KR101506916B1 - miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법 - Google Patents

miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 시료로부터 분석된 미가공의 RNA 염기서열 데이터를 자동 전처리하여 정제된 스몰 RNA(small RNA) 서열들을 생성하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 정제된 스몰 RNA 서열들을 대상으로 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 miRNA를 자동 탐색하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 자동 탐색된 miRNA를 대상으로 생물학적 검색 프로그램을 이용하여 타겟 유전자를 동정하는 단계; 및 (d) 동정된 결과를 레포팅하는 단계를 포함하는 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법과 상기 방법을 수행하기 위한 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 기록한 기록매체에 관한 것이다.

Description

miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법{Method for identifying miRNA automatically from sample using miRNA automated detection system}
본 발명은 microRNA (miRNA) 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 (a) 시료로부터 분석된 미가공의 RNA 염기서열 데이터를 자동 전처리하여 정제된 스몰 RNA(small RNA) 서열들을 생성하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 정제된 스몰 RNA 서열들을 대상으로 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 miRNA를 자동 탐색하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 자동 탐색된 miRNA를 대상으로 생물학적 검색 프로그램을 이용하여 타겟 유전자를 동정하는 단계; 및 (d) 동정된 결과를 레포팅하는 단계를 포함하는 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법과 상기 방법을 수행하기 위한 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 기록한 기록매체를 제공한다.
miRNA는 세포 내에서 유전자의 전사를 중지시킴으로써 유전자의 발현을 직접적으로 조절하게 되는 작은 RNA 집단 중의 하나이다. 따라서, 유전체 데이터에서 miRNA를 동정해 내는 작업은 생물학적으로 상당히 중요한 것으로 당업계에서 여겨지고 있으며, 이에 miRNA의 예측 방법 및 동정 방법에 대한 연구가 전 세계적으로 이루어지고 있다.
그러나, 수많은 유전자 서열을 포함하고 있는 유전체 데이터 중의 서열 하나하나에 대해서 실험적으로 miRNA를 동정해내는 작업은 엄청난 시간의 소요와 실험 경비로 인해, 유전체 데이터에서 miRNA를 정확하고 신속하게 동정해낼 수 있는 알고리즘의 개발이 요구되고 있으며, 이러한 알고리즘은 생물학적 실험에서의 시간과 경비를 상당히 절감할 수 있으며, 생물학적으로 miRNA를 동정하는 많은 어려움을 덜어줄 수 있다.
종래에 miRNA와 같은 ncRNA [단백질로 코딩되지 않는 RNA; non-coding RNA(ncRNA)]의 2차 구조에서 공통적인 구조 정보를 추출하는 방법에는 크게 두 가지 접근방법이 주목받았다. 하나는 RNA의 2차 구조의 유사성을 직접적으로 분석할 수 있는 구조 얼라인먼트 (structural alignment) 방법이며, 다른 하나는 여러 개의 염기서열이 주어졌을 때 상동성이 높은 모티프(motif)를 찾기 위해 Hidden Makov Model (HMMs) 방법을 사용하는 것처럼, 여러 개의 RNA가 주어졌을 때 구조적 상동성을 갖는 모델을 학습하는 방법이다.
현재, miRNA를 탐색하기 위한 단계별 프로그램들이 많이 개발되고 있지만, 기존의 프로그램들은 각 단계별로 사용되는 입력 파일 및 출력 파일들의 포맷이 모두 다르고 miRNA를 탐색하기 위한 일련의 파이프라인이 구축되지 않아 생명정보학 전문지식을 갖추지 못한 대부분의 연구자에게 사용의 많은 제한이 따랐다. 몇몇 프로그램들은 miRNA 탐색의 핵심 모듈만을 자동화하기도 하였으나 시퀀서로부터 얻은 미가공의 RNA 염기서열 데이터로부터 최종 miRNA 후보를 탐색하는 일련의 과정을 자동화한 프로그램은 아직 개발되지 않았다. 따라서 본 발명에서는 miRNA 탐색 일련의 전 과정을 자동화함으로써 사용자가 시퀀서로부터 나온 샘플 서열들로부터 몇 번의 마우스 클릭만을 이용하여 miRNA를 탐색할 수 있는 개선된 miRNA 탐색 자동화 시스템을 제공하고자 하는 것이다.
한국등록특허 제0504039호에서는 'ncRNA 서열의 컴퓨터적 동정 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2007-0004957호에서는 'ncRNA 검출 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법에 대해서는 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 기존의 miRNA 탐색 시스템이 3'-어댑터를 제거(trimming)하거나 낮은 퀄리티의 서열을 자동으로 제거하는 등의 전처리 과정 및 레퍼런스 지놈과의 매핑(bowtie, blast, BWA 등을 이용)을 따로 처리한 후 miRNA 탐색 시스템 포맷에 맞는 입력 파일을 만들어야 하는 번거로움, 또한 각 단계별 모듈은 서로 다른 형태의 입력 파일 포맷을 가지고 독립된 모듈로 사용되었기 때문에, 이들 프로그램을 이용하여 miRNA 후보 탐색을 하려면 파일 포맷을 맞추는 일을 비롯하여 시스템 분석 흐름(flow)을 사용자가 직접 구성하여 분석 진행해야 하는 점 및 miRNA 2차 구조를 생성하는 과정에서 헤어핀 내의 스몰 RNA 서열 위치를 파악하기 어려운 점을 극복하기 위해, miRNA 탐색 일련의 전 과정을 자동화함으로써 사용자가 시퀀서로부터 나온 샘플 서열들로부터 몇 번의 마우스 클릭만을 이용하여 miRNA를 탐색하는 개선된 miRNA 탐색 자동화 시스템을 구축함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은
(a) 시료로부터 분석된 미가공의 RNA 염기서열 데이터를 자동 전처리하여 정제된 스몰 RNA(small RNA) 서열들을 생성하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 정제된 스몰 RNA 서열들을 대상으로 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 miRNA를 자동 탐색하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 자동 탐색된 miRNA를 대상으로 생물학적 검색 프로그램을 이용하여 타겟 유전자를 동정하는 단계; 및
(d) 동정된 결과를 레포팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 기록한 기록매체를 제공한다.
본 발명의 miRNA 탐색 시스템은 전 과정을 자동화하여 시퀀서로부터 얻은 미가공의 RNA 염기서열 데이터(fastq) 자체와 레퍼런스 지놈 서열 및 유전정보 파일만을 가지고 miRNA 후보 서열 자동 탐색이 가능하며, 여러 프로그램 및 각 옵션을 선택할 수 있도록 개발되어 사용자의 편의성이 증대되었다.
또한, 본 발명은 기존 miRNA 후보 탐색에 있어 개발되지 않은 자동화 시스템에 관한 것으로 보고되지 않은 miRNA 혹은 다른 종에서 보존되는 것으로 알려진 miRNA 탐색 전 과정을 자동화함으로써 miRNA를 연구하는 연구자들에게 단지 몇 번의 마우스 클릭만으로 사용자는 각종 포맷의 입력 파일로부터 보존된 miRNA 또는 신규한 miRNA 후보를 탐색하여 논문에 직접적으로 사용되는 데이터 및 그림 등을 레포팅하여 miRNA 연구를 가속화시킬 수 있으며, 식물뿐 아니라 동물, 인간의 miRNA 후보 탐색시스템으로 응용할 수 있음을 제시할 수 있어, 매우 유용하다.
도 1은 본 발명에서 구현된 miRNA 탐색 시스템 (miRAuto)의 GUI(graphical user interface)로, 지놈 타입(moldel plant genome과 non-model plant genome)에 의해 적합한 모듈이 선정됨을 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 개발된 miRNA 탐색 시스템의 분석 흐름도(work flow)이다.
도 3은 본 발명의 miRNA 탐색 시스템을 이용한 예측된 miRNA의 길이에 따른 5'시작 뉴클레오타이드(A/U/G/C) 분포 그래프이다.
도 4는 본 발명의 miRNA 탐색 시스템으로 예측된 miRNA 후보에 대해 성숙형을 포함한 전구체(precursor)에 대한 RNA폴드(RNAfold) 및 리드 뎁스(read depth)를 보여주고 그에 해당하는 2차 구조(헤어핀 구조)를 제공하며, 또한 헤어핀 내에서 성숙형 부분에 해당되는 스몰 RNA의 영역을 붉은색으로 표시하여 사용자에게 보다 편의성을 제공함을 구현한 예를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 miRNA 탐색 시스템으로 다른 종에서 보존되는 miRNA 후보군과 샘플 특이적으로 나타나거나 새로 밝혀진 miRNA 후보군의 리스트를 엑셀을 이용하여 결과를 볼 수 있으며. 해당 miRNA 후보에 대한 2차 구조는 하이퍼 링크를 통하여 볼 수 있도록 자동화한 결과를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 시료로부터 분석된 미가공의 RNA 염기서열 데이터를 자동 전처리하여 정제된 스몰 RNA(small RNA) 서열들을 생성하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 정제된 스몰 RNA 서열들을 대상으로 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 miRNA를 자동 탐색하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 자동 탐색된 miRNA를 대상으로 생물학적 검색 프로그램을 이용하여 타겟 유전자를 동정하는 단계; 및
(d) 동정된 결과를 레포팅(reporting)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (a) 단계의 자동 전처리는 3'-어댑터를 제거(trimming)하거나 낮은 퀄리티의 서열을 자동으로 제거하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 단계의 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴은 miRBase 및 PMRD일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (b) 단계의 miRNA의 자동 탐색은 해당 스몰 RNA를 mature하는 전구체(miRNA precursor) 서열을 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 자동 추출하여 miRNA의 2차 구조를 생성한 후 miRNA 헤어핀 기준(criteria)에 적합한 서열들 중 가장 낮은 에너지값을 갖는 전구체를 자동으로 추출하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 miRNA의 2차 구조의 생성은 RNA폴드(RNAfold) 실행시 생성되는 ps 파일을 자동분석하여 헤어핀 내의 해당 스몰 RNA의 위치를 붉은색으로 나타냄으로써 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (c) 단계의 생물학적 검색 프로그램은 BLAST 검색기, BOWTIE, BWA 또는 psRNAtarget 서버일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 (d) 단계의 동정된 결과는 윈도우 상에서 사용자가 편리하게 작업할 수 있도록 .csv 형태 또는 .pdf 형태로 레포팅할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 시료는 식물, 동물 또는 인간일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 본 발명의 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법을 수행하기 위한 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 기록한 기록매체를 제공한다.
컴퓨터로 판독할 수 있는 기록매체란 컴퓨터에 의해 직접 판독되고 엑세스될 수 있는 임의의 기록매체를 말한다. 이러한 기록매체로서는 플로피 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프 등의 자기기록매체, CD-ROM, CD-R, CD, RW, DVD-ROM, DVD-RAM, DVD-RW 등의 광학기록매체, RAM이나 ROM 등의 전기 기록매체 및 이들 범주의 혼합물(예: MO 등의 자기/광학기록매체)을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다.
상기한 기록매체에 기록 또는 입력시키기 위한 기기 또는 기록매체 중의 정보를 판독하기 위한 기기 또는 장치의 선택은 기록매체의 종류와 엑세스 방법에 근거한다. 또한 여러 가지 데이터 프로세서 프로그램, 소프트웨어, 컴퍼레이터 및 포맷이 본 발명의 방법을 수행하기 위한 프로그램을 당해 매체에 기록시키기 위해 사용된다. 당해 정보는 예를 들면, 시판하는 소프트웨어로 포멧된 바이너리 파일(binary file), 텍스트 파일 또는 ASCII 파일의 형태로 나타낼 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 데이터 처리 전과정
데이터 처리 전과정은 데이터 전처리 과정, RNA classification, miRNA identification, miRNA target gene identification, 레포팅 과정으로 구성되며, 각 단계별 자동화 부분은 다음과 같다 (도 2).
- 데이터 전처리 과정에서는 기존 다른 시스템에서 3' 어뎁터 트리밍 단계 및 낮은 퀄리티의 데이터 제거를 따로 수행하여야만 하였으나, 본 시스템에서는 시스템 내 자동 실행이 가능하도록 프로그램을 탑재하였다.
- 전처리 과정을 거친 정제된 small RNA 서열들에서 model plant genome의 경우, 기존에 알려져 있는 tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA 데이터 베이스를 이용하여 자동 분류한다. Non-model plant genome의 경우, 해당 종에 있어서 tRNA, rRNA, snRNA, snoRNA에 대한 알려진 정보가 없기 때문에 이 모듈은 생략 가능하다.
- 기존 식물 miRNA 데이터베이스로 잘 알려진 miRBase와 PMRD 데이터베이스와의 매핑 툴을 통하여 다른 종에서 보존되는 miRNA를 자동 탐색하며 해당 small RNA를 miRNA strand로 하는 miRNA precursor 서열을 레퍼런스 서열로부터 자동 추출하여 2차 구조를 생성한 후 miRNA 헤어핀 criteria에 적합한 서열들 중 가장 낮은 에너지 값을 갖는 miRNA precursor를 자동으로 추출한다.
- 식물 miRNA 표적에 관하여는 거의 대부분 상보적 매핑이 됨을 이용하여 레퍼런스 서열과의 BLAST search를 통해 타겟 영역을 추출하거나 psRNAtarget 서버를 이용하여 식물 miRNA 표적 영역 추출을 자동화 하였다.
- 분석의 결과를 레포팅하는 과정에서는 사용자에게 결과를 도출하는 모듈은 사용자가 쉽게 논문에 사용할 수 있도록 제공되며, 결과 데이터는 .csv 형태와 .pdf 로 윈도우 상에서 사용자가 편리하게 작업할 수 있도록 자동 도출한다.

Claims (10)

  1. (a) 시료로부터 분석된 미가공의 RNA 염기서열 데이터를 3'-어댑터를 제거(trimming)하거나 낮은 퀄리티의 서열을 자동으로 제거함으로써 자동 전처리하여 정제된 스몰 RNA(small RNA) 서열들을 생성하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 정제된 스몰 RNA 서열들을 대상으로 miRBase 및 PMRD로 이루어진 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 miRNA를 자동 탐색하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 자동 탐색된 miRNA를 대상으로 생물학적 검색 프로그램을 이용하여 타겟 유전자를 동정하는 단계; 및
    (d) 동정된 결과를 레포팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 miRNA의 자동 탐색은 해당 스몰 RNA를 mature하는 전구체(miRNA precursor) 서열을 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 자동 추출하여 miRNA의 2차 구조를 생성한 후 miRNA 헤어핀 기준(criteria)에 적합한 서열들 중 가장 낮은 에너지값을 갖는 전구체를 자동으로 추출하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 miRNA의 2차 구조의 생성은 RNA폴드(RNAfold) 실행시 생성되는 ps 파일을 자동분석하여 헤어핀 내의 해당 스몰 RNA의 위치를 붉은색으로 나타냄으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 생물학적 검색 프로그램은 BLAST 검색기, BOWTIE, BWA 또는 psRNAtarget 서버인 것을 특징으로 하는 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계의 동정된 결과는 .csv 형태 또는 .pdf 형태로 레포팅하는 것을 특징으로 하는 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 시료는 식물, 동물 또는 인간인 것을 특징으로 하는 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    (a) 시료로부터 분석된 미가공의 RNA 염기서열 데이터를 3'-어댑터를 제거(trimming)하거나 낮은 퀄리티의 서열을 자동으로 제거함으로써 자동 전처리하여 정제된 스몰 RNA(small RNA) 서열들을 생성하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 정제된 스몰 RNA 서열들을 대상으로 miRBase 및 PMRD로 이루어진 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 miRNA를 자동 탐색하는 단계로서, 상기 miRNA의 자동 탐색은 해당 스몰 RNA를 mature하는 전구체(miRNA precursor) 서열을 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(reference miRNA database)의 맵핑 툴을 이용하여 자동 추출하여 miRNA의 2차 구조를 생성한 후 miRNA 헤어핀 기준(criteria)에 적합한 서열들 중 가장 낮은 에너지값을 갖는 전구체를 자동으로 추출하여 이루어지며;
    (c) 상기 (b) 단계의 자동 탐색된 miRNA를 대상으로 BLAST 검색기, BOWTIE, BWA 또는 psRNAtarget 서버의 생물학적 검색 프로그램을 이용하여 타겟 유전자를 동정하는 단계; 및
    (d) 동정된 결과를 .csv 형태 또는 .pdf 형태로 레포팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 miRNA 탐색 자동화 시스템을 이용하여 시료로부터 miRNA를 자동으로 동정하는 방법.
  10. 제1항, 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 컴퓨터로 판독 가능한 프로그램을 기록한 기록매체.
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