CN108998532B

CN108998532B - 一种直肠腺癌的诊治标志物

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Publication number: CN108998532B
Application number: CN201811012635.8A
Authority: CN
Inventors: 董东; 石小峰
Original assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-08-04
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN108998532A

Abstract

本发明公开了一种直肠腺癌的诊治标志物，所述诊治标志物为lncRNALOC102723961。本发明公开了LOC102723961在制备直肠腺癌诊断和治疗产品中的应用以及相应的产品。本发明同时公开了LOC102723961在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用以及构建诊断直肠腺癌的计算模型中的应用。

Description

一种直肠腺癌的诊治标志物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种直肠腺癌的诊治标志物，所述标志物为LOC102723961。

背景技术

直肠癌是源自于直肠的常见的消化道恶性肿瘤，在男性和女性中的发病率基本一致，位居全球肿瘤发病率和死亡率的第四位。近年，随着人们预防保健意识的增强和检查手段的不断提高，直肠癌早期发现率和手术治愈率显著增加。然而，由于人们生活方式的改变、人口数量增长和人口老龄化等因素的影响，无论在发达国家还是发展中国家直肠癌仍呈现不断上升的趋势，已成为严重危害人类健康的全球性疾病(Manner survivalBauerfeind P:Impact of socioeconomic status on incidence,mortality,andcolorectal cancer patients:a systematic review.Gastrointest 2014 80(1):42-60e49.)。

直肠癌病因至今尚未完全清楚，普遍认为多数的直肠癌源于散发性腺瘤，少数由遗传性息肉或炎症性肠道病变发展而来。直肠癌的诊断和治疗主要依据肿瘤的原发病灶、淋巴结转移及远处转移情况，即TNM(Tumor-node-metastasis)分期作为主要参考指标。约90％的早期直肠癌患者(TNM I/II)手术即可治愈，患者五年生存率高(Przybyla AqCrockett JA,Rex JC,et al:Current screening guidelines overlook a significantnumber of patients treated for colorectal cancer.Am Surg 2014,80(6):539-543.)；中晚期转移性直肠癌(TNM III/IV)患者以放化疗为主，患者五年生存率不高。肿瘤复发、转移和肿瘤细胞耐药是患者预后不良的主要影响因素(Sheridan J,Wa1sh P,KevansD,et al:Determinants of short-and long-term survival from colorectal cancerin very elderly patients.JGeriatr Oncol 2014,5(4):376-383.)。在临床工作中，具有同样临床病理类型和TNM分期的直肠癌患者，对治疗的反应存在着显著差异。

在精准医疗时代的背景下，已发现多种肿瘤分子与肿瘤的相关性，这些相关分子已被应用于肿瘤的分子诊断和靶向治疗中。通过不同分子标志物鉴别直肠癌也已成为指导治疗和预后评估的重要参考指标。同时，基于不同分子的靶向药物应用也成为肿瘤治疗的一种新型手段，是以在肿瘤发生发展中起关键作用的癌基因或参与的信号通路作为其发挥作用的靶标分子，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。因此，在直肠癌的基础研究中，发现直肠癌癌变相关的分子生物标记物和药物靶标，也是目前肿瘤研究的热点问题之一，发现更多、更有效、更特异的与直肠癌发生、发展密切相关的基因作为分子标志物，可进一步优化靶向治疗与传统治疗方案，实现个体化精准医疗，对提高患者生存率和改善生存质量具有重要意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种与直肠腺癌发生发展相关的lncRNA生物标志物及其在直肠腺癌诊断和治疗中的应用。

本发明的目的之二在于提供一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法。

本发明的目的之三在于提供lncRNA生物标志物在构建诊断直肠腺癌的计算模型中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测LOC102723961的表达水平。

进一步，所述试剂包括特异性识别LOC102723961的探针；或特异性扩增LOC102723961的引物。

进一步，所述特异性扩增LOC102723961的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种直肠腺癌的诊断模型，所述模型包括一种或几种生物标志物指标，所述生物标志物为LOC102723961。

本发明的第五方面提供了一种组合物，所述组合物包括LOC102723961的抑制剂。所述抑制剂选自：以LOC102723961或其转录本为靶序列、且能够抑制LOC102723961基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～14所示。

优选的，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7～8所示。

本发明的第六方面提供了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC102723961基因的体系；和

检测所述体系中LOC102723961基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制LOC102723961基因的水平，则表明该待筛选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。

所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对LOC102723961基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明的第七方面提供了如下任一项应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用；

d.LOC102723961在构建诊断直肠腺癌的计算模型中的应用；

e.LOC102723961在制备治疗直肠腺癌、或直肠腺癌侵袭、或直肠腺转移的药物中的应用；

f.本发明第五方面所述的组合物在制备治疗直肠腺癌、或直肠腺癌侵袭、或直肠腺癌转移的药物中的应用；

g.LOC102723961在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用。

本发明的优点与有益效果：

本发明首次发现了LOC102723961的差异表达与直肠腺癌的发生发展相关，通过检测LOC102723961的表达水平可以判断患者是否患有直肠腺癌。

本发明首次发现了LOC102723961表达水平的变化可以引起直肠腺癌细胞增殖、侵袭和转移的变化，据此可以将其应用于直肠腺癌的治疗。

本发明公开了一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，通过检测待选物质是否可以下调LOC102723961的表达水平来判断待筛选物质是否是候选药物。

附图说明

图1是利用QPCR检测LOC102723961基因在直肠腺癌组织中的表达情况图；

图2是检测siRNA对LOC102723961的沉默效果图；

图3是CCK8法检测LOC102723961对直肠腺癌细胞增殖的影响图；

图4是利用划痕实验检测LOC102723961对直肠腺癌迁移的影响图；

图5是利用Transwell小室检测LOC102723961对直肠腺癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

标志物

在本发明中，“标志物”、“生物标志物”“基因标志物”可以通用，指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

LOC102723961

转录LOC102723961的基因是位于人17号染长臂2区5带上，本发明中的LOC102723961包括野生型、突变型或其片段。在本发明的实施例中，一种代表性的转录LOC102723961基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LOC102723961基因(XR_935021.3)所示。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

lncRNA水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(northern blots)、核糖核酸酶保护试验和基于PCR的方法。当生物标志物是lncRNA分子时，lncRNA序列或其片段可以用于制备至少有部分互补的探针。然后采用例如基于PCR的方法、RNA印迹法(Northernblotting)或试纸条检测(dipstick assay)等任何合适的测定法，可以用探针检测样品中的lncRNA序列。

所述测定方法可以根据所需lncRNA信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(Northern blots)和基于PCR的方法(例如，qRT-PCR)。qRT-PCR等方法也可以对样品中lncRNA的量进行准确定量。

试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测LOC102723961的表达水平的试剂，以及选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

芯片

本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LOC102723961所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片可用于检测包括LOC102723961基因在内的多个基因(例如，与直肠腺癌相关的多个基因)的表达水平，将直肠腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高直肠腺癌诊断的准确率。

在本发明中，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于直肠腺癌的风险或与有助于评估直肠腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有直肠腺癌风险的个体、具有直肠腺癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估直肠腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

抑制剂和药物组合物

基于发明人的发现，本发明提供了一种LOC102723961的抑制剂，所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要，只要它抑制LOC102723961基因的功能性表达即可，举例来说，本发明的抑制剂可以是以LOC102723961基因为靶序列、且能够抑制LOC102723961基因的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调LOC102723961有用的物质，可用于治疗直肠腺癌。

作为本发明的一种优选方式，所述LOC102723961的抑制剂是一种LOC102723961特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的lncRNA为靶目标降解特定的lncRNA，这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

在筛选有效的siRNA序列时，本发明人通过大量的比对分析，从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列，并将它们分别通过转染试剂转染直肠腺癌细胞系进行验证，选出干扰效果最佳的siRNA，在本发明的具体实施例中，该siRNA的序列如SEQID NO.7～8所示，进一步地在细胞水平实验，结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LOC102723961基因的表达水平，以及直肠腺癌细胞的增殖。

本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成，也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物，可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内，或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。

作为本发明的一种可选方式，所述的LOC102723961的抑制剂也可以是一种“小发夹RNA(Small hairpin RNA，shRNA)”，其是能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，小发夹RNA能够通过RNA干扰途径来抑制基因的表达。如上述，shRNA可以由双链DNA模板来表达。双链DNA模板被插进一个载体，例如质粒或病毒载体，然后在体外或体内连接到一个启动子进行表达。shRNA在真核细胞内DICER酶的作用下，可被切割成小干扰RNA分子，从而进入RNAi途径。“shRNA表达载体”是指一些本领域常规用于构建shRNA结构的质粒，通常该质粒上存在“间隔序列”以及位于“间隔序列”两边的多克隆位点或供替换序列，从而人们可以将shRNA(或类似物)相应的DNA序列通过正向和反向的方式插入多克隆位点或替换其上的供替换序列，该DNA序列转录后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)结构。所述的“shRNA表达载体”目前已经完全可以通过商购的途径购买获得，例如一些病毒载体。

在本发明中，“药物”、“药物组合物”可以通用。作为可选择的实施方案中，药物组合物包括LOC102723961的抑制剂以及药学上可接受的载体。药学可接受的载体的实例是软化水或蒸馏水；盐水溶液；植物油类，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油，麻油类，如花生油(peanutoil)、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油、花生油(arachisoil)或椰子油；硅油类，包括聚硅氧烷类，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性硅酮类；矿物油类，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级烷醇类，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇类(aralkanols)；低级聚烷撑二醇类或低级烷撑二醇类，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇或甘油；脂肪酸酯类，如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄耆树胶或阿拉伯胶和凡士林。一般载体或多种载体形成组合物的10wt％至99.9wt％。

组合物可以是适合注射给药的剂型、适合口服摄取的剂型(如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适合局部给药的油膏、乳膏或洗剂形式、适合用作滴眼剂的递送剂型、适合通过吸入给药的气雾剂形式(如通过鼻内吸入或口吸入)、适合胃肠外给药的剂型，即皮下、肌肉内或静脉内注射。

对于可注射溶液或悬液的给药，无毒的胃肠外可接受的稀释剂或载体可包括林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1，2丙二醇。

用于口服的合适载体、稀释剂、赋形剂和佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯胶、黄耆树胶、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、明胶和卵磷脂。另外，这些口服剂型可含有合适的调味剂和着色剂。当以胶囊剂型使用时，胶囊可用能延缓崩解的化合物包被，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

佐剂典型地包括润滑剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀菌剂和缓冲剂。

口服给药的固体剂型可包含在人和兽医药学实践中可接受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于口服给药的液体剂型除了上述药物以外，还可包含液体载体。合适的液体载体包括水、油类如橄榄油、花生油(peanutoil)、麻油、向日葵油、红花油、花生油(arachisoil)、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。

用于口服给药的悬液可进一步包括分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙稀吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰乙醇。合适的分散剂包括卵磷脂、如硬脂酸之类的脂肪酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-或二-油酸酯、-硬脂酸酯或-月桂酸酯和类似物。

用于口服给药的乳剂可进一步包括一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括上面所例举的分散剂或天然树胶，如瓜尔胶、阿拉伯胶或黄耆树胶。

本发明的药物组合物还可与其他治疗直肠腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 筛选与直肠腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集3例直肠腺癌癌旁正常上皮组织和直肠腺癌组织样本，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，无其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病，癌旁正常上皮组织取自距肿瘤上缘5cm处，所有的患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取，具体操作按说明书进行。

3、总RNA定量与纯度分析

将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD260/280介于1.8～2.2之间。

4、构建cDNA文库

1)去除rRNA

使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；

2)片段化RNA

对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。

3)反转合成cDNA

利用Illumina TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建，在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以lncRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。

4)连接adaptor

加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。

5)UNG酶消化cDNA二链

用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。

5、测序

使用Illumina X-Ten测序平台，进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)tophat比对到参考基因组上。所用的参考基因组版本为GRCh38.p7，fasta和gff文件下载自NCBI；

3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)cuffdiff比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异表达lncRNA的筛选标准：p_value<0.05，|log₂FC|>1。

7、结果

结果显示，与癌旁正常上皮组织相比，LOC102723961在直肠腺癌组织中的表达水平显著上调。

实施例2 QPCR测序验证LOC102723961基因的差异表达

1、对LOC102723961基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择直肠腺癌癌旁正常组织和直肠腺癌组织各45例。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH₂O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT EnzymeMix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH₂O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物设计

根据Genebank中LOC102723961基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

LOC102723961基因：

正向引物为5’-TGCTGGAGAGTGATAGTA-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-TCTGTTGGCTTGTCTTAC-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：

2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROXReference Dye^△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：

95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环，95℃15s，60℃60s，95℃15s)。

4)cDNA模板浓度的筛选

将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品RealTime PCR检测

将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

QPCR结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁正常组织相比，LOC102723961在直肠腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；阳性检出率＝上调表达例数/总检测例数×100％＝40/45＝88.9％，提示LOC102723961在直肠腺癌的诊断中具有较高的应用价值。

实施例3 LOC102723961基因的沉默

1、细胞培养

人直肠腺癌细胞株HRC-99，以含10％小牛血清和1％P/S的RPMI1640培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用含EDTA的0.25％胰蛋白酶常规消化传代，取处于对数生长期的细胞用于实验。

2、siRNA的设计

针对LOC102723961基因的序列设计siRNA，设计的siRNA序列如下所示：

阴性对照siRNA-NC的序列：

正义链：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5)，

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6)；

siRNA1：

正义链：5’-AAGAAGAACCGUAAAGGAGUA-3’(SEQ ID NO.7)，

反义链：5’-CUCCUUUACGGUUCUUCUUCC-3’(SEQ ID NO.8)；

siRNA2：

正义链：5’-UGAAGAUGAGCAAUGUCUCAU-3’(SEQ ID NO.9)，

反义链：5’-GAGACAUUGCUCAUCUUCAGA-3’(SEQ ID NO.10)；

siRNA3：

正义链为5’-AGGUUAACCUCUGUGAAUGUU-3’(SEQ ID NO.11)，

反义链为5’-CAUUCACAGAGGUUAACCUGG-3’(SEQ ID NO.12)

siRNA4：

正义链为5’-ACGCUUUAGCUGAUGAAGCAU-3’(SEQ ID NO.13)，

反义链为5’-GCUUCAUCAGCUAAAGCGUGG-3’(SEQ ID NO.14)

3、转染

将细胞按1×10⁴/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的RPMI1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为空白对照组(HRC-99)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1、siRNA2、siRNA3、siRNA4)，其中阴性对照组siRNA与LOC102723961基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

4、QPCR检测LOC102723961基因的转录水平

1)细胞总RNA的提取

使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA，具体步骤详见说明书。

2)逆转录步骤同实施例2。

3)QPCR扩增步骤同实施例2。

5、结果

结果如图2显示，与HRC-99和转染空载siRNA-NC组相比，实验组(siRNA1～4)能降低LOC102723961的水平，其中siRNA1的效果最为显著，因此选择siRNA1进行后续实验。

实施例4 LOC102723961对直肠腺癌细胞增殖的影响

1、直肠腺癌细胞HRC-99接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用脂质体2000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换新培养基。

2、转染siRNA1后培养24h，将干扰组细胞和对照组细胞消化，在96孔板中接种转染后的HRC-99细胞悬液以及各对照组(100μl/孔)，接种密度为5×10⁴/L。将培养板放在培养箱中预培养(37℃，5％CO₂)。

3、向每孔加入10μl CCK8溶液。

4、将培养板放在培养箱内培养1-4h。

5、使用酶标仪测定在490nm处的吸光度。

6、结果

结果如图3所示，与对照组相比，siRNA1转染组的细胞增殖减缓，差异具有显著统计学意义(P<0.05)，提示LOC102723961与直肠腺癌细胞的增殖相关，可将其作为可能的潜在靶标应用与直肠腺癌的治疗中。

实施例5划痕实验检测转染siRNA后直肠腺癌细胞增殖、迁移能力

1、将HRC-99细胞平铺于六孔板中，待细胞密度达到85％-90％，使用Lipo 2000转染siRNA1，无血清培养4-6h后更换培养基。

2、直肠腺癌细胞将培养板底部均匀盖满后，用1ml枪头对准孔板保持垂直角度进行细胞划痕，尽可能使每个划痕的宽度相同。

3、去除细胞原培养液，用磷酸盐缓冲液对孔板进行冲洗，将由于细胞划痕形成的碎片洗去，加入无血清培养基，进行拍照，留取数据。

4、培养板置于细胞培养箱进行培养，培养4-6h后将培养板取出，再次拍照、记录数据，计算划痕愈合率。

5、结果

结果如图4所示，随着培养时间的增长，siRNA1组的划痕愈合率明显低于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，抑制LOC102723961的表达可以降低直肠腺癌细胞的迁移，提示LOC102723961可作为治疗直肠腺癌的可能的分子靶标。

实施例6 Matrigel侵袭实验

1、结直肠癌HRC-99细胞接种于6孔板中培养，待细胞密度达到85％-90％，使用Lipo 2000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换培养基。

2、干扰组和对照组培养24h后，胰酶消化离心，使用无血清培养基进行重悬，调整细胞密度为5×l0⁵个/ml，将200μl不含胎牛血清的基础培养基细胞悬液加入已铺好Matrigel基质胶的Transwell小室，24孔板的下室加入500μl含10％胎牛血清的培养基，细胞培养24h。

3、细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

4、结果

结果如图5所示，与对照组相比，实验组的穿膜细胞数减少，说明细胞侵袭能力明显下降(P<0.05)，提示LOC102723961可作为治疗直肠腺癌侵袭的潜在的分子靶标。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种直肠腺癌的诊治标志物

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctggagag tgatagta 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctgttggct tgtcttac 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 7

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagaagaacc guaaaggagu a 21

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cuccuuuacg guucuucuuc c 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ugaagaugag caaugucuca u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagacauugc ucaucuucag a 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agguuaaccu cugugaaugu u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cauucacaga gguuaaccug g 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acgcuuuagc ugaugaagca u 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcuucaucag cuaaagcgug g 21

Claims

1.一种筛选治疗直肠腺癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC102723961 基因的体系；和

检测所述体系中LOC102723961 基因的表达水平；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制LOC102723961基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗直肠腺癌的候选药物。

2.如下任一项应用：

a.试剂在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用，其特征在于，所述试剂能够检测LOC102723961的表达水平；

b.试剂盒在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括能够检测LOC102723961的表达水平的试剂；

c.芯片在制备诊断直肠腺癌的工具中的应用，其特征在于，所述芯片包括能够检测LOC102723961的表达水平的试剂；

d. LOC102723961在构建诊断直肠腺癌的计算模型中的应用；

e. LOC102723961的抑制剂在制备治疗直肠腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂降低LOC102723961的表达水平；

f.组合物在制备治疗直肠腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括LOC102723961的抑制剂，所述抑制剂降低LOC102723961的表达水平；

g. LOC102723961在筛选治疗直肠腺癌的候选药物中的应用，其特征在于，所述候选药物降低LOC102723961的表达水平。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a-c中所述试剂包括特异性识别LOC102723961的探针；或特异性扩增LOC102723961的引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增LOC102723961的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，f中的抑制剂为siRNA。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.7~12所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，siRNA的序列如SEQ ID NO.7~8所示。