CN111363796B - 使用超低量总rna的多文库混样测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，属于生物技术和分子生物学领域，具体包括以下步骤：微量样本总RNA的提取、起始总RNA的反转录和扩增富集、测序库的建立、利用MinlON纳米孔测序仪进行cDNA测序。本发明提供的测序方法所需最低起始量的样本核酸量可低至10pg‑10ng，相当于1‑1000个单细胞的核酸量，能够实现那些获取大量总RNA困难的稀有样本测序，在稀有样本和特殊样本等多个测序领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和分子生物学领域，尤其涉及一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法。
背景技术
目前，以Illumina为代表的第二代测序平台测得的短读长仅能覆盖转录本的长度，且存在难以实现依赖计算重构准确的异构体等缺陷，因此纳米孔测序技术，又称第三代或第四代测序技术应运而生。使用纳米孔测序技术不仅没有读长上限的限制，还能实现对整个转录本进行单读长的端到端测序，真正实现了简单、准确的组装并能对高度相似的异构体进行区分，所以新一代的纳米孔测序技术已经成为研究RNA测序的一种新的且更为有效的方式。
目前，RNA测序技术对样本的起始RNA量要求较高，对于那些无法达到最低上样量的样本是无法进行测序分析的，但在许多情况下，例如在生殖发育生物学、干细胞、癌症、考古学、临床诊断等多个研究领域中，都无法获得足够上样数量的总RNA。因为上述研究中均涉及微量且稀有的样本，无法满足目前RNA测序技术中对起始RNA量的需求，这无疑成为阻碍RNA测序这项新技术的进一步应用与发展，因此，本领域迫切需要在传统RNA测序方法的技术之上建立一种针对微量样本的RNA测序方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，该测序方法是将超低量总RNA反转录成cDNA，并将cDNA扩增后连接上不同的条码，然后利用MinlON进行测序，该方法不仅能对低于1ng的总RNA进行测序，还可将不同的总RNA混合在一起共同测序。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；
将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；
利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。
作为优选，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。
作为优选，所述测序库的建立具体包括以下步骤：
利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；
在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；
将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；
利用磁珠纯化、回收所述测序连接接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量≥100ng时，建立得到测序库。
作为优选，所述末端修复反应的反应体系为：扩增富集后的cDNA50μl、反应缓冲液7μl、末端修复酶3μl，共计60μl；反应条件为：在20℃条件下反应30min，然后在65℃条件下反应30min。
作为优选，所述第一次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。
作为优选，所述第一次连接反应的反应体系为：
利用末端修复酶处理所述cDNA反应结束后，向该反应体系中加入连接预混液30μl、条码2.5μl、连接增强剂1μl和无酶水6.5μl，共计100μl。
作为优选，所述第二次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。
作为优选，所述第二次连接反应的反应体系为：
所述纯化后的条码-末端修复cDNA 65μl、测序接头预混液5μl、连接反应缓冲液20μl和DNA连接酶10μl，共计100μl。
作为优选，利用Qubit DNA HS Assay检测纯化后的条码-末端修复cDNA和纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA的回收量。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
本发明提供的使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，有以下优点：(1)对样品的需求量小，仅需要10pg-10ng的起始总RNA，相当于1个至1000个细胞的总RNA，能够实现那些难以获得大量总RNA的稀有样本的测序工作；(2)可将不同的总RNA混合在一起进行测序工作。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的流程图；
图2为本发明实施例所提供的扩增后cDNA质量和浓度检测图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；
将起始总RNA的进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；
利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序。
在一优选实施例中，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。
在一优选实施例中，所述测序库的建立具体包括以下步骤：
利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；
在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；
将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；
利用磁珠纯化、回收所述连接测序接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量≥100ng时，建立得到测序库。
在一优选实施例中，所述末端修复反应的反应体系为：扩增富集后的cDNA 50μl、反应缓冲液7μl、末端修复酶3μl，共计60μl；反应条件为：在20℃条件下反应30min，然后在65℃条件下反应30min。
在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。
在一优选实施例中，所述第一次连接反应的反应体系为：
利用末端修复酶处理所述cDNA反应结束后，向该反应体系中加入连接预混液30μl、条码2.5μl、连接增强剂1μl和无酶水6.5μl，共计100μl。
在一优选实施例中，所述第二次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。
在一优选实施例中，所述第二次连接反应的反应体系为：
所述纯化后的条码-末端修复cDNA 65μl、测序接头预混液5μl、连接反应缓冲液20μl和DNA连接酶10μl，共计100μl。
在一优选实施例中，利用Qubit DNA HS Assay检测纯化后的条码-末端修复cDNA和纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA的回收量。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1：微量样本总RNA的提取、反转录和扩增富集
本次实验选用的样本为60粒老鼠的卵母细胞，具体测序步骤如下：
S1、微量样本总RNA的提取：
使用PicoPureTM RNA Isolation Kit(ThermoFisher Scientific)提取六十粒细胞的总RNA，将总RNA重悬于30μl无酶水中；
S2、起始总RNA的反转录和扩增富集：
分别取2μl，5μl和9.5μl的总RNA，相当于4个，10个和19个卵母细胞，使用SMART-Seq v4 Ultra Low RNA试剂盒(Takara)，按照厂家的指示，对不同起始量的总RNA进行反转录和扩增。cDNA的扩增使用了18个PCR循环。使用Agilent D5000 Screen Tape对扩增的cDNA进行浓度和质量检测，检测结果如表1和图2所示。
表1 总RNA的反转录和扩增结果
| 总RNA(μl) | 相对应细胞数量(个) | PCR循环数 | cDNA总量(ng) |
| 2 | 4 | 18 | 1990(cDNA-1) |
| 5 | 10 | 18 | 2530(cDNA-2) |
| 9.5 | 19 | 18 | 3010(cDNA-3) |
实施例2：测序库的建立及测序
利用实施例1反转录和扩增反应得到的cDNA进行后续的测序库的建立工作，具体操作如下：
(1)向0.2ml的PCR试管中依次添加50μl扩增后的cDNA(750ng-800ng，不足的体积可以用无酶水补齐)、7μl反应缓冲液、3μl末端修复酶，共计60μl，混匀并离心后，将盛有上述样品和试剂的PCR试管放入PCR仪中20℃反应30min后，65℃反应30min，得到末端修复cDNA；
(2)待上述反应结束后，将PCR试管从PCR仪中取出，置于冰上，并向其中加入30μl连接预混液、2.5μl条码、1μl连接增强剂、6.5μl无酶水，共计100μl，混匀并离心后，放入PCR仪中20℃条件下反应1h，得到条码-末端修复cDNA；
(3)将磁珠从4℃条件下转至室温条件下预热30min；
(4)将装有100μl样品和试剂的PCR试管从PCR仪中取出后，将PCR试管内的样品和试剂全部转至另一干净的1.5ml试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一，然后向盛有100μl样品和试剂的1.5ml试管中加入100μl的磁珠溶液，吹打10次以混匀混合液后，室温下静置5min；
(5)利用无水乙醇和超纯水配置80％的酒精；
(6)待静置结束后，将试管放置于磁力架上分离磁珠，静置至少5min，直至上清完全澄清后，移弃上清；
(7)然后向移弃上清后的试管中加入所述80％酒精100μl，室温静置至少30s，然后移弃上清后，重复该步骤一次；
(8)将重复上述步骤后的试管放置于所述磁力架上，室温静置5min，挥发残留的酒精后，从所述磁力架上取走试管，然后向试管中加入21μl的H2O重悬吹打或振荡混匀磁珠后，室温放置5min，然后将其放置于磁力架上，待溶液澄清后，将试管内的全部试剂转移至又一洁净的1.5ml试管中，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，然后取出1μl的cDNA利用Qubit DNA HS Assay检测cDNA的回收量，结果如表2所示；
(9)取一个洁净PCR试管，并向其中加入65μl混合的纯化后的条码-末端修复cDNA、5μl测序接头预混液、20μl连接反应缓冲液和10μl的DNA连接酶，共计100μl，混匀并离心后，将其放入PCR仪中20℃反应1h；
(10)上述反应结束后，将PCR试管中共计100μl的样品和试剂转入1.5ml试管中，涡旋混匀至磁珠悬液颜色均一后，向盛有100μl样品和试剂的1.5ml试管中加入50μl的预热在室温的磁珠溶液，吹打10次以混匀溶液，然后于室温静置5min，然后将试管放置于磁力架上分离磁珠，静置5min，直至上清完全澄清，并移弃上清；
(11)再向上述移弃上清后的试管中加入250μl的S Fragment Buffer(SFB)，吹打10次混匀溶液后，放置于磁力架上分离磁珠，然后重复该步骤一次，然后将试管离心后放置于磁力架上，移除残留的S Fragment Buffer(SFB)，室温下静置30s；
(12)静置结束后，从磁力架上移走试管，加入15μl的Elution Buffer(EB)重悬吹打或振荡混匀磁珠，室温放置10min，然后将试管转至磁力架上，待溶液澄清后，将试管中的样品和试剂转移至另一1.5ml试管中，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并取出1μl的cDNA利用Qubit DNAHS Assay检测cDNA的回收量，(本次实验共回收了402ng的cDNA)。
(13)利用MinlON纳米孔测序仪进行cDNA测序，并对测序结果进行数据分析，结果如表3-5所示。
表2 总RNA的反转录和扩增结果
表3 cDNA-1相当于4个卵母细胞样品的测序结果
表4 cDNA-2相当于10个卵母细胞样品的测序结果
表5 cDNA-3相当于19个卵母细胞样品的测序结果
通过对比表3-5中的数据我们可以看出，随着起始总RNA量的增加，以及相对应的细胞数目的增加，比对到编码蛋白基因的读数，长链非编码RNA的读数均有增加，同时检测到的转录体数目也显著增加。同时，上述数据与起始RNA量没有线性关系的数值，比如总读数，比对到hg38的读数，最长读数，读数长度的中间值等都没有明显变化。这些都和我们的预想是一致的，这说明此方法产生的读数是可信赖的。
为了验证本发明提供的测序方法的重复性，又对12个老鼠的胚胎单细胞和多细胞进行了测序，具体测序结果如下表所示(表6-7)：
表6 12个老鼠单细胞的条码编号和回收cDNA量
注：由于安捷伦和Qubit两种测定方法之间存在一定的检测差异，导致回收cDNA多过起始的cDNA。
表7 12个老鼠胚胎单细胞和多细胞的测序结果
此次测序的中途发生了测序错误，导致读数过低，所以我们对剩余的已经连接条码的cDNA进行了第二次测序，测序结果如下表所示(表8)。
表8 剩余样品(12个老鼠单细胞)第二次测序结果
注：老鼠卵母细胞4，由于cDNA在保存过程中丢失了，所以只得到很低的读数。
为了验证实验的可重复性以及稳定性，我们对另外12个新的老鼠胚胎单细胞和多细胞再次进行了测序，结果如表9-10。
表9 第二批12个老鼠胚胎单细胞和多细胞的条码编号和回收cDNA量
表10 新一批12个老鼠胚胎单细胞和多细胞测序结果
通过对比表6-10，老鼠卵母细胞以及不同阶段的胚胎细胞的测序结果说明，即使我们降低了起始cDNA的量(从100ng到80ng)以及混合cDNA的量(从100ng到55ng)，最终的测序结果并没有太大的变化，这说明本发明提供的测序方法是可靠的，可重复的以及稳定的。
Claims (8)
1.基于非诊断目的的使用超低量总RNA的多文库混样测序方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提取微量样本总RNA，将提取的样本总RNA作为起始总RNA，其中所述起始总RNA的核酸量为10pg-10ng；
将起始总RNA进行反转录和扩增富集，并对扩增富集后的cDNA进行浓度和质量检测，至cDNA的含量达到50-1000ng；
利用扩增富集后cDNA建立测序库，然后将所述测序库作为待测样品，并用MinlON纳米孔测序仪进行测序；
其中，所述建立测序库，具体包括以下步骤：
利用末端修复酶处理所述cDNA，通过末端修复反应，得到末端修复cDNA；
在所述末端修复cDNA上通过第一次连接反应连接不同条码，得到条码-末端修复cDNA后，利用磁珠纯化、回收所述条码-末端修复cDNA，得到纯化后的条码-末端修复cDNA，至检测其回收量≥50ng；
将纯化并检测后的条码-末端修复cDNA混合后，在连接酶的作用下，通过第二次连接反应与测序接头连接，得到连接测序接头的条码-末端修复cDNA；
利用磁珠纯化、回收所述连接测序接头的条码-末端修复cDNA，得到纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA，并检测其回收量≥100ng时，建立得到测序库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微量样本包括单细胞检测样本和多细胞检测样本。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述末端修复反应的反应体系为：扩增富集后的cDNA50μl、反应缓冲液7μl、末端修复酶3μl，共计60μl；反应条件为：在20℃条件下反应30min，然后在65℃条件下反应30min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一次连接反应的反应体系为：
利用末端修复酶处理所述cDNA反应结束后，向该反应体系中加入连接预混液30μl、条码2.5μl、连接增强剂1μl和无酶水6.5μl，共计100μl。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二次连接连接反应的反应条件为20℃条件下反应1-2h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二次连接连接反应的反应体系为：
所述纯化后的条码-末端修复cDNA65μl、测序接头预混液5μl、连接反应缓冲液20μl和DNA连接酶10μl，共计100μl。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Qubit DNAHS Assay检测纯化后的条码-末端修复cDNA和纯化后的连接测序接头的条码-末端修复cDNA的回收量。
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