KR20110138341A

KR20110138341A - 비암호화 ｒｎａ 발현 검정법을 이용한 방법

Info

Publication number: KR20110138341A
Application number: KR1020117019196A
Authority: KR
Inventors: 재신토 피터 에스티바이로; 존 프란시스 고든; 크리스토퍼 로버트 힐리어; 빈센트 오브리언
Original assignee: 시스테믹 스코틀랜드 리미티드
Priority date: 2009-01-19
Filing date: 2010-01-19
Publication date: 2011-12-27
Also published as: EP2492357B1; EP2387617B1; US20110312524A1; CA2787218A1; SG196843A1; IL214154A; AU2010205493A1; US9074241B2; JP2012514994A; US20160002722A1; EP2387617A1; CN102356163A; WO2010082039A1; EP2492357A1; SG173042A1; IL214154A0; US20170058346A1

Abstract

본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하는 방법을 개시한다: 다수의 발현 검정법을 수행하는 단계로서, 여기서 각 발현 검정법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것인 단계: 생물계를 대상으로 개입 수단을 적용하는 단계, 상기 개입 수단에 의해 영향을 받은 생물계 내 비암호화 RNA의 발현 프로필을 측정하는 단계, 및 측정된 발현 프로필로부터 유래하는 발현 데이터 세트를 저장하는 단계(상기 발현 검정법은 다수의 상이한 개입 수단과 다수의 상이한 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다와 관련된 것임); 및 결과로 얻어진 발현 데이터 세트를 분석하여, 상이한 개입 수단 또는 상이한 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다와 관련된 2개 이상의 발현 검정법으로 이루어진 군 내 각각의 개입 수단의 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계를 측정하는 단계.

Description

비암호화 ＲＮＡ 발현 검정법을 이용한 방법{METHODS EMPLOYING NON-CODING RNA EXPRESSION ASSAYS}

본 발명은 비암호화 RNA 발현 검정법을 이용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 구체예는 이에 한정되지 않으나, 예를 들어 2개 이상의 개입 수단이 생물계에 효과를 미치는 기작 간 유사성을 측정하는 것, 테스트 제제의 치료상 사용 가능한 용도를 식별하는 것, 그리고 하나 이상의 징후와 관련하여, 이전에 임상 실험 대상이 되었던 치료제의 신규 용도를 식별하는 것을 포함하는 여러 가지 문제점을 다루고 있다.

지금부터, 본 발명과 관련된 문제는 마이크로 RNA(miRNA) 발현 검정법의 용도를 참고로 하여 논의될 것이지만, 본 발명은 기타 비암호화 RNA 분자와 관련된 발현 검정법을 이용할 수도 있다.

miRNA는 길이가 약 21~23 뉴클레오티드인 단일 사슬 RNA 분자이다. miRNA는 1993년 빅터 앰브로스(Victor Ambros)에 의해 처음 기술되었으며, 그 후로 miRNA를 주제로 한 논문이 2,000편 이상 발표되었다. 일각에서는 miRNA가 수 만개에 이른다고 추정하고 있지만, 사람에 있어서는 약 1,000개의 miRNA가 존재할 것으로 추정되며, 이것들 중 약 600개는 현재 이미 실험에 의해 규명되어 업계에 개시되었다. 그러나, 다양한 사람 및 설치류 조직 및 세포주 내 miRNA 발현 지도를 작성하고자 시도했던 최근 보고서에 따르면, 약 300개의 miRNA가 확인된 전체 miRNA 중 97％에 해당한다고 한다.

miRNA는 단백질로 번역되지 않는 대신에, 하나 이상의 다른 유전자의 발현을 조절한다. 현재 밝혀진 생물학적 연구 결과에 따르면, 마이크로 RNA는 특정한 개별 메신저 RNA(mRNA) 또는 mRNA 군을 표적화하여 이것들이 번역되는 것을 막고, 드물게는 mRNA 분해를 가속화한다고 한다. 성숙한 단일 사슬 miRNA 분자는 RNA 유도 침묵 복합(RNA-Induced Silencing Complex; RISC) 단백질과 복합체를 형성한 후, 표적 유전자로부터 단백질을 암호화하는 mRNA의 3' 비번역 영역(3'-UTR) 내 부분적으로 상보성인 서열과 결합한다. 또 다른 단백질도 보충되어 침묵 복합체를 형성하며, mRNA의 번역을 차단하는 기작에 의해 표적 유전자 산물의 발현은 억제된다.

miRNA의 생물학적 특성과 침묵 복합체의 조성 및 작용 기작에 관하여 규명해야 할 것들이 아직 많이 남아있지만, miRNA가 다수 유전자의 조절과 관련되어 있다는 사실은 분명하다. miRNA는 번역 단계에서 모든 유전자의 30％를 조절하는 것으로 생각된다[Xie et al, 2005]. miRNA는 다수의 유전자를 조절할 수 있으며, 각 유전자도 다수의 miRNA에 의해 조절될 수 있다. miRNA의 조직 특이적 발현은 세포가 분화하고/분화하거나 조직의 일체성을 적극적으로 유지하는데 기여하도록 유도하는 것으로 생각된다. 이와 같이 광범위하게 미치는 영향력과 상이한 miRNA 간 상호 작용을 통하여, 단일 miRNA 또는 이 miRNA의 소규모 하위 세트 발현의 조절을 해제하면 질병의 징후가 복합적으로 나타날 수 있음을 알 수 있을 것이다(Lim et al, 2005, Nature). 알려진 사람 miRNA 중 50％ 초과는 암 세포에서 변형되기 쉬운 게놈 영역에 존재한다(Calin et al, 2004 PNAS, 101, 299-3004). 그다지 놀라운 사실은 아니지만, 상기 miRNA의 발현 패턴은 암과 기타 질병 병상에서 바뀌게 된다. 이와 같은 정보는 암을 분류하고 진행 단계를 식별하며, 예후 및 반응에 대한 바이오마커를 밝혀주고, 또한 치료적 개입 수단을 결정하는 중요한 결정 인자를 제공할 뿐만 아니라, 화학 약품 민감성을 설명해 주며, 암 줄기 세포 내 특이적인 miRNA 발현 패턴을 정의할 수 있게 해줌으로써 화학 약품 내성 기작을 규명하는데 이용되기 시작했다.

사용 가능한 신규 치료제를 연구 및 개발하기 위한 miRNA의 적용은 통상적으로 miRNA 발현과 가공 과정이 조절되는 기작과, 특이적인 miRNA가 mRNA 번역을 조절하는 기작을 상세히 분석할 수는 있지만 시간이 많이 소요되었다. 특이적인 약물 표적이 동정되었으며, 이 약물 표적과 관련된 연구가 진행되고 있다. 이러한 연구들이 완전하긴 하지만, 이러한 연구 패러다임은 시간이 소요되는 작업이며 비용도 많이 든다.

그러므로, 본 발명은 특이적인 약물 표적의 개입 작용 기작 또는 이것의 식별 방법을 자세히 이해하지 않아도 되는, 실질적인 개입 수단의 적용을 규명하기 위한 대안적인 방법, 예를 들어 치료제를 투여하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명의 몇몇 구체예는 공지의 치료 물질에 대한 새로운 식별 지표를 결정하거나 테스트 제제의 약리학적 특성, 예를 들어 이 테스트 제제의 독성학적 프로필에 관한 양상을 예측함에 있어서의 문제점을 다루고 있다.

본 발명에 의하면, 다음과 같은 단계를 포함하는 방법이 제공된다:

(1) 다수의 발현 검정법을 수행하는 단계로서, 여기서 각 발현 검정법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것인 단계: 생물계를 대상으로 개입 수단을 적용하는 단계, 상기 개입 수단에 의해 영향을 받은 생물계 내 비암호화 RNA의 발현 프로필을 측정하는 단계, 및 측정된 발현 프로필로부터 유래하는 발현 데이터 세트를 저장하는 단계(상기 발현 검정법은 다수의 상이한 개입 수단과 다수의 상이한 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다와 관련된 것임); 및

(2) 결과로 얻어진 발현 데이터 세트를 분석하여, 상이한 개입 수단 또는 상이한 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다와 관련된 2개 이상의 발현 검정법으로 이루어진 군 내 각각의 개입 수단의 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계를 측정하는 단계.

수행된 개입 수단과 개입 수단이 수행된 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다에 관하여 상이한 2개 이상의 발현 검정법으로 이루어진 군 내 비암호화 RNA의 발현 프로필에 개입 수단이 미치는 효과 간 유사성을 측정하기 위해 발현 데이터 세트를 분석함으로써, 하나 이상의 생물계 내 비암호화 RNA의 발현 프로필에 하나 이상의 개입 수단이 영향을 미치는 기작을 측정할 필요 없이 상관 관계를 측정할 수 있다.

그러므로, 제2 개입 수단이 치료학적으로 관련성이 있는 것으로 알려진 제1 개입 수단에 따른 효과와 상관된 비암호화 RNA의 발현 프로필에 영향을 미치는 것으로 파악되는 경우, 제2 개입 수단은 동일하거나 유사한 치료적 용도에 대한 후보 수단으로서 취급될 수 있다. 여기에는 최소한 몇 가지 가능성 즉, 제1 개입 수단과 제2 개입 수단의 작용 기작이 동일하거나, 유사하거나 또는 관련되어 있을 것이라는 가능성이 있다. 이와 같은 방법은 치료적 개입 수단을 발견하는데 사용되는 공지의 방법과는 상반되는 것으로서, 여기서는 특이 표적(예를 들어, 단백질, 핵산 또는 액체 분자)이 동정 및 분석되고, 표적에 관한 생물학적 특성이 심도있게 연구되며, 표적의 하나 이상의 작용을 조정하는데 적당한 치료적 개입 수단은 합리적이고/합리적이거나 조합하여 행해지는 방법에 의해 개발된다.

상기 개입 수단 중 하나 이상(선택적으로는 전부)은 하나 이상의 테스트 제제를 동시에 또는 연속적으로 생물계에 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 테스트 제제는 화학 물질, 예를 들어 분자량이 2,000 달톤 미만, 1,000 달톤 미만 또는 500 달톤 미만인 분자일 수 있다. 이와 같은 화학 물질은 비중합체일 수 있다. 상기 하나 이상의 테스트 물질은 생물학적 물질, 예를 들어 생물학적 거대 분자, 예를 들어 지질, 올리고뉴클레오티드 또는 단백질(예를 들어, 효소, 항체 또는 항체 단편, 인간화된 항체 또는 항체 단편, 파지 또는 리보좀 전시 단백질 단편, 또는 프리온)일 수 있다. 상기 생물학적 물질은 바이러스나 박테리아일 수 있다. 그러므로, 발현 검정법 중 일부 또는 각각은 생물계 내 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 테스트 제제의 효과를 측정할 수 있다.

상기 테스트 제제 중 하나 이상은 치료제일 수 있다. 상기 테스트 제제 중 하나 이상은 공지의 병태를 치료 또는 예방하는 것으로 알려진 용도를 가지는 치료제일 수 있다. 상기 테스트 제제 중 하나 이상은 하나 이상의 징후와 관련하여, 임상 실험의 대상이 되었던(그 임상 실험이 성공적이었거나 또는 그렇지 않았는지 여부에 상관없음) 치료제일 수 있다. 그러나, 상기 개입 수단 중 하나 이상(선택적으로는 전부)은 다음과 같은 것으로 이루어진 군 중 하나 이상의 생물계로의 적용을 포함할 수 있다: 이온화 방사선, 연속 방사 또는 펄스 전자기 방사선(예를 들어, 가시 광선, 자외선, 적외선), (공기나 액체 매질을 통해서 전달되는) 음향 에너지, 기계적 개입 수단(예를 들어, 압력 부가), 전기, 온도 변화, 삼투압 변화, 성장 배지의 긴장성 또는 pH, 자기장, 유체 역학의 변화, 그리고 기계 화학적 신호 전달. 그러므로, 최소한 몇 가지 개입 수단은 생물계에 유해한 것으로 알려진 개입 수단일 수 있다. 이와 같이 유해한 개입 수단에 의해 영향을 받는 발현 프로필은 유해 효과를 역전시키거나 예방하는 제제를 동정하는데 유용할 수 있다.

상기 생물계 중 하나 이상은 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예를 들어 사람, 토끼, 또는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트) 세포, 또는 배양된 곤충, 양서류 또는 어류 세포주를 포함할 수 있다. 상기 생물계 중 하나 이상은 세포류의 혼합물을 포함할 수 있다. 개입 수단은 통상적으로 배양된 포유동물 세포를 대상으로 적용될 수 있다. 상기 포유동물 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포일 수 있다. 줄기 세포란 자기 재생을 할 수 있고 하나 이상의 다른 특화된 세포류로 분화할 수 있는 세포를 말한다. 그러나, 상기 생물계 중 하나 이상은 전체 유기체, 생체 외 조직, 합성 계 또는 형질 전환된 세포일 수 있다. 상기 생물계 중 하나 이상은 유전자 이식된 것일 수 있다. 배양된 세포는 세포 주기가 동시에(synchronous) 또는 이시에(asynchronous) 진행될 수 있다. 상기 개입 수단 중 하나 이상은 줄기 세포 또는 전구 세포의 분화 또는 탈분화 상태를 바꾸거나, 또는 줄기 세포나 전구 세포를 특화하거나, 특정 세포 계통 또는 분화 단계의 특징을 유지하면서 복제하는 개입 수단일 수 있다.

본 발명의 발현 검정법은 반복 수행될 수 있으며, 분석된 발현 데이터 세트는 균등한 생물계를 대상으로 하는 균등한 개입 수단을 이용하여 실시한 반복 실험 중 일부 또는 전부로부터 편집할 수 있다.

어느 발현 데이터가 발현 데이터 세트에 저장되는지와 관련하여, 비암호화 RNA 하위 세트의 발현 간에는 통상적으로 상관 관계가 존재한다. 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계는 통상적으로 2개 이상의 발현 검정법 사이에서 1개 또는 소수(예를 들어, 2개, 3개, 5개 또는 5개 미만, 10개 또는 10개 미만)의 비암호화 RNA의 발현에 양의 변화 또는 음의 변화를 일으킬 수 있는 상관 관계이다. 양의 상관 관계로서는 상기 2개의 발현 검정법 각각에 있어서 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현이 증가하는 것을 포함할 수 있다. 양의 상관 관계로서는 상기 2개의 발현 검정법 각각에 있어서 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현이 감소하는 것을 포함할 수 있다. 음의 상관 관계로서는 제1 발현 검정법에 있어서 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현이 증가하는 것과 제2 발현 검정법에 있어서 동일한 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현이 감소하는 것을 포함할 수 있다.

각각의 개입 수단에 사용되는 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계를 측정하기 위하여, 본 발명의 방법은 적당한 제어 검정법, 예를 들어 각각의 개입 수단을 적용하지 않는 제어 검정법, 또는 각각의 개입 수단을 적용하기 전에 생물계 내 비암호화 RNA의 발현 프로필을 측정하는 단계를 포함하는 제어 검정법에서, 비암호화 RNA의 발현 프로필을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 발현 검정법 및 이와 상응하는 제어 검정법에 있어서 비암호화 RNA의 발현 프로필 간 차이점을 측정할 수 있다. 저장된 발현 데이터 세트는 측정된 발현 프로필 및 상기 발현 검정법과 상응하는 제어 검정법으로부터 얻은 발현 프로필로부터 얻을 수 있다. 결과로 얻어진 발현 데이터를 분석하는 단계는 제어 검정법에 의해 영향받은 발현 프로필을 고려하는 단계를 포함할 수 있다. 그러나, 몇몇 적용에 있어서는 제어 검정법을 수행할 필요가 없을 것이다. 예를 들어, 만일 다수의 개입 수단이 균등한 생물계를 대상으로 적용되면, 각각의 개입 수단에 사용되는 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계를 측정하기 위해 각각의 발현 검정법을 수행한 결과 얻은 발현 프로필만으로부터 유래하는 데이터 세트를 분석할 필요가 있을 수 있다.

상기 상관 관계 중 최소한 몇 가지, 예를 들어 2개 이상의 발현 검정법으로 이루어진 군에 있어서 각각의 개입 수단에 사용되는 비암호화 RNA의 발현에 대한 효과 간 유사성은 양의 상관 관계일 수 있다. 결과로 얻어진 발현 데이터 세트를 분석하여 상관 관계를 측정하는 단계는, 발현 검정법으로부터 얻어진 발현 데이터 세트 간 유사성을 바탕으로 하여 발현 검정법을 분류(예를 들어, 클러스터링(clustering) 또는 그루핑(grouping))하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같은 단계는 공유 기작 특성을 이해할 필요 없이, 2개 이상의 상이한 개입 수단이 (통상적으로는, 동일하거나 균등한 생물계상에서 발생하는) 비암호화 RNA의 발현 프로필에 직접적으로 또는 간접적으로 효과를 나타내는 기작의 유사성을 확인할 수 있으므로 유리하다.

그러므로, 본 발명의 방법은 2개 이상의 개입 수단이 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현에 대해 유사한 효과를 나타낸다는 것을 규명하는 방법일 수 있다. 제1 개입 수단은 제1 치료상 용도가 하나 이상 공지된 제1 치료 물질을 사용하는 것일 수 있고, 이 방법은 제2 치료 물질을 사용하는 것을 포함하여 제2 개입 수단의 비암호화 RNA 발현에 대한 효과 간에 양의 상관 관계가 있다는 것을 규명하는 방법일 수도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 공지의 치료 물질(제2 치료 물질)을 대상으로 적용 가능한 신규의 치료상 용도(제1 치료상 용도)를 규명하는 방법일 수 있다. 본 발명의 방법은 제2 개입 수단이 상기 공지된 제1 치료상 용도로서 수행되는 치료 방법에 적용할 수 있는지 여부를 테스트하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.

제1 개입 수단은 공지의 제1 치료상 용도로서 사용되지는 않지만, 치료 수단으로서 사용하기 적당한 약리학적 프로필 및 독성학적 프로필을 가지는 것으로 공지된 물질을 사용하는 것일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 독성 실험은 통과하였으나, 임상 실험에서 효능이 확인되지 않은 치료 물질 또는 대조군 치료 물질보다 더욱 효능이 있는 것으로 확인되지 않은 치료 물질의, 적용 가능한 신규의 치료상 용도를 측정하는 방법일 수 있다.

상기 상관 관계 중 최소한 몇 가지는 음의 상관 관계일 수 있는데, 예를 들어 2개 이상의 개입 수단은 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현에 상반되는 효과를 가져다 줄 수 있음을 측정할 수 있다. 유리하게, 제1 개입 수단과 제2 개입 수단에 사용되는 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 사이의 음의 상관 관계를 통하여, 제2 개입 수단이 치료법에 있어서 제2 개입 수단에 따른 효과 중 하나 이상을 역전시키는데 유용할 수 있었음을 알 수 있다. 그러므로, 제1 개입 수단은 생물계에 유해한 효과를 나타내는 것으로 알려진 개입 수단일 수 있는데, 예를 들어 제1 개입 수단은 독소를 사용하는 것일 수 있다. 이와 같은 경우, 본 발명의 방법은 제2 개입 수단이 제1 개입 수단에 의해 유발되는 것으로 알려진 병태를 치료 또는 예방하는데 사용되는 후보 수단이라는 것을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

그러므로, 다수의 개입 수단은 생물계에 유해한 독소 또는 처리를 적용하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 하나 이상의 기타 개입 수단에 의해 유발되는 것으로 알려진 병태를 치료 또는 예방할 수 있는 후보 개입 수단(예를 들어, 후보 치료 물질)을 측정하는 방법의 일환일 수 있다. 본 발명의 방법은 공지된 치료 개입 수단(예를 들어, 치료 물질이나 방사선 요법을 적용하는 것)의 부작용을 치료 또는 예방하는 후보 물질을 측정하는 방법의 일환일 수 있다.

본 발명의 방법은, 예를 들어 제1 개입 수단으로부터 발생하는 비암호화 RNA의 발현 프로필이 생물계에 유해한 효과를 나타내는 것으로 알려진 개입 수단에 의해 영향을 받은 발현 프로필과 양의 상관 관계가 있다거나, 또는 제제를 투여하는 것을 포함하는 개입 수단에 의해 영향을 받은 발현 프로필(즉, 공지된 독성에 관한 하나 이상의 양상)과 양의 상관 관계에 있다는 것을 확인함으로써, 테스트 제제의 독성에 관한 하나 이상의 양상을 예측하는 방법일 수 있다.

본 발명의 방법은 제1 테스트 제제와 제2 테스트 제제, 또는 특이적인 표적 거대 분자의 공지된 작동제 또는 길항제인 테스트 제제의 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계를 각각 측정함으로써, 제1 테스트 제제가 제2 테스트 제제, 또는 특이적인 표적 거대 분자의 후보 작동제 또는 길항제임을 측정하는 방법일 수 있다.

본 발명의 방법은 비암호화 RNA의 발현에 대해 유사한 효과를 나타내는 개입 수단을 그루핑하는 단계를 포함할 수 있다. 결과로 얻어진 발현 프로필은 추가의 치료 물질을 확인하는 후속 연구에 유용한 초석이 될 수 있다. 본 발명의 방법은 일군의 개입 수단, 예를 들어 일군의 치료 물질과 연관된 비암호화 RNA의 발현 프로필에 일어나는 변화를 측정하는 방법일 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 화학 물질 또는 생물학적 물질이, 생물계에 대한 기타 화학 물질 또는 생물학적 물질의 작용 기작과 관련된 생물계에의 작용 기작을 나타내는지 여부를 측정하는 방법일 수 있다. 군은 계층상 순서가 정해질 수 있다.

개입 수단이 생물계에 제2 테스트 제제를 적용하는 것인 경우, 제2 테스트 제제를 사용할 때의 비암호화 RNA 발현 프로필에 대한 효과는 다른 제1 테스트 제제의 생물계에 대한 효과와 (양 또는 음으로) 상관되어 있는 것으로 파악되는데, 여기서 제1 테스트 제제는 제1 병태를 치료 또는 예방하는데 유용한 것으로 알려져 있으며, 제2 테스트 제제 또는 제2 테스트 제제를 개질하여 만든 테스트 제제는 제1 병태, 또는 제1 병태와 관련된 병태를 치료 또는 예방함에 있어서 그 효능이 테스트될 수 있다. 제1 병태, 또는 제1 병태와 관련된 병태를 치료 또는 예방하기 유용한 것으로 파악되는 테스트 제제는 관련된 병태의 치료법 또는 예방법에서 효율적으로 사용될 수 있다.

몇몇 구체예에서, 동일한 개입 수단, 또는 개입 수단 군이 다수의 상이한 생물계를 대상으로 적용되는 발현 검정법이 수행된다. 그러므로, 본 발명의 방법은 상이한 다수의 생물계 중 오로지 몇 개에서만 나타나는, 개입 수단으로 인한 효과 간 상관 관계를 파악할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 다수의 상이한 생물계로서는 상이한 분화 또는 탈분화 단계에 있는(예를 들어, 상이한 발달 단계에 있는) 줄기 세포가 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 분화 또는 탈분화 과정 중 특정 단계에 있는 줄기 세포에 대한 개입 수단에 따른 효과 간 상관 관계를 파악할 수 있게 해준다. 이러한 정보는 발달 및 줄기 세포나 전구 세포의 분화 및 탈분화 기작을 관찰하는데 유용하다. 다수의 상이한 생물계는 상이한 병상을 나타내는 포유동물 세포를 포함할 수 있다. 개입 수단은 줄기 세포 또는 전구 세포를 분화 또는 탈분화시키거나, 또는 상기 세포들이 특정 분화 단계에 이르도록 만들거나, 또는 특정 분화 단계에 있는 줄기 세포 또는 전구 세포의 안정성을 유지시키도록 만드는 개입 수단일 수 있다.

발현 프로필은 하나 이상, 통상적으로는 다수의 비암호화 RNA, 바람직하게는 10개 이상, 또는 더욱 바람직하게는 100개 이상의 비암호화 RNA의 발현과 관련되어 있다. 발현 프로필은 마커로서 작용하는 하나 이상의 유전자 이식된 비암호화 RNA의 발현과 관련되어 있을 수 있다. 발현 프로필은 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현 수준을 정량 또는 정성 측정한 결과를 포함할 수 있다. 상기 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현 수준은 특정 생물계 내 리포터 구조물, 예를 들어 생물계 게놈에 통합된 유전자 이식 리포터 구조물의 양이나 작용 수준, 또는 이와 같은 생물계 내 에피좀에 유지되는 양이나 수준에 관한 측정 결과를 통하여 간접적으로 측정될 수 있다. 발현 프로필은 통상적으로 생물계 내 최소한 일부 환경에서 발현되는 하나 이상의 비암호화 RNA의 양, 예를 들어 하나 이상의 비암호화 RNA가 정상 상태일 때의 양 또는 이것이 가장 많이 존재할 때의 양과 관련되어 있다. 그러나, 발현 프로필은, 예를 들어 하나 이상의 비암호화 RNA의 발현의 변화율과 관련될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 발현 프로필은 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 얻는다.

비암호화 RNA는 통상적으로 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하며, miRNA 전구체 및 성숙한 miRNA 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 상기 비암호화 RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 피위(piwi) 상호 작용 RNA(piRNA), 소형 핵 RNA(snRNA), 그리고 짧은 머리핀형 RNA(shRNA) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 비암호화 RNA는 유전자 이식된 것일 수 있다. 상기 RNA 중 일부 또는 전부는, 예를 들어 비암호화 RNA 발현 리포터로서 작용하는 유전자 이식 RNA일 수 있다. 비암호화 RNA는 에피좀에 존재하는 것일 수 있으며, 본 발명의 방법은, 예를 들어 생물계를 바이러스로 감염시켜 에피좀 DNA를 생물계에 도입시키는 단계를 포함할 수 있는데, 이 경우 상기 에피좀 DNA는 전사되어 프로필 분석된 비암호화 RNA의 전부 또는 일부를 구성하는 비암호화 RNA를 생산할 수 있다.

발현 프로필은 비암호화 RNA 군 내에 포함된 각각의 비암호화 RNA에 대해 측정될 수 있으며, 본 발명의 방법은 각각의 비암호화 RNA, 또는 비암호화 RNA 군을 이루는 하위 군을 동정하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기서 상기 비암호화 RNA의 발현 프로필에는 다수의 개입 수단이 상관된 효과를 나타낸다.

상관된 효과를 나타내는 다수의 개입 수단을 본 발명의 방법에 의해 확인할 수 있는데, 이로써 비암호화 RNA 군 및 개별 비암호화 RNA, 또는 발현 수준이 다수의 개입 수단에 의해 영향을 받은 군에 포함된 비암호화 RNA 하위 군의 발현 프로필에 대한 효과가 상관되어 있는 두 개의 개입 수단을 확인할 수 있다.

상관된 효과를 나타내는 다수의 개입 수단은 작용 기작이 관련되어 있는 것으로 이미 공지되어 있는 개입 수단일 수 있는데, 예를 들어 다수의 개입 수단은 동일하거나 유사한 작용 기작을 가지는 것으로 알려져 있거나 또는 그렇게 생각되는 제제, 예를 들어 약물 군을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 발현 수준이 다수의 개입 수단에 의해 영향을 받은 개별 비암호화 RNA 또는 비암호화 RNA의 하위 군을 확인하는 방법을 제공한다.

결과로 확인된 개별 비암호화 RNA 또는 확인된 비암호화 RNA의 하위 군은 이후 비암호화 RNA 축소군의 발현 프로필을 측정하는 또 다른 발현 검정법에서의 사용을 위하여 선택될 수 있으며, 상기 비암호화 RNA 축소군은 최소한 확인된 개별 비암호화 RNA 또는 이 비암호화 RNA의 확인된 하위군을 포함하거나, 선택적으로는 이로 이루어진 비암호화 RNA군 중 일부만을 포함한다. 그렇게 함으로써 비암호화 RNA 축소군의 발현 프로필에 대한 추가 개입 수단에 따른 효과와, 비암호화 RNA 축소군의 발현 프로필에 대한 추가 개입 수단에 따른 효과 및 비암호화 RNA 축소군의 발현 프로필에 대한 상기 다수의 개입 수단에 따른 효과 사이의 상관 관계를 측정할 수 있다. 그러므로, 추후 행해지는 검정법과 테스트는 더 적은 수의 비암호화 RNA를 사용하므로, 비용은 줄이고 처리량은 늘릴 수 있다. 예를 들어, 치료제 군이 상관된 효과를 나타냄에 따라서 발현 수준이 달라지는 비암호화 RNA 축소군은 치료학적으로 유용한 신규의 제제를 발견하거나 또는 공지의 치료제가 작용할 신규의 징후를 확인하는 후보 제제를 스크리닝하는데 사용될 수 있다.

생물학적 개입 수단에 의한 효과를 서로 구별하기 위해 비암호화 RNA 군 또는 이의 하위 군의 발현 수준의 관련성을 측정할 수 있다. 본 발명의 방법은 생물학적 개입 수단에 의한 효과를 서로 구별하는데 적용되는 비암호화 RNA의 관련성에 따라, 상기 비암호화 RNA 군 또는 이의 하위 군 안에서 비암호화 RNA의 순위를 매기는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 생물학적 개입 수단에 사용되는 비암호화 RNA가 속하는 군이나 하위 군, 또는 비암호화 RNA의 발현에 상관된 효과를 나타내는 생물학적 개입 수단의 군 안에서 비암호화 RNA의 발현에 대한 효과의 순위를 매기는 단계를 포함할 수 있다. 결과로 매겨진 순위는 생물학적 개입 수단에 따른 효과 간 상관 관계를 확인하는데 사용될 수 있다.

통계 수학적 방법, 예를 들어 주성분 분석법(principle component analysis)에 의해 상관 관계를 확인할 수 있다. 다수의 특이적인 비암호화 RNA 각각의 발현에 생물학적 개입 수단이 미치는 효과를 각각의 비암호화 RNA의 발현에 생물학적 개입 수단이 미치는 효과의 특성을 나타내는 암호 군 중 하나에 대입할 수 있다. 결과로 얻어진 암호를 분석하여 상관 관계를 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻어진 상기 비암호화 RNA 축소군으로 이루어진 비암호화 RNA를 포함하는 검정 장치(예를 들어, 비암호화 RNA가 고정되어 있는 고상 지지체 또는 테스트 키트)에도 확대된다.

이하, 본 발명의 예시적인 구체예를 다음과 같은 도면을 참고로 하여 기술하고자 한다:
도 1은 본 발명에 의한 방법의 플로우 다이어그램이다.
도 2는 하나의 생물학적 개입 수단(도 2a)과 하나의 변수(도 2b)를 주성분 분석법으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 11개의 miRNA를 대상으로 이 miRNA의 p-값과 q-값에 의해 통계학적 순위를 매긴 결과를 나타내는 표이다.
도 4a는 구별 가능한 miRNA의 표지화된 하위 군을 나타내는 주성분 분석 으로부터 얻은 데이터 그래프를, 그리고 도 4b는 상이한 종류의 개입 수단으로부터 얻은 발현 데이터가 어떻게 클러스터링하는지를 보여주는 4가지 종류의 개입 수단으로부터 얻은 데이터 그래프를 도시한 것이다.

예시적 구체예의 상세한 설명

본 발명의 예시적 방법에 있어서는, miRNA 발현 데이터 세트(예를 들어, 측정된 비암호화 RNA 발현 프로필로부터 유래하는 발현 데이터 세트)의 데이터베이스가 구축된다. 도 1을 참고로 하였을 때, 적당한 사람 세포는 공지의 방법에 의해 배양되고(2), 테스트 제제는 이 배양된 세포에 투여된다(4). 이후, 개입 수단이 적용된 후 1회 이상, 처리된 세포 샘플을 사용하여 miRNA 발현 프로필을 측정하여(6), 처리된 세포 내에 존재하는 다수의 miRNA 각각의 발현 수준을 측정한다.

miRNA 발현 프로필을 측정하는 대안적 방법 2가지, 즉 마이크로어레이 분석법과 실시간 정성 PCR 분석법을 이하에 제시하였다.

(1) miRNA 마이크로어레이 및 데이터 분석

덴마크 베드바엑 소재 엑시콘 A/S(Exiqon A/S) 사로부터 시판되고 있는 컬럼을 기본 구조로 하는 키트를 사용하여 약물 처리한 세포(n = 3) 및 대조군 처리 세포(n = 3)로부터 전체 RNA를 분리하였다. 각 샘플에서 얻은 전체 RNA 2㎍을 대상으로 miRNA 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 표지화, 혼성화, 스캐닝, 정규화 및 데이터 분석 단계를 포함하는 miRNA 마이크로어레이 분석에 사용되는 키트는 다수의 공급처, 예를 들어 엑시콘 A/S로부터 시판되고 있다. 요약하면, 바이오애널라이저 2100 마이크로플루이딕스 플랫폼(Bioanalyser 2100 microfluidics platform; 바이오애널라이저는 애질런트 태크놀로지스(Agilent Technologies) 사의 상표임)을 사용하여 RNA 정도 관리법(RNA Quality Control)을 수행하였다. 애질런트 사로부터 입수한 컴플릿 라벨링 힙 키트(Complete Labelling Hyb Kit)를, 사용 지침대로 사용하여 샘플을 표지화하였다.

(2) 실시간 정량 PCR

상기 방법 (1)을 수행할 때와 같이, 엑시콘 사로부터 구입한 컬럼을 기본 구조로 하는 키트를 제조자 지침대로 사용하여 모든 세포 RNA를 추출하였다. 제조자(미국 캘리포니아 포스터 시티에 소재하는 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에 의해 기술된 바에 따라서 택맨 실시간 PCR(TaqMan Real-Time PCR)에 의해 miRNA를 정량하였다(상기 택맨은 로쉐 몰리큘러 시스템즈 인코포레이션(Roche Molecular Systems, Inc.)의 상표임). 요약하면, 택맨 마이크로 RNA 역전사 키트와 miRNA 특이 스템-루프 프라이머(stem-loop primer)(Applied Biosystems)를 사용하여 역전사(RT)를 수행함에 있어서, 주형으로서 RNA 10ng을 사용하였다. RT 생성물 분액(1.5㎕)을 20㎕의 PCR 반응물에 첨가하였는데, 여기서 상기 PCR 반응물은 ABI 7900HT 열 순환 반응기(Applied Biosystems) 상 96웰 평판에서 95℃에서 10분동안 항온 처리하고, 그 후 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분씩 40회 순환으로 하여 항온 처리하였다. U48 RNA(소형 비암호화 RNA) 발현 수치(또는, 만일 약물을 처리함에 따라서 U48이 달라지는 것으로 파악되는 경우에는 GAPDH 수치)를 바탕으로 하여 상이한 샘플 간에서 표적 유전자 발현을 정규화하였다.

각각의 경우에 있어서, 결과로 얻어진 miRNA의 발현 수준은 8개의 발현 데이터 세트로 저장된다. 다수의 발현 검정법을 수행하는 것이 바람직하다. 통상적으로, 테스트 제제 중 다수(예를 들어, 수백 개 또는 수천 개)가 세포 배양액에 첨가되고, 이러한 방식으로 분석되어 miRNA 발현 데이터의 데이터베이스를 구축한다.

일단, 적당한 규모의 miRNA 발현 데이터 세트의 데이터베이스를 얻을 수 있으면, 이 발현 데이터 세트를 분석하여(10), miRNA 발현에 대한 각각의 테스트 제제의 효과 사이의 상관 관계를 측정하고, miRNA 발현 프로필에 대해 유사한 효과를 나타내는 테스트 제제의 계층 클러스터(hierarchical cluster)를 구축한다.

핵산 발현 데이터 세트 간 상관 관계를 측정하는 방법은 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 한 가지 방법으로서는 엑시콘 A/S로부터 얻은 GPR 포맷의 마이크로어레이 데이터를 스프레드시트에 부과하는 방법이 있다(GPR은 미국 캘리포니아 유니언 시티 소재, 몰리큘라 디바이시스(Molecular Devices)로부터 시판중인 제네픽스 6(Genepix 6) 소프트웨어가 활용하는 데이터 포맷이며, 제네픽스는 몰리큘라 디바이시스의 상표임). 각각의 miRNA에 대한 스팟 강도(spot intensity)를 miRNA 어레이에 제공된 보정 스팟(calibration spot)(제네픽스 6 소프트웨어에 의해 음의 플래그로 표시됨) 및 품질 제어에 대해 분석하였다. 50 미만의 신호 강도 수치를 0 이하로 만들었다. 각각의 miRNA 포집 프로브 종에 대한 각각의 복사본 스팟 4개에 있어서, 백그라운드 보정된 스팟 강도의 중앙값을 계산하여, 계층 클러스터링을 수행하는 TMeV 마이크로어레이 분석 소프트웨어 및/또는 당업자에게 널리 알려진 기타 통계학적 분석 소프트웨어에 도입하였다(TMeV는 다나-파버 암 연구소(Dana-Farber Cancer Institute)(URL; www.tm4.org)에 의해 제공됨).

대안적으로, GRP 포맷 발현 데이터는 애질런트 테크놀로지스사로부터 시판되고 있는 진스프링 GX(Genespring GX) 소프트웨어에 도입되어, 75 백분위수로 정규화된 후, 계층적 클러스터링을 통해 프로세싱될 수 있으며, 기타 통계학적 도구는 상기 진스프링 GX에 통합된다(상기 진스프링 GX는 애질런트 테크놀로지스의 상표임).

2개 이상의 테스트 제제가 하나 이상의 miRNA 발현에 미치는 효과 간에 양의 상관 관계가 관찰되는 경우, 이 상관 관계는 테스트 제제가 동일하거나 관련성이 있는 작용 기작을 공유한다는 것을 말해주는 것일 수 있다. 그러므로, miRNA 발현 프로필에 대한 효과가 임의의 병태에 대한 치료제로서 알려진 제제와 유사한 것으로 파악된 테스트 제제를 동일하거나 또는 관련된 병태의 치료를 위한 후보 물질로서 동정할 수 있다(12). 이와 같은 단계는 하나의 치료상 용도로서 잠재적으로 유용한 것으로 이미 동정된 약물의 재배치(repositioning)를 촉진하는데 유용할 수 있다. 후보 테스트 제제가 동일하거나 서로 관련된 병태를 치료하는데 유용할 수 있는지 여부, 또는 이 제제가 추가 연구에서 출발 물질로 사용될 수 있는지 여부를 측정하기 위해서 후보 테스트 제제를 테스트할 수 있다. 예를 들어, 상기 후보 테스트 제제는 합리적인 디자인 방법 또는 조합 수행되는 디자인 방법을 이용하여 개질될 수 있으며, 모의 화합물을 제조하여 이를 대상으로 테스트 등을 수행할 수 있다. 후보 테스트 제제가 치료 물질로서의 사용에 적당한지 여부를 측정하기 위해 테스트 하고(14), 만일 이것들이 적당하다면 치료 물질로서 효율적으로 사용한다(16).

이와 같은 방법은 하나 이상의 miRNA의 발현에 유사한 효과를 나타내는 테스트 제제를 군으로 나누는데에 특히 유용한데, 그 이유는 이와 같이 miRNA의 발현에 대한 효과에 따라 분류하면 miRNA 발현 수준에 대한 작용 기작이 유사하거나 관련되어 있다는 것을 직접적 또는 간접적으로 반영할 수 있기 때문이다.

음의 상관 관계가 확인되었을 경우, 하나의 테스트 제제는 추가의 테스트 제제 또는 기타 개입 수단으로 인해 나타나는 원치않는 효과 중 하나 이상이 나타나는 것을 예방, 경감 또는 억제하는 후보 물질인 것으로 확인될 수 있었다. 그러므로, 하나 이상의 miRNA 발현에 대해서, 원치않는 효과를 나타내는 다른 테스트 제제와 상반된 효과를 나타내는 것으로 알려진 테스트 제제는 이러한 원치않는 효과를 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질로서 간주할 수 있었다.

화학 물질 또는 생물학적 물질을 투여하는 것 이외의 개입 수단을 포함하는 일정한 범위의 개입 수단에 따른 효과를 평가하기 위해 miRNA 발현 검정법을 수행하는 것이 유리하다. 예를 들어, 세포를 자외선, 이온화 방사선, 음파 및 세포에 유해한 기타 개입 수단으로 처리할 수 있다. 이와 같은 개입 수단에 따른 효과에 대해 음의 상관 관계가 있는 하나 이상의 miRNA 발현에 영향을 미치는 테스트 제제를 동정할 수 있는 경우, 상기 테스트 제제는 생체 내 상응하는 개입 수단으로부터 기인하는 원치않는 효과를 치료 또는 예방하기 위한 후보 물질일 수 있다. 이는 자외선에 의해 유발되는 손상과 방사선 요법으로 인해 발생하는 부작용을 예방하기 위한 제제를 동정하는데 유용할 수 있다.

본 발명의 방법은 다수의 테스트 제제(예를 들어, 소형 화학 물질, 펩티드, 펩티드 모의체 또는 다중 핵산의 조합형 라이브러리)를 고 처리량으로 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 신규의 발현 검정법이 수행됨에 따라서, 결과로 얻어진 발현 데이터 세트를 미리 저장해둔 발현 데이터 세트와 비교하여, 스크리닝된 테스트 제제와 이미 검정한 제제의 효과 간 상관 관계를 구할 수 있다.

본 발명의 방법은 통상적으로 miRNA 발현 데이터 세트의 대규모 데이터베이스를 사용할 때 가장 효율적이다. 그러나, 몇몇 특정 분야에 있어서는, 신규 검정법을 통해 얻어진 miRNA 발현 데이터 세트와 비교하는데 이용될 수 있는, 소수의 miRNA 발현 데이터 세트, 심지어는 하나의 miRNA 발현 데이터 세트를 마련할 필요가 있을 수 있다. 이는 구체적으로 확인된 효과, 예를 들어 miRNA 발현에 중요한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있거나 또는 의심이 되는 제제의 효과와 양 또는 음의 상관 관계에 있는 miRNA 발현에 영향을 미치는 제제를 찾기 위해 수행되는 고 처리량 스크리닝과 관련될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 테스트 제제(예를 들어, 화학 물질 및 생물학적 물질)의 작용 기작 상 유사성이 있고, 그러한 사실 때문에 이 테스트 제제를 실질적으로 사용할 수 있음을, 테스트 제제가 miRNA 발현 프로필에 영향을 미치는 기작을 굳이 이해할 필요 없이 miRNA(및 잠재적으로는 기타 비암호화 RNA) 발현에 미치는 효과를 비교 분석함으로써 파악할 수 있다는 원리를 바탕으로 한다. 이는, 작용 기작을 심도있게 연구하여 약물 표적과 원하는 상호 작용을 하는 제제를 찾아내는 스크리닝 검정법에 사용되는 약물 표적을 동정하는, 종래의 약물 발견 기술 및 약물 재배치 기술과는 상반되는 점이다.

실험을 통하여 파악된 사실 및 이것이 함축하는 의미

전술한 방법을 사용하여, miRNA 발현 데이터를 그루핑한 결과를 토대로 개입 수단을 치료용으로 적용할 수 있는 방식을 결정할 수 있었다. 뿐만 아니라, 본 발명의 방법은 발현 수준이, 스크리닝된 개입 수단이 치료용으로 적용되고 있음을 말해주는, 임의의 miRNA를 동정하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 지표 miRNA(indicative miRNA)는 장차 적용될 개입 수단 스크리닝법이 전체 miRNA 라이브러리가 아닌 비교적 소규모 miRNA 군의 발현 수준을 분석하여, 스크리닝될 개입 수단의 잠재적인 치료상 용도를 확인할 수 있게 될 것이다.

개입 수단에 대한 잠재적인 치료상 용도를 결정하기 위해서 엄선된 소규모 miRNA 군을 이용하는 방법의 예를 이하에 제시하였다.

본 단락에 기술된 실험을 수행하는 중, 대조군으로서 일군의 세포를 디메틸 설폭사이드 또는 DMSO와, 포스페이트 완충 염수를 포함하는 약물 용매 혼합물로 처리하였다. 상기 약물 용매 혼합물은 miRNA 발현에 효과를 미치지 않을 것이며, 만약 효과를 미친다면 테스트할 약물과 관련된 패턴 중 어느 것과도 일치하지 않는다고 가정하였다. 그러나, 상기 약물 용매 혼합물은 HDAC 억제제가 작용하는 패턴과 동일한 miRNA 발현 패턴을 보이는 것으로 파악되었다. 결과적으로, 문헌 조사를 통하여 DMSO가 HDAC 억제제인 것으로 파악된다는 것을 알 수 있었는데, 이는 곧 본 발명의 방법을 이용함으로써 약물의 알려지지 않은 잠재적인 치료 특성을 측정할 수 있음을 말해주는 것이다.

재료와 방법

표준적인 방법을 이용하여 HeLa 세포를 배양하였다. 상기 세포를 DMEM 배지에 나누어 넣었다.

상기 배지를 흡입한 후, 세포 단일 층을 적당량의 포스페이트 완충 염수(PBS, NaCl 8g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 1.44g 및 KH₂PO₄ 0.24g을 증류수 800㎖ 중에 용해함)]로 세정하였다. 상기 PBS를 흡입하였다.

미지의 테스트 제제를 세포에 투여한 후 48시간 동안 항온 처리하였다.

RNA 추출

다음과 같은 방법에 따라서, 엑시콘 사로부터 구입한 컬럼을 기본 구조로 하는 키트를 사용하여 상기 세포로부터 RNA를 분리 및 정제하였다.

세포가 생장한 배지를 흡입하고, 세포 단일 층을 적당량의 PBS로 세정하였다. 이후, 상기 PBS를 마저 흡입하였다.

용해 용액 350㎕를 배양 평판에 직접 첨가하였다. 배양 접시를 가볍게 쳐서 평판 표면 주위에 있는 완충액에 소용돌이가 일어나도록 만들어(5분) 세포를 용해하였다. 이후, 용해물을 미세 원심분리 튜브에 옮겨 넣었다.

95∼100％ 에탄올 200㎕를 용해물에 첨가한 다음, 이를 10초 동안 와동시켜 혼합하였다.

키트 내에 있던 튜브 중 하나를 사용하여 컬럼을 조립하였다. 이 컬럼에 용해물/에탄올 600㎕를 가한 후, 14,000×g에서 1분 동안 원심 분리하였다. 컬럼을 통과한 물질은 버리고, 수집 튜브를 사용하여 스핀 컬럼(spin column)을 재조립하였다.

공급된 세정 용액 400㎕를 컬럼에 가하고, 14,000×g에서 1분 동안 원심 분리하였다. 컬럼을 통과한 물질은 버리고, 수집 튜브를 사용하여 스핀 컬럼을 재조립하였다.

컬럼에 세정 용액 400㎕를 더 첨가한 후 14,000×g에서 1분 동안 원심 분리하여 상기 컬럼을 2번 더 세정하였다. 컬럼을 통과한 물질은 버리고, 수집 튜브를 사용하여 스핀 컬럼을 재조립하였다.

컬럼을 2분 동안 14,000×g에서 회전시켜 수지를 완전히 건조한 다음, 수집 튜브를 폐기하였다.

키트에 있던 1.7㎖들이 용리 튜브에 컬럼을 조립하여 끼워 넣었다. 이 컬럼에 용리 완충액 50㎕를 첨가한 다음, 200×g에서 2분 동안 원심 분리한 후, 다시 14,000×g에서 1분 동안 원심 분리하였다.

결과로 얻어진 정제 RNA 샘플은 수일 동안 -20℃에 보관할 수 있었다. 샘플을 장기 보관할 경우에는 -70℃에 보관하였다.

(1) miRNA 마이크로어레이 및 데이터 분석

표지화

애질런트 사로부터 구입한 표지화 키트를 사용하여, 정제된 RNA 샘플을 표지화하였다.

전체 RNA 샘플을 1×TE(pH 7.5) 중에 50ng/㎕로 희석하였다. 희석된 전체 RNA 2㎕를 1.5㎖들이 미세 원심 분리 튜브에 첨가한 다음, 이를 얼음에 놓아두었다. 사용하기 직전에, 10×소 장 내 포스파타제 완충액 0.4㎕, 뉴클레아제를 포함하지 않는 물 1.1㎕, 그리고 소 장 내 포스파타제 0.5㎕를 가볍게 혼합하여 소 장 내 알칼리성 포스파타제 마스터 혼합물(calf intestinal alkaline phosphatase master mix)을 제조하였다.

상기 소 장 내 알칼리성 포스파타제 마스터 혼합물 2㎕를 각각의 샘플 튜브에 첨가하고(총 반응물 부피 = 4㎕), 피펫팅으로 가볍게 혼합하였다. 이 반응물을 순환 수조 내에서 30분 동안 37℃에서 항온 처리하였다.

100％ DMSO 2.8㎕를 각각의 샘플에 첨가하였다. 이 샘플을 순환 수조 내에서 5∼10분 동안 100℃에서 항온 처리한 다음, 이를 즉시 얼음 수조에 옮겨넣었다.

10×T4 RNA 리가제 완충액을 37℃로 승온하고, 모든 침전물이 용해될 때까지 회전시켰다. 사용 직전에, 10×T4 RNA 리가제 완충액 1㎕, 시아닌 3-pCp 3㎕ 및 T4 RNA 리가제 0.5㎕를 가볍게 혼합하여 결찰 마스터 혼합물을 만들고, 이를 얼음에 넣어두었다.

결찰 마스터 혼합물 4.5㎕를 각각의 샘플 튜브에 첨가하여 총 반응물 부피가 11.3㎕가 되도록 만들었다. 피펫팅으로 샘플을 가볍게 혼합한 다음, 회전 침강시켰다. 이후, 상기 샘플을 순환 수조 내에서 2시간 동안 16℃에서 항온 처리하였다. 이후, 진공 농축기를 사용하여 45∼55℃에서 상기 샘플을 건조하고, 튜브를 손가락으로 튀겨보았을 때 펠렛이 이동하지 않거나 퍼지지 않으면 건조된 것으로 하여 이 샘플이 건조되었는지 결정하였다.

혼성화

뉴클레아제를 포함하지 않는 물 125㎕를 동결 건조된 10×GE 차단제(애질런트 키트사 제공)를 담고 있는 바이알에 넣은 후, 이를 혼합하였다.

건조된 샘플을 뉴클레아제를 포함하지 않는 물 18㎕ 중에 재현탁하였다. 10×GE 차단제 4.5㎕를 각각의 샘플에 첨가하였다. 2×Hi-RPM 혼성화 완충액 22.5㎕를 각각의 샘플에 첨가한 다음, 이를 잘 혼합하였다. 결과로 생성된 샘플을 5분 동안 100℃에서 항온 처리한 후, 이를 즉시 얼음 수조로 옮겨 5분 동안 넣어두었다.

깨끗한 개스킷 슬라이드를 애질런트 슈어힙 챔버(Agilent SureHyb chamber) 베이스에 로딩하여, 상기 개스킷 슬라이드가 챔버 베이스와 같은 높이가 되도록 만들었다. 혼성화 샘플을 개스킷 웰에 분배하여 소포가 형성되지 않도록 만들었다.

어레이의 작동 면의 아랫 부분을 슈어힙 개스킷 슬라이드와 닿도록 배치하고, 슈어힙 챔버 커버에 끼워넣어 조립 챔버를 만들었다. 조립된 챔버를 55℃로 설정한 혼성화 오븐에 넣은 후, 이 온도에서 20시간 동안 20rpm으로 회전시켰다.

추후, GE 제조 세정 완충액을 사용하여 상기 어레이를 세정한 후 스캐닝하였다.

(2) 실시간 정량 PCR

RT 반응 마스터 혼합물의 제조

얼음에 얼려두었던 성분들을 해동하였다. dNTPs(100mM) 0.15㎕, 멀티스크라이브(MultiScribe) 역전사 효소 1㎕(멀티스크라이브는 어플레라 코포레이션(Applera Corporation) 사의 상표임)(50U/㎕), 10×역전사 완충액 1.5㎕, RNase 억제제(20U/㎕) 0.19㎕, 뉴클레아제를 포함하지 않는 물 4.16㎕ 를 혼합하여 RT 반응 마스터 혼합물을 제조한 다음, 이를 얼음에 넣어두었다. 여기서, 상기 언급한 부피는 RT 반응물 15㎕를 기준으로 한 수치로서, 수행할 RT 반응의 횟수에 따라서 늘릴 수도 있음에 주목해야 할 것이다.

RT 반응물의 제조

RT 반응물 15㎕당 RT 마스터 혼합물 7㎕를 전체 RNA 5㎕와 혼합하였다. RT 프라이머를 얼음 상에서 해동시키고, 96웰 평판 웰 내에 있는 RT 마스터 혼합물/전체 RNA 12㎕에 RT 프라이머 3㎕를 첨가하였다. 이 평판이 충전될 때까지 이를 얼음에 넣어두었다가, 열 순환 반응기에 넣었다.

열 순환 반응기 단계:

16℃, 30분

42℃, 30분

85℃, 5분

4℃, 필요한 시간만큼

PCR 증폭

각각의 웰에서, 택맨(Taqman) 2×보편 PCR 마스터 혼합물 10㎕를 뉴클레아제를 포함하지 않는 물 7.67㎕, 20×택맨 마이크로RNA 검정 혼합물 1㎕, 그리고 이전 단계에서 얻은 RT 생성물 1.33㎕와 혼합하였다. 모든 웰이 충전되었을 때, 평판을 광 접착 커버로 밀봉하여 원심 분리시켜, 공기 방울을 완전히 없앴다.

이후, 평판을 실시간 작동 열 순환기(real-time capable thermal cycler)/PCR 기계에 로딩하여, 다음과 같은 프로그램을 실행하였다:

95℃, 10분(앰플리택 골드 효소(AmpliTaq Gold Enzyme) 작용)

(95℃에서 15초, 60℃에서 60초) × 40

데이타 분석

상기한 바와 같은 2가지 기술을 실행하여 얻은 데이터를 각 평판의 스파이크인(spike-in) miRNA 스팟에 대해 정규화하여, 각 어레이로부터 얻은 데이터를 비교할 수 있었다.

miRNA 발현 프로필 간 상관 관계를 확인하는 것으로서 당 업자에게 널리 알려진 표준 기술인 주성분 분석법을 이용하여 정규화된 데이터를 분석하고, 관찰한 데이터를 그루핑하여 원래 세포에 가하여진 특정 테스트 제제가 작용함으로써 개별 miRNA의 발현에 미치는 영향을 측정하였다.

도 1은 마이크로 RNA에 대한 발현 프로필을 얻는 방법의 플로우 다이어그램이다.

도 2a 및 도 2b는 주성분 분석법을 수행한 후의 발현 프로필의 일례를 도시한 것이다. 도 2a는 miRNA 발현의 전체 다차원 발현 데이터 세트(total multidimensional expression data set)의 주성분 3가지를 3차원 투영하여 나타낸 것으로서, 하나의 처리 유형에 대한 miRNA 발현 데이터를 클러스터링한 결과를 도시하였다. 도 2b는 단일 miRNA 발현에 대한 데이터 스프레드이다.

도 3은 구별 가능한 miRNA를 has-miR-1로부터 has-miR-11로 표지화한 것 11개를 대상으로 통계학적 순위를 매긴 결과를 나타내는 것이다. p-값은, 결과가 통계학적으로 유의적인 것인지 아니면 확률의 결과인지(이 경우, 일반적으로 p-값은 ≤0.05임), 그리고 q-값은 복수 회 테스트한 결과를 보정하여 얻은 p-값인지 여부에 대한 표준적인 통계학적 테스트 수치로서, 오류 발견율에 대한 측정치를 제공한다. 제시한 모든 p-값은 0.05에 훨씬 못 미쳤다.

도 4a는 다수의 miRNA에 대한 miRNA 발현 다차원 데이터 세트와, 잠재적인 치료상 용도를 지시하는 miRNA의 클러스터링 결과의 주성분 3가지를 투영하여 나타낸 것이다. 도 4b는 다수의 miRNA에 대한 miRNA 발현 다차원 데이터 세트의 주성분 3가지를 투영하여 나타낸 것으로서, 여기서 개개의 miRNA에 음영 표시를 해서 생물학적 개입 수단이 miRNA 발현에 영향을 미치도록 치료상의 용도로 사용되었다는 것을 표시하였다.

도면에서 살펴 볼 수 있는 바와 같이, 결과는 명백히 그루핑되며, 이와 같은 그루핑 결과는 miRNA가 발현된 세포에 적용된 생물학적 개입 수단의 치료상 용도와 일치하였다. 다시 말해서, 그루핑된 생물학적 개입 수단은 이 개입 수단이 적용된 세포에서의 작용 기작과 유사한 작용 기작을 나타낼 수 있으며, 공통된 기작을 통해 miRNA 발현 수준에 유사한 효과를 나타내게 된다는 사실을 측정할 수 있다.

작용 기작이 유사한 생물학적 개입 수단은 또한 치료 특성도 유사할 수 있으므로, 이 개입 수단은 치료상 용도가 유사할 수 있다. 도 3 내지 도 4b에 제시한 데이터를 통하여, 치료상 용도가 유사한 생물학적 개입 수단(예를 들어, 대사 길항 물질)에 대한 miRNA 발현의 다차원 데이터 세트의 주성분 3가지를 투영하면 테스트된 생물학적 개입 수단이 실제로 함께 군을 형성하는 것이 입증되었으며, 치료상 용도가 상이한 생물학적 개입 수단(예를 들어, 후성적 개질제)을 그루핑하는 것은 개별적으로 수행되었다는 것도 입증되었다.

miRNA 발현 패턴에 관한 데이터베이스는, 다수의 생물학적 개입 수단을 수행하고, miRNA 발현 프로필상 나타나는 변화를 분석함으로써 구축할 수 있다. 이와 같은 데이터베이스는 상기 테스트하지 않은 생물학적 개입 수단의 miRNA 발현 프로필과 데이터베이스 내 miRNA 발현 프로필을 비교하여 상기 발현 프로필이 치료상 용도 그루핑 결과 중 하나에 속하는지 여부를 측정함으로써 상기 테스트하지 않은 생물학적 개입 수단의 치료상 용도, 또는 추후 잠재적인 치료상 용도를 식별할 수 있다. 만일 이와 같은 상관 관계가 존재한다면, 테스트하지 않은 생물학적 개입 수단은 특정 치료상 용도를 가지는 것으로 간주할 수 있다.

뿐만 아니라, miRNA 발현 데이터 베이스를 구축하면, 임의의 치료상 용도에 대한 지표가 되는 임의의 miRNA 하위세트를 규명할 수 있다. 일단 상기 지표 miRNA 하위세트가 식별되면, 세포에 의해 생산된 miRNA 전부의 발현 프로필이 아닌, 지표 miRNA의 발현 프로필 하위세트의 발현 프로필을 찾음으로써 추후 잠재적인 치료상 용도를 판별하는 신규의 생물학적 개입 수단을 테스트하거나 신규 치료상 용도에 대한 공지의 생물학적 개입 수단을 테스트할 수 있다.

miRNA 발현 데이터의 데이터베이스는 또한 임의의 miRNA 하위세트를 측정하는데에도 사용될 수 있으며, 그 발현 수준은 생물학적 개입 수단 또는 작용 방식이 유사할 것으로 추측되거나 유사한 것으로 알려진 생물학적 개입 수단 군을 상호 구별하는데 가장 유용하게 이용된다. miRNA는 생물학적 개입 수단 또는 작용 방식이 유사할 것으로 추측되거나 유사한 것으로 알려진 생물학적 개입 수단 군들을 구별하는데 이용되는 발현 수준의 관련성의 순서대로 순위가 매겨질 수 있다. miRNA에는 생물학적 개입 수단 또는 작용 방식이 유사할 것으로 추측되거나 유사한 것으로 알려진 생물학적 개입 수단 군을 구별하는데 사용되는 발현 수준의 관련성을 나타내는 수치가 매겨질 수 있다. 예를 들어, 이와 같은 수치는 miRNA의 발현 수준이 주성분 변동성에 기여하는 바와 관련될 수 있다.

통계학적 방법, 예를 들어 주성분 분석법을 이용하여 miRNA 발현 프로필을 비교하는 방법의 대안으로서 또는 이 방법에 더하여, miRNA의 제한된 군(예를 들어, 10∼50) 각각의 발현에 대한 생물학적 개입 수단에 따른 효과를 확인할 수 있으며, 또한 암호 군으로부터 암호를 선택하여 각각의 miRNA 발현에 대한 생물학적 개입 수단에 따른 효과에 매길 수 있다. 결과로 얻어진 암호를 비교하여 효과간 유사성을 식별할 수 있다.

예를 들어, 다음과 같은 사항을 바탕으로 하여, 각각의 생물학적 개입 수단(예를 들어, 스크리닝한 각각의 화합물)에 대해서, 순위를 매긴 각각의 miRNA에 암호로서 3자리 이진수(3-digit binary number)를 매길 수 있다:

1. 만일, 생물학적 개입 수단이 적용되었음에도 miRNA 발현에 변화가 없으면(실험을 통한 가변성의 정상 범위 내에 있으면), 첫 번째 비트는 0으로 설정한다. 만일 발현에 유의적인 변화가 발생하면, 첫 번째 비트는 1로 설정한다.

2. 만일, 발현 수준에 변화가 감지되고 이 변화가 발현 수준이 증가하는 것이면, 두 번째 비트는 1로 설정한다. 만일, 생물학적 개입 수단에 의하여 발현 수준이 감소하게 되면, 두 번째 비트는 0으로 설정한다.

3. 만일, 발현 수준이 4배 이상 변하면, 세 번째 비트는 1로 설정하고, 그렇지 않을 경우에는 0으로 설정한다.

그러므로, 생물학적 개입 수단의 miRNA 발현 수준에 대한 효과에 5개의 가능 값(possible value) 중 어느 하나를 갖는 암호를 매겼다:

1. 발현에 변화가 없음 - 000

2. 발현이 다량 증가함 - 111

3. 발현이 소량 증가함 - 110

4. 발현이 다량 감소함 - 101

5. 발현이 소량 감소함 - 100

miRNA 군의 발현 수준에 대한 생물학적 개입 수단(예를 들어, 특정 화합물을 투여하는 것)의 효과는 관련 암호, 즉 주성분 분석 결과와는 구별되지 않는 발현 수준 변화를 확인할 수 있게 해주고, 생물학적 개입 수단의 유사성에 스코어를 매기는 대안적 방법을 수행할 수 있게 해주며, 또한 결과로 얻어진 발현 데이터를 눈으로 관찰하여 파악할 수 있도록 만들어주는 암호로 특징지을 수 있다.

생물학적 개입 수단 효과의 특징을 규명하고, 상이한 생물학적 개입 수단의 miRNA 발현에 대한 효과 간 상관 관계를 측정하는 다른 방법으로서는 miRNA 군(통상적으로 10∼50개의 miRNA로 이루어짐)을 이루는 각 구성원의 발현에 대한 생물학적 개입 수단에 따른 효과를 측정하여, 예를 들어 발현량이 최대로 증가한 군에 속하는 miRNA에서부터 발현량이 최대로 감소한 군에 속하는 miRNA에 이르기까지(또는 그 반대), 효과의 강약에 따라서 해당 군에 속하는 miRNA의 순위를 매기는 발현 검정법을 수행하는 방법이 있다. 결과로 얻어진 순위는 구체적인 생물학적 개입 수단에 따른 효과를 나타낸다. 그러므로, 기타 생물학적 개입 수단의 miRNA 군에 대한 효과를 측정하여, 그 효과의 강약에 따라서 해당 군에 속하는 miRNA에 순위를 매길 수 있다. 결과로 얻어진 순위를 비교한 결과, 생물학적 개입 수단에 따른 효과 간 상관 관계를 확인할 수 있었다.

잠재적인 신규의 치료상 용도를 가지는지 여부를 스크리닝할 수 있는 생물학적 개입 수단에 따라서 효율과 속도를 상당 수준 증가시키는지에 대해 지표 miRNA 하위세트를 테스트할 수 있는 평판을 포함하는 키트를 제공할 수 있다.

본원에 개시된 본 발명의 범위 내에서 추가적인 변형 및 변경이 이루어질 수 있다.

[참고 문헌]

1. Xie, X., et al., Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3'- UTRs by comparison of several mammals . Nature, 2005. 434(7031): p. 338-45

2. Lim, L.P., et al., Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature, 2005. 433(7072): p. 769-73

3. Calin, G.A., et al., MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias . Proc Natl Acad Aci USA, 2004. 101 (32): p. 11755-60

Claims

(1) 다수의 발현 검정법을 수행하는 단계로서, 여기서 각 발현 검정법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것인 단계: 생물계를 대상으로 개입 수단을 적용하는 단계, 상기 개입 수단에 의해 영향을 받은 생물계 내 비암호화 RNA의 발현 프로필을 측정하는 단계, 및 측정된 발현 프로필로부터 유래하는 발현 데이터 세트를 저장하는 단계(상기 발현 검정법은 다수의 상이한 개입 수단과 다수의 상이한 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다와 관련된 것임); 및
(2) 결과로 얻어진 발현 데이터 세트를 분석하여, 상이한 개입 수단 또는 상이한 생물계 중 어느 하나 또는 둘 다와 관련된 2개 이상의 발현 검정법으로 이루어진 군 내 각각의 개입 수단의 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과 간 상관 관계를 측정하는 단계;
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 개입 수단 중 하나 이상은 테스트 제제를 생물계에 적용하는 것을 포함하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개입 수단은 다수의 테스트 제제를 생물계에 적용하는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물계는 배양된 세포를 포함하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 상관 관계 중 최소한 몇 가지는 양의 상관 관계인 방법.
제5항에 있어서, 발현 검정법으로부터 얻어진 발현 데이터 세트 간 유사성을 바탕으로 하여 발현 검정법을 분류하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 2개 이상의 상이한 개입 수단이 유사한 기작에 의해서 비암호화 RNA의 발현 프로필에 직접적으로 또는 간접적으로 효과를 나타내는 것을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 개입 수단은 제1 치료상 용도가 하나 이상 공지된 제1 치료 물질을 생물계에 적용하는 것이고, 또한 상기 방법은 상기 제2 치료 물질을 사용하는 것을 포함하여 제2 개입 수단의 비암호화 RNA 발현에 대한 효과 간에 양의 상관 관계가 있다는 것을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 제2 치료 물질이 상기 제1 치료상 용도로서 사용될 수 있는지 여부를 테스트하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 상관 관계 중 최소한 몇 가지는 음의 상관 관계인 방법.
제10항에 있어서, 상기 제1 개입 수단은 생물계에 유해한 효과를 나타내는 개입 수단이고, 비암호화 RNA의 발현 프로필에 대한 효과가 제1 개입 수단에 따른 효과와 음의 상관 관계에 있는 것으로 측정된 제2 개입 수단은 제1 개입 수단에 의해 유발되는 것으로 알려진 병태를 치료 또는 예방하는데 사용되는 후보 수단이라는 것을 확인하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물학적 개입 수단에 의한 효과를 서로 구별하기 위해 비암호화 RNA 군의 발현 수준의 관련성을 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 다수의 생물학적 개입 수단들 각각에 대해서, 각각의 비암호화 RNA의 발현에 대한 상기 각각의 생물학적 개입 수단에 따른 효과에 따라 비암호화 RNA 군 안에서 이 군을 이루는 비암호화 RNA들에 순위를 매기고, 결과로 매겨진 순위들을 비교하여 비암호화 RNA의 발현에 대한 생물학적 개입 수단에 따른 효과 간 상관 관계를 확인하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 방법을 포함하는, 공지된 치료 개입 수단의 부작용을 치료 또는 예방하는 후보 치료 물질을 측정하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 의한 방법을 포함하는, 테스트 제제의 독성에 관한 양상 중 하나 이상을 예측하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 의한 방법을 포함하는, 제1 테스트 제제가 제2 테스트 제제 또는 특이적인 표적 거대 분자의 후보 작동제 또는 길항제인 것을 측정하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 동일한 개입 수단, 또는 이 개입 수단 군이 다수의 상이한 생물계를 대상으로 적용되는 다수의 발현 검정법이 수행되는 방법.
제17항에 있어서, 상기 상이한 생물계는 상이한 분화 또는 탈분화 단계에 있는 포유동물 줄기 세포를 포함하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 발현 프로필은 다수의 비암호화 RNA의 발현과 관련된 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 비암호화 RNA는 miRNA인 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 발현 프로필은 비암호화 RNA 군을 이루는 각각의 비암호화 RNA에 대해 측정되고, 상기 방법은 발현 프로필이 다수 개입 수단에 따른 효과와 상관되어 있는 비암호화 RNA 군의 하위군 또는 개별 비암호화 RNA를 확인하는 단계를 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 비암호화 RNA 군 및 개별 비암호화 RNA 또는 발현 수준이 상기 다수의 개입 수단에 의해 영향을 받는 군 내 비암호화 RNA 하위군의 발현 프로필에 상관된 효과를 나타내는 두 개의 개입 수단을 확인하는 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 효과가 상관되어 있는 다수의 개입 수단은 작용 기작이 관련되어 있는 것으로 이미 공지된 개입 수단이고, 상기 방법은 발현 수준이 상기 다수의 개입 수단에 의해 영향을 받는 개별 비암호화 RNA 또는 비암호화 RNA의 하위 군을 확인하는 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 결과로 확인된 개별 비암호화 RNA 또는 확인된 비암호화 RNA의 하위 군은 비암호화 RNA 축소군의 발현 프로필을 측정하는 다른 발현 검정법에 사용할 것으로 선택되며, 상기 비암호화 RNA 축소군은 최소한 확인된 개별 비암호화 RNA 또는 비암호화 RNA의 확인된 하위 군을 포함하여, 비암호화 RNA군 중 일부만을 포함하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 비암호화 RNA의 선택된 축소군은 치료학적으로 유용한 신규의 물질을 발견하거나 또는 공지의 치료 물질이 작용할 신규의 징후를 확인하는 후보 물질을 스크리닝하는데 사용되는 방법.
상기 제25항의 방법에 의해 얻어진 비암호화 RNA 축소군을 이루는 비암호화 RNA를 포함하는 검정 장치.