KR20240033712A - 전이성 대장암 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 전이성 대장암 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 전이성 대장암을 진단하는 신규 바이오마커를 발굴함으로써 전이성 대장암 진단용 조성물 및 키트를 제공할 수 있으며, 나아가 전이성 대장암 의심 개체 또는 대장암 환자의 전이 여부를 신속하고 정확하게 진단하여 환자 상태에 맞는 치료법을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 전이성 대장암 진단용 신규 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
대장암(Colorectal cancer)은 악성 종양 중 세 번째로 흔한 유형이며 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. 치료의 발전에도 불구하고, 대장암 환자의 예후는 좋지 않으며, 사망률은 계속 상승하고 있다. 높은 사망률의 주요 원인으로는 대장암의 간 전이를 꼽는다. 대장암 환자의 20%는 진단 시 이미 전이가 진행된 상태이며, 약 50%에서는 결국 간 전이가 발생한다. 게다가 간 전이 환자의 전체 5년 생존율은 14%에 불과하다.
진단 및 치료 표적을 개발하기 위한 최근 대장암 연구는 단백질 암호 유전자(protein-coding gene)에서부터 마이크로RNA(microRNA, miRNA), 안티센스 전사체(antisense transcript), 긴 유전자 간 비암호화 RNA(long intergenic non-coding RNA, lincRNA), 원형 RNA(circular RNA, circRNA)와 같은 비암호화 RNA(non-coding RNA)로 점차 확대되고 있다. 이러한 비암호화 RNA 중에서 circRNA는 스플라이싱 오류(splicing error)로 인식되었지만, 최근에는 유전자 발현을 조절하는 강력한 수단으로 활발히 연구되고 있다. CircRNA는 주로 역스플라이싱(back-splicing)에 의해 생성되며, 5' 캡(cap)과 3' 폴리 A 꼬리(poly-A tail)가 없는 공유 폐쇄 루프 구조(covalently-closed loop structure)를 가지기 때문에 핵산외부가수분해효소(exonuclease)에 대한 내성이 더 높아서 현저하게 안정적이다. 이러한 circRNA는 암이나 질병을 진단하고 치료하는데 강력한 도구로 활용될 수 있으며, 일부 연구를 통해 대장암 전이에 관여하는 여러 circRNA들이 밝혀지고 있다 (Onco Targets Ther. 2020;13:4035-48, Biochem Biophys Res Commun. 2019;512(4):716-22, Biol Chem. 2020;401(4):487-96, J Pathol. 2018;246(2):166-79).
본 발명의 일 양상은 전이성 대장암 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 전이성 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전이성 대장암 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 "전이성 대장암"은 대장, 특히 결장 및 직장에 생긴 악성종양 (대장암)에서 떨어져 나온 세포가 혈관이나 림프관을 따라 이동하여 간이나 복막, 폐 등 다른 장기, 림프절 등에 정착 및 증식한 것을 말한다. 대장암 진단 환자의 약 20 ~ 25%는 다른 장기로 전이된 4기로 확인되며, 이러한 원격 전이 대장암은 5년 관찰 생존율이 18%에 불과하다. 특히 대장암 4기의 약 85%는 절제술이 불가능하며, 절제술을 받지 못한 경우 5년 및 10년 생존율이 각각 11% 및 0% 수준이다.
본 발명에서 사용된 "진단"은 아직 진단되지 않거나 진단을 받은 개체를 대상으로 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 바이오마커를 이용하여 원발성 대장암의 전이 가능성 또는 대장암 전이 여부를 확인하는 것일 수 있다.
여기서 "바이오마커"란 일반적으로 생물학적 시료에서 검출 가능한 물질로서 생체 변화를 알아낼 수 있는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질, 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 대장암의 전이 가능성을 예측하거나 대장암 전이 여부를 확인하기 위한 바이오마커는 circRNA의 일종인 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S는 세포질 및/또는 핵에서 분리된 원형 RNA인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "원형 RNA(circRNA)"는 단일 가닥 형태 RNA의 한 종류로, 널리 알려진 선형(linear) RNA와 달리 스플라이싱(splicing) 과정에서 역스플라이싱에 의해 형성된 연속적인 닫힌 루프 구조이다. 일부 circRNA들은 잠재적 유전자 조절기능을 보이기도 하지만, 대부분은 생물학적 기능이 명확히 밝혀진 바가 없다. 대다수의 circRNA는 세포질에서 발견되며, circRNA의 세포 내 풍부함과 진화적 보존, 잠재적 조절기능 등을 볼 때 circRNA는 병의 발생을 연구하기 위해 쓰일 수 있고 치료 보조 수단으로도 기능할 수 있다.
이러한 circRNA는 차세대 염기서열분석(next-generation sequencing, NGS)을 통해 확인된 전이성 대장암 세포에서 특이적인 발현 수준 변화를 보이는 특정 circRNA로 구성되며, 대장암의 전이 가능성 또는 대장암 전이 여부를 확인하기 위한 바이오마커로 제시될 수 있다.
상기 NGS는 수십만 개의 반응을 동시에 수행하는 다중화(multiplexing) 능력이 있으며, 적은 양의 샘플로도 시퀀싱이 가능하다. NGS는 상용화된 기술에 따라 구체적인 적용 기법이 다소 다르지만, 일반적으로 클론증폭(clonal amplification), 대량병렬 시퀀싱 및 Sanger 방법과 작용기전이 다른 새로운 염기서열결정법을 사용한다. 상용화 기술로는 2007년에 Roche가 출시한 454 GS 개량형 FLX model sequencer, 2006년에 Illumina가 출시한 Genome Analyzer HiSeq, 2007년에 Applied Biosystems가 출시한 SOLiD 등이 있다. 이러한 세 가지의 플랫폼은 공통적으로 복잡한 라이브러리 구축과 클로닝 과정을 버리고 클론증폭기술을 채택하였고, 한꺼번에 대량으로 처리할 수 있는 대량병렬방식(massively parallel sequencing) 기술을 택하였으며, 순환 시퀀싱(cyclic sequencing)을 통한 합성신호읽기(sequencing by synthesis)로 염기서열을 결정하여 번잡한 전기영동과정을 배제하였다. 또한 shotgun 방식을 사용하여 읽혀진 짧은 리드(read)를 컴퓨터로 배열하여 중복된 부분을 찾아 전체를 완성하는 알고리즘을 사용한다.
이러한 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 측정하기 위해서는 각 circRNA에 특이적으로 결합하는 제제가 요구된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제제는 프라이머 쌍, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 표적 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로 다른 물질에 비해 표적 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.
본 발명에서 사용된 "프라이머(primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로, 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)를 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응 (즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 핵산으로 구성되며, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 수준에서 15 ~ 30개의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용된 "프로브(probe)"는 자연의 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하고, 표적 뉴클레오티드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다.
이러한 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드는 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로서, 형광물질, 예를 들면, Cy3, Cy5 등과 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 핵산의 혼성화 결과를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 조성물을 포함하는 전이성 대장암 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서 사용된 "전이성 대장암 진단용 키트"는 검사 대상자, 보다 구체적으로 전이성 대장암을 진단받지 않은 개체 또는 전이 여부가 확인되지 않은 대장암 환자로부터 채취한 생물학적 시료를 통해 진단할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명에서는 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S를 검출하는 제제를 포함할 수 있다.
상기 키트는 통상적인 RNA 발현 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 키트는 PCR(polymerase chain reaction) 키트, RT-PCR(reverse transcription PCR) 키트, 실시간(real time) PCR 및 마이크로어레이(microarray) 키트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
예를 들면, 상기 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합 효소 보조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있으며, 본 발명의 키트는 DNA 또는 RNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다.
본 발명의 다른 양상은 a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계; b) 상기 생물학적 시료에서 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 miRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 측정된 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전이성 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.
상기 a) 내지 c) 단계에 대해 다음에서 자세히 살펴보며, 전술한 내용과 공통된 내용은 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 a) 단계는 전이성 대장암의 진단에 대한 검사가 필요한 개체 또는 대상자로부터 생물학적 시료를 채취하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 피험자는 전이성 대장암 의심 개체 또는 대장암 환자인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 b) 단계는 생물학적 시료에서 전이성 대장암의 바이오마커인 circRNA의 발현 수준을 측정하는 과정이다.
본 발명에서의 circRNA 발현 수준은 통상적인 RNA 발현 분석 방법에 기반하여 제한 없이 측정될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 b) 단계의 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것일 수 있다.
상기 c) 단계는 생물학적 시료에서 측정된 2개의 circRNA 발현 수준에 근거하여 피험자의 대장암 전이 가능성을 예측하거나 대장암 전이 여부를 확인하는 과정이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 c) 단계는 대조군과 비교하여 피험자에서 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준이 낮은 경우, 즉 상대적으로 발현량이 적거나 발현되지 않는 경우 전이성 대장암으로 진단하는 것일 수 있다.
본 발명에서는 전이성 대장암을 진단하는 신규 바이오마커를 발굴함으로써 전이성 대장암 진단용 조성물 및 키트를 제공할 수 있으며, 나아가 전이성 대장암 의심 개체 또는 대장암 환자의 전이 여부를 신속하고 정확하게 진단하여 환자 상태에 맞는 치료법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 KM12C (원발성) 및 KM12L4 (전이성) 세포의 (A) 침습 및 이동 능력과 (B) 생체내 비장내 주사를 이용한 간 전이성을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 circRNA 마이크로어레이 분석에 의한 (A) KM12C 세포와 KM12L4 세포 간의 차등 발현 circRNA를 보여주는 히트맵과 (B) KM12L4 세포에서 하향조절된 9개 및 상향조절된 20개의 circRNA를 보여주는 볼케이노 플롯이며, (C)는 각 세포 내 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 구조 및 세부 정보이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) RT-qPCR 및 (B) 세미 qPCR에 의한 circPPFIA1-L, circPPFIA1-S 및 선형 PPFIA1의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) RNase R 내성 및 (B) 악티노마이신 D 실험에 의한 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 안정성을 나타낸 것으로, 선형 PPFIA1, ACTB 및 GAPDH는 대조군으로 사용되었다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 KM12C 세포에서 분리된 cDNA 및 gDNA를 이용하여 세미 qPCR로부터 측정된 (A) circPPFIA1-L 및 (C) circPPFIA1-S의 발현 수준과 생어 염기서열분석으로 확인된 (B) circPPFIA1-L 및 (D) circPPFIA1-S의 발산 영역을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포분획 분석에 의한 세포질 및 핵 내 발현을 나타낸 것으로, (A)는 세포질 및 핵 추출물의 검증을 위해 웨스턴 블롯으로 측정된 a-Tubulin 및 lamin B이며, (B)는 RT-qPCR로 측정된 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S와 선형 PPFIA1, 세포질 마커로서 GAPDH 및 7SK, 그리고 핵 마커로서 7SL, NEAT1 및 MALAT1의 발현 수준이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) circPPFIA1-L 및 (B) circPPFIA1-S의 녹다운을 세미 qPCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 녹다운된 KM12C 세포의 (A) 침습 및 이동 능력과 (B) 생존 세포 수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 개별적으로 또는 모두 녹다운된 세포의 (A) 침습 및 (B) 이동 능력을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) circPPFIA1-L 및 (B) circPPFIA1-S가 녹다운된 KM12C 세포가 주입된 비장내 주사 모델의 간 전이성을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) circPPFIA1-L 및 (C) circPPFIA1-S의 과발현을 세미 qPCR (상단) 및 RT-qPCR (하단)로 측정하여 나타낸 것이며, (B) circPPFIA1-L 및 (D) circPPFIA1-S가 과발현된 세포의 침습 및 이동 능력을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 과발현된 KM12L4 세포가 주입된 비장내 주사 모델의 간 전이성을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) RT-qPCR 및 (B) 세미 qPCR에 의한 대장 원발암(colon primary, P)과 간 전이(liver metastatic, L) 조직에서의 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S 발현 수준을 나타낸 것으로, GAPDH는 대조군으로 사용되었다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 circRNA 마이크로어레이 분석에 의한 (A) KM12C 세포와 KM12L4 세포 간의 차등 발현 circRNA를 보여주는 히트맵과 (B) KM12L4 세포에서 하향조절된 9개 및 상향조절된 20개의 circRNA를 보여주는 볼케이노 플롯이며, (C)는 각 세포 내 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 구조 및 세부 정보이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) RT-qPCR 및 (B) 세미 qPCR에 의한 circPPFIA1-L, circPPFIA1-S 및 선형 PPFIA1의 발현 수준을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) RNase R 내성 및 (B) 악티노마이신 D 실험에 의한 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 안정성을 나타낸 것으로, 선형 PPFIA1, ACTB 및 GAPDH는 대조군으로 사용되었다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 KM12C 세포에서 분리된 cDNA 및 gDNA를 이용하여 세미 qPCR로부터 측정된 (A) circPPFIA1-L 및 (C) circPPFIA1-S의 발현 수준과 생어 염기서열분석으로 확인된 (B) circPPFIA1-L 및 (D) circPPFIA1-S의 발산 영역을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포분획 분석에 의한 세포질 및 핵 내 발현을 나타낸 것으로, (A)는 세포질 및 핵 추출물의 검증을 위해 웨스턴 블롯으로 측정된 a-Tubulin 및 lamin B이며, (B)는 RT-qPCR로 측정된 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S와 선형 PPFIA1, 세포질 마커로서 GAPDH 및 7SK, 그리고 핵 마커로서 7SL, NEAT1 및 MALAT1의 발현 수준이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) circPPFIA1-L 및 (B) circPPFIA1-S의 녹다운을 세미 qPCR로 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 녹다운된 KM12C 세포의 (A) 침습 및 이동 능력과 (B) 생존 세포 수를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 개별적으로 또는 모두 녹다운된 세포의 (A) 침습 및 (B) 이동 능력을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) circPPFIA1-L 및 (B) circPPFIA1-S가 녹다운된 KM12C 세포가 주입된 비장내 주사 모델의 간 전이성을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) circPPFIA1-L 및 (C) circPPFIA1-S의 과발현을 세미 qPCR (상단) 및 RT-qPCR (하단)로 측정하여 나타낸 것이며, (B) circPPFIA1-L 및 (D) circPPFIA1-S가 과발현된 세포의 침습 및 이동 능력을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 과발현된 KM12L4 세포가 주입된 비장내 주사 모델의 간 전이성을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) RT-qPCR 및 (B) 세미 qPCR에 의한 대장 원발암(colon primary, P)과 간 전이(liver metastatic, L) 조직에서의 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S 발현 수준을 나타낸 것으로, GAPDH는 대조군으로 사용되었다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 세포 배양 및 형질주입(transfection)
각각 원발성 및 간 전이성 대장암 세포주인 KM12C 및 KM12L4는 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 10% FBS (Gibco) 및 1% 항균 용액(antibiotic-antimycotic solution) (Gibco)이 보충된 DMEM (Gibco)에서 배양되었다. 모든 세포주에는 마이코플라스마 오염이 없었으며 STR(Short Tandem Report) 분석을 통해 확인되었다.
세포는 제조사의 프로토콜에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 사용하여 siRNA 및 플라스미드(plasmid)가 형질주입되었다. 유전자 녹다운(knockdown)을 위해 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S에 대한 siRNA 및 대조군(control) siRNA를 Bioneer에서 합성하였다 (하기 표 1 참조). circPPFIA1 과발현의 경우 인간 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S (하기 표 2 참조)의 전체 길이를 합성하여 pcDNA3.1(+) circRNA 미니 벡터 (No. 60648, Addgene)에 클로닝하였다. 공벡터(empty vector)는 음성 대조군으로 사용되었다.
| siRNA 명칭 | 염기서열 (5'-3') | 서열번호 | |
| Control siRNA | UUCUCCGAACGUGUCACGU | 1 | |
| circPPFIA1-L | siRNA 1 | UCUGGAAGGUGGCAACGUUCU | 2 |
| siRNA 2 | AAGGUGGCAACGUUCUAGAUG | 3 | |
| siRNA 3 | UGGAAGGUGGCAACGUUCUAG | 4 | |
| circPPFIA1-S | siRNA 1 | CUCUGGAAGGUGGCAAUUUUU | 5 |
| siRNA 2 | UCUGGAAGGUGGCAAUUUUUU | 6 | |
| 염기서열 (5'-3') | 서열번호 | |
| circPPFIA1-L | TTGCCACCTTCCAGAGAAGAGGTACGAGATGACAAGACAACCATAAAGTGTGAAACCTCCCCGCCTTCCTCCCCGAGAGCCCTTCGGTTAGACCGGCTGCACAAAGGGGCGCTGCACACCGTCAGCCACGAGGACATCAGGGACATAAGGAACTCCACAGGCTCCCAGGATGGTCCCGTGAGCAACCCCAGCAGTAGCAACAGTAGCCAGGACTCGCTCCACAAAGCCCCAAAGAAGAAAGGCATTAAGTCCTCCATTGGCCGCTTGTTTGGCAAGAAAGAAAAGGGCCGACCTGGACAAACTGGCAAAGAAGCATTAGGACAAGCTGGTGTTTCCGAGACGGATAACTCATCTCAGGATGCCTTGGGACTTAGCAAATTGGGGGGACAGGCTGAAAAAAATCGTAAACTTCAAAAAAAGCATGAATTGCTGGAGGAAGCCCGGAGACAAGGTTTACCTTTTGCCCAATGGGACGGGCCAACGGTTGTGGTCTGGCTAGAGCTCTGGGTTGGGATGCCAGCCTGGTATGTGGCTGCCTGCCGAGCAAACGTGAAAAGCGGGGCCATCATGTCGGCCCTGTCCGACACAGAGATCCAGCGTGAGATTGGCATCAGCAACCCCCTGCACAGGCTGAAGCTGAGGCTGGCCATCCAGGAGATCATGTCGCTGACCAGCCCGTCTGCCCCGCCCACATCTAGAACG | 7 |
| circPPFIA1-S | TTGCCACCTTCCAGAGAAGAGGTACGAGATGACAAGACAACCATAAAGTGTGAAACCTCCCCGCCTTCCTCCCCGAGAGCCCTTCGGTTAGACCGGCTGCACAAAGGGGCGCTGCACACCGTCAGCCACGAGGACATCAGGGACATAAGGAACTCCACAGGCTCCCAGGATGGTCCCGTGAGCAACCCCAGCAGTAGCAACAGTAGCCAGGACTCGCTCCACAAAGCCCCAAAGAAGAAAGGCATTAAGTCCTCCATTGGCCGCTTGTTTGGCAAGAAAGAAAAGGGCCGACCTGGACAAACTGGCAAAGAAGCATTAGGACAAGCTGGTGTTTCCGAGACGGATAACTCATCTCAGGATGCCTTGGGACTTAGCAAATTGGGGGGACAGGCTGAAAAAAATCGTAAACTTCAAAAAAA | 8 |
1-2. 마이크로어레이 분석
총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 KM12C 및 KM12L4 세포에서 분리되었다. circRNA 마이크로어레이는 Arraystar (AS-S-CR-H-V2.0)로 수행하였다. 차등 발현 circRNA는 p < 0.05 및 배수변화(fold-change) > 2.0의 기준으로 분석하였다.
1-3. circRNA의 특징
RNase R 내성(resistance) 및 악티노마이신 D(actinomycin D) 처리를 통해 안정성을 시험하여 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 원형 구조를 확인하였다. RNase R 내성 시험에서는 분리된 총 RNA 1 μg을 2U RNase R (Epicenter Technologies)과 37℃에서 15분 동안 배양하였다. circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 잔여 수준은 세미 qPCR 및 RT-qPCR로 측정되었다. 악티노마이신 D 처리 시험에서는 세포에 악티노마이신 D (5 μg/μl)를 처리한 후 0 또는 24시간에 채취하였다. 이후 RNA를 분리하여 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 수준을 세미 qPCR 및 RT-qPCR로 측정하였다. 대조군으로는 선형 PPFIA1, ACTB 및 GAPDH mRNA를 사용하였다.
circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발산 영역(divergent region)을 확인하기 위해 생어 염기서열분석(Sanger sequencing) (Bioneer)을 수행하였다. KM12C cDNA는 프라이머를 사용하여 세미 qPCR로 증폭하였으며, AccuPrep® PCR/Gel Purification Kit (Bioneer)를 사용하여 생성물을 정제하였다.
1-4. 트랜스웰 침습 및 이동 분석
세포의 침습(invasive) 및 이동(migration) 능력을 조사하기 위해 트랜스웰 챔버(transwell chamber) (Corning)를 사용한 트랜스웰 분석을 수행하였다. 동일한 수의 세포를 무혈청 배지로 챔버 상부에 분주하고, 10% FBS로 보충된 750 μl의 배지를 화학적 유인물질(chemo-attractant)로 하여 챔버 하부에 추가하였다. 24시간 후 세포를 95% MeOH로 5분간 고정하고 0.1% 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 전이 잠재력(metastatic potential)은 무작위로 선택된 최소 10개의 필드(field)에서 침입 및 이주된 세포 수를 세어 결정되었다.
1-5. 세포분획 분석
세포 내 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 위치를 알아보기 위해 세포분획(cellular fractionation) 분석을 수행하였다. KM12C 세포는 4 mg/ml의 디지토닌(digitonin) (BN2006, ThermoFisher Scientific)을 함유한 RSB 완충액에 용해 및 원심분리한 후 상층액을 세포질 추출물로 수집하였다. 남은 핵 함유 펠릿을 RSB 완충액으로 5회 세척하여 핵 추출물로 수집하였다. 이후 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 각 추출물로부터 RNA를 추출하였다. 추출된 세포질(cytoplasm) 및 핵(nucleus) RNA는 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성한 후 RT-qPCR 분석을 실시하였다. GAPDH 및 7SK, 그리고 7SL, NEAT1 및 MALAT1는 각각의 세포질 및 핵 분획에 대한 대조군으로 사용되었다.
1-6. 환자 시료
삼성서울병원에서 진단 받은 간 전이성 대장암 환자의 조직 시료를 이용하였다 (IRB 승인번호: 2010-04-004 및 2019-03-054). 결과에 영향을 주는 외부인자를 배제하고자 간 전이를 보인 대장암 환자 중에서 어떠한 항암치료 (화학요법 또는 방사선요법)도 받지 않은 환자의 대장 원발암 (대장 조직)과 간 전이 대장암 (간 조직) 시료를 수집하였다 (n = 6). 시료 내 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준은 RT-qPCR 및 세미 qPCR으로 측정되었다. 환자 136번의 경우 RNA가 충분하지 않아서 RT-qPCR만이 수행되었다.
1-7. 세미 qPCR 및 RT-qPCR 분석
총 RNA는 제조사의 프로토콜에 따라 TRIzol 시약 (Invitrogen)을 사용하여 분리되었다. circRNA와 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위해 1 μg의 RNA를 주형(template)으로 하여 SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA, 프라이머 및 Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)를 혼합하여 RT-qPCR(real time-quantitative PCR)를 실시하였다. GAPDH는 내부 대조군으로 사용되었다. 세미 qPCR(semi-quantitative PCR) 분석에서는 cDNA, 프라이머 및 AccuPower® HotStart Pfu Premix (Bioneer)를 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로스 겔(agarose gel) (Biosesang)에서 전기영동되었으며, 밴드의 세기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
여기서 사용된 PCR 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
| 프라이머 명칭 | 제품 정보 또는 염기서열 (5'-3') | 서열번호 | |
| circPPFIA1-L | RT-qPCR primer 1 | F: CGCCCACATCTAGAACGTT | 9 |
| R: CGGGGAGGTTTCACACTTTA | 10 | ||
| RT-qPCR primer 2 | F: CCACATCTAGAACGTTGCCA | 11 | |
| R: GAAGGCGGGGAGGTTTCA | 12 | ||
| RT-qPCR primer 3 | F: AGGAGATCATGTCGCTGACC | 13 | |
| R: GGTTGTCTTGTCATCTCGTACC | 14 | ||
| Semi-qPCR primer | F: CCCACATCTAGAACGTTGCC | 15 | |
| R: GGCTGGTCAGCGACATGAT | 16 | ||
| Convergent primer | F: TGCCAGCCTGGTATGTGG | 17 | |
| R: CTGGTCAGCGACATGATCT | 18 | ||
| Divergent primer | F: GCCGAGCAAACGTGAAAAG | 19 | |
| R: ATGTCCCTGATGTCCTCGTG | 20 | ||
| circPPFIA1-S | RT-qPCR primer 1 | F: AGGATGCCTTGGGACTTAGC | 21 |
| R: TCTCTGGAAGGTGGCAATTTT | 22 | ||
| RT-qPCR primer 2 | F: CTTCAAAAAAATTGCCACCTTCC | 23 | |
| R: GGTCTAACCGAAGGGCTCT | 24 | ||
| Semi-qPCR primer | F: TTCAAAAAAATTGCCACCTTCC | 25 | |
| R: CGATTTTTTTCAGCCTGTCCC | 26 | ||
| Convergent primer | F: ACAGGCTCCCAGGATGGT | 27 | |
| R: GCTTCTTTGCCAGTTTGTCC | 28 | ||
| Divergent primer | F: CTCATCTCAGGATGCCTTGG | 29 | |
| R: TTATGTCCCTGATGTCCTCGT | 30 | ||
| PPFIA1 | RT-qPCR primer 1 | F: CGAGAGTGATGCTGACGTGT | 31 |
| R: GCATCATGGCTAGTGTGTGC | 32 | ||
| RT-qPCR primer 2 | F: TGGATCCTGTCAATTGGCCT | 33 | |
| R: TCTAAGGCCAGAAGTGCTCC | 34 | ||
| Semi-qPCR primer | F: ATGGAAGCACAGTTGGAGGA | 35 | |
| R: GGTGCTGTAGGAGTCTGTGT | 36 | ||
| circPPFIA1 | Sanger primer | F: CCACAAAGCCCCAAAGAAGA | 37 |
| R: ATGTCCCTGATGTCCTCGTG | 38 | ||
| GAPDH | RT-qPCR primer | F: TGCACCACCAACTGCTTAGC | 39 |
| R: GGCATGGACTGTGGTCATGAG | 40 | ||
| Semi-PCR primer | F: CTGACTTCAACAGCGACACC | 41 | |
| R: AGGGGAGATTCAGTGTGGTG | 42 | ||
| Convergent primer | F: ACCCAGAAGACTGTGGATGG | 43 | |
| R: TGACAAAGTGGTCGTTGAGG | 44 | ||
| Divergent primer | F: TGAATCTCCCCTCCTCACAG | 45 | |
| R: TGCTGTAGCCAAATTCGTTG | 46 | ||
| ACTB | Semi-PCR primer | F: AGAAAATCTGGCACCACACC | 47 |
| R: CTCCTTAATGTCACGCACGA | 48 | ||
| 7SK | RT-qPCR primer | F: CAAAACTCCCGTGCTGATCA | 49 |
| R: GGCTGGAGTGCAGTGGCTAT | 50 | ||
| 7SL | RT-qPCR primer | F: GACGACCATCCCCGATAGAG | 51 |
| R: GGGAGCGCAGCTACTCGTAT | 52 | ||
| NEAT1 | RT-qPCR primer | F: CGGAGGGTCTTGTAACACCAG | 53 |
| R: AGTCCGGGCAACACAGAAAG | 54 | ||
| MALAT1 | RT-qPCR primer | F: TTCCGGGTGTTGTAGGTTTC | 55 |
| R: TCTCCAGGACTTGGCAGTCT | 56 | ||
1-8. 비장내 주사(Intrasplenic injection)에 의한 생체내 간 전이 측정
6 ~ 7주령 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Orient Bio)는 복강내 주사를 통해 케타민(ketamine) (#7001, Yuhan) (30 mg/kg)과 자일라진(xylazine) (Rompun®, Bayer) (10 mg/kg)의 혼합물로 마취되었다. 왼쪽 복부 옆구리를 작게 절개하고 비장을 꺼내 비장내 주사를 하였다. 주입할 세포로는 KM12C 및 KM12L4 세포에 각각 circPPFIA1 siRNA 또는 과발현 벡터를 형질주입하여 준비하였다. 동일한 수의 형질주입된 세포 (2.0 x 106 세포)를 HBSS (Gibco) 50 μl로 현탁하여 30 게이지(gauge) 바늘로 마우스 비장에 주사하였다. 4주 후, MRI로 간 전이를 검사하고 간 조직을 얻기 위해 마우스를 희생시켰다.
본 동물실험은 삼성서울병원의 SPF 동물 실험 센터에서 수행되었고, 삼성서울병원 동물실험위원회 (승인번호 20200410002)에서 동물사용에 대한 윤리허가를 받았다.
2. 결과
2-1. 간 전이성 대장암 세포에서 하향조절된 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S
전이 관련 circRNA를 탐색하기 위해, 이전 연구 (Cancer Res. 1988;48(7):1943-8)에서 확립된 세포주인 원발성 대장암 KM12C 세포 및 그 간 전이 유도체 KM12L4 세포를 사용하였다. KM12L4 세포의 높은 전이 잠재력은 모세포인 KM12C 세포와 침습 및 이동 능력을 비교하여 검증되었다. 트랜스웰 침습 및 이동 분석의 결과에서는 KM12L4 세포가 KM12C 세포에 비해 침입 및 이주된 세포의 수가 더 많았으며 (도 1A), 이는 KM12L4 세포가 KM12C 세포보다 높은 전이 잠재력을 갖는다는 것을 보여준다. 생체내(in vivo) 간 전이 정도를 알아보기 위해 비장에 KM12C 및 KM12L4 세포를 주입하고 시각적 계측(visual counting) 및 MRI를 통해 간 전이 정도를 측정하였다. 간 전이 정도는 AU(arbitrary unit, 0 ~ 3)의 점수를 부여해 계산하였다. 그 결과, 예상대로 KM12L4 세포를 주입한 생쥐에서 KM12C 세포를 주입한 생쥐보다 간 전이가 더 많았다 (도 1B).
KM12C 세포와 KM12L4 세포 사이에서 차등적으로 발현되는 circRNA를 식별하기 위해 circRNA 마이크로어레이를 수행하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 29개의 circRNA가 2배 이상 차등적으로 발현되었으며, 그 중 9개가 KM12C 세포에 비해 KM12L4 세포에서 발현 감소를 보였고 나머지 20개는 발현이 증가하였다. 가장 발현 감소가 큰 것은 hsa_circRNA_100873 (hsa_circ_0003429)(이하 'circPPFIA1-L'이라 함)으로, PTPRF 상호작용 단백질 알파 1(PTPRF interacting protein alpha 1, PPFIA1)의 5개의 엑손 (엑손 17-21)에서 생성된 엑손 circRNA이다 (도 3). 흥미롭게도 또 다른 PPFIA1 유래 circRNA인 hsa_circRNA_100872 (hsa_circ_0000337)가 발견되었다. hsa_circRNA_100872(이하 'circPPFIA1-S'라 함)은 3개의 엑손 (엑손 17-19, 419 bp)에서 생성된 것으로, 길이가 circPPFIA1-L (702 bp)보다 짧았다 (도 3). circBase 데이터베이스 (www.circbase.org)에 따르면, PPFIA1로부터 37개의 circRNA가 생성될 수 있으나, 이들 중 작용 메커니즘 및 역할이 확인된 circRNA는 거의 없다.
마이크로어레이 데이터를 검증하기 위해 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 RT-qPCR 및 세미 qPCR로 측정하였다. 그 결과, 발산 영역을 인식하는 프라이머 (상기 표 3의 circPPFIA1-L RT-qPCR primer 2 및 circPPFIA1-S RT-qPCR primer 1)를 이용한 RT-qPCR 분석에서는 KM12L4 세포에서 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S 모두 유의미한 감소를 보인 반면, 선형 PPFIA1 mRNA 수준은 거의 같았다 (도 4A). 마찬가지로, 세미 qPCR 프라이머 (상기 표 3의 circPPFIA1-L semi-qPCR primer 및 circPPFIA1-S semi-qPCR primer)를 이용한 세미 qPCR 분석 결과에서도 KM12L4 세포에서 선형 mRNA 수준의 유의미한 변화 없이 KM12C 세포에 비해 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현량이 적었다 (도 4B).
2-2. 안정적인 구조를 가지는 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S
circPPFIA1s의 안정성은 RNase R 및 악티노마이신 D 처리 후 세미 qPCR 또는 RT-qPCR에 의해 평가되었다. 그 결과, RNase R이 선형 PPFIA1 mRNA를 분해시킨 반면, circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S는 RNase R에 대한 내성이 높았다 (도 5A). 또한, 선형 PPFIA1 mRNA는 악티노마이신 D로 24시간 처리 후에 거의 분해되었으나, circPPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S는 모두 분해되지 않았다 (도 5B). 이러한 결과는 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 구조적으로 매우 안정적이라는 것을 나타내며, 이는 circRNA의 전형적인 특성이다.
circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 접합 서열(junction sequence)을 확인하기 위해 게놈 DNA(gDNA) 및 cDNA를 수렴 및 확산 영역을 인식하는 프라이머와 함께 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. 그 결과, 수렴 프라이머(convergent primer, ▶◀)에 의한 PCR 생성물은 gDNA와 cDNA가 주형인 경우에서 관찰된 반면, 발산 프라이머(divergent primer, ◀▶)는 cDNA에서만 PCR 생성물을 생성하였다 (도 6A 및 C). 또한 역스플라이싱 접합부(back-spliced junction)는 생어 염기서열분석에 의해 증폭 및 검증되었다. 그 결과, circPPFIA1-L에서 엑손 21 및 17, circPPFIA1-S에서 엑손 19 및 17 사이에서 헤드-투-테일 스플라이싱(head-to-tail splicing)이 관찰되었는데 (도 6B 및 D), 이는 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 원형 구조를 가지고 있음을 보여준다.
circRNA의 위치(localization)를 평가하기 위해 세포분획 분석을 실시하였다. α-tubulin과 lamin B의 수준은 세포질(cytoplasm)과 핵(nucleus)에 대한 분획을 확인하기 위해 웨스턴 블롯으로 측정되었다 (도 7A). 결과적으로, circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S는 모두 세포질에서 풍부하게 발현되었다 (도 7B).
2-3. 대장암의 전이 잠재력 및 간 전이에 대한 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 부정적 조절
circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 녹다운이 KM12C 세포의 전이 잠재력을 조절하는지 조사하기 위해, circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발산 접합부(divergent junction)를 표적으로 하는 siRNA를 설계하여 형질주입하였다. 설계된 모든 siRNA는 해당 circRNA에서 효율적인 감소를 보였지만 선형 PPFIA1의 발현에는 거의 영향을 미치지 않았다 (도 8A 및 B). 또한 circPPFIA10-L 및 circPPFIA1-S가 침묵된(silenced) KM12C 세포에서는 침습 및 이동 능력이 증가하여 전이 잠재력이 향상한 것으로 나타났다 (도 9A). 한편, circPPFIA1s 녹다운 후 관찰된 침입 및 이주 세포 수의 증가가 세포 성장의 증가에 기인할 가능성을 배제하기 위해 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 침묵된 KM12C 세포의 증식률을 조사하였다. 그 결과, circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 침묵은 모두 세포 성장에 영향을 미치지 않았다 (도 9B). 따라서 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S는 세포 성장에 영향을 미치지 않고 KM12C 세포의 전이 잠재력을 조절한다는 것을 알 수 있다. 특히, circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S를 동시에 침묵시켰을 때 세포가 침입하거나 이주하는 등 전이 특성이 더욱 증가하였다 (도 10A 및 B).
circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 녹다운이 생체내 대장암의 간 전이를 증가시키는지 조사하기 위해 비장내 주사 마우스 모델을 사용하였다. 그 결과, circPPFIA1-L-침묵 KM12C 세포를 주입한 생쥐에서 간 전이가 약 4배 증가한 것으로 관찰되었다 (도 11A). 또한 circPPFIA1-S-침묵 KM12C 세포를 주입한 경우에서도 간 전이가 4배 이상 증가하였다 (도 11B). 이러한 결과를 바탕으로, circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 녹다운이 전이 잠재력을 강화하고 대장암의 간 전이를 향상시킨다는 것을 확인하였다.
circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 과발현이 KM12L4 세포의 전이 잠재력을 억제하는지를 조사하기 위해 각 circRNA를 발현하는 과발현 벡터를 구축하였다. 그 결과, 두 벡터 모두 선형 PPFIA1 mRNA의 변화 없이 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 유의미한 증가를 유도하였으며 (도 12A 및 C), circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 증가는 KM12L4 세포의 침습 및 이동 특성을 억제하였다 (도 12B 및 D). 또한 비장내 주사 실험 결과에서는 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S를 과발현하는 KM12L4 세포가 주입된 마우스에서 간 전이 감소를 보였다 (도 13). 이러한 결과는 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S가 대장암에서 간 전이를 부정적으로 조절한다는 것을 시사한다.
세포주 및 비장내 주사 마우스 모델에서의 결과를 검증하기 위해 대장암 환자 시료를 이용하여 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 RT-qPCR 및 세미 qPCR로 측정하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 발산 영역을 인식하는 프라이머 (상기 표 3의 circPPFIA1-L RT-qPCR primer 2 및 circPPFIA1-S RT-qPCR primer 1)를 이용한 RT-qPCR 분석에서는 원발암 조직과 비교하여 간 전이 조직에서 circPPFIA1-L 및 circPPIFA1-S 모두 현저하게 발현 감소를 보였으며, 세미 qPCR 프라이머 (상기 표 3의 circPPFIA1-L semi-qPCR primer 및 circPPFIA1-S semi-qPCR primer)를 이용한 세미 qPCR 분석 결과에서도 동일한 결과를 보였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (8)
- circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 전이성 대장암 진단용 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S는 세포질 및/또는 핵에서 분리된 원형 RNA인 것인 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 제제는 프라이머 쌍, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 조성물. - 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 전이성 대장암 진단용 키트.
- a) 피험자로부터 생물학적 시료를 채취하는 단계;
b) 상기 생물학적 시료에서 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
c) 상기 측정된 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계
를 포함하는 전이성 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 a) 단계의 생물학적 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 타액, 소변 및 조직으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 b) 단계의 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준은 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR, 실시간 PCR, 실시간 RT-PCR, 핵산분해효소 보호 분석(nuclease protection assay), in situ 교잡, DNA 마이크로어레이 및 노던 블롯으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법으로 측정되는 것인 방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 c) 단계는 대조군과 비교하여 피험자에서 circPPFIA1-L 및 circPPFIA1-S의 발현 수준이 낮은 경우 전이성 대장암으로 진단하는 것인 방법.
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| US20150299702A1 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-22 | Aarhus Universitet | Circular rna for inhibition of microrna |
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2022
- 2022-09-02 KR KR1020220111195A patent/KR20240033712A/ko unknown
Patent Citations (1)
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