

一种构建植物中pri‑miRNA‑3’RACE‑seq文库的方法 Download PDF

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CN107385516A CN201710594860.6A CN201710594860A CN107385516A CN 107385516 A CN107385516 A CN 107385516A CN 201710594860 A CN201710594860 A CN 201710594860A CN 107385516 A CN107385516 A CN 107385516A
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dna
primer
mirna
pri
race
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宋剑波
莫小为
岳路明
杨海奇
刘琳
陈雪梅
莫蓓莘
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Shenzhen University
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明提供了一种构建植物中pri‑miRNA‑3’RACE‑seq文库的方法，是一种利用SDS‑PAGE RNA分离技术、3’‑RACE加接头技术和巢式PCR等技术，通过5’端的特殊引物设计，在植物中创立了用于高通量测序的pri‑miRNA 3’RACE‑seq文库构建新方法，利用该技术可通过二代高通量测序技术分析植物中pri‑miRNA的3’端在不同的基因突变下的变化情况。本方法利用pri‑miRNA 5’端的特殊引物设计，通过两轮PCR，特异性的克隆出丰度极低的pri‑miRNA，构建出了高质量的pri‑miRNA 3’RACE‑seq文库。

Description

一种构建植物中pri-miRNA-3’RACE-seq文库的方法
技术领域
本发明涉及一种构建植物中pri-miRNA-3’RACE-seq文库的方法。
背景技术
随着测序技术的发展，转录组和降解组的测序日渐普遍，作为二代测序技术的基础，文库的构建对测序结果起着决定性作用。现在市场上已经出现了很多种RNA文库构建方法，已经很成熟。但是在植物中，对pri-miRNA 3’RACE-seq的文库构建方法还没有报道。Pri-miRNA作为miRNA的初始转录产物，其结构与普通的mRNA类似，是miRNA加工过程中的第一步产物，其3’端修饰对于最终加工成为成熟miRNA非常重要，所以探明3’pri-miRNA的核苷酸的变化情况对于研究miRNA的形成具有重要的生物学意义。然而，由于pri-miRNA很快会被剪切加工成pre-miRNA，所以丰度极低(实验检测发现比pre-miRNA丰度更低)。到目前为止，还没有现成的pri-miRNA 3’RACE-seq文库的构建方法。
发明内容
针对上述对pri-miRNA-3’RACE-seq文库的构建过程中遇到的各种问题，本发明提供一种构建植物中pri-miRNA-3’RACE-seq文库的方法，利用该方法可以明确的看到植物中pri-miRNA 3’末端碱基的变化情况。
本发明所采用的技术如下：一种构建植物中pri-miRNA-3’RACE-seq文库的方法，步骤如下：
步骤(1)植物总RNA的提取；
步骤(2)RNA的准备：利用SDS-PAGE对所提取的植物总RNA进行分离，对50bp-无穷大之间的RNA进行切胶回收；
步骤(3)反转录：利用反转录试剂盒，对RNA进行反转录，反转录成cDNA；
步骤(4)巢式PCR：利用5’端的引物，以步骤(3)的反转录cDNA为模板，进行第一轮PCR，PCR产物回收后，再利用第二轮引物进行第二轮PCR，这样就能够扩增出来引物所扩增出来的miRNA，PCR产物回收后送去测序；
步骤(4)所述的第一轮PCR的引物，上引物如序列表SEQ ID No.1-SEQ ID No.78所示，下引物如序列表SEQ ID No.79所示；
步骤(4)所述的第二轮PCR的引物，上引物如序列表SEQ ID No.80所示，下引物如序列表SEQ ID No.81所示。
本方法利用pri-miRNA 5’端的特殊引物设计，通过两轮PCR，特异性的克隆出丰度极低的pri-miRNA，构建出了高质量的pri-miRNA 3’RACE-seq文库。
附图说明
图1为本发明建库流程简图。
具体实施方式
实施例1
一、植物总RNA的提取
(1.1)、取100mg新鲜的植物组织于干净的1.5mL离心管中。
(1.2)、将植物组织在液氮中速冻，用枪头捣碎。
(1.3)、加入1mL TRIZOL上下颠倒混匀，室温下静置5min。
(1.4)、加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置15min。
(1.5)、12000Xg离心15min，吸取上清400μL。
(1.6)、加入400μL异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置30min淀RNA。
(1.7)、4℃，12000Xg离心15min，弃上清。
(1.8)、加入1mL 75％的乙醇洗涤RNA，4℃，12000Xg离心5min。
(1.9)、室温干燥RNA，加入30μLddH2O溶解RNA。
(1.10)、将提取的RNA存放于-80℃保存。
二、RNA的准备(50bp-无穷大)
(2.1)制胶
(2.1.1)、配置15％尿素-PAGE胶，共15mL：
Urea(尿素) 6.3g
5×TBE 1.5mL
40％Acr(丙烯酰胺)：
BIS(N，N’一亚甲基双丙烯酰胺)(29:1) 5.63mL
10％APS(过硫酸铵) 120μL
TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺) 9μL
将胶倒入夹板，放上梳子，凝胶至少30min。
(2.1.2)、在30μL的总RNA中，加入等量的2×small RNA loading dye(上样缓冲液)，混匀后70℃变性5min，然后立即放在冰上。
2×small RNA loading dye包含：80％formamide(甲酰胺)、0.1％Xylene FF(二甲苯FF)、0.1％Brophenol Blue(溴酚蓝)。
(2.1.3)、点样，并加入10μL 10bp的DNA marker，150V电泳1-1.5h。(Runningbuffer:0.5×TBE)
(2.1.4)、EB染色5min
(2.1.5)、切胶，回收50-无穷大的胶到1.5mL离心管，并用1mL的枪头将胶磋碎。
(2.1.6)、加入500μL0.4N NaCl-DEPC到离心管，并确保胶在翻转离心管的时候能够流动。
(2.1.7)、4℃保持持离心管翻转6h或者过夜。
(2.1.8)、4℃，13200r/m离心1min，将上清液转移到新的离心管中。重复2-3次，直到去除所有的胶。
(2.1.9)、加入1μL Glycogen(糖元)，50μL NaOAc和1mL 100％乙醇，混匀后放入-20℃6h或者过夜。
(2.1.10)、离心并用70％的乙醇洗涤RNA。
(2.1.11)、用20μL DEPC-水溶解RNA，此RNA用来建库。
(2.2)回收(50bp–最大)
(2.2.1)、配置15％尿素-PAGE胶，
共15mL：
Urea(尿素) 6.3g
5×TBE 1.5mL
40％Acr(丙烯酰胺)：
BIS(N，N’一亚甲基双丙烯酰胺)(29:1) 5.63mL
10％APS 120μL
TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺) 9μL
将胶倒入夹板，放上梳子，凝胶至少30min。
(2.2.2)、在30μL的总RNA中，加入等量的2×small RNA loading dye，混匀后70℃变性5min，然后立即放在冰上。
2×small RNA loading dye配方：80％formamide(甲酰胺)、0.1％Xylene FF(二甲苯FF)、0.1％Brophenol Blue(溴酚蓝)。
(2.2.3)、点样，并加入10μL 10bp的DNA marker，150V电泳1-1.5h。(Runningbuffer:0.5×TBE)。
(2.2.4)、EB染色5min。
(2.2.5)、切胶，回收50-无穷大的胶到1.5mL离心管，并用1mL枪头将胶戳碎。
(2.2.6)、加入500μL 0.4N NaCl-DEPC到离心管，并确保胶在翻转离心管的时候能够流动。
(2.2.7)、4℃保持离心管翻转6h或者过夜。
(2.2.8)、4℃，13200r/m离心1min，将上清液转移到新的离心管中。重复2-3次，直到去除所有的胶。
(2.2.9)、加入1μL Glycogen(糖元)，50μL NaOAc和1mL 100％乙醇，混匀后放入-20℃6h或者过夜。
(2.2.10)、离心并用70％的乙醇洗RNA，烘干后溶于20μL DEPC-水，-80℃保存。
三、反转录反应
(3.1)预变性
回收的RNA 12μL
olig dT 1μL
70℃反应10min，迅速放冰上2min。
(3.2)反转录反应(20μL体系)
30℃10min，42℃1h，70℃15min变性后，4℃保存。
四、巢式PCR反应
两轮PCR反应(LA Taq)
(4.1)第一轮10个循环
引物：
Sense:1st PCR Forward primer(将以下78条引物混合)
miR156a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCACAAAGGCAATTTGCA
miR156b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGTCTATAACTTTGCGTGT
miR156c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGCACTTTGCATGTTCG
miR156d GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGAAGTTGTATAAAAGTTTTG
miR156e GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCATGGTGGTTTCTTGCA
miR156f GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCATGGTGGCTTTCTTGCA
miR156h GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGCACAACCTGGGATTAG
miR157a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAGATGATGAGATACAATTCGGAG
miR157b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCAGATGATAAGATACAATTCCTC
miR157c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTCTACTCTTTTGTGCT
miR157d GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAAGAGCTAGAAGACTATCTGCAT
miR158a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTTCTTTGTCTACAATTTTGGAA
miR158b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTGGAAAAGGTGATGAT
miR159b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAGCTTTCACTTACCCCTTT
miR160a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGCCTGGCTCCCTGTATG
miR160b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGCCTGGCTCCCTGTAT
miR160c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCCTGGCTCCCTGTATGC
miR162a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATGTAAAAGCATGAATAGATC
miR162b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGGAGGCAGCGGTTCAT
miR163 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAGAGCACGGTCGAAGAA
miR164a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCAAACCAACAAACACGAAATC
miR164b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCATGCGGAATTTTGTGAT
miR164c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGGAGAAGCAGGGCACG
miR165a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGTTGTCTGGATCGAGGA
miR165b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGCCACATGGTATCGTCG
miR166a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTCTAACAATCGAATTGAACC
miR166b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTGGCTCGAGGACTCTT
miR166e GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTCTTCTTTATTCATTAG
miR166f GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGAATGATGCCTGGCTCG
miR166g GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGGCTCGAGGTCATGGA
miR167a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTTTCTTTATCCTTTGTTG
miR167c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCATATTTCTTGTTCTTACAAG
miR168a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTGGTTTGTGAGCAGGGAT
miR168b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTGGCTGACACCGACAC
miR169a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTCCGTATAAAATACAAG
miR169d GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCACAAATCTTAACTGATTTTGGTG
miR169f GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTCACAATCTGTTGATTCGTG
miR169h GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGTTGGTCGTCAGGCAGTC
miR169i GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCATGACCATTTTGCTTAT
miR169j GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGTTGAATCTTGCGGGTTA
miR169k GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATAGACATCAGGCAGT
miR169m GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTCATCAAAAGACATCAGGCA
miR169n GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGTTGAATCTTGCGGGTTA
miR170 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGGCCTGGTTCACTCAG
miR171a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGTTCACTCAGATCTTACCTGACC
miR171b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGTTCAATCAAATAGTCGTC
miR171c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGTGCGGTTCAATCAGA
miR172a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCATGGACGGTGGTGATTC
miR172b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCACATGGAAATTGATAAATACC
miR172d GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGGTTTTCTTTTGAGCC
miR172e GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGTTCCCTTTGCTTTCGC
miR173 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTACTTTCGCTTGCAGAG
miR319b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAAATGAATGAATGATGCGAGA
miR390a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCGCCATGATGATCACAT
miR390b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGGCTCACCAGTGCTGT
miR391 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAGTGGTGACGGTATCTC
miR393a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTGGCAAATAAATCACA
miR393b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTCAATCGAAAGATGGAA
miR394a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGCATTCTGTCCACCTCC
miR394b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATAAGTGTACGTATCTACGGTG
miR396a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTTACGCATAAAATAGTG
miR396b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTCTTAAACAAAAGTAAGAAG
miR398a GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGAGTGGCATGTGAACA
miR398b GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCACGGCTGTAATGACGCT
miR398c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCGAGCAATCAACGGCTAT
miR399c GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGCAGGCGACTTGGCTAT
miR400 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTCACTACATTTGGTAAGC
miR403 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCATTCAACAGGCTTTATG
miR408 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCCTCTTCCCTGGCTCCC
miR5663 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCGGATTTGCATTCTCATG
miR822 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATGCTTTCTACAGGAA
miR824 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTTGGGGAGTGGGGAGAT
miR837 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTACACTCATAATCTTGAAACGAA
miR840 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAATCCGCACGATGATCT
miR844 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCCTTCTACGCATTGGGCTTA
miR846 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTAGTTTTGAATTGAAGTGCTTGA
miR851 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCTGAAAACAATCATCACGAG
miR864 GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATCAAATACCTTGAAACTATAAACC
Anti-sense1:TTTTTTTTTTTTTTTTTT
(4.2)回收
用12％的聚丙烯酰胺凝胶分离DNA，回收50bp-无穷大的片段。
(4.2.1)、制备12％的聚丙烯酰胺凝胶
共15mL
5×TBE 1.5mL
40％Acr(丙烯酰胺)：
(4.2.2)、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR产物中，将所有的DNA点入胶孔，同时点上10μL 10bp DNA marker；
(4.2.3)、150v 1.5h；
(4.2.4)、切50bp-无穷大的DNA条带，用回收小RNA的方法回收DNA；
(4.2.5)、离心，洗涤，干燥；
(4.2.6)、用20-30μL的水溶解DNA。
(4.3)第二轮PCR(16个循环)
引物：
Sense:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
Anti-sense2:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCATTTTTTTTTTTTTTTTTT
(4.4)回收
用12％的聚丙烯酰胺凝胶分离DNA，回收100bp-无穷大的片段。
(4.4.1)、制备12％的PAGE胶
共15mL
5×TBE 1.5mL
40％Acr(丙烯酰胺)：
(4.4.2)、加入10μL 6×DNA loading dye到PCR产物中，将所有的DNA点入胶孔，同时点上10μL10bp DNA marker；
(4.4.3)、150v 1.5h；
(4.4.4)、切100bp-无穷大的DNA条带，用回收小RNA的方法回收DNA；
(4.4.5)、离心，洗涤，干燥；
(4.4.6)、用20-30μL的水溶解DNA，用来测序。
＜110＞深圳大学
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＜210＞ 20
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR163
＜400＞ 20
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAGAG CACGGTCGAA GAA
＜210＞ 21
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ miR164a
＜400＞ 21
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCAAA CCAACAAACA CGAAATC
＜210＞ 22
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR164b
＜400＞ 22
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGC GGAATTTTGT GAT
＜210＞ 23
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR164c
＜400＞ 23
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGA GAAGCAGGGC ACG
＜210＞ 24
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR165a
＜400＞ 24
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTTG TCTGGATCGA GGA
＜210＞ 25
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR165b
＜400＞ 25
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCCA CATGGTATCG TCG
＜210＞ 26
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ miR166a
＜400＞ 26
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCTA ACAATCGAAT TGAACC
＜210＞ 27
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR166b
＜400＞ 27
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTGG CTCGAGGACT CTT
＜210＞ 28
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ miR166e
＜400＞ 28
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTCT TCTTTATTCA TTAG
＜210＞ 29
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR166f
＜400＞ 29
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGAAT GATGCCTGGC TCG
＜210＞ 30
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR166g
＜400＞ 30
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGC TCGAGGTCAT GGA
＜210＞ 31
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR167a
＜400＞ 31
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTT CTTTATCCTT TGTTG
＜210＞ 32
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ miR167c
＜400＞ 32
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATAT TTCTTGTTCT TACAAG
＜210＞ 33
＜211＞45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR168a
＜400＞ 33
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG TTTGTGAGCA GGGAT
＜210＞ 34
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR168b
＜400＞ 34
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG CTGACACCGA CAC
＜210＞ 35
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169a
＜400＞ 35
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTCC GTATAAAATA CAAG
＜210＞ 36
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169d
＜400＞ 36
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCACAA ATCTTAACTG ATTTTGGTG
＜210＞ 37
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169f
＜400＞ 37
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTCA CAATCTGTTG ATTCGTG
＜210＞ 38
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169h
＜400＞ 38
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGTT GGTCGTCAGG CAGTC
＜210＞ 39
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169i
＜400＞ 39
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGA CCATTTTGCT TAT
＜210＞ 40
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169j
＜400＞ 40
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGTT GAATCTTGCG GGTTA
＜210＞ 41
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169k
＜400＞ 41
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATA GACATCAGGC AGT
＜210＞ 42
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169m
＜400＞ 42
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTCA TCAAAAGACA TCAGGCA
＜210＞ 43
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR169n
＜400＞ 43
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGTT GAATCTTGCG GGTTA
＜210＞ 44
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR170
＜400＞ 44
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGC CTGGTTCACT CAG
＜210＞ 45
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ miR171a
＜400＞ 45
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTTC ACTCAGATCT TACCTGACC
＜210＞ 46
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ miR171b
＜400＞ 46
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGTT CAATCAAATA GTCGTC
＜210＞ 47
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR171c
＜400＞ 47
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGTG CGGTTCAATC AGA
＜210＞ 48
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR172a
＜400＞ 48
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATGG ACGGTGGTGA TTC
＜210＞ 49
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ miR172b
＜400＞ 49
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCACAT GGAAATTGAT AAATACC
＜210＞ 50
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR172d
＜400＞ 50
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGGT TTTCTTTTGA GCC
＜210＞ 51
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR172e
＜400＞ 51
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGTTC CCTTTGCTTT CGC
＜210＞ 52
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR173
＜400＞ 52
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTACT TTCGCTTGCA GAG
＜210＞ 53
＜211＞ 47
＜212＞ DNA
＜213＞ miR319b
＜400＞ 53
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAAAT GAATGAATGA TGCGAGA
＜210＞ 54
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR390a
＜400＞ 54
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCGCC ATGATGATCA CAT
＜210＞ 55
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR390b
＜400＞ 55
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGGC TCACCAGTGC TGT
＜210＞ 56
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR391
＜400＞ 56
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAGTG GTGACGGTAT CTC
＜210＞ 57
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR393a
＜400＞ 57
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG CAAATAAATC ACA
＜210＞ 58
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR393b
＜400＞ 58
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCAA TCGAAAGATG GAA
＜210＞ 59
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR394a
＜400＞ 59
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCAT TCTGTCCACC TCC
＜210＞ 60
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ miR394b
＜400＞ 60
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATA AGTGTACGTA TCTACGGTG
＜210＞ 61
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ miR396a
＜400＞ 61
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTA CGCATAAAAT AGTG
＜210＞ 62
＜211＞ 46
＜212＞ DNA
＜213＞ miR396b
＜400＞ 62
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCTT AAACAAAAGT AAGAAG
＜210＞ 63
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR398a
＜400＞ 63
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGAG TGGCATGTGA ACA
＜210＞ 64
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR398b
＜400＞ 64
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCACGG CTGTAATGAC GCT
＜210＞ 65
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ miR398c
＜400＞ 65
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCGAG CAATCAACGG CTAT
＜210＞ 66
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR399c
＜400＞ 66
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGCAG GCGACTTGGC TAT
＜210＞ 67
＜211＞ 44
＜212＞ DNA
＜213＞ miR400
＜400＞ 67
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTCAC TACATTTGGT AAGC
＜210＞ 68
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR403
＜400＞ 68
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCATTC AACAGGCTTT ATG
＜210＞ 69
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR408
＜400＞ 69
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCCTC TTCCCTGGCT CCC
＜210＞ 70
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR5663
＜400＞ 70
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCGGAT TTGCATTCTC ATG
＜210＞ 71
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR822
＜400＞ 71
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATG CTTTCTACAG GAA
＜210＞ 72
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR824
＜400＞ 72
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTTGG GGAGTGGGGA GAT
＜210＞ 73
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ miR837
＜400＞ 73
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTACA CTCATAATCT TGAAACGAA
＜210＞ 74
＜211＞ 43
＜212＞ DNA
＜213＞ miR840
＜400＞ 74
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAATC CGCACGATGA TCT
＜210＞ 75
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR844
＜400＞ 75
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCCTTC TACGCATTGG GCTTA
＜210＞ 76
＜211＞ 49
＜212＞ DNA
＜213＞ miR846
＜400＞ 76
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTAGT TTTGAATTGA AGTGCTTGA
＜210＞ 77
＜211＞ 45
＜212＞ DNA
＜213＞ miR851
＜400＞ 77
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCTGAA AACAATCATC ACGAG
＜210＞ 78
＜211＞ 48
＜212＞ DNA
＜213＞ miR864
＜400＞ 78
GTTCAGAGTT CTACAGTCCG ACGATCAAAT ACCTTGAAAC TATAAACC
＜210＞ 79
＜211＞ 18
＜212＞ DNA
＜213＞ Anti-sense1
＜400＞ 79
TTTTTTTTTT TTTTTTTT
＜210＞ 80
＜211＞ 50
＜212＞ DNA
＜213＞ Sense
＜400＞ 80
AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACG TTCAGAGTTC TACAGTCCGA
＜210＞ 81
＜211＞ 81
＜212＞ DNA
＜213＞ Anti-sense2
＜400＞ 81
CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATCGTGAT GTGACTGGAG TTCCTTGGCA CCCGAGAATT 60
CCATTTTTTT TTTTTTTTTT T 81

Claims (1)

1.一种构建植物中pri-miRNA-3’RACE-seq文库的方法，步骤如下：
步骤(1)植物总RNA的提取；
步骤(2)RNA的准备：利用SDS-PAGE对所提取的植物总RNA进行分离，对50bp-无穷大之间的RNA进行切胶回收；
步骤(3)反转录：利用反转录试剂盒，对RNA进行反转录，反转录成cDNA；
其特征在于，
步骤(4)巢式PCR：利用5’端的引物，以步骤(3)的反转录cDNA为模板，进行第一轮PCR，PCR产物回收后，再利用第二轮引物进行第二轮PCR，这样就能够扩增出来引物所扩增出来的miRNA，PCR产物回收后送去测序；
步骤(4)所述的第一轮PCR的引物，上引物如序列表SEQ ID No.1-SEQ ID No.78所示，下引物如序列表SEQ ID No.79所示；
步骤(4)所述的第二轮PCR的引物，上引物如序列表SEQ ID No.80所示，下引物如序列表SEQ ID No.81所示。
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