KR20150131555A - 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136 - Google Patents

근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136 Download PDF

Info

Publication number
KR20150131555A
KR20150131555A KR1020140058381A KR20140058381A KR20150131555A KR 20150131555 A KR20150131555 A KR 20150131555A KR 1020140058381 A KR1020140058381 A KR 1020140058381A KR 20140058381 A KR20140058381 A KR 20140058381A KR 20150131555 A KR20150131555 A KR 20150131555A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mirna
muscle
aging
rna
fragment
Prior art date
Application number
KR1020140058381A
Other languages
English (en)
Inventor
권기선
김지영
김선영
이광표
권은수
이승민
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020140058381A priority Critical patent/KR20150131555A/ko
Priority to PCT/KR2015/004929 priority patent/WO2015174798A1/ko
Publication of KR20150131555A publication Critical patent/KR20150131555A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 근육노화 진단 마커로서의 마이크로RNA-136에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 근육노화 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 근육노화 진단용 키트 및 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 근육노화 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 miRNA-136을 비롯한 다양한 miRNA는 노화에 따른 근위축 및 그에 수반하는 근기능의 저하 뿐만 아니라, 이에 따른 에너지 대사의 저하로 비만이나 당뇨병 등의 질환까지도 수반할 수 있는, 근육노화의 진행 또는 발명 여부, 그리고 노화 정도를 진단할 수 있는 마커로 사용될 수 있으므로, 근육노화 진단 키트 개발 및 근육노화 억제 물질을 탐색하는데 있어서, 탁월한 효과가 있는 마커로 널리 활용될 수 있다.

Description

근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로RNA-136{MicroRNA-136 for the diagnosis and treatment of muscle aging}
본 발명은 근육노화 진단 마커로서의 마이크로RNA-136에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 근육노화 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 근육노화 진단용 키트 및 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 근육노화 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
노화는 생리학적 노화와 병적 노화로 크게 나뉘어진다. 생리학적 노화는 가령에 수반하여 필연적으로 일어나는 노화로서, 모발, 피부, 눈, 뼈, 뇌 등의 변화, 운동 능력이나 에너지 대사의 저하가 생긴다.
한편, 노화에 의해 생기는 근력이나 지구력의 저하는 일상의 생활 능력을 저하시킨다. 또한, 에너지 대사의 저하는 에너지 섭취와 에너지 소비의 불균형을 초래하여, 비만이나 당뇨병 등의 생활 습관병의 원인이 될 수도 있다.
일반적으로, 근육의 근질량이나 근력이 감소하는 근위축(muscular atrophy)에는, 폐용성 근위축(disuse muscle atrophy)이나 사르코페니아(Sarcopenia) 등을 들 수 있는데, 근위축이 일어나면, 그에 수반하여 근기능의 저하가 나타나게 된다. 특히, 고령자는 가령에 의한 근위축이나 근력의 저하가 관찰되어, 근육 손상이나 골절이 되기 쉬워지며, 이의 치료 및 요양을 위한 안정 상태나 깁스 고정 등의 활동 제한하에 놓여지면, 폐용성 근위축이나 근기능의 저하가 급속히 진행되는 악순환에 빠지게 된다.
노화는 유전적 요인이나 환경적 요인에 의해 진행되지만, 식사 및 운동과 같은 생활 습관을 비롯한 환경적 요인을 개선함으로써 늦추는 것은 가능하다고 여겨지고 있다. 노화에 수반하는 운동 능력 저하나 근위축이나 근기능의 저하를 방지하는 수단으로서, 특히 고령자의 경우에는 적당한 운동 또는 재활요법(rehabilitation)의 실천이 요망된다.
아울러, 최근에는 운동이나 이학요법 뿐만 아니라, 노화를 억제할 수 있는, 보다 구체적으로 근위축 및 그에 수반하는 근기능의 저하 등의 근육노화를 억제할 수 있는 성분 탐색 연구가 행해지고 있다.
이와 더불어, 근위축 및 그에 수반하는 근기능의 저하 뿐만 아니라, 이에 따른 에너지 대사의 저하로 비만이나 당뇨병 등의 질환까지도 수반할 수 있는 근육노화의 여부 및 정도를 진단하거나, 상기 근육노화 억제 물질을 탐색하는데 있어서 탁월한 효과가 있는 진단 마커의 개발이 절실하다.
최근, 노화를 비롯한 다양한 생명현상을 조절하는 주요한 인자로 알려져 많은 관심을 받고 있는 것들 중 하나로 마이크로RNA(microRNA; miRNA)가 있다. miRNA는 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 암호화되지 않은(non-coding) RNA로서, 식물에서부터 다양한 동물들에서 발견되는 유전체이다. miRNA는 전사 이후의 단계에서 상보적인 메신저RNA(messenger RNA; mRNA)의 전사과정을 방해하거나 mRNA를 분해하게 함으로써, 30% 이상의 단백질 생산 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이 miRNA는 다양한 생물학적 과정에 관여한다는 것이 많은 연구들을 통해 밝혀졌으며, 최근에는 세포, 조직 및 한 개체의 수명 등 여러 노화과정에 miRNA 발현 변화가 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다.
아직까지 miRNA가 노화 질환에 어떤 역할을 하는지는 잘 알려져 있지는 않으나, 노화과정에 있어서 miRNA의 발현 변화에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예컨대, 피부 노화에 대한 징후(예를 들어, 주름)를 감소시키기 위한, 노화 관련 유전자 및 miRNA를 기재한 문헌(미국공개특허, 제2011-0301091호), 마우스의 노화된 간(liver) 및 뇌(brain) 등의 기관에서 발현되는 노화와 관련된 유전자 및 miRNA의 발현량 변화 및 역할에 대해 기재한 문헌(Smith-Vikos T. et al., J Cell Sci ., 125(1):7-17, 2012) 및 마우스의 노화된 심장에서 발현되는 노화와 관련된 miRNA 및 miRNA 클러스터(cluster)의 발현량 변화에 대해 기재한 문헌(Zhang X. et al., PLoS One ., 7(4):e34688, 2012) 등이 보고된 바 있다.
이러한 노화와 관련된 miRNA는 피부 노화, 심장 및 뇌 등의 다양한 기관의 노화에 따른 질환의 예방 및 치료를 위한 물질 탐색 용도로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대하고 있으나, 아직까지는 근육노화 진단 마커로서 miRNA의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 근육노화를 진단할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 노화된 골격근에서 다양한 miRNA의 발현량이 변화될 수 있음을 검출함으로써, 이를 통해 근육노화를 진단할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 근육노화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 근육노화 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 근육노화 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육노화 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA-136"이란, 생물학적으로, 항 세포사멸 유전자인 AEG-1(astrocyte elevated gene-1)과 Bcl-2(B-cell lymphoma-2)의 발현을 저해하여 신경교종 세포(glioma cell)의 세포 사멸(apoptosis)을 촉진하는 것으로 알려져 있는 miRNA로, 마우스 염색체 12(chromosome 12) 좌에 위치해 있으며, miRNA-337, miRNA-127 및 miRNA-411 등과 동일한 좌(locus)에 존재함으로써 클러스터(cluster)를 형성하고 있는 miRNA이다. 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 miRNA-136의 "단편"이란, miRNA의 참조서열(reference sequence)과 비교할 때 결실되거나, 참조 서열과 상응하는 위치와 동일한 서열의 분절을 포함하는 것일 수 있으며, 본 발명의 용어 "참조서열"이란, 서열 비교의 근거로서 사용되도록 지정된 서열이다. 본 발명의 miRNA-136 단편은, 바람직하게는 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
microRNA 서열
서열번호 1
(miRNA-136)		 GAGGACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGAUUCUUAAGCUCCAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCUUC
서열번호 2
(miRNA-136-3p)		 AUCAUCGUCUCAAAUGAGUCUU
서열번호 3
(miRNA-136-5p)		 ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGG
서열번호 4
(miRNA-337)		 CAGUGUAGUGAGAAGUUGGGGGGUGGGAACGGCGUCAUGCAGGAGUUGAUUGCACAGCCAUUCAGCUCCUAUAUGAUGCCUUUCUUCACCCCCUUCA
서열번호 5
(miRNA-337-3p)		 UUCAGCUCCUAUAUGAUGCCU
서열번호 6
(miRNA-337-5p)		 GAACGGCGUCAUGCAGGAGUU
서열번호 7
(miRNA-127)		 CCAGCCUGCUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUUCAGAAAGAUCAUCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCUGGUCGG
서열번호 8
(miRNA-127-3p)		 UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU
서열번호 9
(miRNA-127-5p)		 CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU
서열번호 10
(miRNA-411)		 UGGUACUUGGAGAGAUAGUAGACCGUAUAGCGUACGCUUUAUCUGUGACGUAUGUAACACGGUCCACUAACCCUCAGUAUCA
서열번호 11
(miRNA-411-3p)		 UAUGUAACACGGUCCACUAACC
서열번호 12
(miRNA-411-5p)		 UAGUAGACCGUAUAGCGUACG
서열번호 13
(miRNA-34a)		 CCAGCUGUGAGUAAUUCUUUGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUUGUGAGUAUUAGCUAAGGAAGCAAUCAGCAAGUAUACUGCCCUAGAAGUGCUGCACAUUGU
서열번호 14
(miRNA-34a-3p)		 AAUCAGCAAGUAUACUGCCCU
서열번호 15
(miRNA-34a-5p)		 UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU
서열번호 16
(miRNA-34c)		 AGUCUAGUUACUAGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGCUAAUAGUACCAAUCACUAACCACACAGCCAGGUAAAAAGACU
서열번호 17
(miRNA-34c-3p)		 AAUCACUAACCACACAGCCAGG
서열번호 18
(miRNA-34c-5p)		 AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC
서열번호 19
(miRNA-143)		 CCUGAGGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGUCAGUUGGGAGUCUGAGAUGAAGCACUGUAGCUCAGG
서열번호 20
(miRNA-143-3p)		 UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC
서열번호 21
(miRNA-143-5p)		 GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGG
서열번호 22
(miRNA-144)		 GGCUGGGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGUUUGUGAUGAGACACUACAGUAUAGAUGAUGUACUAGUC
서열번호 23
(miRNA-144-3p)		 UACAGUAUAGAUGAUGUACU
서열번호 24
(miRNA-144-5p)		 GGAUAUCAUCAUAUACUGUAAGU
서열번호 25
(miRNA-146a)		 AGCUCUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUUAUAUCAAUGUCAGACCUGUGAAAUUCAGUUCUUCAGCU
서열번호 26
(miRNA-146a-3p)		 CCUGUGAAAUUCAGUUCUUCAG
서열번호 27
(miRNA-146a-5p)		 UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU
서열번호 28
(miRNA-148a)		 AGCCAGUUUGGUCUUUUGAGACAAAGUUCUGAGACACUCCGACUCUGAGUAUGAUAGAAGUCAGUGCACUACAGAACUUUGUCUCUAGAGGCUGUGGUC
서열번호 29
(miRNA-148a-3p)		 UCAGUGCACUACAGAACUUUGU
서열번호 30
(miRNA-148a-5p)		 AAAGUUCUGAGACACUCCGACU
서열번호 31
(miRNA-185)		 AGGGAUUGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGAUGGUCCCCUCCCAGGGGCUGGCUUUCCUCUGGUCCUU
서열번호 32
(miRNA-185-3p)		 AGGGGCUGGCUUUCCUCUGGU
서열번호 33
(miRNA-185-5p)		 UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA
서열번호 34
(miRNA-190a)		 CUGUGUGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGUUGUUAUUUAAUCCAACUAUAUAUCAAGCAUAUUCCUACAG
서열번호 35
(miRNA-190a-3p)		 ACUAUAUAUCAAGCAUAUUCCU
서열번호 36
(miRNA-190a-5p)		 UGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGU
서열번호 37
(miRNA-193a)		 GAGAGCUGGGUCUUUGCGGGCAAGAUGAGAGUGUCAGUUCAACUGGCCUACAAAGUCCCAGUCCUC
서열번호 38
(miRNA-193a-3p)		 AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU
서열번호 39
(miRNA-193a-5p)		 UGGGUCUUUGCGGGCAAGAUGA
서열번호 40
(miRNA-196b)		 AACUGGUCGGUGAUUUAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGGAUCCACCUUUCUCUCGACAGCACGACACUGCCUUCAUUACUUCAGUUG
서열번호 41
(miRNA-196b-3p)		 UCGACAGCACGACACUGCCUUC
서열번호 42
(miRNA-196b-5p)		 UAGGUAGUUUCCUGUUGUUGGG
서열번호 43
(miRNA-215)		 AGCUCUCAGCAUCAACGGUGUACAGGAGAAUGACCUAUGAUUUGACAGACCGUGCAGCUGUGUAUGUCUGUCAUUCUGUAGGCCAAUAUUCUGUAUGUCACUGCUACUUAAA
서열번호 44
(miRNA-215-3p)		 UCUGUCAUUCUGUAGGCCAAU
서열번호 45
(miRNA-215-5p)		 AUGACCUAUGAUUUGACAGAC
서열번호 46
(miRNA-223)		 UCUGGCCAUCUGCAGUGUCACGCUCCGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUGGACACUCUGUGUGGUAGAGUGUCAGUUUGUCAAAUACCCCAAGUGUGGCUCAUGCCUAUCAG
서열번호 47
(miRNA-223-3p)		 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
서열번호 48
(miRNA-223-5p)		 CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUG
서열번호 49
(miRNA-369)		 GGUACUUGAAGGGAGAUCGACCGUGUUAUAUUCGCUUGGCUGACUUCGAAUAAUACAUGGUUGAUCUUUUCUCAGUAUC
서열번호 50
(miRNA-369-3p)		 AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU
서열번호 51
(miRNA-369-5p)		 AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC
서열번호 52
(miRNA-483)		 GAGGGGGAAGACGGGAGAAGAGAAGGGAGUGGUUUUUGGGUGCCUCACUCCUCCCCUCCCGUCUUGUUCUCUC
서열번호 53
(miRNA-483-3p)		 UCACUCCUCCCCUCCCGUCUU
서열번호 54
(miRNA-483-5p)		 AAGACGGGAGAAGAGAAGGGAG
서열번호 55
(miRNA-615)		 UCGGGAGGGGCGGGAGGGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUCUCGAGGGUGCUUAUUGUUCGGUCCGAGCCUGGGUCUCCCUCUUCCCCCCAUCCC
서열번호 56
(miRNA-615-3p)		 UCCGAGCCUGGGUCUCCCUCUU
서열번호 57
(miRNA-615-5p)		 GGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUC
서열번호 58
(miRNA-155)		 CUGUUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGUUUUGGCCUCUGACUGACUCCUACCUGUUAGCAUUAACAG
서열번호 59
(miRNA-155-3p)		 CUCCUACCUGUUAGCAUUAAC
서열번호 60
(miRNA-155-5p)		 UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU
서열번호 61
(miRNA-203)		 GCCUGGUCCAGUGGUUCUUGACAGUUCAACAGUUCUGUAGCACAAUUGUGAAAUGUUUAGGACCACUAGACCCGGC
서열번호 62
(miRNA-203-3p)		 GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG
서열번호 63
(miRNA-203-5p)		 AGUGGUUCUUGACAGUUCAACA
서열번호 64
(miRNA-434)		 UCGACUCUGGGUUUGAACCAAAGCUCGACUCAUGGUUUGAACCAUUACUUAAUUCGUGGUUUGAACCAUCACUCGACUCCUGGUUCGAACCAUC
서열번호 65
(miRNA-434-3p)		 UUUGAACCAUCACUCGACUCCU
서열번호 66
(miRNA-434-5p)		 GCUCGACUCAUGGUUUGAACCA
서열번호 67
(miRNA-92b)		 GGUGGGCGGGAGGGACGGGACGUGGUGCAGUGUUGUUCUUUCCCCUGCCAAUAUUGCACUCGUCCCGGCCUCCGGCCCCCUCG
서열번호 68
(miRNA-92b-3p)		 UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC
서열번호 69
(miRNA-92b-5p)		 AGGGACGGGACGUGGUGCAGUGUU
본 발명에서 사용되는 용어 "근육노화"란, 노화에 수반하여 생기는 근육의 쇠퇴, 예를 들어 근기능(근력, 근지구력, 근순발력 등) 저하나 근위축 등을 포괄하는 의미로서, 상기 근위축이란 근세포의 감소나 축소에 의해 근량이 저하되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 근육노화의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명에서 상기 근육노화 진단용 조성물은 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146, miRNA-148, miRNA-185, miRNA-190, miRNA-193, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA-34는 miRNA-34a 또는 miRNA-34c를, miRNA-146은 miRNA-146a를, miRNA-148은 miRNA-148a를, miRNA-190은 miRNA-190a를, miRNA-193은 miRNA-193a, miRNA-196은 miRNA-196b를, miRNA-92는 miRNA-92b를 포함할 수 있다.
이에 제한되지는 않으나, 상기 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34a, miRNA-34c, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146a, miRNA-148a, miRNA-185, miRNA-190a, miRNA-193a, miRNA-196b, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92b의 서열 또는 이들의 단편의 서열은 상기 표 1에 개시한 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 miRNA들은 서열번호 1 내지 69로 기재된 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 1 내지 69로 기재된 염기서열은 근육노화의 진행 또는 발병 여부를 진단할 수 있는 진단 마커로 활용될 수 있으며, 상기 서열은 근육노화의 진행 또는 발병 여부를 진단하는데 있어서 일정정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98%의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 근육노화 진단 마커로서 정상 개체와 노화 개체 간에 발현량 차이를 유의있게 비교 가능하는 한, 본 발명의 상기 염기서열과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 근육노화 세포 또는 근육노화 질환을 가진 개체를 정상세포 또는 정상 개체와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 근육노화가 진행 또는 발병된 세포 또는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 근육노화 진단 마커는 정상 세포 또는 조직의 세포에 비하여, 근육노화 세포에서 특이적으로 발현 수준의 차이를 보이는 miRNA 또는 해당 miRNA의 단편이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "miRNA-136 또는 이의 단편의 수준을 측정하는 제제"란, 시료에 포함된 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 여부를 확인하는 방법에 사용되는 제제를 의미하는데, 바람직하게는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), 유전자 칩 분석법 등의 방법에 사용되는 표적 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머"란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브"란, 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체 (예: 메틸 포스포네이트, 포스소트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 근육노화를 진단할 수 있는 마커로서 활용될 수 있는 miRNA를 도출하였다. 상기 miRNA는, 솔렉사(Solexa) 또는 SOLID 시퀀서를 이용하여 DNA의 염기서열을 대량으로 동시에 분석할 수 있는 새로운 염기서열 분석 방법인, 차세대염기서열(next generation sequence; NGS) 방법을 이용하여 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근에 발현하는 miRNA의 발현량을 추정함으로써, 노화 마우스 골격근 특이 miRNA를 도출하였다.
표 2 및 표 3에 개시한 바와 같이, 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근에서 발현되는 miRNA의 비교 결과, 노화 마우스의 골격근에서 특이적으로, 그 발현량이 하향 조절 또는 상향 조절되는 miRNA를 도출할 수 있었다.
노화 마우스의 골격근에서 하향 조절되는 miRNA에는 miRNA-136을 비롯하여, miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-148a, miRNA-190a, miRNA-193a 및 miRNA-434 등이 있음을 확인할 수 있었고, 상향 조절되는 miRNA에는 miRNA-34a, miRNA-34c, miRNA-146a, miRNA-185, miRNA-196b, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92b 등이 있음을 확인할 수 있었다(도 3).
또한, 상기와 같이 도출되어진, 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근에서 발현되는 miRNA들의 발현량 차이 재검증을 위하여, 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 수행해 본 결과, 마찬가지로 노화 마우스의 골격근에서 miRNA-136을 비롯하여, miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-148a 및 miRNA-434 등의 발현량이 하향 조절됨을 확인할 수 있었고, miRNA-34a, miRNA-146a, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92b 등이 상향 조절됨을 확인할 수 있었다(도 4).
이러한 결과를 통하여, 상기 다양한 miRNA들은 근육노화가 진행됨에 따라 발현량이 감소 또는 증가함을 확인할 수 있었고, 본 발명의 miRNA-136을 비롯한 상기 다양한 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하면 근육노화를 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 근육노화 진단용 조성물을 포함하는 근육노화 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 근육노화의 발병이 의심되는 개체의 시료로부터 miRNA-136을 비롯하여 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146, miRNA-148, miRNA-185, miRNA-190, miRNA-193, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편의 발현 수준을 측정함으로써 근육노화를 진단하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 miRNA-136을 비롯한 상기 다양한 miRNA 또는 이에 해당하는 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머 또는 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 miRNA-136 또는 이의 단편, 그리고 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146, miRNA-148, miRNA-185, miRNA-190, miRNA-193, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 진단 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
다른 일례로서, 본 발명의 키트는 유전자 칩 분석법을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 유전자 칩 분석용 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 진단용 조성물 또는 키트를 이용하여 근육노화 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데, 구체적으로, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miRNA-136 또는 이의 단편, 그리고 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-148, miRNA-190, miRNA-193 및 miRNA-434 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miRNA-136을 비롯한 상기 다양한 miRNA 또는 이에 해당하는 단편의 발현 수준이 정상 대조군 시료로부터 측정된 수준과 비교하여, 유의하게 감소하는 경우 근육노화가 진행 또는 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
또한, (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miRNA-34, miRNA-146, miRNA-185, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miRNA-34를 비롯한 상기 다양한 miRNA 또는 이에 해당하는 단편의 발현 수준이 정상 대조군 시료로부터 측정된 수준과 비교하여, 유의하게 증가하는 경우 근육노화가 진행 또는 발병된 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
이때, 상기 miRNA-136 또는 이의 단편, 그리고 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146, miRNA-148, miRNA-185, miRNA-190, miRNA-193, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편의 발현 수준을 측정하는 방법은 상술한 바와 동일하다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 근육노화의 진행 또는 발병을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하고, miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 근육노화의 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 근육노화 예방 또는 치료용 제제를 스크리닝하는 방법은 (a) 대조군인 근육노화가 발병된 실험동물의 시료로부터 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 실험동물에서 근육노화를 치료할 수 있을 것으로 예상되는 후보물질을 투여하는 단계; (c) 실험군인 상기 후보물질이 투여된 실험동물의 시료로부터 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및, (d) 대조군에서 측정된 miRNA-136 또는 이의 단편의 수준을 실험군에서 측정된 것과 비교하여, 대조군에서 측정된 것보다도 실험군에서 측정된 것이 높은 수준을 나타내는 경우, 상기 후보물질을 근육노화의 진행 또는 발병을 방지하는 예방용 제제 또는 근육노화를 치료하는 치료용 제제로서 사용할 수 있는 것으로 판정하는 단계를 포함한다.
근육노화를 예방 또는 치료할 수 있는 후보 물질의 부재 하에 세포, 보다 바람직하게는 근육줄기세포(satellite cell)에서의 본 발명의 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 상기 miRNA-136 또는 이의 단편의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 상기 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준이 상기 후보 물질의 부재 하에서의 수준보다 증가시키는 물질을 근육노화의 예방용 제제로 예측할 수 있다.
또한, 노화 마우스의 골격근에서 하향 조절되는 miRNA인, miRNA-136 외에, miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-148, miRNA-190, miRNA-193 및 miRNA-434 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등의 발현 수준을 증가시키는 물질을 근육노화 예방용 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
아울러, 노화 마우스의 골격근에서 상향 조절되는 miRNA인, miRNA-34, miRNA-146, miRNA-185, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등의 발현 수준을 감소시키는 물질을 근육노화 예방용 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 miRNA-136 또는 이의 단편을 표적으로 한 증진제를 유효성분으로 포함하는 근육노화 억제용 조성물을 제공한다.
상기 근육노화 억제용 조성물은 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-148, miRNA-190, miRNA-193 및 miRNA-434로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 miRNA들에 해당하는 단편 등을 표적으로 한 증진제 또는 miRNA-34, miRNA-146, miRNA-185, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등을 표적으로 한 억제제를 포함할 수 있다.
구체적으로, 노화 마우스의 골격근에서 하향 조절되는 miRNA인, miRNA-136 외에, miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-148, miRNA-190, miRNA-193 및 miRNA-434 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등을 표적으로 한 증진제는 상기 miRNA 및 이에 해당하는 단편들의 발현 수준을 증가시킴으로써, 근육노화를 억제할 수 있다.
아울러, 노화 마우스의 골격근에서 상향 조절되는 miRNA인, miRNA-34, miRNA-146, miRNA-185, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92 또는 상기 miRNA들에 해당하는 단편 등을 표적으로 한 억제제는 상기 miRNA 및 이에 해당하는 단편들의 발현 수준을 감소시킴으로써, 근육노화를 억제할 수 있다.
상기 miRNA들 또는 이의 단편을 표적으로 한 증진제에는, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는, 상기 miRNA들 또는 이의 단편에 특이적인 화합물 또는 그 유사체(mimic) 형태일 수 있다.
또한, 상기 miRNA들 또는 이의 단편을 표적으로 한 억제제에는, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는, 상기 miRNA들 또는 이의 단편에 특이적인 siRNA, 앱타머, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 또는 화합물 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "유사체(mimic)"란, miRNA 작용을 모방하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 유사체에 의해 치료적으로 표적이 될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "siRNA"란, RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knockdown) 방법 또는 유전자 치료 방법으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "앱타머(aptamer)"란, 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 앱타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "안티센스"란, 유전자 발현을 방해하고 특정한 원하는 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 인지하거나 결합할 수 있도록 설계된 분자를 말한다. 안티센스 분자는 전형적으로 RNA 분자 상에 존재하는 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드"란, DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드로 구성된 한 분자이며, "올리고뉴클레오티드 유사체"란 용어는, 올리고뉴클레오티드-유사 구조를 포함하는 한 분자이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "리보자임(ribozyme)"이란, 효소 활성이 있는 RNA 분자를 의미하는 것으로서, 화학적 반응을 분자 내적으로나 또는 분자 사이에서 촉매할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 리보자임으로는 천연 시스템에서 발견되는 리보자임을 토대로 한 뉴클레아제나 핵산 중합효소 타입 반응을 촉매하는 리보자임의 상이한 유형들 모두 가능하며, 생체 내 특이한 반응을 촉매하기 위해 공학적으로 처리되는 리보자임도 이용 가능하다. 리보자임은 RNA 또는 DNA 기질을 절단할 수 있으며, 본 발명의 목적상 RNA 기질을 절단할 수 있다. 리보자임은 전형적으로 표적 기질의 인식 및 결합과 이어지는 절단을 통하여 핵산 기질을 절단하게 되는데, 이러한 인식은 대부분 염기쌍 상호작용을 토대로 하므로, 표적 특이적 절단이 가능한 특징을 가질 수 있다.
본 발명에서 제공하는 miRNA-136을 비롯한 다양한 miRNA는 노화에 따른 근위축 및 그에 수반하는 근기능의 저하 뿐만 아니라, 이에 따른 에너지 대사의 저하로 비만이나 당뇨병 등의 질환까지도 수반할 수 있는, 근육노화의 진행 또는 발명 여부, 그리고 노화 정도를 진단할 수 있는 마커로 사용될 수 있으므로, 근육노화 진단 키트 개발 및 근육노화 억제 물질을 탐색하는데 있어서, 탁월한 효과가 있는 마커로 널리 활용될 수 있다.
도 1은 어린(young) 마우스와 노화(aged) 마우스 간의 골격근(skeletal muscle)의 근량 차이를 나타낸 도이다.
도 2는 차세대 염기서열(next generation sequencing; NGS) 방법으로 도출된 어린 마우스의 골격근과 노화 마우스의 골격근에 발현하는 소형 리보핵산 전사체(small RNA transcriptome)의 분석 개요를 나타낸 도이다.
도 3은 고속대량(high throughput) 소형-RNA 서열분석법(sequencing)으로 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근으로부터 발견된 최종 miRNA의 발현량 차이를 비교한 도이다.
도 4는 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR) 방법으로 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근으로부터 발견된 최종 miRNA의 발현량 차이를 비교한 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 근육 조직 샘플 준비 및 근육 근량 측정
골격근에서 노화(aging)에 관한 연구를 수행하기 위해, 어린(young) 마우스(6개월령)와 노화(aged) 마우스(24개월령) 간의 근육 근량(muscle mass)을 비교하였다.
구체적으로, 6마리의 어린 수컷 C57BL/6 마우스(6개월)와 6마리의 노화 수컷 C57BL/6 마우스(24개월령)는 실험동물자원센터(한국생명공학연구원)에서 구입하였다. 족저근(soleus muscle; SOL), 장지신근(extensor digitorum longus; EDL), 전경골근(tibialis anterior; TA), 및 비복근(gastrocnemius; gastroc.) 4가지 종류의 근육 해부(dessection)를 위해 희생시키기 전에, 마우스의 체중을 기록하였다. 각각의 근육량(muscle mass)을 기록하고, 비복근(gastrocnemius; gastroc.)은 다음 단계의 마이크로RNA(miRNA) 프로파일링(profiling) 실험을 위해 즉시 수집하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 어린 마우스(6개월령)와 노화 마우스(24개월령) 간의 근육 근량을 비교해 본 결과, 어린 마우스에 비해 노화 마우스의 전경골근(tibialis anterior; TA), 및 비복근(gastrocnemius; gastroc.) 둘 다에서 두드러진 근육량 손실이 나타났으며, 특히, 32개월령까지 나이에 따라 골격근인 비복근의 근육량이 점진적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 근육소실이 근육노화의 주요 특징 중 하나임을 의미한다.
실시예 2: 마이크로 RNA ( miRNA ) 서열분석( sequencing ) 및 데이터 분석
근육 노화의 분자적 메카니즘을 도출하기 위하여, 소형 리보핵산(small RNA) 서열분석(sequencing)으로 어린 마우스의 골격근과 노화 마우스의 골격근에 발현하는 전체 유전체 마이크로RNA(genome-wide miRNA)를 분석, 비교하였다.
구체적으로, 제조업자의 프로토콜에 따라 mirVAna miRNA isolation kit(Ambion, Austin, TX)를 사용하여, 비복근(gastrocnemius; gastroc.)(n=12)으로부터 소형 리보핵산이 풍부한(small RNA-enriched) 토털 RNA(total RNA)를 추출하였고, miRNA 라이브러리는 Illumina library preparation protocol(Illumina Inc., San Diego, CA, USA)에 따라 준비하였다. 각각의 라이브러리는 Illumina 어댑터(adaptor)(6-염기 바코드(base barcode))로 색인화 하였다. 소형 리보핵산(small RNA) 라이브러리는 6% TBE 유레아 폴리아크릴아마이드 겔(TBE urea polyacrylamide gel)에서 크기별로 나누고(size fractionation), 140 내지 160 염기 쌍(base pair) 부분(fraction)은 겔로부터 절개하여 얻고 정제하였다. 정제된 miRNA 라이브러리는 Agilent DNA 1000 chip을 이용하여 정량화하였다. 모든 색인화된 샘플은 Illumina GAⅡx(36 bp 단편(reads))의 하나의 레인(lane)에서 풀링(pooling)하고 서열분석(sequencing)하였다.
가공되지 않은 소형 리보핵산(raw small RNA) 서열분석 맵핑(mapping)전에 참조 표준 유전체(reference genome)로 해독하고, 염기 서열의 질(quality)적 해독은 FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)로 평가하였으며, 3' 말단에 부착된 어댑터 시퀀스는 내부(in-house)의 펄 스크립트(PERL script)로 제거하였다. 어댑터 시퀀스 트리밍(trimming) 후, 단편 크기(read size) 분배(distribution)는 R(http://www.r-project.org.) 스크립트로 분석하였다. 어댑터 시퀀스를 트리밍한(adapter-trimmed) 소형 리보핵산 단편(read)은 디폴트 옵션(default option)을 가진 BWA(http://bio-bwa. sourceforge.net.) 소프트웨어를 따른 UCSC Genome Browser(http://genome. ucsc.edu)로부터 다운로드된 참조 표준 유전체 mm10에 맵화(mapped)하였다(Li & Durbin 2009). 맵화한 서열 단편을 RNA 계열(class)로 구분하기 위해, 마이크로RNA(microRNA; miRNA), 운반RNA(transfer RNA; tRNA), 리보솜RNA(ribosomal RNA; rRNA )및 다른 비번역 RNA(non-coading RNA)를 계열화 하기 위한 UCSC Genome Browser와 fRNAdb(http://www.ncrna.org/frnadb.)로부터의 주석 파일(annotation file)에서 소형 리보핵산과 반복서열(repeats)의 게놈 위치 정보(genomic position information)를 사용하여 수행하였다. 맵핑 위치(mapping position)와 주석 정보(annotation information)를 비교하여, 모든 맵화된 서열 단편과 부합되는 RNA 타입으로 계열화하고, 각각의 RNA 타입의 발현에 대한 상대적 빈도는 지정한 서열 단편 수에 기초하여 평가하였다. 토털 소형 RNA 서열분석 테이터에서 주요 miRNA 발현 부분을 결정하기 위해, 6마리의 어린 마우스 샘플의 풀링(pooling)된 서열 단편 셋트로부터 발현된 상위 10개의 miRNA를 선택하고, 풀링(pooling)된 어린 마우스와 노화된 마우스의 서열 단편 셋트에서 상기 가장 많은 10개의 miRNA와 적은 부분을 차지하는 서열 단편에 대한 상대적 비율(portion)을 평가하였다. 이미 알려진 miRNA(miRBase ver. 20)에 대해서는 파이썬(Python) 스크립트를 사용하여 맵화된 서열 단편으로부터 각각의 전구체(precursor)와 최종 miRNA(mature microRNA)에 대한 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)을 계산하였다. 새로운 miRNA 탐색을 위해, 디폴트 파라미터(default parameter)를 가진 mirDeep2 소프트웨어를 사용하였고, MiRBase는 알려진 miRNA를 배제하기 위해 사용하였다. 시궁쥐(Rattus norvegicus)는 근연종으로써 사용하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 서열(sequence)은 22nt(nucleotide)에서 피크를 가지는 20 내지 23 nt 길이인(도 2의 A), 최종 miRNA(mature miRNA)가 96.9% 로 나타났으며, 나머지 3.1%의 small RNA는 소형 핵RNA(small nuclear RNA; snRNA), 소세포질 RNA(small cytoplasmic RNA; scRNA), 신호-인식입자RNA(signal recognition particle RNA; srpRNA), 리보솜RNA(ribosomal RNA; rRNA), 운반RNA(transfer RNA; tRNA), 및 피위 단백질과 상호작용하는 RNA (piwi-interacting RNA; piRNA)인 것으로 나타났다(도 2의 B). 생식 세포(germ cell)에서 발견되는 piRNA는 노화 마우스의 골격근에서 상향조절(up-regulation) 되는 것으로 확인되었다(도 2의 C). 또한, 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근에서 최종 miRNA의 존재비(abundance)를 확인하기 위해, 상위 10개의 miRNA로 구분해 본 결과, 골격근에서 가장 높게 발현하는 상위 10개의 최종 miRNA가 전체 miRNA의 75%를 차지하는 것으로 나타났다(도 2의 D). 상기 분석한 상위 10개의 최종 miRNA 중, 대부분을 차지하고 있는 miR-10b를 제외한, 나머지 miRNA는 이미 근육에서의 역할이 보고된 바 있는 miRNA인 것으로 확인되었다.
실시예 3: 리보핵산( RNA ) 서열분석( sequencing ) 및 데이터 분석
골격근의 노화와 관련된 miRNA를 탐색하기 위하여, 고속대량(high throughput) 소형-RNA 서열분석법(sequencing)으로 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근으로부터 최소 5개의 서열 단편을 가지는, 최종 miRNA를 발견하였다. 이들 중, 노화된 근육에서 20개의 miRNA는 상향 조절(up-regulation)되었고, 19개의 miRNA는 하향 조절(down-regulation)되었다(>1.5 배 차이, t-test, p<0.05). 선택된 miRNA 중에는 이전에 근육 노화와 관련되어 보고된 바 있는 miRNA-206, miRNA-434, miRNA-34 등의 miRNA도 포함되어 있었다.
보다 구체적으로, 토털 RNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(Qiagen)을 사용하여 어린 쥐와 노화된 쥐의 비복근(gastrocnemius; gastroc.)(n=5)으로부터 추출하였다. RNA의 질(quality)과 안정성(integrity)은, 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)을 수행하고, 브롬화 에티듐(ethidium bromide; EtBr) 염색하여 자외선 (ultraviolet light) 하에서 육안 시험(visual examination)으로 확인하였다. 시퀀싱 라이브러리는 제조업자의 프로토콜에 따라 TruSeq RNA Sample Preparation kit v2(Illumina, CA, USA)를 사용하여 준비하였다. 간단하게, 메신저 RNA(messenger RNA; mRNA)는 토털 RNA로부터 폴리-T-올리고 부착 마그네틱 비드(poly-T oligo-attached magnetic bead)를 사용하여 정제하고, 단편화(fragmentation)하여 cDNA로 전환하였다. 어댑터(adapter)를 결찰(ligation)한 다음, 단편(fragment)은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR)로 증폭하였고, 서열분석(sequencing)은 Genome Analyzer Ⅱx(Illumina)를 사용하여 쌍으로 된 말단 서열 단편(2×76 bp)으로 수행하였다.
생쥐(Mus musculus)로부터 얻은 참조 표준 유전체(reference genome) 서열(sequence)은 캘리포니아 대학교 Santa Cruz Genome Browser Gateway (assembly ID: mm10)로부터 얻었다. 참조 표준 유전체 색인은 Bowtie2(ver. 2.0)과 SAMtools(ver. 0.1.18)의 Bowtie2-build 구성요소(component)를 사용하여 설계하였다. Tophat2(ver. 2.0.8)는 참조 표준 유전체에 대한 서열 단편을 맵화하기 위한 조직 샘플(tissue sample)에 적용하였다. 유전자 발현은 UCSC Browser gateway로부터 다운로드한 표준 시퀀스 유전자(Refseq gene, mm10) 모델(model)을 사용하여 각각의 유전자에 대한 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)을 계산하였고, 각각의 FPKM은 추가 분석을 위해 log2로 변환하여 도출하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근으로부터 발견된 최소 5개의 서열 단편을 가지는 최종 miRNA 중, 본 발명의 miRNA-136의 발현 수준은 어린 마우스의 근육에서의 발현량과 비교하여, 노화 근육에서의 발현량이 하향 조절되는 것을 확인할 수 있었다.
추가적으로, 하기 표 2 및 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 노화된 근육에서 20개의 상향 조절(up-regulation)되는 miRNA와 본 발명의 miRNA-136을 포함하여, 하향 조절(down-regulation)되는 19개의 miRNA를 확인할 수 있었다(>1.5 배 차이, t-test, p<0.05)
Figure pat00001
Figure pat00002
이러한 결과를 통하여 본 발명의 miRNA-136을 비롯한, 상기 miRNA들이 근육노화에 따라 상향 조절 또는 하향 조절되는 것을 검출함으로써, 근육노화를 진단할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3-1: 최종 miRNA ( mature microRNA ) 발현 분석 검증
고속대량(high throughput) 소형-RNA 서열분석법(sequencing)으로 어린 마우스와 노화 마우스의 골격근으로부터 탐색된 최종 miRNA의 발현량 차이 재검증을 위하여, 실시간 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 수행하였다.
보다 구체적으로, miRNA 발현 분석을 위한, TaqMan MicroRNA assay는 제조업자가 제시한 프로토콜에 따라 수행하였다(Applied Biosystems). 간단하게, 각각의 역전사 효소(reverse transcriptase; RT) 반응(reaction)은 50 nM stem-loop RT 프라이머, 0.25mM dNTP, 3.33 units/ul MultiScribe RT 효소, 및 0.25 units/ul RNase 저해제(inhibitor)와 1 × RT 버퍼(buffer)가 포함되어 있는 mirVana miRNA isolation kit를 사용하여 10 ng의 토털 RNA를 분리하였다(Applied Biosystems). 상기 반응은 16℃에서 30분, 42℃에서 30분, 85℃에서 5분 동안 인큐베이션하고, 4℃에서 반응을 정지시켰다. 각각의 정량 PCR(quantitative PCR; qPCR) 반응은 1.33ul의 역전사 산물, TaqMan MicroRNA assay의 20× 프라이머 1 ul, 프로브 믹스(probe mix), 및 H-Taq DNA polymerase 0.5 ul 그리고 10ul의 버퍼 혼합물(40 mM Tris-HCL(pH 8.4), 100 mM KCl, 6 mM MgCl2, 0.5 mM dNTP, 및 10% DMSO)을 포함하여 이루어졌다. 상기 반응은 Bio-Rad CFX96 System을 사용하여, 96 웰 플레이트 상에서 95℃에서 10분 동안 인큐베이션하고, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분 동안, 각각 40 사이클(cycle)의 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응 단계에서, 역방향 프라이머로는 TaqMan® Universial reverse primer를 사용하였고, 정방향 프라이머는 하기 표 4에 나타난 바와 같다. 감지 시작 주기(threshold cycle, Ct)는 형광 발광이 고정된 역치(threshold)를 띄는 부분 주기(fractional cycle) 수로 정의하였다. U6 snRNA(small nuclear RNA)는 표준화(normalization)를 위한 내생의 대조군(endogenous control)로서 제공되었다.
microRNA 프라이머 서열 서열번호
miRNA-136-5p primer ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGG 70
miRNA-337-3p primer UUCAGCUCCUAUAUGAUGCCU 71
miRNA-127-3p primer UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU 72
miRNA-34a-5p primer UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 73
miRNA-146a-5p primer UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU 74
miRNA-148a-3p primer UCAGUGCACUACAGAACUUUGU 75
miRNA-411-5p primer UAGUAGACCGUAUAGCGUACG 76
miRNA-92b-3p primer UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 77
miRNA-155-5p primer UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU 78
miRNA-203-3p primer GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG 79
miRNA-434-3p primer UUUGAACCAUCACUCGACUCCU 80
miRNA-434-5p primer GCUCGACUCAUGGUUUGAACCA 81
도 4에 나타난 바와 같이, 서열분석(sequencing)에 의하여 노화 근육에서의 발현량이 하향 조절되는 것이 확인된 본 발명의 miRNA-136이, 실시간 정량 PCR을 통해서도 어린 마우스의 근육에서의 발현량과 비교하여, 노화 근육에서 발현량이 하향 조절됨이 재입증되었다.
또한, 서열분석(sequencing)에 의하여 노화 근육에서의 발현량이 상향 조절되는 것이 확인된 miRNA-34, miRNA-92, miRNA-146, miRNA-155 및 miRNA-203의 경우에도, 실시간 정량 PCR을 통하여 어린 마우스의 근육에서의 발현량과 비교한 결과, 노화 근육에서 발현량이 상향 조절됨이 재입증되었다(도 4의 A).
아울러, 서열분석(sequencing)에 의하여 노화 근육에서의 발현량이 하향 조절되는 것이 확인된 miRNA-127, miRNA-148, miRNA-337, miRNA-411, miRNA-434의 경우에도, 실시간 정량 PCR을 통하여 어린 마우스의 근육에서의 발현량과 비교한 결과, 노화 근육에서 발현량이 하향 조절됨이 재입증되었다(도 4의 B).
따라서, 상기 실시간 정량 PCR 결과를 통하여, 본 발명의 miRNA-136을 비롯한, 상기 miRNA들이 근육노화 마커로 사용될 수 있음을 다시 한번 명확하게 알 수 있었다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> MicroRNA-136 for the diagnosis and treatment of muscle aging <130> KPA140123-KR <160> 81 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-136 <400> 1 gaggacucca uuuguuuuga ugauggauuc uuaagcucca ucaucgucuc aaaugagucu 60 uc 62 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-136-3p <400> 2 aucaucgucu caaaugaguc uu 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-136-5p <400> 3 acuccauuug uuuugaugau gg 22 <210> 4 <211> 97 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-337 <400> 4 caguguagug agaaguuggg gggugggaac ggcgucaugc aggaguugau ugcacagcca 60 uucagcuccu auaugaugcc uuucuucacc cccuuca 97 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-337-3p <400> 5 uucagcuccu auaugaugcc u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-337-5p <400> 6 gaacggcguc augcaggagu u 21 <210> 7 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-127 <400> 7 ccagccugcu gaagcucaga gggcucugau ucagaaagau caucggaucc gucugagcuu 60 ggcuggucgg 70 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-127-3p <400> 8 ucggauccgu cugagcuugg cu 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-127-5p <400> 9 cugaagcuca gagggcucug au 22 <210> 10 <211> 82 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-411 <400> 10 ugguacuugg agagauagua gaccguauag cguacgcuuu aucugugacg uauguaacac 60 gguccacuaa cccucaguau ca 82 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-411-3p <400> 11 uauguaacac gguccacuaa cc 22 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-411-5p <400> 12 uaguagaccg uauagcguac g 21 <210> 13 <211> 102 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34a <400> 13 ccagcuguga guaauucuuu ggcagugucu uagcugguug uugugaguau uagcuaagga 60 agcaaucagc aaguauacug cccuagaagu gcugcacauu gu 102 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34a-3p <400> 14 aaucagcaag uauacugccc u 21 <210> 15 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34a-5p <400> 15 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 16 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34c <400> 16 agucuaguua cuaggcagug uaguuagcug auugcuaaua guaccaauca cuaaccacac 60 agccagguaa aaagacu 77 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34c-3p <400> 17 aaucacuaac cacacagcca gg 22 <210> 18 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34c-5p <400> 18 aggcagugua guuagcugau ugc 23 <210> 19 <211> 63 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-143 <400> 19 ccugaggugc agugcugcau cucuggucag uugggagucu gagaugaagc acuguagcuc 60 agg 63 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-143-3p <400> 20 ugagaugaag cacuguagcu c 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-143-5p <400> 21 ggugcagugc ugcaucucug g 21 <210> 22 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-144 <400> 22 ggcugggaua ucaucauaua cuguaaguuu gugaugagac acuacaguau agaugaugua 60 cuaguc 66 <210> 23 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-144-3p <400> 23 uacaguauag augauguacu 20 <210> 24 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-144-5p <400> 24 ggauaucauc auauacugua agu 23 <210> 25 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-146a <400> 25 agcucugaga acugaauucc auggguuaua ucaaugucag accugugaaa uucaguucuu 60 cagcu 65 <210> 26 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-146a-3p <400> 26 ccugugaaau ucaguucuuc ag 22 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-146a-5p <400> 27 ugagaacuga auuccauggg uu 22 <210> 28 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-148a <400> 28 agccaguuug gucuuuugag acaaaguucu gagacacucc gacucugagu augauagaag 60 ucagugcacu acagaacuuu gucucuagag gcugugguc 99 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-148a-3p <400> 29 ucagugcacu acagaacuuu gu 22 <210> 30 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-148a-5p <400> 30 aaaguucuga gacacuccga cu 22 <210> 31 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-185 <400> 31 agggauugga gagaaaggca guuccugaug guccccuccc aggggcuggc uuuccucugg 60 uccuu 65 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-185-3p <400> 32 aggggcuggc uuuccucugg u 21 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-185-5p <400> 33 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22 <210> 34 <211> 67 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-190a <400> 34 cugugugaua uguuugauau auuagguugu uauuuaaucc aacuauauau caagcauauu 60 ccuacag 67 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-190a-3p <400> 35 acuauauauc aagcauauuc cu 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-190a-5p <400> 36 ugauauguuu gauauauuag gu 22 <210> 37 <211> 66 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-193a <400> 37 gagagcuggg ucuuugcggg caagaugaga gugucaguuc aacuggccua caaaguccca 60 guccuc 66 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-193a-3p <400> 38 aacuggccua caaaguccca gu 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-193a-5p <400> 39 ugggucuuug cgggcaagau ga 22 <210> 40 <211> 85 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-196b <400> 40 aacuggucgg ugauuuaggu aguuuccugu uguugggauc caccuuucuc ucgacagcac 60 gacacugccu ucauuacuuc aguug 85 <210> 41 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-196b-3p <400> 41 ucgacagcac gacacugccu uc 22 <210> 42 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-196b-5p <400> 42 uagguaguuu ccuguuguug gg 22 <210> 43 <211> 112 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-215 <400> 43 agcucucagc aucaacggug uacaggagaa ugaccuauga uuugacagac cgugcagcug 60 uguaugucug ucauucugua ggccaauauu cuguauguca cugcuacuua aa 112 <210> 44 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-215-3p <400> 44 ucugucauuc uguaggccaa u 21 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-215-5p <400> 45 augaccuaug auuugacaga c 21 <210> 46 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-223 <400> 46 ucuggccauc ugcaguguca cgcuccgugu auuugacaag cugaguugga cacucugugu 60 gguagagugu caguuuguca aauaccccaa guguggcuca ugccuaucag 110 <210> 47 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-223-3p <400> 47 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 48 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-223-5p <400> 48 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 49 <211> 79 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-369 <400> 49 gguacuugaa gggagaucga ccguguuaua uucgcuuggc ugacuucgaa uaauacaugg 60 uugaucuuuu cucaguauc 79 <210> 50 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-369-3p <400> 50 aauaauacau gguugaucuu u 21 <210> 51 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-369-5p <400> 51 agaucgaccg uguuauauuc gc 22 <210> 52 <211> 73 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-483 <400> 52 gagggggaag acgggagaag agaagggagu gguuuuuggg ugccucacuc cuccccuccc 60 gucuuguucu cuc 73 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-483-3p <400> 53 ucacuccucc ccucccgucu u 21 <210> 54 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-483-5p <400> 54 aagacgggag aagagaaggg ag 22 <210> 55 <211> 92 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-615 <400> 55 ucgggagggg cgggaggggg guccccggug cucggaucuc gagggugcuu auuguucggu 60 ccgagccugg gucucccucu uccccccauc cc 92 <210> 56 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-615-3p <400> 56 uccgagccug ggucucccuc uu 22 <210> 57 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-615-5p <400> 57 gggggucccc ggugcucgga uc 22 <210> 58 <211> 65 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-155 <400> 58 cuguuaaugc uaauugugau agggguuuug gccucugacu gacuccuacc uguuagcauu 60 aacag 65 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-155-3p <400> 59 cuccuaccug uuagcauuaa c 21 <210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-155-5p <400> 60 uuaaugcuaa uugugauagg ggu 23 <210> 61 <211> 76 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-203 <400> 61 gccuggucca gugguucuug acaguucaac aguucuguag cacaauugug aaauguuuag 60 gaccacuaga cccggc 76 <210> 62 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-203-3p <400> 62 gugaaauguu uaggaccacu ag 22 <210> 63 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-203-5p <400> 63 agugguucuu gacaguucaa ca 22 <210> 64 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-434 <400> 64 ucgacucugg guuugaacca aagcucgacu caugguuuga accauuacuu aauucguggu 60 uugaaccauc acucgacucc ugguucgaac cauc 94 <210> 65 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-434-3p <400> 65 uuugaaccau cacucgacuc cu 22 <210> 66 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-434-5p <400> 66 gcucgacuca ugguuugaac ca 22 <210> 67 <211> 83 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-92b <400> 67 ggugggcggg agggacggga cguggugcag uguuguucuu uccccugcca auauugcacu 60 cgucccggcc uccggccccc ucg 83 <210> 68 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-92b-3p <400> 68 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 69 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-92b-5p <400> 69 agggacggga cguggugcag uguu 24 <210> 70 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-136-5p primer <400> 70 acuccauuug uuuugaugau gg 22 <210> 71 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-337-3p primer <400> 71 uucagcuccu auaugaugcc u 21 <210> 72 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-127-3p primer <400> 72 ucggauccgu cugagcuugg cu 22 <210> 73 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-34a-5p primer <400> 73 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 74 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-146a-5p primer <400> 74 ugagaacuga auuccauggg uu 22 <210> 75 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-148a-3p primer <400> 75 ucagugcacu acagaacuuu gu 22 <210> 76 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-411-5p primer <400> 76 uaguagaccg uauagcguac g 21 <210> 77 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-92b-3p primer <400> 77 uauugcacuc gucccggccu cc 22 <210> 78 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-155-5p primer <400> 78 uuaaugcuaa uugugauagg ggu 23 <210> 79 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-203-3p primer <400> 79 gugaaauguu uaggaccacu ag 22 <210> 80 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-434-3p primer <400> 80 uuugaaccau cacucgacuc cu 22 <210> 81 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-434-5p primer <400> 81 gcucgacuca ugguuugaac ca 22

Claims (13)

  1. miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 근육노화 진단용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 miRNA-136은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 miRNA-136의 단편은 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진 것인, 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 miRNA-136 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 miRNA-136의 단편에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열번호 70의 염기서열을 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146, miRNA-148, miRNA-185, miRNA-190, miRNA-193, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 근육노화 진단용 키트.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 유전자 칩 키트인 것인 근육노화 진단용 키트.
  9. (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 측정된 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 miRNA-136 또는 이의 단편의 발현 수준보다 감소하는 경우 근육노화가 진행된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 근육노화 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 miRNA-136의 발현 수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩에 의하여 측정되는 것인 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-34, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-146, miRNA-148, miRNA-185, miRNA-190, miRNA-193, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203, miRNA-434 및 miRNA-92로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 miRNA-337, miRNA-127, miRNA-411, miRNA-143, miRNA-144, miRNA-148, miRNA-190, miRNA-193 및 miRNA-434로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준보다 감소하는 경우 근육노화가 진행된 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 11항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 miRNA-34, miRNA-146, miRNA-185, miRNA-196, miRNA-215, miRNA-223, miRNA-369, miRNA-483, miRNA-615, miRNA-155, miRNA-203 및 miRNA-92로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 또는 이의 단편의 발현 수준보다 증가하는 경우 근육노화가 진행된 것으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
KR1020140058381A 2014-05-15 2014-05-15 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136 KR20150131555A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140058381A KR20150131555A (ko) 2014-05-15 2014-05-15 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136
PCT/KR2015/004929 WO2015174798A1 (ko) 2014-05-15 2015-05-15 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140058381A KR20150131555A (ko) 2014-05-15 2014-05-15 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150131555A true KR20150131555A (ko) 2015-11-25

Family

ID=54845368

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140058381A KR20150131555A (ko) 2014-05-15 2014-05-15 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20150131555A (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210003647A (ko) 2019-07-02 2021-01-12 주식회사 케이프로텍 Cd146 단백질을 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2024049247A1 (ko) * 2022-09-01 2024-03-07 주식회사 제노헬릭스 신규 파킨슨병 바이오마커 및 이의 용도

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210003647A (ko) 2019-07-02 2021-01-12 주식회사 케이프로텍 Cd146 단백질을 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2024049247A1 (ko) * 2022-09-01 2024-03-07 주식회사 제노헬릭스 신규 파킨슨병 바이오마커 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2733219B1 (en) Diagnostic miRNA markers for Alzheimer
US20180340228A1 (en) Diagnostic mirna markers for parkinson&#39;s disease
KR102029775B1 (ko) 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커 및 이의 용도
KR20170019425A (ko) 위암의 검출 키트 또는 디바이스 및 검출 방법
KR20100093538A (ko) 편평세포 폐암의 예후를 예측하는 방법
WO2019074615A2 (en) IN VITRO METHODS FOR DISCOVERING THERAPEUTIC COMPOUNDS FOR THE SKIN USING SKIN AGING BIOMARKERS
CN107312852A (zh) 心肌梗死诊断标志物组合物
AU2017313455A1 (en) Biomarkers of oral, pharyngeal and laryngeal cancers
KR20200015545A (ko) 인간 개인의 연령 결정
Shu et al. Deep sequencing microRNA profiles associated with wooden breast in commercial broilers
JP2018504909A5 (ko)
KR20150131555A (ko) 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-136
KR20150131556A (ko) 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-337
EP2942399B1 (en) Method for the diagnosis of breast cancer
KR101814868B1 (ko) 마이크로 rna와 nmda 수용체의 상관관계를 이용한 해마의 기능감소 판단 방법, 기능감소 억제 방법 및 기능감소 억제제 스크리닝 방법
KR20150131557A (ko) 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-127
WO2015174798A1 (ko) 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna
EP2682752A1 (en) HMGA2 as a marker for diagnosing diabetes
EP3599288B1 (en) Diagnosis and treatment of psoriatic arthritis
KR20150131559A (ko) 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-34
KR20150131558A (ko) 근육노화 진단 및 치료를 위한 마이크로rna-411
KR101777911B1 (ko) 골다공증 골절 발생 예측용 바이오마커
CN113444808B (zh) Loc114108859及其新用途
CN113604578B (zh) 一种与绵羊脂肪相关的miRNA及其应用
KR102293039B1 (ko) 근육 노화 진단용 miRNA 마커 및 이를 이용한 진단방법

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Withdrawal due to no request for examination