KR101960597B1

KR101960597B1 - 발현 유전자의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 rna id의 분석방법

Info

Publication number: KR101960597B1
Application number: KR1020170081899A
Authority: KR
Inventors: 이정상; 이지성
Original assignee: 전주대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-28
Filing date: 2017-06-28
Publication date: 2019-03-20
Also published as: KR20190001799A

Abstract

본 발명은 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법 및 그로부터 도출한 바이오마커 및 치료제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 miRNA의 분석 능력을 향상하기 위하여 과잉 발현된 miRNA에 대비하여 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP)과 공통으로 과잉 발현된 miRNA의 비율을 산출한 통계적 보정을 이용하여 비교적 정확한 miRNA를 분석하고, 이를 통하여 알츠하이머의 발현을 예측할 수 있는 miRNA의 데이터 마이닝을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석방법을 이용하여 도출한 miRNA ID의 알츠하이머 바이오마커를 제공한다.

Description

발현 유전자의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법{Method for analysis of Alzheimer biomarker microRNA ID using correction of expression gene}

본 발명은 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법 및 그로부터 도출한 바이오마커 및 치료제에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 마이크로RNA(miRNA)의 분석 능력을 향상하기 위하여 과잉 발현된 miRNA에 대비하여 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP)과 공통으로 과잉 발현된 miRNA의 비율을 산출한 통계적 보정을 이용하여 비교적 정확한 miRNA를 분석하고, 이를 통하여 알츠하이머의 발현을 예측할 수 있는 miRNA의 데이터 마이닝을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석방법에 관한 것이다.

나아가 본 발명은 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석방법을 이용하여 도출한 miRNA ID의 알츠하이머 바이오마커에 관한 것이다.

알츠하이머는 뇌의 질환으로 인해 생기는 하나의 증후군으로서, 대개 만성적이고 진행성으로 나타난다. 이 질환으로 정상적이던 사람이 점진적인 기억력장애 및 다른 지적능력의 상실로 인하여 더 이상의 정상적인 가정생활, 사회생활 및 다양한 대인 관계를 유지할 수 없는 상황이 된다. 그 증상으로는 점차적인 기억력 손상, 일상생활의 장애, 방향감각의 상실, 판단력 손상, 성격변화, 학습능력 장애, 그리고 언어소통 능력의 상실 등이며, 나아가 환자로 하여금 전혀 자신을 돌볼 수 없게 만든다. 또한 이 질병은 3년에서 20년까지 계속 진행되는 무서운 노인성 질환이다. 발병률은 남,녀 모두 비슷하며, 이것은 4번째로 높은 노인의 사망원인이다.

알츠하이머의 발병은 거의 알아차릴 수 없을 정도로 서서히 진행되며, 현재 우리나라에서도 지난해 65세 이상 노인이 전체의 8%를 넘었으며, 2020년께는 10%를 넘을 것으로 예상된다. 이처럼 노령화가 진행되면 알츠하이머 환자도 함께 늘어날 수밖에 없으며, 한국은 노인의 10% 가량이 알츠하이머 증세를 보이고 있는 것으로 추산되고 있다.

최근에 β-아밀로이드 단백질이 알츠하이머병의 발생에 중요한 원인적 인자의 하나가 된다는 것이 밝혀지고 있기 때문에 β-아밀로이드에 대한 분자생물학적 연구가 이 질병의 해결에 가장 큰 공헌을 하리라 예견되고 있다. 이 노인성 알츠하이머의 중요한 병변은 39개∼43개의 아미노산으로 구성된 β-아밀로이드 단백질이 세포 내와 외에 침착하여 신경섬유 덩어리(neurofibrillary tangle)와 신경반(neuritic plaque)을 형성하는 것이다.

전술한 바와 같이, 전뇌 기저부(basal forebrain)의 콜린성 신경핵과 해마구조에 주로 침착이 된다. 이 β-아밀로이드 단백질은 큰 분자량의 전구단백질(amyloid precursor protein 695, 751, 770: APP 695, 751, 770)에서 잘라져서 형성된다. 그러나 현재 아밀로이드 전구 단백질이 어떤 효소에 의해서, 어떤 대사 과정에 의해서 잘라져서 β-A4 단백질을 만들어 내는지는 아직 전혀 모르고 있다. 따라서 β-아밀로이드 단백질의 형성을 촉진하는 프로테아제(protease)와 이 프로테아제의 유전자를 발현하려는 노력이 현재 연구의 핵심이 되고 있으며, 이 프로테아제 효소 단백질이나 프로테아제 유전자의 발현을 억제하는 약물의 개발이 미래의 약물 개발에 가장 큰 목표가 되고 있다. 또한 세포막에 붙어 있는 아밀로이드 전구 단백질들의 세포내 기능과 이 아밀로이드 전구 단백질에서 잘려나가 형성되어 조직에 침착된 β-A4 단백질의 기능이 무엇인지에 대해서도 많은 논란이 제기되고 있다. 최근 각종 뇌신경질환과 허혈성 신경손상, 중추신경계 장애 등의 원인이 활성산소종의 생성과 분해기구의 조절과 직접적인 관련이 있다고 보고하고 있다. 이러한 조절기구의 사실로 과잉의 활성산소가 뇌조직의 지질과산화를 유도함과 활성산소종의 발생으로 인한 app알츠하이머 유도물질에 의해 뇌세포 세포막이 손상되고 각종 뇌신경계 장애가 발생한다고 사실로 밝혀지고 있다.

그런데 알츠하이머 질환에 대한 기전은 지속적으로 연구되고 있으나, 아직까지도 그 질환에 대한 중요한 역할을 하는 유전자는 아직도 연구 중에 있다. 예를 들어 유전물질의 득실이 악성 형질전환과 진행에 있어서 중요한 역할을 한다. 이들 유전물질 중에서 가장 중요한 역할을 하는 것으로는 miRNA가 알려져 있다.

miRNA는 1993년 미국 하버드대 앰브로스(V.Ambros) 교수팀에 의해 처음으로 밝혀졌다. 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 발생시기를 조절하는 유전자를 찾던 중에 lin-4라고 명명된 짧은 RNA 단편이 LIN-14 단백질의 합성에 영향을 준다는 것을 발견하였으나, 이후 같은 종에서 조절인자로서 역할을 하는 let-7이라고 명명된 RNA 단편이 추가로 발견되면서 miRNA의 존재와 기능에 대한 관심이 증가하게 되었다. 또한 miRNA는 21개에서 25개의 뉴클레오티드(nucelotide)로 이루어진 작은 단일가닥염기(single-strand nucleotide)로서, 진핵생물에서 다양한 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 선충(C. elegance)에서 발현되는 miRNA가 1993년 앰브로스 그룹에 의해서 발견된 후, 현재까지 700종 이상이 인간세포에 존재하고 있음이 밝혀졌다.

miRNA의 생합성은 크게 두 가지 효소의 절단에 의해서 진행된다. 먼저 miRNA를 포함하고 있는 유전자가 RNA 중합효소 II 또는 III(RNA polymerase II/III)에 의해서 전사되어 다양한 크기의 miRNA 전사체(transcript)가 합성이 된다. 이러한 과정으로 합성된 primary miRNA(pri-miRNA)는 5‘말단에 cap (7-methylguanylate cap)과 3'말단에 poly[A] tail을 가지고 있다. Pri-miRNA는 핵 내에 존재하는 Drosha라는 RNA 절단효소와 DGCR8(DiGeorge critical region 8)으로 구성된 microprocessor complex에 의해서 70여개의 뉴클레오티드(nucleotide) 길이로 된 전구체 miRNA(pre-miRNA)로 가공된다. Pre-miRNA는 exportin5와 Ran-GTP를 통해서 세포질로 나온 후, 두 번째 절단효소인 Dicer와 TRBP(transactivating response RNA binding protein)에 의해서 20-25개의 뉴클레오티드로 구성된 성숙한 이중가닥의 miRNA로 가공된다.

이중가닥 중에서 한 가닥은 분해되고, 다른 한 가닥만이 Ago(Argonaute)와 함께 결합하여 RISC(RNA-induced silencing complex)를 구성한다. TRBP는 Ago와 miRNA의 결합을 유도하여 miRNA가 표적유전자의 발현을 조절할 수 있도록 한다. 일반적으로 miRNA는 단백질로 번역되지 않는 3' 말단(3' untranslated region, 3'UTR)에 결합하여 mRNA의 안정성(stability)을 낮추거나 번역율(translation efficiency)을 낮추어 표적유전자의 발현을 억제한다.

최근에는 생물학적으로 miRNA가 유전자의 발현을 조절하는 중요한 조절인자임이 밝혀지고, 또한 지금까지 동식물을 포함한 32가지의 종에서 15,172개의 miRNA가 발견됨에 따라 대량의 데이터를 처리하고 분석하기 위하여 생물정보학적 연구방법이 도입되었다.

miRNA들의 서열 및 정보, 특징들을 저장, 관리하는 데이터베이스들이 구축되었는데, miRBase, ASRP, miRNA Map 등이 널리 이용되는 대표적인 데이터베이스들이다. 또한, miRNA 유전자 후보나 miRNA의 표적 유전자를 예측하는 다양한 알고리즘과 이를 적용할 수 있는 애플리케이션 개발도 활발히 진행되고 있다.

miRNA 유전자의 후보를 예측하는 방법에는 일반적으로 RNA 구조(RNA conformation) 기반 검색, 유사한 서열을 가진 miRNA에 대한 호몰로지(homology) 검색, miRNA 특성 값을 적용한 기계학습(machine-learning) 방법에 의한 접근 등이 사용된다. RNA 구조에 기반한 검색은 pre-miRNA가 가지는 머리핀(hairpin) 구조의 물리화학적 특징을 이용하는 방법으로서, 특정 염기서열이 열역학적으로 안정한 머리핀 구조를 가질 수 있는 지를 계산하여 miRNA의 후보인지를 예측하는 과정이다.

호몰로지 검색에 의한 예측은 염기서열의 유사 정도를 확률적으로 계산하여 후보를 예측하는 방법으로서, 진화적으로 보존되어 있는 miRNA의 서열 예측에 매우 유용하게 적용된다. 기계학습 방법을 통한 예측은 생물정보학 연구에서 널리 사용하는 방법으로서, 이미 알려진 miRNA에 대한 염기서열이나 분포, 구조적 특이성, 진화보존성과 같은 특징들을 이용하여 반복적으로 학습(training)시킨 후에, 새로운 염기서열 정보가 입력되었을 때 학습된 사항에 따라 결과를 예측해 주는 방법이다.

이와 관련한 종래기술로서, 하기 특허 문헌 0001은 “miRNA의 분석능력을 향상시켜 miRNA를 정확히 분석하고, 이를 통하여 암세포의 발현을 예측할 수 있는 miRNA ID의 분석방법”이 알려져 있으나, 이는 종양, 염증 및 항산화 관련유전자를 조절하는 것으로서, 대장암과 관련한 유전자를 조절하는 miRNA 바이오마커를 제공하는 것이다.

또한 하기 특허문헌 0002는 모세관 전기영동 시스템을 이용하여 다중 miRNA를 검출하는 것을 기술하고 있으나, 이와 같은 방법으로는 정확한 miRNA의 특성을 파악할 수 없다. 또 하기 특허문헌 0003은 miRNA의 정량분석방법에 관한 것이나, 이는 미지의 miRNA를 파악할 수 있는 정확성이 떨어지는 실정이다. 또한 하기 특허문헌 0004는 miRNA의 탐색자동화시스템에 관한 것이나, 단순한 레퍼런스 miRNA 데이터베이스(D/B)의 맵핑 툴을 이용하는 것으로 단순하게 동정하는 방법에 대해 개시되어 있을 뿐이다.

이에 본 발명자들은 이러한 종래 기술상의 문제점을 해결하고자 연구를 거듭한 결과, miRNA의 분석 능력을 향상하기 위하여 과잉 발현된 miRNA에 대비하여 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP)과 공통으로 과잉 발현된 miRNA의 비율을 산출한 통계적 보정을 이용하여 비교적 정확한 miRNA를 분석하고, 이를 통하여 알츠하이머의 발현을 예측할 수 있는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID 분석하고, 이를 통하여 알츠하이머의 발현을 예측할 수 있는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법을 연구하여 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-1583450호(2016. 01. 03.) 한국공개특허공보 제10-2013-0122541호(2013. 11. 07) 한국공개특허공보 제10-2014-0108913호(2014. 9. 15) 한국공개특허공보 제10-2014-0114684호(2014. 9. 29)

본 발명은 miRNA의 분석 능력을 향상하기 위하여 과잉 발현된 miRNA에 대비하여 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP)과 공통으로 과잉 발현된 miRNA의 비율을 산출한 통계적 보정을 이용하여 비교적 정확한 miRNA를 분석하고, 이를 통하여 알츠하이머의 발현을 예측할 수 있는 miRNA의 데이터 마이닝을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석방법의 분석결과를 이용하여 알츠하이머 관련유전자를 조절하는 치료제 또는 바이오마커를 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 (a) 미지의 바이오 시료를 준비하는 제 1단계; (b) 상기 제 1단계의 준비된 시료로부터 미지의 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA를 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류한 후, 이후 2.5폴드 이상의 발현수준별 miRNA 데이터를 선택하는 제 2단계 (c) 암유전체 지도(The cancer Genome Atlas)으로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계; (d) 상기 제2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 상기 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 데이터와 비교하여 과잉 발현된 수준별 miRNA 결과를 얻는 제 4단계; (e) 발현 유전자(gene)를 선정하여 유전자와 다른 유전자에서 공통으로 발현하는 miRNA를 얻기 위하여 표적예측 데이터 베이스를 이용하여 miRNA 결과를 얻는 제 5단계; (f) 발현유전자의 보정을 위하여, 상기 제 4단계에서 얻어진 결과(A) 와 상기 제 5단계에서 얻어진 결과(B)의 비율(B/A)로부터 매칭 확률을 얻은 제 6단계; (g) 제 6단계에 의해 얻어진 매칭 확률로부터 miRNA ID를 얻는 제 7단계; 를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법을 제공한다.

또한 얻어진 miRNA ID를 펌메드(PubMed) 데이터 베이스를 이용하여 재확인하는 단계를 더 포함하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법을 제공한다.

또한 본 발명은 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커마이크로 RNA ID의 분석방법에 의하여 얻어진 miRNA ID의 분석결과를 이용하는 알츠하이머예방 치료제를 제공한다.

또한 본 발명은 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커마이크로 RNA ID의 분석방법에 의하여 얻어진 miRNA ID의 분석결과를 이용하는 알츠하이머용 바이오마커를 제공한다.

한편, 본 발명에 의한 그 밖의 구체적인 과제의 해결수단은 발명의 상세한 설명에 기재되어 있다.

본 발명에 의한 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석능력을 향상하기 위하여, 과잉 발현된 miRNA에 대비하여 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP)과 공통으로 과잉 발현된 miRNA의 비율을 산출한 통계적 보정을 이용하여 비교적 정확한 miRNA 분석을 통하여 알츠하이머의 발현을 정확하게 예측할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 통한 알츠하이머 바이오마커 miRNA ID의 분석결과를 이용하여 알츠하이머 관련된 유전자에 대한 miRNA 바이오마커 또는 치료제로 제공할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 의한 2.5 폴드 이상인 경우에, 발현유전자의 보정을 통하여 얻어지는 매칭확률을 얻는 결과이다.
도 2는 본 발명에 의한 5 폴드 이상인 경우에, 발현유전자의 보정을 통하여 얻어지는 매칭 확률을 얻는 결과이다.
도 3은 본 발명에 의한 APOE, EPHA1, CR1, FERMT2, BIN1의 miRNA 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 매칭 확률의 결과이다.

이하, 본 발명의 발현 유전자(gene)의 통계적 보정법을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법에 대하여 바람직한 실시형태를 들어 자세하게 설명한다.

본 발명에 의한 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법은 (a) 미지의 바이오 시료를 준비하는 제 1단계; (b) 상기 제 1단계의 준비된 시료로부터 미지의 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA를 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류한 후, 이후 2.5폴드 이상의 발현수준별 miRNA 데이터를 선택하는 제 2단계 (c) 암유전체 지도(The cancer Genome Atlas, TGCA)으로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계; (d) 상기 제 2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 상기 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 데이터와 비교하여 과잉 발현된 수준별 miRNA 결과를 얻는 제 4단계; (e) 발현 유전자(gene)를 선정하여 유전자와 다른 유전자에서 공통으로 발현하는 miRNA를 얻기 위하여 표적예측 데이터 베이스를 이용하여 miRNA 결과를 얻는 제 5단계; (f) 발현유전자의 보정을 위하여, 상기 제 4단계에서 얻어진 결과(A) 와 상기 제 5단계에서 얻어진 결과(B)의 비율(B/A)로부터 매칭 확률를 얻은 제6단계; (g) 제 6단계에 의해 얻어진 매칭 확률로부터 miRNA ID를 얻는 제 7단계; 를 포함하여 수행하는 것을 특징으로 한다.

먼저, 상기 제 1단계에 있어서, 미지의 바이오시료는 신선한 또는 냉동된 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP), 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득된 것일 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 제 2단계의 시료로부터 미지의 miRNA를 포함하는 전체 RNA를 추출하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 바람직하게는 트리졸 또는 트리톤 X-100을 이용하여 추출할 수 있다.

제3단계의 발현 수준별 종양 miRNA 데이터는 알츠하이머 관련 miRNA의 데이터를 IluminaGA-miRNAseq 플랫폼을 이용하여 개방형으로 쉽게 접근가능한 알츠하이머 유전체 지도부터 추출하였고, 상기 발현 수준별 종양 miRNA 데이터는 여러 가지 정보를 포함하고 있으며, 이들 정보에는 miRNA ID, read-count, read per milion miRNA 맴(map) 등이 있다.

또한 제 5단계의 표적예측 데이터베이스는 당업계에서 다양하게 공개된 miRWalk, MicroT4, miRanda, miRBridge, miRDB, miRMap, miRNAMap, PICTAR2, PITA, RNA22, RNAhybrid, Targetscan 중에서 1종 이상을 선택하여 이용할 수 있으며, 이에 제한 된 것은 아니다.

또한 상기 제 7단계에서 얻어진 miRNA ID를 펌메드(Pub Med) 데이터 베이스를 이용하여 재확인하는 단계를 더 포함하며, 펌메드에서 게시된 논문을 검색하여 교차 확인하여 miRNA ID를 재확인할 수 있으며, 펌메드의 대표키워드는 miR- 이며, miRNA ID와 표적 예측데이터베이스의 miRNA와의 상관관계를 입증할 수 있으며, 이에 제한된 것은 아니다.

나아가 본 발명으로 얻어진 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법을 이용하여 알츠하이머 관련 유전자를 파악할 수 있는데, 상기 알츠하이머 관련 유전자로는 EPHA1, PICALM, ABCA7, APOE BIN1, CD2AP, CLU, CR1, APP, NM8 등이 있다.

EPHA1 protein-tyrosine kinase family의 ephrin receptor subfamily에 속한다. EPH 및 EPH- 관련 수용체는 특히 신경계에서 발생 발달의 중재에 연루되어 있다. EPH 서브 패밀리 내의 수용체는 전형적으로 단일 키나아제 도메인 및 Cys- 풍부 도메인 및 2종의 피브로넥틴 III 형 반복부를 함유하는 세포 외 영역을 갖는다. 에프 린 수용체는 그들의 세포 외 도메인 서열의 유사성 및 결합 에프 린-A 및 에프 린-B 리간드에 대한 그들의 친화력에 기초하여 2개의 군으로 나누어진다.

PICALM 유전자의 알츠하이머병의 발병 위험이 증가하는 것과 통계적으로 연관되어 있는 유전자 중의 하나이다.

ABCA7에 관련하여 ABCA7의 단백질 파괴형은 알츠하이머 질환에 걸리기 쉬우며, ABCA7 유전자의 불활성 변이가 존재할 때 알츠하이머병을 일으킬 가능성이 두 배로 증가한 것으로 알려져 있다.

APOE 유전자는 노인성 알츠하이머병의 중요한 위험유전자이다. 이 유전자는 ApoE2, E3, E4의 3가지 형태가 있으며, 이중 ApoE4를 가진 경우, 위험성이 증가하는 것으로 알려져 있다. ApoE4 대립유전자를 두 개 가지고 있는 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 10배까지 증가하는 것으로 알려져 있다.

BIN1 유전자는 nucleocytoplasmic adaptor protein의 여러 가지 동형(isoform)을 암호화하는데, 그 중 하나는 종양 억제인자의 특징을 가진 MYC- 상호 작용 단백질로 처음 발견되었다. 중추 신경계에서 발현되는 이소 형태는 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 관여할 수 있으며 dynanim, synaptojanin, endophilin 및 clathrin과 상호 작용할 수 있다. 근육 및 유비쿼터스로 발현된 이소 형태로 발현되는 이소 형태는 세포질과 핵에 국한되며, 세포 사멸 과정을 활성화시킨다.

CD2AP 유전자는 액틴 세포 골격을 조절하는 스캐 폴딩 분자를 암호화하며, 이를 통하여 여러 가지 액틴 결합 부위, SH3 도메인 및 SH3 도메인에 대한 결합 부위를 포함하는 프롤린이 풍부한 부위를 통해 섬유질 악틴 및 다양한 세포막 단백질과 직접 상호 작용한다.

CLU 유전자는 아홉 개 포함 엑손을 포함한다. 암호로 한 단백질 동형(isoforms)은 모든 다른 세포질 격실에 지방화하며, 1개의 isoform은 핵에 지방화한다, 그리고 두 번째 이성체는 세포질에 국한되고, 세 번째 세포에서 세포가 분비된다. 핵 CLU는 Ku70에 결합하여 BAX를 방출하고 세포 사멸을 유도하지만, 세포질 및 분비 이소형은 세포 사멸을 억제한다.

CR1 유전자는 보체 활성화(RCA) 계열의 조절 인자의 구성원이며 염색체 1의 'cluster RCA' 부위에 위치한다. CR1 유전자는 적혈구, 백혈구, 사구체의 유두 세포에서 발견되는 단량체 단일 패스I형 막 당단백질을 암호화하며, hyalocytes, 및 비장 follicular 돌기 세포, 놉스 혈액형 시스템은 단백질에 위치한 항원 시스템이다. 따라서 CR1 단백질은 보체를 활성화시킨 입자 및 면역 복합체에 대한 세포의 결합을 매개한다.

APP 유전자는 아밀로이드 전구체 단백질이라 불리는 단백질을 만드는 지침을 제공한다. 이 단백질은 뇌와 척수(중추 신경계)를 비롯한 많은 조직과 기관에서 발견되며, 아밀로이드 전구체 단백질은 효소에 의해 절단되어 더 작은 단편 (펩티드)을 만들고, 일부는 세포 외부로 방출된다. 이 두 조각을 가용성 아밀로이드 전구체단백질(amyloid precursor protein, sAPP) 및 아밀로이드 베타펩티드(amyloid β peptide)라고 한다. 최근의 증거에 의하면, sAPP는 성장 촉진 특성을 가지고 있으며, 출생 전후의 뇌에서 신경 세포(뉴런)의 형성에 역할을 할 수 있다.

NME8 유전자는 N 말단 티오레 독신 도메인 및 3개의 C 말단 뉴클레오티드 디 포스페이트 키나제(NDK) 도메인을 갖는 단백질을 코딩하지만, NDK 도메인은 촉매적으로 비활성이며, NME8 유전자의 성게 ortholog는 정자 외부 dynein 팔의 성분을 암호화 하고, 단백질은 섬모 기능에 연루된다.

또한 본 발명에서 사용된 용어인 ‘발현’은 소정 핵산 또는 mRNA의 측정가능한 발현 수준을 지칭한다. 핵산의 발현 수준은 당업계에서 잘 알려진 통계학적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 또한 폴드(fold)는 발현 변화값을 의미하며, 이는 당업계에서 잘 알려져 있다.

발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법을 위해서는 하기의 방법을 통해 실시할 수 있다.

(1) miRNA 서열 데이터는 미지의 시료에서 리드 카운트(read count)에 기초하여 컴퓨터화한 miRNA의 정량적인 발현 수준을 포함한다. 둘 이상의 샘플에서의 miRNA 발현 비교를 위해, 각각의 서열 분석 샘플에서의 발현 수준은 샘플에서 총 리드 수에 의해 정규화된다. RPM은 각 샘플에 대해 생산된 정규화 발현 수준의 값이다. 따라서 데이터에서의 miRNAs의 발현 수준을 필요로 하기 때문에 miRNA ID 및 RPM을 사용한다.

(2) 플랫폼은 오류를 포함하는 모든 시퀀스를 검출하기 때문에 이러한 일루미나(Illumina)의 게놈 분석기 플랫폼과 같은 단일-분자-기반 플랫폼은 일반적으로 고유의 높은 오류를 표시한다. 높은 오류율이 낮은 리드 카운트를 야기한다. miRNAs 발현 수준의 차이에 따라, 5폴드 이상(RPM>5), 5폴드 미만에서 2.5 폴드 이상(5>RPM≥2.5), 2.5 폴드 미만(RPM<2.5)에서 miRNA IDs는 3군으로 분류(sorting)하였다. 수집된 대량의 데이터 중에서 저 수준 발현(<2.5) 및/또는 변경 없는 miRNA IDs는 오류를 방지하기 위해 제거하였다.

(3) 발현 유전자(gene)를 선정하여 유전자와 다른 유전자에서 공통으로 발현하는 상관관계를 얻기 위하여, miRNA-표적 예측 데이터베이스인 mirWalk, DIANA-microT, miranda, miRBridge, miRDB, miRmap, miRNA Map, PITA, RNA22 및 Targetscan를 통하여 결과값을 얻을 수 있다.

본 발명에서 정의된 매칭확률은 발현유전자의 보정을 위한 것으로 1) 발현 유전자(gene)를 선정하여 유전자와 다른 유전자에서 공통으로 발현하는 miRNA를 얻기 위하여 표적예측 데이터베이스를 이용하여 miRNA 결과(A)와 2) 미지의 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA를 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류한 후, 이후 2.5폴드 이상의 발현수준별 miRNA 데이터를 이용하여 미지의 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA를 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류한 후, 이후 2.5폴드 이상의 발현수준별 miRNA 데이터와 비교하여 과잉 발현된 수준별 miRNA 결과(B)를 이용하여 상기 얻어진 (A)결과에 대한 (B)의 비(B/A)를 의미한다.
(4) 얻어진 유전자에 대한 매칭확률을 얻기 위하여, 5폴드 이상(RPM>5), 2.5폴드 이상(PM≥2.5)으로 표시되는 유전자의 분석결과로부터 추출된 miRNA IDs를 갖는다. 분류과정에서 2.5 폴드 미만으로 표시된 miRNA ID들은 모두 제거되었으므로 더 이상 존재하지 않으며, 추출된 miRNAs는 타겟 유전자를 통해 알츠하이머 발생을 촉진할 수 있는 miRNAs가 있는 것으로 추측되었다. 각 miRNA ID 데이터는 알츠하이머 예방에 효과적이다.

나아가 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법에 의해 알츠하이머관련 유전자를 조절하는 치료제 또는 바이오마커에 이용될 수 있다.

아래의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 아래의 실시예에 한정된 것은 아니다.

<실험예 1> 아밀로이드 전구단백질을 포함하는 시료로부터 RNA 추출방법

아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein)의 냉동된 바이오 시료를 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 바이오시료 50~100mg을 잘게 부수고 나서, 트리아졸 1ml에 넣은 후, 클로로포름 0.2ml를 첨가하여 실온에서 3분간 방치하고, 12000rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 새 튜브에 옮긴 후에 이소프로필알콜 0.5ml를 가하여 10분간 방치한다. 다시 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 버리고, RNA 펠렛을 DEPC 처리한 75% 에탄올 1ml를 가하고 테이핑한 후 12000rpm에서 5분간 원심분리하여 다시 상등액을 버리고, 나머지 RNA 펠렛을 10분간 실온 건조한다.

<실험예 2> 체세포의 RNA 추출방법

체세포 바이오 시료를 준비하고, 준비된 바이오 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 실험예 1과 같다.

<실험예 3> 생체세포의 RNA 추출방법

생체세포 시료를 준비하고, 준비된 생체세포 시료로부터 트리아졸을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출방법은 생체세포시료 50~100mg을 잘게 부수는 점만 다를 뿐이고, 나머지 공정은 실험예 1과 같다.

실험예 1에서 제조된 RNA펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 최적의 결과를 얻기 위하여 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 마이크로 RNA ID의 분석방법에 따라 실시하였다. 파악된 염기서열을 통해 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류하였다. 그리고 암유전체 지도(The cancer Genome Atlas, TGCA)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 발현 수준별 종양 miRNA 데이터를 획득하였고, 이후 미지의 시료로부터 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터와 암유전체지도로부터 얻어진 발현수준별 종양 miRNA 데이터를 비교하여 공통된 발현 수준별 miRNA 결과를 얻는다. 얻어진 공통된 발현수준별 miRNA 결과를 발현수준별 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류하고, 분류된 그룹으로부터 2.5 폴드 미만의 그룹을 제거하여 재그룹화된 발현수준별 miRNA 결과(결과 A)를 얻는다.

또한 발현 유전자(gene)를 선정하여 유전자와 다른 유전자에서 공통으로 발현하는 miRNA를 얻기 위하여 표적예측 데이터 베이스를 이용하여 miRNA 결과(B)를 얻는다. 이를 위하여 표적예측 데이터베이스인 mirWalK, DIANA-microT, miranda, miRBridge, MiRDB, Mirmap, miRNA Map, PITA, RNA22, Targetscan와 비교한다.

이후 매칭 확률을 파악하기 위하여 결과비율(B/A)로부터 miRNA ID를 얻는다. 얻어진 miRNA ID를 공지의 펌메드(Pub Med) 데이터 베이스를 이용하여 miRNA ID를 재확인하여 이로부터 정확성이 높은 miRNA ID를 얻는다.

실시예 2에는 실험예 2로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다.

이하는 실시예 1과 동일하게 하여 정확성이 높은 miRNA ID를 얻는다.

실시예 3에는 실험예 3로부터 제조된 RNA펠렛을 이용하고, 공지의 전기영동시스템을 통하여 RNA의 염기서열을 파악한다. 이하는 실시예 1과 동일하게 하여 정확성이 높은 miRNA ID를 얻는다.

도 1는 2.5 폴드 이상인 경우에, 발현유전자의 보정을 통하여 얻어지는 매칭확률을 얻는 결과이다. 이 경우에 매칭 확률을 보면, APP가 100%, APOE가 60%, CR1 20.9%, EPHA1이 20.0%이다.

도 2는 5 폴드 이상인 경우에, 발현유전자의 보정을 통하여 얻어지는 매칭 확률을 얻는 결과이다. 이 경우에 매칭 확률을 보면, APP가 100%, APOE가 60%, EPHA1이 25.0%, CR1은 23.5%, FERMT2가 19.6%, BIN1은 18.8%이다.

도 3은 APOE, EPHA1, CR1, FERMT2, BIN1의 유전자에 해당하는 miRNA 결과이다.

도 4는 본 발명의 실시예 1에 따른 매칭 확률의 결과를 상세히 알 수 있다.

이상 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명하였다. 상기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 하는 예시적인 것일 뿐이고, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 본질이 변하거나 범위가 축소되는 것은 아니다. 상기 실시예에서 제시되지 않은 여러 가지 실시예 및 적용예들이 가능함은 당업자에게 있어 당연할 것이다.

Claims

(a) 알츠하이머병 환자에서 획득한 시료를 준비하는 제 1단계;
(b) 상기 제 1단계의 준비된 시료로부터 미지의 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA를 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류한 후, 이후 2.5폴드 이상의 발현수준별 miRNA 데이터를 선택하는 제 2단계;
(c) 암유전체 지도(The Cancer Genome Atlas)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 알츠하이머병 환자의 발현 수준별 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계;
(d) 상기 제 2단계를 통해 얻어진 발현수준별 miRNA 데이터를 상기 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 데이터와 비교하여 과잉 발현된 수준별 miRNA 결과(A)를 얻는 제 4단계;
(e) 발현 유전자(gene)를 선정하여 선정된 유전자와 다른 유전자를 공통으로 표적으로 하는 miRNA를 얻기 위하여 표적예측 데이터베이스를 이용하여 miRNA 결과(B)를 얻는 제 5단계;
(f) 발현유전자의 보정을 위하여, 상기 제 4단계에서 얻어진 결과(A)와 상기 제 5단계에서 얻어진 결과(B)의 비율(B/A)로부터 매칭 확률을 얻는 제 6단계;
(g) 제 6단계에 의해 얻어진 매칭 확률로부터 miRNA ID를 얻는 제 7단계;를 포함하되, 컴퓨터로써 수행하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 제 1단계의 시료는 아밀로이드 전구단백질(an amyloid precursor protein, APP)을 포함하는 냉동된 세포, 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 제 2단계의 miRNA를 추출하기 위하여 트리졸 또는 트리톤 X-100을 이용하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 제 3단계의 발현 수준별 miRNA 데이터는 miRNA ID, read-count, read per million miRNA 맵(map) 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 제 4단계의 과잉 발현 수준별 miRNA 결과는 알츠하이머 관련 유전자 정보에 관한 것으로 EPHA1, PICALM, ABCA7, APOE BIN1, CD2AP, CLU, CR1, APP, NM8 중에서 1종 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제1항에 있어서,
상기 제 5단계의 표적예측 데이터베이스는 mirWalK, DIANA-microT, miranda, miRBridge, MiRDB, Mirmap, miRNA Map, PITA, RNA22, Targetscan 중에서 1종 이상을 선택하여 이용하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제6항에 있어서,
상기 제5단계에서 얻어진 miRNA 결과(B)는 알츠하이머 관련 유전자 정보에 관한 것으로 EPHA1, PICALM, ABCA7, APOE BIN1, CD2AP, CLU, CR1, APP, NM8 중에서 1종 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제7항에 있어서,
상기 제6단계에서 얻어진 매칭 확률은 알츠하이머 관련 유전자 정보인 APP인 경우 100%인 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 마이크로 알츠하이머 바이오마커 RNA ID의 분석방법.
(a) 알츠하이머병 환자에서 획득한 시료를 준비하는 제 1단계;
(b) 상기 제 1단계의 준비된 시료로부터 미지의 마이크로 RNA(miRNA)를 추출하여 서열화된 miRNA를 발현 수준의 차이에 따라 5폴드 이상, 5폴드 미만부터 2.5폴드 이상, 2.5폴드 미만의 3개 그룹으로 분류한 후, 이후 2.5폴드 이상의 발현수준별 miRNA 데이터를 선택하는 제 2단계;
(c) 암유전체 지도(The Cancer Genome Atlas)로부터 데이터 플랫폼을 이용하여 알츠하이머병 환자의 발현 수준별 miRNA 데이터를 획득하는 제 3단계;
(d) 상기 제 2단계를 통해 선택된 발현수준별 miRNA 데이터를 상기 제 3단계에서 얻어진 발현 수준별 miRNA 데이터와 비교하여 과잉 발현된 수준별 miRNA 결과(A)를 얻는 제 4단계;
(e) 발현 유전자(gene)를 선정하여 선정된 유전자와 다른 유전자를 공통으로 표적으로 하는 miRNA를 얻기 위하여 표적예측 데이터 베이스를 이용하여 miRNA 결과(B)를 얻는 제 5단계;
(f) 발현유전자의 보정을 위하여, 상기 제 4단계에서 얻어진 결과(A)와 상기 제 5단계에서 얻어진 결과(B)의 비율(A/B)로부터 매칭 확률을 얻는 제 6단계;
(g) 제 6단계에 의해 얻어진 매칭 확률로부터 miRNA ID를 얻는 제 7단계;
(h) 제7단계에서 얻어진 miRNA ID를 펌메드(PubMed) 데이터 베이스를 이용하여 miRNA ID를 재확인하는 제8단계;를 포함하되, 컴퓨터로써 수행하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제9항에 있어서,
상기 제 4단계의 과잉 발현 수준별 miRNA 결과는 알츠하이머 관련 유전자 정보에 관한 것으로 EPHA1, PICALM, ABCA7, APOE BIN1, CD2AP, CLU, CR1, APP, NM8 중에서 1종 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제9항에 있어서,
상기 제 5단계의 표적예측 데이터베이스는 mirWalK, DIANA-microT, miranda, miRBridge, MiRDB, Mirmap, miRNA Map, PITA, RNA22, Targetscan 중에서 1종 이상을 선택하여 이용하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제11항에 있어서,
상기 제5단계에서 얻어진 miRNA 결과는 알츠하이머 관련 유전자 정보에 관한 것으로 EPHA1, PICALM, ABCA7, APOE BIN1, CD2AP, CLU, CR1, APP, NM8 중에서 1종 이상을 분석하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제12항에 있어서,
상기 제6단계에서 얻어진 매칭 확률은 알츠하이머 관련 유전자 정보인 APP인 경우 100%인 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
제13항에 있어서,
상기 제8단계에서 miRNA ID의 재확인은 miRNA ID를 공지의 펌메드(Pub Med)에서 개시된 논문을 검색하여 교차 확인하는 것을 특징으로 하는 발현 유전자(gene)의 보정을 이용한 알츠하이머 바이오마커 마이크로 RNA ID의 분석방법.
삭제
제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 분석방법에 의하여 얻어진 miRNA ID의 분석결과를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 진단용 조성물.