KR101884992B1 - 조절 miRNA의 검출방법 및 이를 이용한 대장암 바이오마커 - Google Patents

조절 miRNA의 검출방법 및 이를 이용한 대장암 바이오마커 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1) 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하는 제1단계; 2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계; 3) 암유전체지도(TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 종양 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계; 4) 제 2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 종양 miRNA 데이터와 비교하여 공통된 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 얻는 제 4단계; 5) 상기 제4단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제5단계; 6) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 5폴드 이상인 값만으로 재정렬된 miRNA 결과 (2)를 얻는 제6단계; 7) 암억제 유전자 데이터베이스부터 암억제 유전자 리스트를 얻고, 상기 얻어진 암억제 유전자 리스트와 상기 정렬된 miRNA 결과 (2)와 비교하여 공통된 결과로부터 암억제 유전자 선별결과를 얻는 제7단계; 8) 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과와 (2) 상기 제7단계에서 얻어진 암억제 유전자 선별결과를 암억제 유전자를 표적예측 데이터베이스와 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제8단계; 9) 상기 제8단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제9단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법에 관한 것이다.
나아가 본 발명은 대장암 조절 miRNA를 검출하고, 이를 통하여 대장암 바이오 마커 및 치료제에 적용할 수 있다.

Description

조절 miRNA의 검출방법 및 이를 이용한 대장암 바이오마커{Detecting method for controlling miRNA and its application of biomarker for colon cancer}
본 발명은 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터로부터 얻어진 결과물을 통하여 대장암 바이오마커에 적용하는 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발현수준별 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻어서, 상기 공통된 결과물로부터 조절 miRNA를 검출하여, 이를 대장암 바이오마커에 적용하는 것이다.
나아가 본 발명은 대장암 조절 miRNA를 검출하여, 이를 치료제에 적용하는 것이다. 또한 본 발명은 조절 miRNA를 검출하여, 검출된 결과를 기초로 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체에 적용할 수 있다.
다수의 질환 상태는 유전적 DNA 카피수의 변화 또는 특정 유전자의 전사 수준의 변화를 통한 다양한 유전자의 발현 수준상의 차이를 특징으로 한다. 예를 들면, 유전물질의 득실이 악성 형질전환과 진행에 있어서 중요한 역할을 한다. 이들 유전물질 중에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로는 miRNA가 알려져 있다.
miRNA는 1993년 미국 하버드대 앰브로스(V.Ambros) 교수팀에 의해 처음으로 밝혀졌다. 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 발생시기를 조절하는 유전자를 찾던 중에 lin-4라고 명명된 짧은 RNA 단편이 LIN-14 단백질의 합성에 영향을 준다는 것을 발견하였으나, 이 후 같은 종에서 조절인자로서 역할을 하는 let-7이라고 명명된 RNA 단편이 추가로 발견되면서 miRNA의 존재와 기능에 대한 관심이 증가하게 되었다. 또한 miRNA는 21개에서 25개의 뉴클레오티드(nucelotide)로 이루어진 작은 단일가닥염기(single-strand nucleotide)로서, 진핵생물에서 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 선충(C. elegance)에서 발현되는 miRNA가 1993년 앰브로스 그룹에 의해서 발견된 후, 현재까지 700종 이상이 인간세포에 존재하고 있음이 밝혀졌다.
miRNA의 생합성은 크게 두 가지 효소의 절단에 의해서 진행된다. 먼저 miRNA를 포함하고 있는 유전자가 RNA 중합효소 II 또는 III(RNA polymerase II/III)에 의해서 전사되어 다양한 크기의 miRNA 전사체(transcript)가 합성이 된다. 이러한 과정으로 합성된 primary miRNA(pri-miRNA)는 5‘말단에 cap (7-methylguanylate cap)과 3'말단에 poly[A] tail을 가지고 있다. Pri-miRNA는 핵 내에 존재하는 Drosha라는 RNA 절단효소와 DGCR8(DiGeorge critical region 8)으로 구성된 microprocessor complex에 의해서 70여개의 nucleotide 길이로 된 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 가공된다. Pre-miRNA는 exportin5와 Ran-GTP를 통해서 세포질로 나온 후, 두 번째 절단효소인 Dicer와 TRBP(transactivating response RNA binding protein)에 의해서 20-25개의 nucleotide로 구성된 성숙한 이중가닥의 miRNA로 가공된다.
이중가닥 중에서 한 가닥은 분해되고, 다른 한 가닥만이 Ago(Argonaute)와 함께 결합하여 RISC(RNA-induced silencing complex)를 구성한다. TRBP는 Ago와 miRNA의 결합을 유도하여 miRNA가 표적유전자의 발현을 조절할 수 있도록 한다. 일반적으로 miRNA는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 miRNA의 안정성(stability)을 낮추거나 번역율(translation efficiency)을 낮추어 표적유전자의 발현을 억제한다.
최근에는 생물학적으로 miRNA가 유전자의 발현을 조절하는 중요한 조절인자임이 밝혀지고, 또한 지금까지 동식물을 포함한 32가지의 종에서 15,172개의 miRNA가 발견됨에 따라 대량의 데이터를 처리하고 분석하기 위하여 생물정보학적 연구방법이 도입되었다.
또한 최근에는 코돈 패턴 마이닝(mining)법을 통하여 유전성 대장암을 유발하는 원인 유전자의 일정한 패턴들을 발견함으로써 암 발생 여부를 사전에 예측할 수 있다. 특히, 세균에서 사람에 이르기까지 연구된 모든 형태의 생물에서 같은 코돈이 같은 아미노산을 지정한다는 특성을 고려하여 유전자 패턴 중에서도 코돈 패턴에 초점을 맞추었다. 하나의 코돈 패턴은 하나의 아미노산을 지정하게 되는데, 여러 아미노산은 단백질의 구성요소가 되며, 만약 코돈의 패턴변이가 일어나게 되면 단백질이 원래의 기능을 상실하게 되어 예상치 못한 신체 이상이 생기되므로 DNA 서열을 일련의 유전자 마이닝 기법을 응용하여 일정한 코돈들의 패턴을 추출하여 변이된 코돈 패턴을 발견함으로서 대장암의 조기진단에 이용될 수 있다.
miRNA들의 서열 및 정보, 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스들이 구축되었는데, miRBase, ASRP, miRNA Map 등이 널리 이용되는 대표적인 데이터베이스들이다. 또한, miRNA 유전자 후보나 miRNA의 표적 유전자를 예측하는 다양한 알고리즘과 이를 적용할 수 있는 애플리케이션 개발도 활발히 진행되고 있다
miRNA 유전자의 후보를 예측하는 방법에는 일반적으로 RNA 구조(RNA conformation) 기반 검색, 유사한 서열을 가진 miRNA에 대한 호몰로지(homology) 검색, miRNA 특성 값을 적용한 기계학습(machine-learning) 방법에 의한 접근 등이 사용된다. RNA 구조에 기반한 검색은 pre-miRNA가 가지는 머리핀(hairpin) 구조의 물리화학적 특징을 이용하는 방법으로서, 특정 염기서열이 열역학적으로 안정한 머리핀 구조를 가질 수 있는 지를 계산하여 miRNA의 후보인지를 예측하는 과정이다.
호몰로지 검색에 의한 예측은 염기서열의 유사 정도를 확률적으로 계산하여 후보를 예측하는 방법으로서, 진화적으로 보존되어 있는 miRNA의 서열 예측에 매우 유용하게 적용된다. 기계학습 방법을 통한 예측은 생물정보학 연구에서 널리 사용하는 방법으로 이미 알려진 miRNA에 대한 염기서열이나 분포, 구조적 특이성, 진화보존성과 같은 특징들을 이용하여 반복적으로 학습(training)시킨 후, 새로운 염기서열 정보가 입력되었을 때 학습된 사항에 따라 결과를 예측해 주는 방법이다.
이와 관련한 종래기술로서, 하기 특허 문헌 001은 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 다중 miRNA를 검출하는 것을 기술하고 있으나, 이와 같은 방법으로는 정확한 miRNA의 특성을 파악할 수 없다. 또 하기 특허문헌 002은 miRNA의 정량분석하는 방법에 관한 것이나, 이는 미지의 miRNA를 파악할 수 있는 정확성이 떨어지는 실정이다. 또한 하기 특허문헌 003은 miRNA의 탐색자동화시스템에 관한 것이나, 단순한 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(D/B)의 맵핑 툴을 이용하는 것으로 단순하게 동정하는 방법에 대해 개시되어 있을 뿐이다. 하기 특허문헌 004는 ncRNA 서열의 컴퓨터 동정방법만이 개시되어 있다.
이에 본 발명자들은 이러한 종래 기술상의 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, miRNA의 데이터 마이닝을 통한 신규의 최적화된 miRNA 분석방법으로서, miRNA의 분석 능력을 향상하기 위하여, 2회 이상의 데이터베이스의 비교분석을 통해 정확한 miRNA를 분석하고, 이를 통하여 암세포의 발현을 예측할 수 있는 miRNA의 데이터 마이닝을 통한 최적화된 miRNA 분석방법을 연구하여 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허공보 제10-2013-0122541호(2013. 11. 07) 한국공개특허공보 제10-2014-0108913호(2014. 9. 15) 한국공개특허공보 제10-2014-0114684호(2014. 9. 29) 한국등록특허 제0504039(2005. 7. 19)
본 발명은 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻고, 상기 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 표적예측 데이터베이스 및 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻은 후에, 상기 공통된 결과물로부터 조절 miRNA를 검출하여 이를 대장암 바이오 마커에 적용하는 것이다.
나아가 본 발명은 조절 miRNA를 검출하여, 검출된 결과를 기초로 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체 및 치료제에 적용할 수 있다.
본 발명은 1) 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하는 제1단계; 2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계; 3) 암유전체지도(TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 종양 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계; 4) 제 2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 종양 miRNA 데이터와 비교하여 공통된 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 얻는 제 4단계; 5) 상기 제4단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제5단계; 6) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 5폴드 이상인 값만으로 재정렬된 miRNA 결과 (2)를 얻는 제6단계; 7) 암억제 유전자 데이터베이스부터 암억제 유전자 리스트를 얻고, 상기 얻어진 암억제 유전자 리스트와 상기 정렬된 miRNA 결과 (2)와 비교하여 공통된 결과로부터 암억제 유전자 선별결과를 얻는 제7단계; 8) 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과와 (2) 상기 제7단계에서 얻어진 암억제 유전자 선별결과를 암억제 유전자를 표적예측 데이터베이스와 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제8단계; 9) 상기 제8단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제9단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 제8단계와 상기 제9단계 사이에 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과(2)와 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법을 제공한다.
한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.
본 발명은 대장암의 특이적 miRNA를 얻기 위해, 발현수준별 miRNA 데이터를 TSgene(암억제 유전자) 데이터베이스를 통해 대장암 특이적 저발현 암억제 유전자를 선별한 후, 표적예측 데이터베이스와 비교하여 공통된 결과물을 얻고, 또한 추가로 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 비교하여 공통된 결과물을 얻은 후에, 상기 공통된 결과물로부터 조절 miRNA를 검출하는 것으로 이를 통해 암세포의 발현을 정확하게 예측할 수 있으며, 특히 대장암 발현 miRNA 분석의 효율을 높일 수 있는 효과를 가진다.
나아가 본 발명에 따른 조절 miRNA의 검출결과를 기초로 하여, 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체 및 치료제를 제공할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조절 miRNA 검출방법에 대한 흐름도이다.
도 2는 RET를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록 및 발현배율에 따른 점유율이다.
도 3는 APC를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록 및 발현배율에 따른 점유율이다.
도 4는 PTEN를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록 및 발현배율에 따른 점유율이다.
도 5은 SMAD4를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록 및 발현배율에 따른 점유율이다.
도 6은 TP53를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록 및 발현배율에 따른 점유율이다.
도 7은 UNC5C를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 8은 TMEFF2를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 9는 TGF - β1를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 10은 TET2를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 11은 SMCHD1를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 12는 SCUBE2를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 13은 PDCD4를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 14는 CLDN1를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록으로 발현배율이 5배이상이다.
도 15은 종양억제유전자를 조절할 수 있는 조절 miRNA ID 결과 (I)이다.
도 16은 종양억제유전자를 조절할 수 있는 조절 miRNA ID의 클러스터링 결과이다.
도 17은 종양억제유전자를 조절할 수 있는 조절 miRNA ID 결과 (II)이다.
이하, 본 발명의 조절 miRNA를 검출을 통하여, 얻어지는 대장암 바이오 마커에 대하여 바람직한 실시형태를 들어 자세하게 설명한다.
본 발명은 1) 미지의 바이오 시료로부터 miRNA를 추출하는 제1단계; 2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계; 3) 암유전체지도(TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 종양 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계; 4) 제 2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 종양 miRNA 데이터와 비교하여 공통된 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 얻는 제 4단계; 5) 상기 제4단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제5단계; 6) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 5폴드 이상인 값만으로 재정렬된 miRNA 결과 (2)를 얻는 제6단계; 7) 암억제 유전자 데이터베이스부터 암억제 유전자 리스트를 얻고, 상기 얻어진 암억제 유전자 리스트와 상기 정렬된 miRNA 결과 (2)와 비교하여 공통된 결과로부터 암억제 유전자 선별결과를 얻는 제7단계; 8) 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과와 (2) 상기 제7단계에서 얻어진 암억제 유전자 선별결과를 암억제 유전자를 표적예측 데이터베이스와 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제8단계; 9) 상기 제8단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제9단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 제8단계와 상기 제9단계 사이에 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과(2)와 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻는 단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법을 포함하는 것을 특징으로 한다.
먼저, 상기 제1단계에 있어서, 미지의 바이오 시료는 신선한 또는 냉동된 암조직, 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 신선한 또는 냉동된 암조직의 암은 대장암, 유방암, 위암, 전립선암, 신장암, 간암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 혈액암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니나, 특히 대장암에 효과적이다.
또한 상기 바이오 시료로부터 미지의 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 트리졸 또는 트리톤 X-100을 이용하여 추출할 수 있다.
그리고 제8단계의 표적예측 데이터베이스는 당업계에서 다양하게 공개된 miRWalk, MicroT4, miRanda, miRBridge, miRDB, miRMap, miRNAMap, PICTAR2, PITA, RNA22, RNAhybrid, Targetscan 중에서 1종 이상을 선택하여 이용할 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니다.
또한 상기 제8단계와 상기 제9단계 사이의 RNA 레퍼런스 데이터베이스는 당업계에서 다양하게 공개된 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR 중에서 1종 이상을 선택하여 이용할 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니다.
또한 상기 기재된 TSgene 데이터베이스는 당업계에서 다양한 암에서 저발현된 암억제 유전자에 대한 공지의 데이터베이스로서, 표적예측데이터베이스와 과발현된 miRNA의 암 특이적 상관관계를 입증할 수 있으며, 이제 제한된 것은 아니다.
또한 상기 기재된 TGCA는 암유전체지도(The Cancer Genome Atlas)로서, 미국 국립암연구소(NCI)와 국립인간게놈연구소(NHGRI)에서 33개 암 종류에 대한 주요 게놈 변경의 종합 다차원 맵을 생성한 것이다. 이로써 게놈 데이터의 둘 이상의 패턴을 이루어지는 TCGA 데이터는 공개적으로 이용 가능하게 되었으며, 이러한 게놈 정보는 암의 예방, 진단 및 치료를 개선하기 위해 암 연구 생태계를 돕는다. 따라서 암유전체지도(TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용할 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니다.
나아가 본 발명으로 얻어진 조절 miRNA의 검출을 통하여 종양억제유전자를 파악할 수 있으며, 종양억제유전자는 SMAD4, RET, PTEN, TP53, APC, CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2, UNC5C 등이 있다. 이들 중 1종 이상의 조합을 통하여 비교 분석할 수 있다.
SMAD4는 염색체 18번(18q21)에서 종양억제유전자로 처음 클론되었고, 췌장암에서 결손되거나, 돌연변이에 의해 인산화되어 활성화된다. SMAD4는 종양의 발생 및 진행에 있어 중요한 인자로 알려져 돌연변이가 관찰되므로 DPC4(deleted in pancreatic carcinoma locus 4)로 명명되었는데, TGF-β 신호전달에 있어서 중심적인 역할을 하므로 종양발생에 있어서도 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 실제적으로 SMAD4는 췌장암 이외에도 결직장암, 대장암, 유방암, 난소암, 두경부암, 전립선암 등에서 보고되었으며, 식도 및 위암 등에서도 돌연변이가 관찰되었다. 이러한 여러 보고들로부터 SMAD4의 돌연변이를 유발하여 이에 따른 종양세포의 변화를 관찰하고 SMAD4가 종양의 발생에 있어서 중요한 역할을 하고 있다.
PTEN은 인산화 효소로서 403개의 아미노산으로 구성되어 있으며, PTEN의 넓고 깊으며 양전하를 띠고 있는 기질(substrate) 결합부위 주머니는 phosphoinositide substrate의 수용에 중요한 역할을 한다. 이런 PTEN 특유의 형태는 점진적으로 보호되었고 인산화 효소의 활성이 줄어들도록 유도하는 종양 관련 PTEN 돌연변이의 표적이 되었다. C-terminal 부위는 170개의 아미노산으로 이루어져 있고 PLC1(phospholipase C1), protein kinase C(PKC), PLA2와 유사한 C2 부위가 존재하는데 이는 세포막의 인지질과 결합할 수 있어서 PTEN이 세포의 이주 (migration)를 억제할 수 있도록 한다. 짧은 N-termianl 부위에는 PBD (PtdIns(4,5)P2-binding domain)를 가지고 있으며 C-terminal 꼬리에는 PEST 염기서열과 PDZ-domain 연관 motif를 포함하고 있다. 모든 PTEN domain에 발생하는 종양 연관 돌연변이의 다양성은 언급한 각각의 부위가 생리적으로 PTEN 관련 종양형성(tumorigenesis)에 관련되어 있다는 것을 나타낸다. 따라서 PTEN 유전자는 여러 종류의 암의 발생과 진행을 막는데 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 지금까지의 연구 결과들을 종합적으로 판단하면 PTEN이 기능을 잃거나 PTEN에 돌연변이가 발생하면 악성 세포들이 통제되지 못한 증식을 거듭하여 암으로 발전하게 된다는 것이다
TP53는 암의 활성화를 제어시키는 역할을 하는 종양억제유전자로서, DNA가 손상을 받았을 때는 DNA가 정상으로 복구될 때까지 세포 분열을 중단시키거나, DNA 손상이 복구하기 힘들 정도로 심할 경우에는 세포 자살을 명령하여 세포를 보호하는 기능을 한다. 그런데 TP53유전자에 돌연변이가 발생하면 암의 활성을 제어시키지 못하게 되어 발암률이 매우 높아지게 된다. 정상 TP53유전자에 돌연변이가 발생함으로써 암억제 기능이 상실되고, 이에 따라 세포는 암화가 진행된다. 즉, 염색체상의 TP53 유전자가 결손되거나, 점 돌연변이 되는 것이 암 발병의 한 가지 요인이며, 이로써 TP53은 이젠 종양을 촉진하는 유전자로 변신한 셈이다. 따라서 TP53은 다세포 생물의 세포 주기에서 암 억제자로서 암을 예방하기에 중요하다.
APC 유전자는 15개의 엑손으로 구성되어 있으며 총 2,843개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 생성하는데, 이 단백질은 세포들 사이의 부착에 관여하는 단백질인 β카테닌이라는 단백질과 결합하여 세포 사이의 신호전달에 관여함으로써 세포의 성장 조절에 영향을 미친다. APC 유전자는 종양억제유전자의 일종이므로 쌍으로 된 유전자 중 1개에서만 돌연변이가 발생해도 세포를 형질 변환시키는 암유전자와는 달리 2개에서 모두 돌연변이가 발생하여 정상 역할을 하는 단백질의 생성이 되지 않아야 암을 일으킨다. 그런데 그다지 흔한 경우는 아니지만 면역세포도 활성산소의 공격으로 인해 산화스트레스를 장기간 받거나 암바이러스에 감염이 되면, 다른 세포와 마찬가지로 돌연변이를 일으켜 암을 일으키는 발암유전자(oncongene)으로 변신해버린다.
RET는 형질 주입할 때에 유전자재편성에 의해 ret유전자의 5′측에서 유전자재편성을 일으킨 결과, 활성화한 암유전자로서 분리한 유전자이며, ret라는 이름은 rearranged during transfection에서 유래한 것이다. RET는 유전자 재편성에 의해 생산된 것에는 막관통영역 전후에서 그 상류가 다른 DNA배열과 치환하고 있다. ret유전자는 10번염색체의 장완(10q11.2)에 위치하고 있다. 이어맞추기의 차이에 따라 C말단 측의 배열이 다른 2종류의 단백질이 생산되는데, 형질전환 활성에는 차이가 없다. 가족성 갑상샘유사암, 다내분비종양(MEN)에서 고빈도로 유전자의 점돌연변이가 나타난다. 따라서 RET에 돌연변이가 발생하면, 악성 세포들이 통제되지 못한 증식을 거듭하여 암으로 발전하게 된다는 것이다.
CLDN1는 단백질을 코딩하는 유전자로서, CLDN1과 관련된 질병에는 백혈구, 탈모 및 경화성 담관암 등에 관련된다.
PDCD4는 유전자는 세포 증식의 핵에 국부적인 단백질을 암호화한다. 이 유전자의 발현 및 자연 살해 T 세포의 사이토카인에 의해 조절된다. 유전자 산물은 세포 사멸에 중요한 역할을 하는 것이지만, 특정 역할은 아직 결정되지 않았다.
SCUBE2는 Signal peptide-CUB-EGF domain-containing protein 2로서, 분비 및 멤브레인 관련 다중 도메인 SCUBE 단백질 패밀리에 속해 있고, SCUBE2는 새로운 종양 억제를 예측하는 유용한 지표 중의 하나이다.
SMCHD1는 유전자 DNA의 구조를 변화시켜 유전자 활성 조절에 관여하는 단백질을 제조하기 위한 것이다. 즉 SMCHD1 단백질은 DNA 분자로(하나의 C 원자, 세 개의 H 원자로 이루어진 페닐) 메틸기의 부가인 DNA 메틸화에서 역할을 수행한다. DNA의 메틸화 때문에 활성영역이 켜져 적은 수의 유전자를 갖는 경향이 커집니다.
TET2는 암세포를 억제하는 역할을 한다는 것으로 DNA에 작용하는 효소로서, 염기의 화학적 변화에 관여한다.
TGF-β1은 폴리펩티드 부재인 형질전환 성장인자 베타상과의 사이토카인 및 TGF-β1의 조절을 포함한 많은 세포 기능을 수행하는 단백질로서, 세포 성장, 세포 증식, 세포 분화 및 세포 사멸에 관련된다. TGF-β1은 면역 체계의 제어에 중요한 역할을 한다.
TMEFF2는 단백질이 인간에 부호화된 유전자로서, 역전사 중합효소의 연쇄반응되며, 또한 TMEFF2는 암세포 성장에 관련되다,
UNC5C는 돌연변이와 종양의 진행 정도는 직접 관련이 있는 것으로서, 대장암 발생에도 적용되고 새로운 암 표지자로 사용될 수 있는 것으로 알려져 있다.
또한 본 발명에서 사용된 용어인 ‘발현’은 소정 핵산 또는 miRNA의 측정 가능한 발현 수준을 지칭한다. 핵산의 발현 수준은 당업계에서 잘 알려진 통계학적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 또한 폴드(fold)는 발현 변화값을 의미하며, 이는 당업계에서 잘 알려져 있다.
miRNA를 추출하여 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 이용하여 조절 miRNA를 검출하기 위해서는 하기의 방법을 통해 실시할 수 있다.
(1) miRNA 서열 데이터는 미지의 시료에서 리드 카운트(read count)에 기초하여 컴퓨터화한 miRNA의 정량적인 발현 수준을 포함한다. 둘 이상의 샘플에서의 miRNA 발현 비교를 위해, 각각의 서열 분석 샘플에서의 발현 수준은 샘플에서 총 리드 수에 의해 정규화된다. RPM은 각 샘플에 대해 생산된 정규화 발현 수준의 값이다. 따라서 데이터에서의 miRNAs의 발현 수준을 필요로 하기 때문에 miRNA 및 RPM을 사용한다.
(2) 플랫폼은 오류를 포함하는 모든 시퀀스를 검출하기 때문에 이러한 일루미나(Illumina)의 게놈 분석기 플랫폼과 같은 단일-분자-기반 플랫폼은 일반적으로 고유의 높은 오류를 표시한다. 높은 오류율이 낮은 리드 카운트를 야기한다. miRNAs 발현 수준의 차이에 따라, 5 폴드 이상(RPM>5), 5폴드 미만에서 2.5 폴드 이상(5>RPM≥2.5), 2.5 폴드 미만(RPM<2.5)에서 miRNA IDs는 3 군으로 sorting 하였다. 수집된 대량의 데이터에서 저 수준 발현(<2.5) 및/또는 변경 없는 miRNA IDs는 오류를 방지하기 위해 제거하였다.
(3) miRNA IDs 및 분자 표적의 상호작용을 조사하기 위해, miRNA-표적 예측 데이터베이스인 mirWalk, DIANA-microT, miranda, miRBridge, miRDB, miRmap, miRNA Map, PITA, RNA22 및 Targetscan에서 가능한 miRNA IDs는 다섯 개의 신뢰할 수 있는 D/B(miRWalk, miranda, miRDB, RNA22 및 TargetScan)를 통해 재확인되었다. 다섯 D/Bs에서 3 이상, SUM 값을 기준으로 한 조절 miRNA IDs를 선별 한다. 다섯 D/Bs를 비교하여 두 번 확인함으로써, 우리는 세 가지 사실을 얻을 수 있다. 우선 표적 유전자와 조절 miRNA IDs 사이의 상관관계였다. 두 번째 것은 특정 유전자에 속하는 예측된 miRNAs 신뢰성이었다. 마지막 것은 의미가 없는 조절 miRNA IDs의 완전한 제거를 통해 추출된 조절 miRNA IDs의 정확도를 높였다.
(4) 각 표적 유전자는 5 폴드 이상(RPM>5), 5폴드 미만에서 2.5폴드 이상(5 >RPM≥2.5) 및 2.5 폴드 미만으로 표시된 복수의 조절 miRNA IDs를 갖는다. 추출된 miRNAs는 타겟 유전자를 통해 대장암 발생을 촉진할 수 있는 종양 miRNAs가 있는 것으로 추측되었다. 각 조절 miRNA ID 데이터는 대장암 예방에 효과적이고 새로운 타겟이 될 수 있는 공통적인 것을 선별하기 위하여 클러스터링한다.
나아가 본 발명은 조절 miRNA를 검출하여, 검출된 결과를 기초로 판독 가능한 프로그램으로 기록되는 기록매체를 제조할 수 있고, 치료제 또는 바이오 마커에 이용될 수 있다.
아래의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정된 것은 아니다.
<실험예 1> 냉동된 대장암조직의 RNA 추출방법
냉동된 대장암조직의 바이오 시료(cell line HT-29, 한국세포주 은행)를 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 바이오시료 50~100㎎을 잘게 부수고 나서, 트리아졸 1㎖에 넣은 후, 클로로포름 0.2㎖를 첨가하여 실온에서 3분간 방치하고, 12000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 새 튜브에 옮긴 후에 이소프로필알콜 0.5㎖를 가하여 10분간 방치한다. 다시 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고, RNA 펠렛을 DEPC 처리한 75% 에탄올 1㎖를 가하고 테이핑한 후 12000rpm에서 5분간 원심분리하여 다시 상등액을 버리고, 나머지 RNA 펠렛을 10분간 실온 건조한다.
<실험예 2> 정상 바이오 조직의 RNA 추출방법
정상 바이오 조직(normal colon cell line CCD841, 한국세포주 은행)을 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 실험예 1과 같다.
<실험예 3> 체세포의 RNA 추출방법
체세포 바이오 시료를 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 실험예 1과 같다.
<실험예 4> 생체세포의 RNA 추출방법
생체세포 시료를 준비하고, 준비된 생체세포 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 생체세포시료 50~100㎎을 잘게 부수는 점만 다를 뿐이고, 나머지 공정은 실험예 1과 같다.
실험예 1에서 제조된 RNA펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, miRNA의 데이터 마이닝을 통한 최적화된 miRNA 분석방법을 나타내는 흐름도에 따라서 최적화된 miRNA 분석방법을 실시하였다. 파악된 염기서열을 통해 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류하였다. 그리고 암유전체지도(TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 종양 miRNA 데이터를 획득하였고, 이후 미지의 시료로부터 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터와 암유전체지도로부터 얻어진 발현수준별 종양 miRNA 데이터를 비교하여 공통된 발현 수준별 miRNA 결과를 얻는다. 얻어진 공통된 발현수준별 miRNA 결과를 발현수준별 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류하고, 분류된 그룹으로부터 5폴드 이상인 값만으로 재정렬된 발현수준별 miRNA 결과(결과 A)를 얻는다. 이후 암억제 유전자 데이터베이스로부터 암억제 유전자 리스트를 얻고, 얻어진 암억제 유전자 리스트와 재정렬된 발현수준별 miRNA 결과(결과 A)와 비교하여 얻어진 공통된 결과로부터 암억제 유전자 선별결과를 얻는다.
그 후에 결과 A와 암억제 유전자 선별결과를 표적예측 데이터베이스인 mirWalK, DIANA-microT, miranda, miRBridge, MiRDB, Mirmap, miRNA Map, PITA, RNA22, Targetscan와 비교하여 공통된 결과(결과 B)로부터 miRNA를 얻는다.
다시 결과 A와 암억제 유전자 선별결과를 레퍼런스 데이터베이스인 miRBase, ASRP, micro RNAMAP, miRGen, CoGemiR와 비교하여 공통된 결과(결과 C)를 얻는다. 얻어진 결과 B와 C를 서로 비교하여 공통된 결과로부터 정확성이 높은 miRNA를 얻는다.
실험예 2로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 조절 miRNA 결과를 얻는 흐름도에 따라서 실시하였고, 얻어진 결과로부터 miRNA를 얻는 방법은 실시예 1과 같다.
실험예 3으로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하여 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 조절 miRNA 결과를 얻는 흐름도에 따라서 실시하였고, 얻어진 결과로부터 miRNA를 얻는 방법은 실시예 1과 같다.
실험예 4로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하여 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 도 1에서 나타낸 바와 같이, 조절 miRNA 결과를 얻는 흐름도에 따라서 실시하였고, 얻어진 결과로부터 miRNA를 얻는 방법은 실시예 1과 같다.
도 2 내지 6에서와 같이, 종양억제유전자와 관련한 예측된 miRNA 목록으로 분류하였다. 도 2는 RET를 조절할 수 있는 추정 miRNA 목록에 관한 것이며, RET은 5폴드 이상(≥5)의 miRNA는 전체의 15%를 점유하고[86 miRNAs], 다음에 5폴드 미만 2.5폴드 이상이 2%[7 miRNAs]를 가진다.
도 3은 miRNAs을 조절하는 APC는 5폴드 이상(≥5)의 miRNAs는 전체의 4%를 점유하고[50 miRNAs], 다음에 5폴드 미만 2.5폴드 이상이 0.4%를 점유하였다.
도 4는 miRNAs를 조절하는 종양억제유전자인 PTEN에 관련한 것으로 5폴드 이상(≥5)의 miRNAs는 전체의 20%[99 miRNAs]을 점유하였고, 5폴드 미만 2.5폴드 이상이 2%를 점유하였다.
도 5는 miRNA를 조절하는 종양억제유전자로 SMAD4에 관한 것으로 5폴드 이상(≥5)의 miRNA는 전체의 19%를 점유하고[175 miRNAs], 다음에 5폴드 미만 2.5폴드 이상이 2%를 점유하였다,
도 6은 miRNA를 조절하는 종양억제유전자로 TP53에 관한 것으로 5폴드 이상(≥5)의 miRNA는 전체의 1.3%를 점유하고[67 miRNAs], 5폴드 미만 2.5폴드 이상이 0.1%를 점유하였다.
도 15 및 16은 종양억제유전자에 관한 것으로 SMAD4, RET, PTEN, TP53, APC를 모두 조절할 수 있는 조절 miRNA ID로는 miR-335-3p를 파악할 수 있었다. 또한 조절 miRNA ID가 miR-26b-5p, miR-200a-3p, miR-106a-5p, miR-22-3p, miR-141-3p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-125a-5p, miR-140-3p 중 하나인 경우에는 종양억제유전자인 SMAD4, RET, PTEN, TP53, APC 중에서 4개를 선택하여 조절할 수 있는 것으로 파악되었다. 또한 조절 miRNA ID가 miR-27a-3p, miR-7-1-3p, miR-148a-5p, miR-27b-3p, miR-589-3p, miR-107, miR-33a-3p, miR-616-5p, miR-3065-5p, miR-577, miR-150-5p, miR-296-5p, miR-766-3p, miR-495-3p, miR-330-3p, miR-320a, miR-3065-3p, miR-93-5p, miR-429, miR-30d-3p, miR-16-1-3p, miR-20a-5p, miR-379-5p, miR-92b-3p, miR-30e-3p, miR-200c-3p, miR-19a-3p, miR-30a-3p, miR-20b-5p, miR-381-3p, miR-182-5p, miR-3609, miR-330-5p 중 하나인 경우에는 종양억제유전자인 SMAD4, RET, PTEN, TP53, APC 중에서 3개를 선택하여 조절할 수 있는 것으로 파악되었다.
도 17은 종양억제유전자를 조절할 수 있는 조절 miRNA ID 결과(II)에 관한 것으로, 종양억제유전자는 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2, UNC5C에 대하여 조절할 수 있는 조절 miRNA에 관한 것이다.
조절 miRNA ID가 has-miR-590-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-20b-3p 중 하나 이상인 종양억제유전자인 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2, UNC5C 중 5개를 조절할 수 있는 것으로 파악되었다.
조절 miRNA ID가 hsa-miR-126-5p, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-539-5p, hsa-miR-224-3p, hsa-miR-642a-3p, hsa-miR-642a-5p, hsa-miR-493-5p, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-185-3p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-214-5p, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-3609, hsa-miR-224-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19a-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-33a-3p, hsa-miR-33a-5p, hsa-miR-203a, hsa-miR-335-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-let-7a-2-3p, hsa-miR-552-5p, hsa-miR-195-3p, hsa-miR-95-5p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200b-3p, hsa-let-7g-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR-20b-5p 중 하나 이상인 것은 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2, UNC5C 중 4개를 조절하는 것으로 파악되었다.
마지막으로, 조절 miRNA ID는 hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-196b-5p, has-miR-455-5p, hsa-miR-150-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-27b-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-
497-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-589-3p, hsa-miR-186-3p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-30d-3p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200a-5p, hsa-miR-222-5p, has-miR-3065-5p, hsa-miR-450b-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-26b-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-382-3p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-4677-5p, hsa-miR-552-3p, hsa-miR-577, has-miR-148a-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-26a-2-3p, hsa-miR-135b-5p, has-miR-183-3p, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-410-5p, hsa-miR-381-3p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-let-7b-5p, has-miR-106a-3p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-25-5p 중 하나 이상인 것은 종양억제유전자인 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2, UNC5C 중 3개를 조절하는 것으로 파악되었다.
이상 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명하였다. 상기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니다. 상기 실시예에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.

Claims (15)

1) 미지의 바이오 시료인 신선한 또는 냉동된 대장암조직, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득되는 것에서 miRNA를 추출하는 제1단계;
2) 상기 제1단계에서 추출된 miRNA로부터 서열화된 miRNA의 발현수준별 miRNA 데이터를 얻는 제2단계;
3) 암유전체지도(TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 종양 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계;
4) 제 2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 종양 miRNA 데이터와 비교하여 공통된 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 얻는 제 4단계;
5) 상기 제4단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 결과 (1)를 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만으로 서열화시키는 제5단계;
6) 상기 제3단계의 서열화된 miRNA 데이터에서 발현수준이 5폴드 이상인 값만으로 재정렬된 miRNA 결과 (2)를 얻는 제6단계;
7) 종양억제 유전자 데이터베이스부터 종양억제 유전자 리스트를 얻고, 상기 얻어진 종양억제 유전자 리스트와 상기 정렬된 miRNA 결과 (2)와 비교하여 공통된 결과로부터 종양억제 유전자 선별결과를 얻는 제7단계;
8) 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과와 (2) 상기 제7단계에서 얻어진 종양억제 유전자 선별결과를 종양억제 유전자를 표적예측 데이터베이스와 비교하여 공통된 결과물을 얻는 제8단계;
9) 상기 제8단계에서 얻어진 공통된 결과물로부터 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA ID를 검출하는 제9단계; 를 포함하되,
상기 제8단계와 상기 제9단계 사이에 상기 제6단계에서 얻어진 재정렬된 miRNA 결과(2)와 RNA 레퍼런스 데이터베이스와 동시에 비교하여 공통된 결과물을 얻는 단계; 를 추가하고,
상기 제9단계 의 종양억제유전자는 SMAD4, RET, PTEN, TP53 및 APC이고, 이를 모두 제어하는 조절 miRNA ID는 miR-335-5p인 것을 특징으로 하는 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법.
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제1항에 있어서,
상기 제9단계의 종양억제 유전자는 SMAD4, RET, PTEN, TP53 및 APC이고,
그 중 4개를 제어하는 조절 miRNA ID는 miR-26b-5p, miR-200a-3p, miR-106a-5p, miR-22-3p, miR-141-3p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-125a-5p 및 miR-140-3p이되,
상기 miR-26b-5p는 SMAD4, PTEN, TP53 및 APC를 제어하고,
상기 miR-200a-3p는 SMAD4, RET, PTEN 및 TP53을 제어하고,
상기miR-106a-5p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-140-3p는 SMAD4, RET, PTEN 및 APC를 제어하고,
상기 miR-22-3p, miR-141-3p는 SMAD4, RET, PTEN 및 TP53을 제어하고,
상기 miR-125a-5p는 SMAD4, RET, TP53 및 APC를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법.

제1항에 있어서,
상기 제9단계의 종양억제 유전자는 SMAD4, RET, PTEN, TP53 및 APC이고, 그 중 3개를 제어하는 조절 miRNA ID가 miR-27a-3p, miR-7-1-3p, miR-148a-5p, miR-27b-3p, miR-589-3p, miR-107, miR-33a-3p, miR-616-5p, miR-3065-5p, miR-577, miR-150-5p, miR-296-5p, miR-766-3p, miR-495-3p, miR-330-3p, miR-320a, miR-3065-3p, miR-93-5p, miR-429, miR-30d-3p, miR-16-1-3p, miR-20a-5p, miR-379-5p, miR-92b-3p, miR-30e-3p, miR-200c-3p, miR-19a-3p, miR-30a-3p, miR-20b-5p, miR-381-3p, miR-182-5p, miR-3609, miR-330-5p이되,
상기 miR-27a-3p, miR-27b-3p, miR-296-5p, miR-766-3p, miR-379-5p, miR-330-5p는 SMAD4, RET 및 TP53을 제어하고,
상기 miR-7-1-3p, miR-589-3p, miR-33a-3p, miR-577, miR-30d-3p, miR-20a-5p, miR-30e-3p, miR-30a-3p, miR-20b-5p는 SMAD4, PTEN 및 APC를 제어하며,
상기 miR-148a-5p, miR-616-5p, miR-92b-3p, miR-19a-3p는 SMAD4, PTEN 및 TP53을 제어하고,
상기 miR-107, miR-495-3p, miR-320a, miR-3065-3p, miR-93-5p, miR-429, miR-16-1-3p, miR-200c-3p, miR-3609는 SMAD4, RET 및 PTEN을 제어하며,
상기 miR-3065-5p, miR-150-5p, miR-330-3p, miR-381-3p는 SMAD4, TP53 및 APC를 제어하고,
상기 miR-182-5p는 SMAD4, RET 및 APC를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 제9단계의 종양억제 유전자는 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2 및 UNC5C이고, 그 중 5개를 제어하는 조절 miRNA ID는 has-miR-590-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-145-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-20b-3p이되,
상기 has-miR-590-5p는 PDCD4, SCUBE2, TET2, TGF-β1 및 TMEFF2를 제어하고,
상기 hsa-miR-21-5p는 PDCD4, SCUBE2, TET2, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-145-5p는 PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-142-3p는 PDCD4, SMCHD1, TET2, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-20b-3p는 PDCD4, TET2, TGF-β1, TMEFF2 및 UNC5C를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 제9단계의 종양억제 유전자는 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2 및 UNC5C이고, 그 중 4개를 제어하는 조절 miRNA ID는 hsa-miR-126-5p, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-539-5p, hsa-miR-224-3p, hsa-miR-642a-3p, hsa-miR-642a-5p, hsa-miR-493-5p, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-185-3p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-204-5p, hsa-miR-582-5p, hsa-miR-214-5p, hsa-miR-330-5p, hsa-miR-3609, hsa-miR-224-3p, hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19a-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-33a-3p, hsa-miR-33a-5p, hsa-miR-203a, hsa-miR-335-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-let-7a-2-3p, hsa-miR-552-5p, hsa-miR-195-3p, hsa-miR-95-5p, hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200b-3p, hsa-let-7g-3p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR-20b-5p이되,
상기 hsa-miR-126-5p, hsa-miR-539-5p, hsa-miR-642a-3p는 SCUBE2, SMCHD1, TET2 및 TGF-β1을 제어하고,
상기 hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-224-3p, hsa-miR-3613-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-224-3p, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-183-5p는 PDCD4, SMCHD1, TET2 및 UNC5C을 제어하며,
상기 hsa-miR-642a-5p는 SCUBE2, SMCHD1, TET2 및 TMEFF2를 제어하고,
상기 hsa-miR-493-5p는 SCUBE2, TET2, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-185-3p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-214-5p, hsa-miR-26b-5p,
hsa-miR-33a-3p, hsa-miR-33a-5p, hsa-miR-335-3p, hsa-miR-552-5p, hsa-miR-95-5p는 SCUBE2, SMCHD1, TET2 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-155-5p, hsa-miR-3609는 PDCD4, SCUBE2, TET2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-204-5p는 SCUBE2, TET2, TMEFF2 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-582-5p, hsa-let-7a-2-3p, hsa-let-7g-3p는 SMCHD1, TET2, TMEFF2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-330-5p, hsa-miR-20b-5p는 PDCD4, TET2, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-19a-3p, hsa-miR-19a-5p는 SMCHD1, TET2, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-203a는 CLDN1, SMCHD1, TET2 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-195-3p는 PDCD4, TET2, TMEFF2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-200b-5p, hsa-miR-200b-3p는 TET2, TGF-β1, TMEFF2 및 UNC5C를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법.
제1항에 있어서,
상기 제9단계의 종양억제 유전자는 CLDN1, PDCD4, SCUBE2, SMCHD1, TET2, TGF-β1, TMEFF2 및 UNC5C이고, 그 중 3개를 제어하는 조절 miRNA ID는 hsa-miR-340-5p, hsa-miR-374b-5p, hsa-miR-576-5p, hsa-miR-429, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-224-5p, hsa-miR-196b-5p, hsa-miR-455-5p, hsa-miR-150-3p, hsa-miR-150-5p, hsa-miR-141-3p, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-17-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-27b-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-497-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-589-3p, hsa-miR-186-3p, hsa-miR-186-5p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-30d-3p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-143-3p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-200a-3p, hsa-miR-200a-5p, hsa-miR-222-5p, hsa-miR-3065-5p, hsa-miR-450b-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-26b-3p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-382-3p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-4677-5p, hsa-miR-552-3p, hsa-miR-577, hsa-miR-148a-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-7-1-3p, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-26a-2-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-183-3p, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-410-5p, hsa-miR-381-3p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-106b-5p, hsa-miR-362-3p, hsa-let-7b-5p, hsa-miR-106a-3p, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-25-5p이되,
상기 hsa-miR-340-5p는 SMCHD1, TET2 및 TMEFF2를 제어하고,
상기 hsa-miR-374b-5p는 PDCD4, TET2 및 TMEFF2를 제어하며,
상기 hsa-miR-576-5p, hsa-miR-628-3p, hsa-miR-628-5p, hsa-miR-196b-5p는 SCUBE2, SMCHD1 및 TET2를 제어하고,
상기 hsa-miR-429는 TET2, TGF-β1 및 TMEFF2를 제어하며,
상기 hsa-miR-224-5p, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-30e-5p, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-27b-5p, hsa-miR-93-3p, hsa-miR-495-3p, hsa-miR-30d-3p, hsa-miR-30d-5p, hsa-miR-222-5p, hsa-miR-3065-5p, hsa-miR-450b-3p, hsa-miR-450b-5p, hsa-miR-27a-3p, hsa-miR-27a-5p, hsa-miR-4677-5p, hsa-miR-183-3p, hsa-miR-381-3p는 SMCHD1, TET2 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-455-5p, hsa-miR-150-3p, hsa-miR-150-5p는 PDCD4, SMCHD1 및 TET2를 제어하며,
상기 hsa-miR-141-3p, hsa-miR-200a-3p는 PDCD4, SCUBE2 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-17-3p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-497-3p, hsa-miR-497-5p, hsa-miR-186-3p, hsa-miR-186-5p는 PDCD4, TET2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-22-3p, hsa-miR-22-5p, hsa-miR-589-3p, hsa-miR-25-5p는 TET2, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-143-3p, hsa-miR-143-5p, hsa-miR-26b-3p, hsa-miR-552-3p, hsa-miR-148a-5p, hsa-miR-125a-3p는 SCUBE2, TET2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-146b-3p, hsa-miR-369-3p, hsa-miR-382-3p, hsa-miR-382-5p, hsa-miR-7-1-3p는 TET2, TMEFF2 및 UNC5C을 제어하고,
상기 hsa-miR-200a-5p, hsa-miR-424-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-199b-3p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-20a-3p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-26a-2-3p, hsa-miR-135b-5p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-106b-3p, hsa-miR-106b-5p, hsa-let-7b-5p, hsa-miR-106a-3p, hsa-miR-106a-5p는 PDCD4, TET2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-577는 CLDN1, SMCHD1 및 UNC5C를 제어하고,
상기 hsa-miR-410-5p는 SMCHD1, TMEFF2 및 UNC5C를 제어하며,
상기 hsa-miR-362-3p는 SMCHD1, TGF-β1 및 UNC5C를 제어하는 것을 특징으로 하는 종양억제 유전자를 제어하기 위한 조절 miRNA의 검출방법.
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