发明内容
本发明要解决的核心问题是寻求一种能够改善测序,尤其二代测序混样均匀性的定量混样方法。为解决上述问题,本发明进行大量优化开发,最终惊奇的发现,出库的文库通过热变性处理,能改变文库中的特殊结构,但不影响文库的整理质量,再使用QubitssDNA/dsDNA检测试剂盒进行定量,尤其使用Qubit dsDNA检测试剂盒,处理后的定量结果能够显著改善文库定量的均一性。同时热变性耗时短,对操作人员的技术水平要求相对较低,操作极其简单。
具体的本发明提出如下技术方案:
本发明首先提供一种测序文库的定量方法,所述方法包括:
步骤1)对测序文库进行热变性处理;
进一步的,所述步骤1)中的热变性处理后再进行冰上静止处理。
进一步的,所述步骤1)中的热变性处理为80-99℃高温处理后2-4min,瞬时离心,立即冰上静置3-5min。
在一些优选的实施方式中,所述步骤1)中的热变性处理为80-99℃处理2min,瞬时离心,冰上静置5min。
进一步的,所述步骤2)中的
荧光定量方法为基于Qubit dsDNA或QubitssDNA检测试剂盒进行定量;优选的,为基于Qubit dsDNA检测试剂盒进行定量。
进一步的,上述测序为一代测序、二代测序或三代测序;优选的,所述测序为NGS二代测序。
更进一步的,所述测序文库为宏基因组测序文库。
本发明还提供一种改善测序混样均匀性的定量混样方法,所述方法包含上述定量方法,并进一步包括混样处理步骤。
本发明还提供一种测序文库构建方法,包括常规测序文库构建步骤,还包括上述的定量或定量混样方法。
本发明还提供一种测序文库构定量混样剂盒,包含Qubit dsDNA检测试剂盒基础组分,以及实施热变性处理的材料组分,比如耐热管等。
本发明还提供一种上述方法在宏基因组测序中的应用,或者在感染领域测序中的应用,或感染领域检测中的应用等。
本发明有益技术效果:
1、本发明通过对文库进行高温温度预处理,并瞬时离心和冰上静置后,可以有效地解决文库DNA特殊结构对Qubit ssDNA/dsDNA检测试剂盒对浓度检测的影响。
2、本发明的定量混样方法能够改善二代测序混样均匀性,能准确均一化文库的浓度,产出数据量更为均一,使数据利用率更高。
3、本发明出乎意料的是,通过高温变性预处理后与Qubit dsDNA检测试剂盒配合使用,效果同样显著,相比于Qubit ssDNA检测,采用Qubit dsDNA检测成本更低,方法更简单,具有非常大的推广使用价值。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规产品。
部分术语定义
除非在下文中另有定义,本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解,但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用,术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的,且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案,这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”,“所述”,包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10%,优选±5%。
此外,说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类,是用于区分相似的元素,不是描述顺序或时间次序必须的。应理解,如此应用的术语在适当的环境下可互换,并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明中的术语“dsDNA”与“ssDNA”分别代表双链DNA和单链DNA。
以上术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
本发明中的“测序文库的定量方法”大体上包括:步骤1)对测序文库进行热变性处理;步骤2)采用
荧光定量试剂盒进行定量;所述步骤1)中的热变性处理后再进行冰上静止处理;优选的,所述步骤1)中的热变性处理为80-99℃高温处理后2-4min,瞬时离心,立即冰上静置3-5min;所述步骤2)中的
荧光定量方法可以为基于Qubit dsDNA检测试剂盒或Qubit ssDNA检测试剂盒进行定量;优选的,为基于Qubit dsDNA检测试剂盒进行定量混样。
本发明中的“改善测序混样均匀性的定量混样方法”大体上是包括了对测序文库进行热变性处理步骤;和采用
荧光定量试剂盒进行定量的步骤。基于本发明的核心思想可知,所述热变性可以是本领域任意手段的热变性,不作限制。比如该热变性处理可以是本发明实施例中具体的80-99℃高温处理,在一些实施方式中,所述高温处理后再进行冰上静止处理。
在一些优选的实施方式中,所述的热变性处理为80-99℃高温处理2-4min后,瞬时离心,立即冰上静置3-5min。在另一些更优选的实施方式中,所述热变性处理可以为80-99℃处理2后,瞬时离心,冰上静置5min。
本发明的
荧光定量可以为基于Qubit dsDNA或Qubit ssDNA检测试剂盒进行定量混样;在优选的实施方式中,本发明更强调的是基于Qubit dsDNA检测试剂盒进行定量混样。
本领域可以理解,本发明方式可以针对的测序文库包括一代测序、二代测序或三代测序;在一些优选的实施方式中,所述测序为NGS二代测序。而所述测序可以是各种类型的基因测序,比如宏基因组测序等。
在确立本发明上述方法后,可以理解本发明可进一步包括诸如:测序文库定量方法、测序文库构建方法等多种主题的方法,只要其包含了本发明的核心步骤1和2,都属于本发明的保护范畴。
下面结合具体实施例来阐述本发明。
实施例1本发明设计开发
本发明所使用实验材料:
Qubit dsDNA检测试剂盒,又称QubitTM双链DNA高灵敏度荧光定量试剂盒,购自InvitrogenTM公司,货号Q32854;Qubit ssDNA检测试剂盒购自InvitrogenTM公司,货号Q10212;0.5ml PCR薄壁管购自Axygen公司,型号MCT-060-C;0.2ml PCR八连排管购自Axygen公司,型号PCR-0208-C等。
本实施例依据华大测序平台分析原始文库及原始数据,来设计本发明技术方案。
一、现有文库定量混样方法的问题分析
在临床使用原始qubit定量方法进行文库浓度定量混样,上机测序后,发现同一芯片的文库产出数据量的均一性极度不好,使得有的文库数据量产出过多,而有的文库产出数据量产出过低从而导致无法准确解读病原。所以本发明将寻找这些产出数据量异常高、以及产出正常的文库来进行测试。
使用Qubit测不同类型文库的dsDNA浓度,试验编号Q10、Q3、Q8、Q18、Q4、Q2为去宿主DNA文库,去宿主后文库质量有所下降,使用Qubit试剂难以准确测量文库浓度,最终按照所测浓度等质量比例进行混样测序,排机量均为50M,导致数据产出差异极大,产出比例的极差值到达4.4,同理实验编号R6、R2、R4、R3、R5、R4、R1为gDNA消化的RNA文库,产出比例的极差值到达2.49,整RUN的CV值高达63%,结果下表1所示,此结果将导致文库因数据量产出低而无法准确解读病原。
表1
二、数据产出不均匀定量分析
使用文库定量方法金标准QPCR法,对数据量产出极不均匀的文库进行QPCR定量分析,QPCR定量结果显示,Qubit定量存在极大的局限性,即Qubit对文库无法准确测定其浓度,原因分析可能为Qubit定量试剂无法测定有特殊结构的文库,结果如下表2所示:
表2
三、对文库进行热变性处理(80℃,99℃,)2min,冰上处理5min,分析处理后Qubit定量结果与QPCR的相关性。
本实验尝试对文库进行热变性处理,使用Qubit测定dsDNA与ssDNA的浓度,分析处理后的Qubit浓度与QPCR定量结果间的相关性。具体结果如下表3所示,高温变性处理后,ssDNA与dsDNA的定量结果与QPCR的定量结果均有极高的相关性;而变性前结果与QPCR的结果相关性极差;另外,在80-99℃区间范围内进行热变性,均保持高相关性,可以实现文库结构的有效改变。
表3、注:表格中dsDNA浓度单位为ng/ul
四、文库热变性不同处理时间的dsDNA浓度分析
本发明选取临床构建好的3个DNA文库进行95℃热变性,热处理时间分别为2、3、4min,瞬时离心,冰上冷却时间分别为,立即冰上分别静置3,4,5min。统计共10组dsDNA浓度,各组数据分别与热变性2min/冰冷却5min做皮尔森相关性分析(见图1)。统计发现原文库dsDNA浓度与热变性2min/冰冷却5min的相关系数为0.633,其余相关系数均大于93%。根据此实验结果,本发明可以得出热变性温度范围80-99℃,变性时间范围2-4min,冰上处理时间范围3-5min都是本发明可选范围。
五、dsDNA和ssDNA浓度的相关性分析
本发明使用Qubit测不同类型文库的dsDNA和ssDNA浓度,以及热变性后测dsDNA和ssDNA浓度,统计dsDNA和ssDNA浓度的内在联系。
本发明选择若干临床已经构建好的文库,测定其ssDNA、dsDNA浓度作为原始浓度,并计算其比值(如表4)。进一步根据原dsDNA浓度分别取文库20ng,加无核酸酶水至15μl,震荡混匀后再次测定其ssDNA、dsDNA浓度并计算其比值(如表5)。
表4文库原浓度
表5文库稀释后浓度
随后取4μl稀释后的文库进行热变性处理,之后统计文库热变性后的ssDNA、dsDNA浓度并计算其比值(表6)。通过比较此3组ssDNA、dsDNA浓度比值发现,其CV值均处于较低水平(表7),说明文库变性前后ssDNA、dsDNA浓度比值会分别稳定在某一水平;通过相关性分析发现文库热变性前dsDNA与ssDNA的相关性系数为0.947,文库热变性后dsDNA与ssDNA的相关性系数为0.965,说明dsDNA与ssDNA存在着极强的相关性(表8)。
基于此,本发明在后续试验中将文库热变性前和热变性后测dsDNA浓度来代替ssDNA浓度,由此使用Qubit dsDNA试剂取代Qubit ssDNA试剂,由此可显著降低生产成本。
表6文库热变性后浓度
表7 ssDNA/dsDNA比值CV分析
表8 dsDNA与ssDNA相关性分析分析
实施例2基于热变性后pooling上机产出比较
一、文库筛选
从华大测序平台下机的数据中,分别选取3个产出效率高的去宿主文库;选取3个产出效率正常的去宿主文库;选取3个产出效率高的非去宿主文库;选取3个产出效率正常的非去宿主文库;选取3个产出效率高的gDNA消化的RNA文库;选取3个产出效率正常的gDNA消化的RNA文库共18个文库(12个DNA文库,6个RNA文库),文库全部为华大平台建库方式,且index接头序号没有重复,具体见图2。
二、文库处理方法
1.文库不做任何处理,进行dsDNA定量,作为阴性对照。
2.热变性方法:80-99℃范围内温度处理2min,瞬时离心,冰上静置5min,进行ssDNA定量混样。
3.热变性方法:80-99℃范围内温度处理2min,瞬时离心,冰上静置5min,进行dsDNA定量混样。
4.QPCR定量方法:
文库稀释:按照2+98稀释50倍;2+198稀释100倍;共稀释5000倍。
QPCR体系:
反应程序:
三、混样
1.选取的原文库使用重新dsDNA定量结果按照1:1进行混样(如下表9),命名pooling1(未做任何处理,作为阴性对照);
表9
2.热变性方法:80-99℃范围内温度处理2-4min,瞬时离心,冰上静置3-5min;对选取的文库进行吸取5ul进行热变性,199+1进行ssDNA定量混样(如下表10),命名pooling2。
表10
3.对选取的热变性后的文库,199+4测dsDNA浓度,使用该dsDNA浓度对原文库进行混样(如下表11),命名pooling3。
表11
4.qPCR混样:
a)对选取的文库,用MGI通用引物,SYBR green体系,做qPCR定量;
b)标准曲线制备:取峰尖、qubit浓度10ng/ul以上的MGI文库一个,使用EB做10倍梯度稀释,共5个梯度,S1,S2,S3,S4,S5;定义浓度分别为:20pmol,2Pmol,0.2pmol,0.02pmol,0.002pmol,MGI通用引物,SYBR green体系,做标准曲线;
c)待测样本制备:待测样本按照使用EB按照5000倍稀释,进行QPCR定量;
d)QPCR结果处理:计算待测样本的QPCR浓度;
e)按照QPCR浓度进行文库的混样(如下表12),命名pooling4。
表12
四、结果分析
对四个混样进行MGI平台大芯片FCL的上机;上机使用手持加载方式,保证每条lane一个混样,分析每条lane下机后的混样均匀性等。
1.均一性CV分析
表13为4条lane pooling1、pooling2、pooling3、pooling4下机的Raw Reads数据,通过计算整条及不同类型文库CV值(表14)可知:整RUN混样CV中,QPCR处理的最低,说明均一性最好;热变性后分别通过ssDNA和dsDNA混样后产出数据整体较为接近;热变性处理的产出数据CV低于未处理的;QPCR处理后的去宿主文库和gDNA消化的文库CV均要好于变性处理和未处理的,热变性处理后的去宿主文库CV显著低于未处理的去宿主文库的CV,改善效果明显。
表13
表14
2.不同处理相关性分析
通过CV分析可知qPCR定量结果是效果最好的方式,反推其文库浓度定量则为准确性最高,通过分析热变性处理和未处理qubit定量与QPCR结果的相关性分析发现,热变性后的ssDNA和dsDNA的qubit结果最接近于QPCR结果,结果显著好于未处理文库;且热变性后的ssDNA和dsDNA的qubit浓度相关性较为接近,由此也可得出热变性的dsDNA浓度可代替ssDNA浓度(如下表15),该实验结果超出实验预期。
表15
最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。