KR102275465B1

KR102275465B1 - 전이성 대장암 치료물질 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102275465B1
Application number: KR1020200003342A
Authority: KR
Inventors: 조용범; 이여송; 김태원
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-07-09
Also published as: KR20210056958A; KR102279189B1; KR20200090111A

Abstract

본 발명은 대장암의 전이를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)를 포함하는 대장암 전이 예측용 마커 조성물, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물 및 예측용 키트, 상기 마커를 이용하여 대장암 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 miRNA17-5p가 대장암 환자에서 전이 과정의 중요한 프로세스인 Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) 관련 인자인 Vimentin의 3`UTR에 직접적으로 결합하여 발현을 조절한다는 것을 규명함으로써, 대장암의 타 장기로의 전이를 예측하기 위한 바이오마커로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

전이성 대장암 치료물질 스크리닝 방법 {Screening Method of therapeutic agent for metastasis of colorectal cancer}

본 발명은 대장암의 전이를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)를 포함하는 대장암 전이 예측용 마커 조성물, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 전이 예측용 조성물 및 예측용 키트, 상기 마커를 이용하여 대장암 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다.

대장암은 전세계적으로 3번째로 흔한 암으로 우리나라에서는 남자의 경우 폐암에 이어, 여자의 경우 폐암, 위암에 이어 각각 2번째와 3번째로 흔히 발생하는 암으로 근래에 식생활의 양상이 서구화되어 가면서 그 발생 빈도가 가파르게 증가하고 있고, 최근 10년 사이 대장암에 의한 사망률은 약 80%정도 증가하여 그 상승속도가 계속 높아지고 있는 추세이다. 대장암 환자의 약 50%는 진단 후 5년 내에 사망하며 15-25%의 환자는 대장암 진단 당시 간 전이가 발견되며 20-30%에서는 원발성 대장암 수술 후 추적관찰하던 중 간전이가 발견된다. 실제 대장암을 비롯한 악성 종양 환자의 사망 원인은 악성 종양 자체가 아니라 악성 종양의 전이 때문이다.

현재까지 진행되고 있는 암과 관련된 연구는 대부분 발암과정 및 기전에 관한 것이 대부분이다. 대장암 환자들의 치료 성적 및 생존율을 향상시키기 위해서는 가장 주된 사망원인인 전이에 대한 연구가 필요하며 그 중 가장 흔한 전이 장소인 간전이에 대한 연구가 필수적이라 할 수 있다.

대장암 전이와 관련된 단백질들이 어떠한 신호전달체계를 통하여 전이 증식 과정을 조절하는지에 대해서는 많은 부분이 밝혀지지 않았다. 암전이는 다양한 유전적 또는 후생유전적인 변이가 결집된 결과로 발생하는 매우 복잡한 과정이며, 다양한 세포 내 신호전달체계가 단독 또는 서로 영향을 받으며 전이의 각 단계를 조절할 것으로 생각된다. 이러한 전이와 연관된 각 신호전달경로에 속한 특정 유전자의 발현 증가 혹은 감소는 아직 규명되지 않은 신호전달 경로에 상당한 영향을 미칠 수 있기 때문에 필연적으로 예상보다 더 큰 변화를 수반하게 된다. 따라서 특정 단백질의 발현에 의한 전이는 그 유전자의 발현 증가 또는 감소에 의한 직접적인 결과로 이해하기 보다는 그 유전자의 발현에 의해 조절되는 신호전달 경로의 변화에 기인한 결과로 이해되어야 할 것이다.

한편, 마이크로RNA (miRNA)는 시료 내에서 장시간 안정하게 유지되며 낮은 양도 검출이 가능한 강점을 지니고 있으며, 또한 유전자의 발현과정에 전반적으로 영향을 주는 것으로 알려져 있고, 암의 발생 및 악성화 과정에 밀접하게 연관되어 있음이 보고 됨에 따라 많은 기초과학자 및 임상과학자들의 관심을 받고 있다. 이에 따라 보다 정확하고 빠른 대장암의 악성화 바이오마커로서 활용이 가능하여 대장암의 전이 가능성을 예측하기 위한 miRNA 바이오마커를 개발하는 연구가 활발하게 진행되고 있으나 (한국등록특허 10-1879392), 아직은 부족한 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 대장암의 전이를 예측할 수 있는 바이오마커를 개발하고자 다양한 연구를 진행한 결과, 대장암 환자의 암전이 과정의 중요한 프로세스인 EMT (Epithelial Mesenchymal Transition)에 관여하는 인자인 Vimentin에 직접적으로 결합하여 발현을 조절하는 miRNA17-5p를 발굴 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)를 포함하는, 대장암 전이 예측용 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 대장암 전이 예측용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 전이 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는, 전이성 대장암 치료물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

(a) 후보물질을 대장암 세포에 처리하는 단계;

(b) 상기 후보물질이 처리된 대장암 세포에서 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 miRNA17-5p의 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 물질을 전이성 대장암 치료물질로 선정하는 단계.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)를 포함하는, 대장암 전이 예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 miRNA17-5p는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 miRNA17-5p는 vimentin의 3`UTR에 결합할 수 있다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 대장암 전이 예측용 조성물을 포함하는, 대장암 전이 예측용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 전이 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 생물학적 시료는 조직, 혈액, 혈장 또는 혈청일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 발현수준은 차세대 염기서열 분석 (Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응 (PCR), 역전사 중합효소연쇄반응 (RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이 (microarray), 및 노던 블롯팅 (northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 전이성 대장암 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 후보물질을 대장암 세포에 처리하는 단계;

본 발명자들은 대장암 환자에서 전이 과정의 중요한 프로세스인 Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) 관련 인자인 Vimentin의 3`UTR에 직접적으로 결합하여 발현을 조절하는 miRNA17-5p를 발굴하였으며, 이에 상기 발굴된 miRNA17-5p는 대장암의 타 장기로의 전이를 예측하기 위한 바이오마커로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 전이가 있는 대장암 원발암 조직과 전이가 없는 대장암 원발암 조직을 비교하여 miRNA-17-5p의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 1b는 도 1a와 동일한 환자군에서 miRNA17-5p와 vimentin 발현의 상관관계를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 대장암 세포 (HCT-116, DLD-1, HCT-15, SW480, SW620, SW48, HT29, Colo205, LS513, RKO, 및 LoVo)에서 EMT 관여인자인 E-cadherin과 Vimentin의 발현 양상을 확인하기 위해서, 웨스턴 블롯 (western bloting) 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 HCT-15, Colo205, LoVo, HT29 및 SW480에서 miRNA17-5p의 발현을 qRT-PCR을 통해 확인하고, EMT 관여인자인 Vimentin을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2c는 LoVo, HT29, SW480 및 Colo205에서 miRNA17-5p에 의한 EMT 관여인자 중 하나인 E-cadherin의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2d는 miRNA17-5p mimic을 도입시킨 LoVo에서 Twist 및 Snail의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 miRNA17-5p mimic을 도입시킨 LoVo 및 HT29에서 vimentin의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3b는 miRNA17-5p inhibitor를 도입시킨 LoVo 및 HT29에서 vimentin의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3c는 miRNA17-5p mimic을 도입시킨 SW480에서 vimentin의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3d는 miRNA17-5p inhibitor를 도입시킨 Colo205에서 vimentin의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3e는 miRNA17-5p mimic을 도입시킨 LoVo, HT29 및 SW480 세포를 사용하여 Vimentin의 발현을 RNA 수준에서 확인한 결과와 miRNA17-5p inhibitor를 처리한 LoVo, HT29 및 Colo205 세포의 Vimentin 발현 RNA 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 LoVo 및 HT29 세포에서 Vimentin과 miRNA17-5p의 상호작용을 RNP-IP (Ribonucleoprotein Immunoprecipitation)를 통해 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 miRNA-17-5p가 vimentin 3'UTR에 붙을 것이라고 예상되는 vimentin wild type sequence, miRNA17-5p가 vimentin 3'UTR에 인위적으로 붙을 수 없게 만든 mutant sequence, wild type에 있는 하나의 mismatch를 보완하여 더욱 잘 붙을 것으로 예상되는 perfect match sequence, 총 3가지의 sequence를 루시퍼라제 벡터에 넣어 miRNA17-5p mimic과 Vimentin의 3`UTR을 LoVo 세포에 동시 형질 감염시킨 후, miRNA17-5p가 Vimentin에 붙을 수 있다는 결과를 보여주는 루시퍼라제 분석 (Luciferase assays) 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 LoVo 세포에서 miRNA17-5p mimic 및 Vimentin 침묵에 따른 세포 이동성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 HT29 세포에서 miRNA17-5p mimic 및 Vimentin 침묵에 따른 세포 이동성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5c는 LoVo 세포에서 miRNA17-5p mimic 및 Vimentin 침묵에 따른 세포 침윤을 Transwell 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 대조군 및 miRNA17-5p mimic 도입 간전이 동물모델의 MRI 촬영 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 대조군 및 miRNA17-5p mimic 도입 간전이 동물모델의 간을 적출하여 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 RT-PCR을 이용하여 대조군 및 miRNA17-5p mimic 군에서 miRNA-17의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6d는 RT-PCR을 이용하여 대조군 및 miRNA17-5p mimic 군에서 Vimentin의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 대장암 전이를 예측하기 위한 바이오마커를 발굴하기 위해 예의 연구한 결과, 대장암 전이 과정에 관여하는 EMT 관련 인자인 Vimentin의 3`UTR에 직접 결합하여 발현을 조절하는 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)를 발굴함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)를 포함하는, 대장암 전이 예측용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 대장암 전이 예측용 조성물 및 상기 대장암 전이 예측용 조성물을 포함하는 대장암 전이 예측용 키트를 제공한다.

본 발명에서 발굴한 대장암 전이 예측용 바이오마커인 상기 miRNA17-5p는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인 "대장암 (colorectal cancer; CRC)"은 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭하는 것을 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이에 대한 지표가 될 수 있으며, 대장암의 발생, 발전 및/또는 전이의 진단에 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 miRNA17-5p의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA의 각각에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소, 효소, 또는 형광체 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 대장암 환자에서 전이가 있는 환자의 원발암 및 전이가 없는 환자의 원발암 조직과 비교하여 암 전이가 있는 환자에서 특이적으로 발현하는 miRNA17-5p, miRNA-424, miRNA-20a, 및 miRNA-122를 최종적으로 선별하였다 (실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 대장암 환자에서 전이가 있는 환자의 원발암 조직 및 전이가 없는 환자의 원발암 조직의 miRNA17-5p의 발현을 분석한 결과, 전이가 있는 대장암 조직에서 miRNA17-5p의 발현이 낮게 나타나는 것을 확인하였고 각 환자의 조직에서 miRNA17-5p 및 상기 miRNA가 표적하는 Vimentin과의 상관관계를 분석한 결과 Vimentin의 발현이 miRNA17-5p와 역상관관계에 있음을 확인하였다 (실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는 대장암 세포에서 EMT 관여 인자와 miRNA17-5p 발현과의 연관성을 확인한 결과, miRNA17-5p의 발현과 EMT 관여 인자인 Vimentin이 유의한 상관관계가 있는 것을 확인하였으며 (실시예 3 참조), 상기 miRNA17-5p에 따른 Vimentin의 발현 변화를 구체적으로 확인하기 위해서, miRNA17-5p mimic 및 miRNA-17 inhibitor를 대장암 세포에 도입하여 Vimentin의 발현을 확인한 결과, miRNA17-5p mimic을 도입시킨 대장암 세포에서 Vimentin의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 반대로 miRNA-17 inhibitor를 도입시킨 대장암 세포에서 Vimentin의 발현이 증가되는 것을 확인하였다 (실시예 4 참조).

이에, 본 발명자들은 상기 Vimentin의 발현의 변화가 miRNA17-5p가 직접적인 조절에 의한 것인지를 확인하고자 하였으며, LoVo 및 HT29 세포에서 Vimentin과 miRNA17-5p의 상호작용을 RNP-IP (Ribonucleoprotein Immunoprecipitation)를 통해 분석하였으며, 이 때, miRNA17-5p의 면역침강 (Immunoprecipitation; IP) 물질의 Vimentin 수준을 RT-qPCR을 통해 확인한 결과, miRNA17-5p mimic에서 Vimentin 수준이 대조군과 비교할 때, 높게 나타나는 것을 확인하였으며, LoVo 세포에서 miRNA17-5p mimic의 루시퍼라제 활성이 대조군과 비교할 때, 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 miRNA17-5p가 Vimentin의 3`UTR에 직접적으로 바인딩 (binding)하여 리포터 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는 miRNA17-5p의 발현에 따른 세포 이동 및 침윤 억제 효과를 확인하였는데, miRNA17-5p의 과발현 및 Vimentin의 발현을 침묵시켰을 때, LoVo 및 HT29 세포의 이동성이 대조군과 비교할 때, 감소하는 것을 확인하였으며, miRNA17-5p의 과발현 및 Vimentin의 발현을 침묵시켰을 때, LoVo 세포의 침윤이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 6 참조).

아울러, 본 발명의 발명자들은 miRNA17-5p에 따른 마우스 간전이 모델에서 Vimentin의 발현 억제 효과를 확인한 결과, miRNA17-5p를 과발현시킨 LoVo 세포주를 도입한 마우스 모델에서는 간전이가 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 7 참조).

상기 결과들을 통해 본 발명의 miRNA17-5p 바이오마커는 대장암 전이 예측 용도로 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

또한, 상기 miRNA17-5p는 대장암 전이 과정에서 EMT (Epithelial Mesenchymal Transition) 관련 인자인 Vimentin의 발현을 효과적으로 억제함으로써, 대장암의 타 장기로의 전이를 효과적으로 제어가 가능한 바, miRNA17-5p를 유효성분으로 포함하는, 전이성 대장암 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 전이 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 방법에 따라 피검자 유래 시료에서 miRNA-17의 발현수준이 정상인보다 낮을 경우, 대장암이 타 장기로의 전이가 되었음을 판정할 수 있다.

상기 microRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 차세대 염기서열 분석 (Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 전이성 대장암 치료물질 스크리닝 방법을 제공한다.

(a) 후보물질을 대장암 세포에 처리하는 단계;

본 발명에서, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 상기 핵산은 바람직하게 siRNA, shRNA, microRNA, 안티센스 RNA, 앱타머(aptamer), LNA(locked nucleic acid), PNA(peptide nucleic acid), 및 모폴리노(morpholino)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 전이성 대장암 특이적 유전자 발굴

전이성 대장암 특이적 유전자를 발굴하기 위해서, 이전 연구를 통해 43 례의 대장암 환자에서 전이가 있는 환자의 원발암 및 전이가 없는 환자의 원발암 조직을 이용하여 miRNA sequencing을 수행하였으며, 두 그룹을 비교하여 암 전이가 있는 환자에서 특이적으로 발현하는 miRNA17-5p, miRNA-424, miRNA-20a, 및 miRNA-122를 선별하였다.

이 때, 대장암 세포주 중 상피세포 타입 및 중간엽세포 타입으로 나누어 상기 miRNA17-5p, miRNA-424, miRNA-20a, 및 miRNA-122 발현과 역 상관관계를 나타내는 miRNA17-5p 및 miRNA-122를 후보군으로 선정하였으며, 이 후, miRNA를 조작하였을 때, 표현형의 변화가 없던 miRNA-122를 제외한 miRNA17-5p를 전이성 대장암 특이적 유전자 마커로서 최종적으로 선별하였다.

실시예 2. 전이성 대장암 조직에서의 miRNA17-5p의 발현 연관성 및 vimentin 발현 상관관계 확인

실시예 1에 개시된 43 례의 miRNA sequencing을 수행한 sequencing data에서 대장암 환자에서 전이가 있는 환자의 원발암 조직 및 전이가 없는 환자의 원발암 조직의 miRNA17-5p의 발현을 분석하였다.

그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 전이가 없는 대장암 조직에 비해 전이가 있는 대장암 조직에서 miRNA17-5p의 발현이 낮음을 확인하였다.

또한, 각 환자 조직에서 miRNA17-5p와 상기 miRNA가 표적하는 Vimentin 발현과의 상관관계를 분석한 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이, Vimentin의 발현이 miRNA17-5p의 발현과 역상관관계에 있음을 확인하였다.

실시예 3. 대장암 세포에서 EMT 관여인자 발현 및 miRNA17-5p 발현과의 연관성 확인

대장암 세포 (HCT-116, DLD-1, HCT-15, SW480, SW620, SW48, HT29, Colo205, LS513, RKO, 및 LoVo)에서 EMT 관여인자인 E-cadherin과 Vimentin의 발현 양상을 확인하기 위해서, 웨스턴 블롯 (western blotting) 분석을 수행하였다. 이 때, β-actin을 웨스턴 블롯 분석에서 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, E-cadherin과 Vimentin이 서로 상호작용하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, HCT-15, Colo205, LoVo, HT29 및 SW480에서 miRNA17-5p의 발현을 qRT-PCR을 통해 확인하고, EMT 관여인자인 Vimentin의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p 발현과 Vimentin 발현이 역 상관관계로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

아울러, 상기 miRNA17-5p가 EMT 관여인자의 발현에 전반적으로 관여하는지 알아보기 위해서 miRNA17-5p에 의해서 EMT 관여인자 중 상피세포 마커인 E-cadherin이 발현을 변화시키는지를 확인하였다.

그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이, Vimentin을 변화시켜서 세포를 중간엽세포로 변화시킨다면 E-cadherin의 발현도 변화할 것이라고 예측할 수 있는데, 대부분의 세포에서 뚜렷한 변화는 관찰되지 않았다.

한편, miRNA 결합 예측프로그램 따르면, EMT 관련인자인 Twist 및 Snail과 miRNA17-5p가 결합한다고 예측하였으며, 이에 실제로 상기 예측에 따라 Twist 및 Snail과 miRNA17-5p가 결합하여 발현을 조절하는지를 확인하기 위해서, miRNA17-5p를 LoVo cell에 도입하여 Twist 및 Snail의 발현을 확인한 결과, 상기 도 2c에서 나타낸 결과와 마찬가지로 도 2d에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p에 따른 발현 변화를 확인할 수는 없었다.

이에, miRNA17-5p는 Vimentin을 직접 타겟하고 Vimentin의 변화만을 유도하는 partial-EMT에 관여한다고 예측하였다.

실시예 4. 대장암 세포에서 miRNA17-5p에 의한 Vimentin 발현 조절 확인

miRNA17-5p의 발현 변화에 따른 Vimentin 발현 변화를 확인하기 위해서, miRNA mimic (4464066, Applied Biosystems, Lincoln Centre Drive Foster City, USA) 및 miRNA17 inhibitor (4464084, Applied Biosystems)를 가닥(strand) 형태로 대장암 세포에 도입하였다.

그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p mimic을 도입시킨 LoVo 및 HT29 세포에서 Vimentin의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 반대로 도 3b에 나타낸 바와 같이, miRNA-17 inhibitor를 도입시킨 대장암 세포에서는 Vimentin의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

한편, 도 3c에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포인 SW480에서 증가된 Vimentin의 발현이 miRNA17-5p mimic에 의해 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포인 Colo205에서 감소된 Vimentin의 발현이 miRNA17-5p의 발현 억제에 의해 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, Vimentin의 변화를 RNA 수준에서 관찰하기 위해서, miRNA17-5p mimic을 도입시킨 LoVo, HT29 및 SW480 세포를 사용하여 Vimentin의 발현을 RNA 수준에서 확인한 결과와 miRNA17-5p inhibitor를 처리한 LoVo, HT29 및 Colo205 세포의 Vimentin 발현 RNA 수준을 확인한 결과, 도 3e에 나타낸 바와 같이, protein 수준에서 뿐만 아니라 RNA 수준에서도 miRNA17-5p에 의해서 Vimentin의 변화가 일어난다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. Vimentin에 대한 miRNA17-5p의 직접적 조절 효과 확인

miRNA17-5p가 Vimentin의 발현을 직접적으로 조절하는지를 확인하기 위해서, 세포 용해물 (cell lysates)을 이용하여 Ago2 침전법 및 루시퍼라제 분석 (Luciferase assays)을 수행하였다.

보다 구체적으로, LoVo 및 HT29 세포에서 Vimentin과 miRNA17-5p의 상호작용을 RNP-IP (Ribonucleoprotein Immunoprecipitation)를 통해 분석하였으며, 이 때, miRNA17-5p의 면역침강 (Immunoprecipitation; IP) 물질의 Vimentin 수준은 RT-qPCR을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p mimic에서 Vimentin 수준이 대조군과 비교할 때, 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

또한, miRNA-17-5p가 vimentin 3'UTR에 붙을 것이라고 예상되는 vimentin wild type sequence, miRNA17-5p가 vimentin 3'UTR에 인위적으로 붙을 수 없게 만든 mutant sequence, wild type에 있는 하나의 mismatch를 보완하여 더욱 잘 붙을 것으로 예상되는 perfect match seqeunce를 만들고, 상기 특정 시퀀스를 루시퍼라제 벡터에 넣어 miRNA17-5p mimic과 Vimentin의 3`UTR을 LoVo 세포에 동시 형질 감염시킨 후, 루시퍼라제 분석 (Luciferase assays) 을 진행한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, LoVo 세포에서 miRNA17-5p mimic의 루시퍼라제 활성이 대조군과 비교할 때, 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 miRNA17-5p mimic이 Vimentin의 3`UTR에 직접적으로 바인딩 (binding)하여 리포터 활성을 감소시키는 것임을 알 수 있었다.

상기 결과로부터 miRNA17-5p가 Vimentin의 발현을 직접적으로 조절하는 것을 구체적으로 확인할 수 있었다.

실시예 6. miRNA17-5p의 발현에 따른 세포 이동 및 침윤 억제 효과 확인

LoVo 및 HT29 세포에서 miRNA17-5p의 발현에 따른 세포 이동 및 침윤 억제 효과를 확인하고자 세포 단층에 상처를 입힌 후, 0 시와 24 시 또는 0 시와 30 시에 상처를 낸 세포 단층의 폭을 촬영하여 세포 이동률을 확인하였다. 이 때, Vimentin의 침묵은 Vimentin siRNA (sc-29522, Santa Cruz Biotechnology, Ca, USA)를 이용하였다.

그 결과, 도 5a 및 5b에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p의 과발현 및 Vimentin의 발현을 침묵시켰을 때, LoVo 및 HT29 세포의 이동성이 대조군과 비교할 때, 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 세포 침윤을 확인하고자 Transwell 분석을 진행하였고, 이 때, 모든 실험은 세 번 반복 수행하였으며, 결과는 mean ± S.D, P < 0.05로 나타내었다.

그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p의 과발현 및 Vimentin의 발현을 침묵시켰을 때, LoVo 세포의 침윤이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 7. 동물 모델에서 miRNA17-5p 과발현에 의한 암전이 감소 효과 확인

본 발명자들은 miRNA17-5p에 따른 마우스 전이 모델에서 암전이 저해 효과를 확인하고자 하였다. 보다 구체적으로, 마우스 간전이 모델 구축을 위해 BALB/c Nude mouse를 졸레틴 (30 mg/kg)을 이용해 마취시킨 후, 일반 LoVo 세포 및 miRNA17-5p mimic 도입 LoVo 세포를 비장에 injection 후, MRI (Magnetic resonance imaging)를 이용하여 간전이 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 6a의 화살표에 나타낸 바와 같이, LoVo 세포를 도입한 마우스 모델에서는 간전이가 검출되는 것을 확인할 수 있었으나, miRNA17-5p mimic 도입 LoVo 세포를 도입한 마우스 모델에서는 간전이가 검출되지 않는 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 마우스 모델의 간을 적출하여 H&E 염색 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 간전이가 관찰되고 있는 반면에 miRNA17-5p를 과발현시킨 LoVo 세포를 도입한 마우스 모델에서는 간전이가 검출되지 않는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 과발현시킨 LoVo 세포를 도입한 마우스 모델에서는 7 마리 중 5 마리 (71 %)에 전이가 발생한 것을 확인할 수 있었으나, miRNA17-5p를 과발현시킨 LoVo 세포를 도입한 마우스 모델에서는 7 마리 중 1 마리 (14 %)에만 전이가 발생한 것을 확인할 수 있었다.

Group	Cell no.	Liver metastasis
LoVo con-miR	1.2 ⅹ 10⁶	5/7 (71 %)
Lovo miR17-mimic	1.2 ⅹ 10⁶	1/7 (14 %)

아울러, RT-PCR을 이용하여 대조군 및 miRNA17-5p mimic 군에서 miRNA17-5p 및 Vimentin의 발현을 확인한 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교할 때, miRNA17-5p mimic 군에서 miRNA17-5p의 발현이 증가되는 것을 확인할 수 있었으며, 도 6d에 나타낸 바와 같이, miRNA17-5p mimic 군에서 대조군과 비교할 때, Vimentin의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Biomarker microRNA17-5p for predict metastasis of colorectal cancer and uses thereof <130> PD18-122 <150> KR 1020190006989 <151> 2019-01-18 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> miRNA17-5p <400> 1 caaagugcuu acagugcagg uag 23

Claims

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하기 단계를 포함하는, 전이성 대장암 치료물질 스크리닝 방법:
(a) 후보물질을 대장암 세포에 처리하는 단계;
(b) 상기 후보물질이 처리된 대장암 세포에서 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현 또는 활성을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군에 비해 상기 마이크로RNA17-5p (miRNA17-5p)의 발현 또는 활성 수준을 증가시키는 물질을 전이성 대장암 치료물질로 선정하는 단계.