CN105002569A - 转录组文库及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种转录组文库及其构建方法。该构建方法包括：以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA；对双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA；利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库。通过利用MMLV逆转录酶将总RNA中的mRNA逆转录成全长片段的双链cDNA；再对双链cDNA进行扩增，以达到文库构建所需要的DNA的量，进而能够顺利实现后续片段化文库的构建。该方法不仅能够富集完整全长的转录本，而且能够高敏感度、无偏好性地扩增cDNA，因而还可以维持原始mRNA各转录本的丰度，从而能够实现微量样本转录组文库的构建。

Description

转录组文库及其构建方法

技术领域

本发明涉及高通量测序文库构建领域，具体而言，涉及一种转录组文库及其构建方法。

背景技术

转录组测序(Transcriptome sequencing)主要通过高通量测序研究特定组织或细胞在某个时期转录出来的mRNA。转录组测序可全面快速地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。

目前，转录组文库构建步骤中，通常要先将核糖体RNA从总RNA中去除，以避免大量的核糖体RNA对测序的影响。去除了核糖体的RNA再利用随机引物进行逆转录，得到cDNA。这样既消除了核糖体RNA的影响又保证了全长cDNA的产出。

普通转录组文库构建时首先要对总RNA进行检测，检测合格的样品才能进行后续建库。而合格的样品需要满足以下四个方面的要求：(1)样品的量：无论真核生物还是原核生物总RNA的量均需≧1.5ug。(2)样品浓度：真核生物的浓度需要≧50ng/μl；原核生物的浓度≧65ng/μl。(3)样品纯度：OD260/280要≧1.8；28S/18S要≧1。(4)RNA完整性：植物或真菌的RIN值要≧6.5；动物的RIN值要≧7.0；原核生物的RIN值要≧6.0。

普通转录组文库构建过程中，利用oligo dT磁珠，从总RNA纯化得到mRNA，经过片段化(200bp左右)、合成一链和二链cDNA，然后再通过末端修复、加A、连接接头和PCR富集步骤得到最终的cDNA文库。操作过程中需多次利用AMPure XP磁珠纯化以去除反应体系中非目标小片段。

普通转录组文库构建的流程如下：(1)mRNA纯化；(2)RNA片段化；(3)第一链cDNA合成；(4)第二链cDNA合成；(5)双链cDNA纯化；(6)末端修复和加腺苷酸A；(7)接头的连接；(8)片段选择加接头的DNA；(9)USER酶消化和PCR富集；(10)PCR产物纯化。

上述文库构建过程中不涉及PCR扩增的步骤，直接是对mRNA反转录来的双链cDNA进行后续建库流程，这样所构建的文库高度忠实于特定细胞或组织在特定状态下所转录出来的mRNA，能够真实体现细胞的转录状态。

由上述内容可知，目前普通转录组文库对样品质量要求较高，总RNA的量≧1.5ug，对纯度及完整性也有一定要求。微量细胞起始量低，提取到的总RNA根本不能通过电泳，而且用Qubit也无法检测到(5ng以下)，更无法用安捷伦2100进行质量检测，无法对其纯度及完整性进行判断，不能完成转录组文库构建。因此，仍需要对现有的转录组文库的构建方法进行改进。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种转录组文库及其构建方法，以解决现有技术中难以实现微量起始细胞的转录组文库构建的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库的构建方法，该构建方法包括：以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA；对双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA；以及利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库。

进一步地，利用Oligo dT引物和MMLV逆转录酶将待测样本总RNA中的mRNA逆转录成双链cDNA。

进一步地，待测样本的总RNA的量小于5ng。

进一步地，MMLV逆转录酶为重组MMLV逆转录酶，重组MMLV逆转录酶包括SMARTScribe^TM逆转录酶、IV逆转录酶或III逆转录酶。

进一步地，以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA的步骤包括：步骤S1，利用MMLV逆转录酶对总RNA中的mRNA进行逆转录，得到第一链cDNA；以及步骤S2，以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到双链cDNA。

进一步地，在步骤S1和步骤S2之间，还包括对第一链cDNA进行磁珠纯化的步骤；以及在步骤S2之后，还包括对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤。

进一步地，磁珠纯化步骤中的磁珠为SPRI Ampure XP磁珠。

进一步地，在对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤后，还包括对双链cDNA的长度和浓度进行检测的步骤。

进一步地，利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库的步骤包括：对扩增cDNA进行片段化，得到片段化DNA；对片段化DNA进行末端修复加A，得到修复DNA；对修复DNA进行接头连接，得到含有带接头DNA和不带接头DNA的混合物；对混合物中的带接头DNA进行分离，得到带接头的DNA；对带接头的DNA进行USER酶消化，得到消化DNA；以及对消化DNA进行富集，得到转录组文库。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转录组文库，该转录组文库采用权利上述任一种构建方法构建而成。

应用本发明的技术方案，通过以总RNA为模板，在不去除核糖体RNA的情况下，通过利用MMLV逆转录酶将总RNA中的mRNA逆转录成全长片段的双链cDNA；再对双链cDNA进行扩增，以达到文库构建所需要的DNA的量，进而能够顺利实现后续片段化文库的构建。该方法不仅能够富集完整全长的转录本(400bp～9000bp)，而且能够高敏感度、无偏好性地扩增cDNA，因而还可以维持原始mRNA各转录本的丰度，从而能够实现微量样本的转录组文库的构建。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据本发明的一种优选的实施例中转录组文库构建的流程示意图；

图2示出了根据本发明的一种优选的实施例中转录组文库构建的详细流程示意图；

图3示出了本发明的一优选的实施中转录组文库构建过程中所得到的扩增cDNA的安捷伦2100检测结果；以及

图4示出了本发明的另一优选的实施中转录组文库构建过程中所得到的扩增cDNA的安捷伦2100检测结果。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术部分所提到的，目前转录组文库的构建方法是直接利用从总RNA中去除核糖体RNA(以避免大量的核糖体RNA对测序的影响)，分离得到的mRNA进行逆转录得到的cDNA进行文库构建，中间不经过PCR扩增的步骤，减少了PCR扩增所带来的偏好性或错误率，使得所构建的转录组文库能够相对真实地体现细胞或组织某一状态下的转录状况。然而，上述构建方法对样品总RNA的量要求较高，对细胞数目较少(如少于10⁴～10⁵细胞个数)的样品而言，无法提取得到满足上述文库构建要的总RNA的量。

为了解决现有技术中的上述状况，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种转录组文库的构建方法，如图1所示，该构建方法包括：以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA；对双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA；利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到转录组文库。

本发明的上述转录组文库的构建方法，通过以总RNA为模板，在不去除核糖体RNA的情况下，利用MMLV逆转录酶将mRNA逆转录成双链cDNA，能够从相对少量的总RNA模板中逆转录得到mRNA全长片段(400bp～9000bp)的双链cDNA；然后对获得的长片段的双链cDNA进行扩增，以达到文库构建所需要的DNA的量，进而能够顺利实现后续文库的构建。该方法能够满足高敏感度、无偏好性的cDNA转录本的扩增，能够富集完整全长的转录本，并且可以维持原始mRNA各转录本的丰度，从而能够实现微量样本的转录组文库的构建。

由于逆转录得到较长的片段相比得到较短的片段难度相对较大，因而在现有的转录组文库构建过程中，通常是从总RNA中分离得到mRNA后，先对mRNA进行打断，然后再对打断后的短片段(150bp～200bp)的mRNA进行逆转录得到双链cDNA，然后不经过扩增步骤直接将双链cDNA进行片段化文库构建。由于这样所构建的文库通常最能真实反映所检测样本的转录状态。而且，这种打断成小片段后再进行转录对逆转录酶的要求也相对较低，只要能够转录较短的片段即可。

而在本发明中，通过采用能够逆转录较长片段、逆转录活性较强且保真性较高的MMLV逆转录酶进行mRNA的逆转录过程，并在逆转录得到双链cDNA之后进行预扩增的步骤，以使得来源于样本mRNA的双链cDNA的量达到满足文库构建的要求，从而实现对微量样本转录组文库的构建。

MMLV逆转录酶为莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶，其野生型除了逆转录酶活性外，还具有较强的RNaseH酶活性，能够对逆转录得到的RNA-DNA杂交体中的RNA链进行酶切，从而影响逆转录片段的长度。目前可用的MMLV都是经过重组改造的逆转录酶。适用于本发明的MMLV系列的逆转录酶包括但不仅限于SMARTScribe^TM逆转录酶、IV逆转录酶或III逆转录酶.。这些MMLV逆转录酶分别具有以下优点：高效、适于众多RNA模板；反应抑制剂耐受性高；cDNA得率高。

上述转录组文库构建的方法中，从总RNA中获取得到mRNA的步骤可以采用现有的分离方法，只要能够进行后续的逆转录步骤即可，比如可以采用Oligo d(T)磁珠或者Oligo d(T)引物进行捕获。在本发明中，优选采用Oligo d(T)引物从待测样本的总RNA中捕获得到mRNA，不仅能够提高mRNA的捕获效率，而且能够降低转录组文库构建的成本。在本发明一种优选的实施例中，待测样本的总RNA小于0.5ng。小于0.5ng总RNA的量采用本发明的上述构建方法同样能够实现文库的构建。

上述构建方法中，利用MMLV逆转录酶将mRNA逆转录成双链cDNA的步骤为常规的逆转录步骤，包括：步骤S1，利用MMLV逆转录酶对mRNA进行逆转录，得到第一链cDNA；以及步骤S2，以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到双链cDNA。

上述逆转录得到双链cDNA的步骤中，根据实际需要可用对得到的第一链cDNA和双链cDNA进行纯化，以去除逆转录反应过程中的酶、dNTPs等杂质，提高后续文库构建的质量。在本发明一种优选的实施例中，在步骤S1和步骤S2之间，还包括对第一链cDNA进行磁珠纯化的步骤；以及在步骤S2之后，还包括对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤。

上述步骤中采用磁珠纯化，方便快速且纯化效果好。市售的各种能够对DNA进行纯化的磁珠均适用于上述纯化步骤。在本发明中，优选采用SPRI Ampure XP磁珠。

在现有的转录组文库构建方法中，通常在文库构建之前，需要对待测样本的总RNA的量进行检测，只要总RNA的量能够达到量的要求，就进行mRNA的捕获及打断。由于打断后的mRNA已为短片段，因而无法检测所逆转录的双链cDNA是否涵盖发生转录了的基因的全长。而在本发明的构建方法中所得到的双链cDNA为基因转录的全长mRNA，而基因全长mRNA的长度通常在400bp到9000bp之间，因而可以通过安捷伦2100对双链cDNA扩增后得到的扩增cDNA的纯度及完整性进行判断，从而对文库构建的质量进行把控。在本发明一种优选的实例中，在对双链cDNA进行磁珠纯化的步骤后，还包括对双链cDNA的长度和浓度进行检测的步骤。

上述构建方法中利用扩增cDNA进行片段化文库构建得到转录组文库的步骤采用现有的构建步骤即可。在本发明的优选实施例中，上述步骤包括：对扩增cDNA进行片段化，得到片段化DNA；对片段化DNA进行末端修复加A，得到修复DNA；对修复DNA进行接头连接，得到带接头DNA；对带接头DNA的片段长度进行选择，得到目的长度DNA；对目的长度DNA进行USER酶消化，得到消化DNA；对消化DNA进行富集，得到转录组文库。

在本发明另一种典型的实施方式中，提供了一种转录组文库，该转录组文库采用上述任一种构建方法构建而成。该转录组文库同样能够实现特定细胞或组织在特定状态下的基因转录状态。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。下列实施例参照图2所示的详细步骤进行转录组文库的构建。

一.TRizol法提取拟南芥花粉细胞的总RNA。

1)将样本加入1ml Trizol中，震荡，室温静置5min，使其充分裂解，13000rpm离心5min，然后将管中的上清转移至新2.0ml EP管；

2)按照Trizol：氯仿＝5:1的比例加入氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀15s，室温静置2-3min，使其自然分相；

3)4℃，13000rpm离心5min，混合物会分成三层：下层红色为苯酚－氯仿有机相，中间层和无色上层水相，RNA主要集中在水相；

4)将上清转入一新2.0ml EP管(注意不要吸到中间层和下层)，加入等体积氯仿，漩涡振荡器上振荡混匀15s，室温静置2-3min，使其自然分相，4℃，13000rpm离心5min；

5)将上层水相转入新的1.5ml EP管(约500-600μl，注意不要取到下层液体)，离心管上标明项目名称、样品名称和日期，加入等体积的异丙醇，混匀后，-80℃或干冰放置20min；

6)4℃，13000rpm离心10min，弃掉上清；

7)向RNA沉淀中加入1ml 75％乙醇，颠倒混匀5s，4℃，13000rpm离心5min，弃上清；

8)重复步骤7

9)4℃，13000rpm离心1min，用枪头小心吸弃多余液体；

10)将RNA沉淀置于超净工作台吹干，约1-2min(不易太干，否则RNA很难溶解)，用10μl无RNA酶的双蒸H₂O溶解RNA沉淀。

对溶解后的总RNA进行Qubit检测，发现检测不到样品的浓度。

二.对提取的RNA进行扩增

(一)第一链cDNA的合成(在PCR洁净工作室)

1.根据需要建立合适体积的反应液，以下为1个样品所需要加入的反应液的量：

2.RNA样品的制备

取1μlRNA样品转移至含有2.5μl反应缓冲液的无RNA酶的2ml PCR管中。然后，立即将反应管放在干冰上。

3.将样品分别放置在经–20℃预冷的PCR管架上，分别其中UP1引物(12μM)，各1μl。混匀各组份，然后瞬时离心。

其中，UP1引物SEQ ID NO 1：5’–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)N-1N–3’(N＝A，C，G，or T；N-1＝A，G，or C)。

4.将反应管放在PCR仪中，72℃，孵育3min，(冰浴2分钟，终止)。

5.与此同时，在室温中混匀以下试剂：

其中，UP2引物为SEQ ID NO 2：5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG-3’

6.待孵育完成后，立即分别向这3个PCR管中加入5.5μl反应混合液。用枪头轻柔地吸打混匀，然后瞬时离心将混合物收集到管底部。

7.42℃，孵育90min；70℃，加热10min；终止反应。

(二)使用SPRI Ampure磁珠纯化第一链cDNA(建议在PCR洁净间进行实验)

1.用200μl的移液管分别吸取25μl的SPRI Ampure XP磁珠加入到每个样品中，定容至35μl。用移液器吹打10次，室温下8min。

2.瞬时离心，然后将样品管放在Promega MagnaBot II磁性分离器上，反应5min或者更长时间，直到澄清。

3.弃上清。瞬时离心，将液体收集到管底部。

4.将样品管放回Promega MagnaBot II磁性分离器再放置2min或者更长时间使磁珠完全和液体分离开。然后，用10μl的移液器将管中剩余的液体洗掉，确保管中不再有剩余的上清液。

(三)LD PCR扩增双链cDNA(操作中的步骤1和2在PCR洁净间进行)

1.准备PCR扩增反应的预混液。将下列试剂按照顺序加入管中旋涡混匀，并在微型离心机中瞬时离心。PCR扩增反应的预混液如下：

其中，IS PCR引物为SEQ ID NO 3：5’–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3’

2.分别向样品中加入50μl PCR预混液，混匀后瞬时离心。

3.将各个反应管放在提前预热的PCR仪中，按照下面参数，设置PCR扩增程序：

(四)扩增后的cDNA的纯化与鉴定

1.取出一个1.5ml离心管，加入90μl的SPRI Ampure XP Beads。

2.将全部的PCR产物包括SPRI beads转移到含有SPRI beads的1.5ml离心管中。用移液器上下吹打10次至完全混匀。室温孵育8min。

3.将样品管中放置于磁力分离器上，大约5min，或者更长时间，直到液体完全澄清为止。

4.吸掉上清液，保持样品管始终在磁性分离器上，然后分别向孔中加入200μl新配制的80％的乙醇。30s后，小心地吸掉上清液。在清洗beads上的杂质时，DNA始终是结合在beads上。

5.重复Step 4。

6. 1,000rpm下离心10min将管壁的液体收集到离心管底部。

7.将样品管放回磁力分离器，30s后，去除孔中残留的乙醇。

8.将样品管放置在室温干燥，约3-5min后，就能看到圆颗粒表面有小裂纹。

9.beads干后，向beads中加入12μl的纯缓冲液。将样品管从磁性分离器上取下放在室温孵育2min，使beads再水化。

10.吹打10次，使DNA从beads上洗脱下来。然后将样品管回磁磁力架，放置1min或者更长时间，直到溶液完全澄清为止。

11.将含有纯化后的cDNA上清液转移到无核酸酶的non sticky的管中，在每个管子上贴上不同的标签。

12.取1μl进行Qubit定量。准备干净的0.5ml离心管，写好对应样品编号，取1μl文库按照Qubit浓度稀释至1.5-2ng/μl，然后采用安捷伦2100进行检测。检测结果如图3和图4所示，样品正常扩增，在约400bp-9000bp间出现明显的峰值域，最高峰值大约在2000bp，无污染、无降解现象。

三.NEB Next Ultra试剂盒建库：

cDNA全长Covaris打断成150-200bp，以20ng-400ng起始量建库；

(一)、Covaris剪切(提前四十分钟开机)

1.设置covaris：

a)在covaris水缸中加入去离子水，水位达到刻度左“15”；

b)检查水位是否能没过管子的玻璃部分；

c)将冷却温度设为2-5℃，冷却至5℃；

d)可选。加入乙二醇(ethylene glycol)至总体积的20％，防止结冰。

e)按下控制板上的“Degas”按钮。使用之前Degas至少30min。

2.在1.5ml EP管中，用1X Low TE缓冲液分别将10ng和30ng cDNA稀释到130μl。

3.将Covaris microTube装到covaris上。

4.用锥形枪头小心地吸取130μl cDNA样本，加入到Covaris microTube管中。(小心操作，不要使管子底部出现气泡)

5.按照下表1设置Covaris参数，进行DNA破碎。破碎产物的主峰在150-200bp。

表1：

循环数(Duty Cycle)	10％
		峰值入射功率(Peak Incident Power)	175瓦
循环数/爆发(Cycles per Burst)	200个
		处理时间(Treatment Time)	300sec
温度(Bath Temperature)	4℃

6.用锥形枪头小心地将破碎后的DNA样本吸到一个新的1.5ml EP管中。

(二)、浓缩

2000rpm，45℃，27-30min，浓缩到小于55.5μl。

(三)、末端修复和加腺苷酸A

1.按如下体系配置末端修复和加A的反应体系：

2.轻柔混匀，瞬时离心，PCR仪上按照如下程序进行反应：

20℃  30min

65℃  30min

4℃   结束。

3.反应结束后立刻放置冰上，立即进入下一步接头连接反应。

(四)、接头的连接

(1)反应体系：

(2)轻柔混匀，瞬时离心。20℃放置15min。

(3)在上述的产物中加入3μl USER酶，充分混匀后，置于PCR仪中37℃反应15min。

(五)、片段选择加接头的DNA(磁珠选择大小后再等体积去除小片段)

(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。

(2)准备干净的1.5ml离心管，写好对应编号，加入16.5μL无RNA酶H₂O(使上步反应终体积为100μL)，再加入57μL(0.6X)重悬的AMPure XP磁珠。

(3)将Adaptor-ligatedDNA产物(83.5μl)加入上步准备好的1.5ml离心管中，枪头混匀，室温孵育5min。

(4)瞬时离心。置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取上清液到另一个干净的1.5ml离心管中(上清勿弃！)，12,000rpm离心3min后置于磁力架上。准备干净的离心管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离心管中(此步磁珠上吸的为大片段DNA，离心帮助去除磁珠，防止文库含大片段)。

(5)加入25μL(0.25X)重悬好的AMPure XP磁珠，并用枪头混匀。室温孵育5min。

(6)磁力架上静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠，此步上清含偏小的片段如接头等，磁珠上吸的为目标片段DNA)。

(7)加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(8)重复步骤7一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(9)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。

(10)加入52μL无RNA酶H₂O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

(11)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μL涡旋混匀好的AMPure XP

磁珠。吸取上步50μL上清至对应AMPure XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。于磁力架上静置5min，小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(12)加入200μL 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(13)重复步骤12一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(14)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。

(15)加入22.5μL无RNA酶H₂O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μl枪头小心吸取21μl上清至干净的PCR管内。

(16)取1μl进行Qubit定量。将浓度低于0.2ng/μl的标注。用后的Qubit管置于黑暗处备用。

(六)、USER酶消化和PCR富集

(1)在上述产物中加入：

其中，PCR引物1的序列为SEQ ID NO 4：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，PCR引物1为带有标签(index)序列的，其中标签序列为上述引物中的第25位碱基至第30位碱基，即CGTGAT。

PCR引物2的序列为SEQ ID NO 5：

5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’。

(2)轻柔混匀，加index时先在记录本中写下样品对应的index号，加时一人加，一人check，并将人员记录。

PCR仪上进行反应：

*注：当第八步的Qubit浓度低于0.2ng/μl的，扩增循环增至11或12个，记录下不同样品的扩增循环数(扩增过程中注意样品间的平行关系，一般这样的样品扩增循环数保持一致)。

(七)、PCR产物纯化(等体积纯化两次)

(1)涡旋混匀AMPure XP磁珠。

(2)按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入50μL(等体积)重悬好的AMPure XP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

(3)置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(4)加入200μL 80％乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(5)重复步骤4一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(6)敞开盖子X min让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥。

(7)加入52μL无RNA酶H₂O，涡旋混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

(8)准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μL涡旋混匀好的AMPure XP磁珠。吸取上步50μL上清至对应AMPure XP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静置5min。于磁力架上小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

(9)加入200μL 80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。

(10)重复步骤9一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

(11)室温干燥X min让乙醇尽量挥发干净。

(12)加入22.5μL无RNA酶H₂O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL枪头枪头小心吸取21μl上清至干净的离心管内；当第八步的Qubit浓度低于0.2ng/μl的，最后文库溶于12μl无RNA酶H₂O中，吸出10μl上清至干净的离心管内。

(13)取1μl进行Qubit定量。记下文库浓度，写上文库编号。准备干净的0.5ml离心管，写好对应文库编号，取1μl文库按照Qubit浓度稀释至1.5-2ng/μl，交至上机组做库检。

将检测合格样品取100ng用NEB Next Ultra试剂盒建库，库检合格后上机测序。

对测序后的数据进行处理，并对测序数据的有效量和测序质量进行了检测，检测结果见表2。

表2：

从表2中可以看出，利用本发明的转录组文库构建方法，不仅实现了微量样本的转录组文库的构建，而且取得了所构建得到文库测序后所得的数据的有效量高达73.27～78.84％，碱基的测序错误率低至0.03％～0.05％的预料不到的技术效果。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的上述构建方法利用Trizol方法对微量细胞提取RNA，用莫洛尼鼠白血病毒逆转录酶(MMLVRT)将提取的总RNA样品中的mRNA进行反转录，在cDNA的两端加上锚定序列，然后利用锚定序列进行PCR扩增，安捷伦2100对扩增产物进行检测，判断样品是否存在污染或降解情况，完成质控检测。将检测合格样品用于后续建库，实现了微量细胞转录组测序文库构建。该方法具有良好的再现性、准确性。

本发明的上述构建方法实现了微量细胞转录组文库的构建，具有以下优点：

1.可以很好的处理低起始量的细胞样品，为微量细胞转录组文库构建提供了一个简单有效的解决方案。

2.通过此方法扩增后对样品进行质控，快速准确，同时具有高通量的能力。

3.本方法还适用于微量降解或污染的样品。微量污染或降解如果对后续的信息分析影响不大，需要建库，该方法也可以完成此类样品建库。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种转录组文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA；

对所述双链cDNA进行扩增，得到扩增cDNA；以及

利用所述扩增cDNA进行片段化文库构建，得到所述转录组文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用Oligo dT引物和所述MMLV逆转录酶将所述待测样本的总RNA中的所述mRNA逆转录成所述双链cDNA。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述待测样本的所述总RNA的量小于5ng。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述MMLV逆转录酶为重组MMLV逆转录酶，所述重组MMLV逆转录酶为SMARTScribe^TM逆转录酶、IV逆转录酶或III逆转录酶。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述以待测样本的总RNA为模板，利用MMLV逆转录酶进行逆转录，得到总RNA中的mRNA的双链cDNA的步骤包括：

步骤S1，利用MMLV逆转录酶对所述总RNA中的所述mRNA进行逆转录，得到第一链cDNA；以及

步骤S2，以所述第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，得到所述双链cDNA。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，

在所述步骤S1和步骤S2之间，还包括对所述第一链cDNA进行磁珠纯化的步骤；以及

在所述步骤S2之后，还包括对所述双链cDNA进行磁珠纯化的步骤。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述磁珠纯化步骤中，所述磁珠为SPRIAmpure XP磁珠。

8.根据权利要求6或7所述的构建方法，其特征在于，在对所述双链cDNA进行磁珠纯化的步骤后，还包括对所述双链cDNA的长度和浓度进行检测的步骤。

9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述利用扩增cDNA进行片段化文库构建，得到所述转录组文库的步骤包括：

对所述扩增cDNA进行片段化，得到片段化DNA；

对所述片段化DNA进行末端修复加A，得到修复DNA；

对所述修复DNA进行接头连接，得到含有带接头DNA和不带接头DNA的混合物；

对所述混合物中的带接头DNA进行分离，得到带接头的DNA；

对所述带接头的DNA进行USER酶消化，得到消化DNA；以及

对所述消化DNA进行富集，得到所述转录组文库。

10.一种转录组文库，其特征在于，所述转录组文库采用权利要求1至9中任一项所述的构建方法构建而成。