WO2024049247A1 - 신규 파킨슨병 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Classifications
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Definitions
- the present invention relates to a diagnostic biomarker and diagnostic composition for Parkinson's disease, a kit containing the same, and a use thereof.
- Parkinson's disease is a disease whose main symptoms include tremor, stiffness, bradykinesia, and gait abnormalities.
- a neurotransmitter called dopamine is produced in the substantia nigra and corpus striatum of the brain. It is a chronic disease caused by a lack of this.
- dopaminergic neurons in the substantia nigra have already been destroyed and already dead neurons cannot be revived. Therefore, the above drugs are aimed at curing the disease. Moreover, because it is aimed only at improving symptoms, there are limitations in treating Parkinson's disease.
- Tests performed in relation to the diagnosis of Parkinson's disease include PET examinations, MRI examinations, and examinations for internal diseases.
- the conventional diagnosis methods for Parkinson's disease have the problem of being complicated and high cost.
- the purpose of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosis of Parkinson's disease.
- Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing Parkinson's disease.
- Another object of the present invention is to provide a diagnostic kit for Parkinson's disease comprising the diagnostic composition.
- Another object of the present invention is to provide a method for providing information for diagnosis of Parkinson's disease.
- Another object of the present invention is to provide a method for diagnosing Parkinson's disease.
- Another object of the present invention is to provide a screening method for a treatment for Parkinson's disease.
- One aspect of the present invention for achieving the above object is miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p and miR-126-3p. It relates to a biomarker composition for diagnosing Parkinson's disease, comprising one or more miRNAs selected from the group consisting of.
- the biomarker composition may include, but is not limited to, miR-144-3p and let-7d-5p.
- the miR-144-3p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 1
- the let-7d-5p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2
- the let-7b-5p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 3 It consists of a sequence
- the miR-19b-3p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- the miR-20b-5p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 5
- the miR-126-3p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 6 It may be composed of base sequences.
- Parkinson's disease refers to a disease in which movement disorders occur due to destruction of the dopaminergic nerves of the substantia nigra located in the center of the brainstem. Parkinson's disease shows symptoms of progressive supranuclear palsy, multiple nervous system atrophy, corticobasal degeneration, and Lewy body dementia.
- the above-mentioned miRNA biomarker can show very high accuracy by showing a high AUC value of 0.8 or 0.9 or more in diagnosing Parkinson's disease compared to normal people. Furthermore, by combining the biomarkers of the present invention, multi-variable When applied, it was confirmed that not only normal people but also Alzheimer's dementia can be diagnosed by distinguishing them from Parkinson's disease.
- Another aspect of the present invention is one or more selected from the group consisting of: It relates to a composition for diagnosing Parkinson's disease, comprising an agent for measuring the expression level of miRNA.
- the diagnostic composition may include an agent for measuring the expression levels of miR-144-3p and let-7d-5p, but is not limited thereto.
- the “agent” is a substance that specifically binds to miRNA and may be a primer, probe, or antisense nucleotide, but is not limited thereto.
- the primer is a nucleic acid sequence with a short free 3' terminal hydroxyl group that can form a base pair with a complementary template and serves as a starting point for copying the template strand. refers to a nucleic acid sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of different nucleoside triphosphates and reagents for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature.
- nucleoside triphosphates and reagents for polymerization i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase
- miRNA refers to a non-coding RNA of 15 to 25 bases that is usually transcribed as an RNA precursor with a hairpin-shaped structure and can participate in translational inhibition of mRNA.
- the miRNA of the present invention has a specific nucleotide sequence (or SEQ ID NO. ), as well as precursors (pre-miRNA, pri-miRNA) of the above-mentioned miRNAs, miRNAs with equivalent biological functions, such as homologs (i.e. homologs or orthologs), variants such as genetic polymorphisms, and Also includes derivatives.
- miRBase release 20 http://www.mirbase.org/
- miRBase release 20 http://www.mirbase.org/
- It may include a miRNA with a base sequence.
- the miRNA used herein may be a gene product of a miR gene, and such a gene product may be a mature miRNA (e.g., a ratio of 15 to 25 bases or 19 to 25 bases involved in translational inhibition of the above-mentioned mRNA).
- coding RNA or a miRNA precursor (e.g., pre-miRNA or pri-miRNA as above).
- Parkinson's disease can be diagnosed by performing PCR amplification using sense and antisense primers that specifically bind to the one or more miRNAs and confirming the expression level.
- PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be modified based on those known in the art.
- the probe refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that is as short as a few bases or as long as several tens of bases. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single stranded DNA probes, double stranded DNA probes, RNA probes, etc. In the present invention, Parkinson's disease can be diagnosed by performing hybridization using a probe complementary to one or more of the above miRNAs and confirming the expression level. Selection of appropriate probes, hybridization conditions, and labeling can be modified based on those known in the art.
- the antisense nucleotide refers to all forms containing nucleic acids such as RNA, DNA, and PNA that can bind complementary to the miRNA of the present invention, and the length, shape, labeling, etc. of the antisense nucleotide can be appropriately modified as needed. It can be applied.
- Parkinson's disease can be diagnosed with high accuracy and sensitivity.
- diagnosis means determining the susceptibility of an object, that is, a test subject, to a specific disease or condition, determining whether an object currently has a specific disease or condition, or determining whether an object currently has a specific disease or condition.
- Another aspect of the present invention relates to a kit for diagnosing Parkinson's disease, including the composition for diagnosing Parkinson's disease.
- the kit of the present invention can be used to diagnose Parkinson's disease by measuring the level of miRNA expressed in the blood, serum, urine, etc. of an individual suspected of having Parkinson's disease, and includes primers and probes that can measure the expression level of the miRNA.
- antisense nucleotides, and other components, solutions, and devices necessary for measurement or analysis can be included without limitation. Examples may include, but are not limited to, RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) kits, DNA chip kits, etc.
- the diagnostic kit may include a solution, lyophilized powder, frozen solution, or strip form, and each form can be formulated by a conventional method in the art. It may also include instructions for using the kit.
- Another aspect of the present invention is a) miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p and miR-126- Measuring the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of 3p; and b) comparing the expression level of the miRNA with the expression level of the corresponding miRNA in a normal control sample.
- Parkinson's disease An additional step of determining the disease may be included.
- the miR-144-3p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 1
- the let-7d-5p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 2
- the let-7b-5p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 3
- the miR-19b-3p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 4
- the miR-20b-5p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 5
- the miR-126-3p consists of the base sequence of SEQ ID NO: 6 It may be composed of base sequences.
- the sample may be blood, tissue, cells, whole blood, plasma, serum, saliva, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, or urine, and if it is a sample applicable to the diagnosis of Parkinson's disease, it may be used in the example above. It is not limited and can be applied as a sample.
- another aspect of the present invention is a) in samples isolated from an individual, miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p andmiR- Measuring the expression level of one or more miRNAs selected from the group consisting of 126-3p; and b) comparing the expression level of the miRNA with the expression level of the corresponding miRNA in a normal control sample.
- Parkinson's disease An additional step of determining the disease may be included.
- the sample in the diagnostic method of the present invention may be blood, tissue, cells, whole blood, plasma, serum, saliva, sputum, lymph, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, or urine. If it is a sample applicable to the diagnosis of Parkinson's disease, the sample may be It is not limited to examples and can be applied as a sample.
- another aspect of the present invention includes the steps of a) treating a sample with a candidate substance for treating Parkinson's disease; and b) in the group consisting of miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p, and miR-126-3p in the sample treated with the candidate substance. It relates to a screening method for a treatment for Parkinson's disease, comprising measuring the expression level of one or more selected miRNAs.
- step b) selected from the group consisting ofmiR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p,miR-19b-3p,miR-20b-5p, andmiR-126-3pmeasured in step b) above. If the expression level of one or more miRNAs is suppressed compared to a sample that is not treated with the candidate material, a step of determining the treated candidate material as a treatment for Parkinson's disease may be additionally included.
- the expression of miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p and/or miR-126-3p is increased in Parkinson's disease patients. As it was confirmed to be increased (FIG. 1), if the expression of these miRNAs is decreased upon treatment with the candidate substance, it can be selected as a treatment for Parkinson's disease.
- composition of the present invention allows diagnosis of Parkinson's disease with high accuracy and sensitivity even in the early stages of Parkinson's disease, thereby enabling early treatment, and thus has a very high possibility of being used for diagnosing Parkinson's disease.
- biomarkers in the present invention when applied in combination as multiple variables, it can be of great utility in diagnosing Parkinson's disease and distinguishing it from normal people and Alzheimer's dementia.
- Figure 1 shows the results of confirming the expression level of the biomarker of the present invention in the normal group and the Parkinson's disease patient group.
- Figures 2 to 7 show the expression levels and ROC analysis results of PD1 to PD6 biomarkers in the normal group and Parkinson's disease patient group.
- Figure 8 shows the results of verifying the ability to distinguish between Parkinson's disease and Alzheimer's disease when applying PD1 and PD2 multiple variables (HC; normal, PD; Parkinson's disease, PDD: Parkinson's disease dementia, DLB; Lewy body dementia, AD; Alzheimer's disease) .
- Example 1 Construction of a clinical cohort for diagnosis of Parkinson's disease
- NGS analysis was performed twice using the Illumine technique, and a total of 140 Parkinson's disease-specific miRNA biomarker candidates that change in increase or decrease were primary. was selected. Afterwards, through additional NGS analysis, 40 Parkinson's disease-specific fluctuating miRNA biomarkers were selected, two additional NGS analyzes were performed, and finally, 30 normal groups and 30 Parkinson's disease patients were tested using the nanostring technique. Biomarker miRNAs were selected, and 6 types of Parkinson's disease-specific biomarkers were finally selected. The nanostring technique was analyzed using Nanostrings' nCounter expression array according to the manufacturer's manual. The final six selected miRNA biomarkers are summarized in Table 2 below.
- RNA was purified from blood samples of normal and Parkinson's disease patients using the XENOPURE Blood Small RNA Purification Kit (XENOHELIX). After mixing 100 ng of whole blood RNA and 2 fmol of each target sensor DNA, 2 ⁇ l of reaction buffer (200mM Tris-HCl, 100mM ( NH4 ) 2SO4 , 100mMKCl , 20mM) MgSO 4 , 1% Triton Complementary DNA to each sensor DNA was synthesized by incubation at 63°C for 10 minutes. As a negative control (NTC), distilled water was added instead of RNA and the same reaction was performed. Then, nuclease was incubated at 60°C for 10 minutes.
- reaction buffer 200mM Tris-HCl, 100mM ( NH4 ) 2SO4 , 100mMKCl , 20mM
- MgSO 4 1% Triton Complementary DNA
- the sensor DNA sequences used for detecting the miRNA biomarker are summarized in Table 3 below.
- ROC receiver operating characteristic
- the accuracy of the test increases. For example, when the total area is 1, the accuracy when the AUC is greater than 0.5, greater than 0.6, greater than 0.7, greater than 0.8, or greater than 0.9. can be judged to be higher, and the closer the curve is to the top left corner of the ROC graph, the higher the accuracy. Additionally, in the ROC curve, it can be determined that the larger the area under the curve (AUC), the higher the accuracy of the corresponding diagnostic model.
- both PD1 to PD6 biomarkers showed lower Cq values compared to the normal group, showing increased expression, but also showed high AUC values of 0.8 or more, showing high accuracy of the biomarkers discovered in the present invention.
- PD1 Figure 2
- PD2 Figure 3
- PD3 Figure 4
- PD5 Figure 6
- Parkinson's disease was verified by applying the biomarkers discovered in the present invention in combination as multiple variables. Specifically, 66 normal people (HC), 43 Parkinson's disease patients (PD), 15 Parkinson's disease with dementia (PDD), 3 Dementia with Lewy bodies (DLB), and 11 Alzheimer's patients. Patients (Alzheimer's disease, AD) were recruited within Severance Hospital. Afterwards, the participant's prior consent was obtained, and the expression of the marker was confirmed from the blood sample in the same manner as in Example 3-1, and the co-efficiency value applying the multiple variables of the biomarker was compared between normal subjects and each patient group.
- HC normal people
- PD Parkinson's disease patients
- PPD Parkinson's disease with dementia
- DLB Dementia with Lewy bodies
- AD Dementia with Lewy bodies
- the biomarker discovered in the present invention can not only diagnose Parkinson's disease when applied individually, but can also show great utility in diagnosing Parkinson's disease and Alzheimer's disease when applied in combination as a multivariate variable.
- All statistical analyzes in the present invention applied analysis of variance (ANOVA) to evaluate differences between each group, and the diagnostic values for each marker and combination marker were the receiver operating characteristic curve (ROC) and the area under the ROC curve (AUC). ) was calculated by analyzing.
- ROC receiver operating characteristic curve
- AUC area under the ROC curve
- Wilson/Brown method which is one of the methods for estimating confidence intervals, the best statistical cutoff value is calculated based on the ROC curve, and then the sensitivity, specificity, accuracy, positive predictive value, and negative predictive value for the selected cutoff point are generalized. Evaluated using equation method. All statistical analyzes of the present invention were performed using GraphPad Prism 9.5.1 (GraphPad Software, Boston, MA, USA), and were considered statistically significant when the p -value was less than 0.0001.
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Abstract
본 발명은 파킨슨병의 진단용 바이오마커 및 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 파킨슨병의 진단용 바이오마커 및 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이의 용도에 관한 것이다.
파킨슨병(Parkinson's Disease; PD)은 떨림, 경직, 운동 완만 및 보행 이상증 등을 주된 증상으로 하는 질병으로, 뇌의 흑색질(substantia nigra)과 선조체(corpus striatum) 부위에서 도파민(dopamine)이라는 신경전달물질이 부족하게 되어 생기는 만성질환이다. 파킨슨병의 주요 증상이 처음 발현되어 진단받는 시기는 대개 흑색질 내 도파민성 신경세포가 이미 70% 이상 파괴된 상태로 이미 죽어버린 신경세포를 다시 살릴 수 없기 때문에, 상기 약물들은 완치를 목적으로 하는 것이 아니라 증상의 개선만을 목적으로 하므로 파킨슨병의 치료에 한계가 있다.
이러한 파킨슨병의 진단과 관련하여 수행되는 검사로는 PET 검사, MRI 검사, 내과적 질환에 대한 검사 등이 있으나, 종래의 파킨슨병 진단 방법은 복잡하면서도 높은 비용이 발생되는 문제가 있다. 특히, 파킨슨 증상을 보이는 경우, 파킨슨병과 유사한 퇴행성 뇌질환들과 구분하는 것이 중요하나, 임상 증상이 비슷하고 검사 과정에서 위약감을 일으키면서 파킨슨병으로 오인되는 경우가 발생한다.
파킨슨병 환자는 해마다 증가하고 있고, 이를 치료하기 위한 치료제 개발 역시 지속되고 있으나 파킨슨병 치료에 있어 중요한 정확한 진단을 조기에 하는 기술 개발은 아직 미진한 실정이다. 이에, 파킨슨병 및 이의 유사질환을 구분하여 정확하게 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴 및 진단 기술의 개발이 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 파킨슨병의 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 파킨슨병의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병의 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 파킨슨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 파킨슨병 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 파킨슨병 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는, 파킨슨병 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 바이오마커 조성물은miR-144-3p 및 let-7d-5p를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 구체적으로, 상기 miR-144-3p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7d-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7b-5p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-19b-3p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-20b-5p는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-126-3p는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서, “파킨슨병(Parkinson's disease)”은 뇌간의 중앙에 존재하는 뇌흑질의 도파민계 신경이 파괴됨으로써 움직임에 장애가 나타나는 질환을 말한다. 이러한 파킨슨병은 진행성 핵상 마비, 다발성 신경계 위축, 피질기저핵 변성, 루이소체 치매의 증상을 보인다.
특히, 파킨슨병 치매(PD with Dementia)와 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies)의 임상 양상은 겹치는 부분이 많아 두 질환의 감별은 매우 어려운 면이 있으며, 주로 파킨슨병 발병 후 치매 발병까지 1년 이상의 시차가 있는지 여부에 따라 이루어지고 있다.
본 발병 일 실시예에서는 상기 miRNA 바이오마커로 정상인 대비 파킨슨병을 진단함에 있어 0.8 또는 0.9 이상의 높은 AUC 값을 나타내어 매우 높은 정확도를 나타낼 수 있음을 확인하였으며, 나아가 본 발명의 바이오마커를 조합하여 다중 변수로 적용할 경우 정상인 이외에 알츠하이머 치매까지 파킨슨병과 구분하여 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 측면은 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 파킨슨병 진단용 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 진단용 조성물은 miR-144-3p 및 let-7d-5p의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 “제제”는 miRNA에 특이적으로 결합하는 물질로서, 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다.
본 발명에서, “miRNA”는 통상 헤어핀 모양 구조의 RNA 전구체로서 전사되고, mRNA의 번역 억제에 관여할 수 있는 15~25염기의 비코딩 RNA를 말한다. 또한, 본 발명의 miRNA는 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 또는 miR-126-3의 특정 염기서열(또는 서열번호)로 나타내어지는 miRNA뿐만 아니라 상기 miRNA의 전구체(pre-miRNA, pri-miRNA), 이들과 생물학적 기능이 동등한 miRNA, 예를 들면 동족체(즉, 호몰로그 또는 오솔로그), 유전자다형 등의 변이체, 및 유도체도 포함한다. 이러한 전구체, 동족체, 변이체 또는 유도체로서는 구체적으로는 miRBase release 20(http://www.mirbase.org/)에 의해 동정할 수 있고, 엄격한 조건 하에서 서열번호 1 내지 6의 miRNA의 상보서열과 혼성화하는 염기서열을 갖는 miRNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용하는 miRNA는 miR 유전자의 유전자 산물일 수 있으며, 이러한 유전자 산물은 성숙 miRNA(예를 들면, 상기와 같은 mRNA의 번역 억제에 관여하는 15~25염기 또는 19~25염기의 비코딩 RNA) 또는 miRNA 전구체(예를 들면, 상기와 같은 pre-miRNA 또는 pri-miRNA)를 포함할 수 있다.
본 발명에서는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 파킨슨병을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 말한다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 파킨슨병을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건, 라벨링 여부는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 본 발명의 miRNA에 대해 상보적으로 결합할 수 있는 RNA, DNA, PNA 등 핵산이 포함된 모든 형태를 의미하며, 안티센스 뉴클레오티드의 길이, 형태, 라벨링 여부 등은 필요에 따라 적절히 변형하여 적용할 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 상기 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및/또는 miR-126-3p의 단독 및/또는 조합을 통해 높은 정확도 및 민감도로 파킨슨병을 진단할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서, “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체 즉 검사 대상자의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 특히, 파킨슨병과 알츠하이머병을 구분하여 진단하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 상기 파킨슨병 진단용 조성물을 포함하는 파킨슨병 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 파킨슨병의 발병이 의심되는 개체의 혈액, 혈청, 뇨 등에서 발현되는 miRNA의 수준을 측정하여 발병 여부를 진단하는데 사용될 수 있으며, 상기 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브, 안티센스 뉴클레오티드 등 측정 또는 분석에 필요한 성분, 용액, 장치 등을 제한없이 포함하여 구성할 수 있다. 일 예로, RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 진단용 키트는 용액, 동결건조 분말, 냉동 용액, 또는 스트립 형태를 포함할 수 있으며, 각각의 형태는 당업계에서 통상적인 방법으로 제형화 할 수 있다. 또한 키트를 사용하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은 a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 파킨슨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p의 발현 수준이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 파킨슨병으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-144-3p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7d-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고, 상기 let-7b-5p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-19b-3p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-20b-5p는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-126-3p는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것일 수 있으며, 파킨슨병의 진단에 적용될 수 있는 시료에 해당하면 상기 예시에 제한되지 않고 시료로서 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및 b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 파킨슨병의 진단 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p의 발현 수준이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 파킨슨 병으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명 진단 방법에서의 상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것일 수 있으며, 파킨슨병의 진단에 적용될 수 있는 시료에 해당하면 상기 예시에 제한되지 않고 시료로서 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 일 측면은 a) 시료에 파킨슨병 치료제의 후보 물질을 처리하는 단계; 및 b) 상기 후보 물질이 처리된 시료에서 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파킨슨병 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 b) 단계에서 측정된 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 후보 물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 처리된 후보 물질을 파킨슨병 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및/또는 miR-126-3p의 발현이 파킨슨병 환자에서 증가되어 있음을 확인하였는 바(도 1), 후보 물질 처리시 이러한 miRNA의 발현이 감소된 경우 이를 파킨슨병 치료제로서 선별할 수 있다.
본 발명의 조성물은 파킨슨병 초기에도 높은 정확성과 민감도로 파킨슨병 진단이 이루어질 수 있도록 함으로써, 조기에 치료가 가능하도록 하는 바, 파킨슨병 진단에 대한 활용 가능성이 매우 높다. 특히, 본 발명 내 바이오마커를 다중변수로서 조합 적용할 경우 파킨슨병을 정상인과 알츠하이머 치매로부터 구별 진단함에 있어 큰 효용을 나타낼 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 정상군 및 파킨슨병 환자군에서 본 발명의 바이오마커 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2 내지 도 7은 정상군 및 파킨슨병 환자군에서 PD1 내지 PD6 바이오마커의 발현 수준 및 ROC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 PD1 및 PD2 다중변수 적용시 파킨슨병과 알츠하이머 치매 질환 구분 능력을 검증한 결과를 나타낸 것이다(HC; 정상, PD; 파킨슨병, PDD: 파킨슨병 치매, DLB; 루이소체 치매, AD; 알츠하이머).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 파킨슨병 진단 임상코호트 구축
정상군 50명, 알츠하이머병(AD) 환자 50명, 파킨슨병(PD) 환자 52명을 세브란스 병원에서 모집하였으며, 인구통계학적 특징은 하기 표 1에 정리된 바와 같다. 연구 목적을 위한 조직 및 혈액 샘플의 사용에 대한 사전 동의는 모든 참가자로부터 얻었다.
실시예 2. 파킨슨병 miRNA 바이오마커 발굴
상기 실시예 1에서 모집된 정상인 및 환자의 혈액 10 ml 채취한 후 일루미나(illumine) 기법을 사용하여 NGS 분석을 2회 실시하여, 총 140개의 파킨슨병 특이적으로 증감이 변하는 miRNA 바이오마커 후보를 일차적으로 선별하였다. 이후 추가적인 NGS 분석을 통하여 40개의 파킨슨병 특이적으로 변동하는 miRNA 바이오마커를 선별하고, 2회의 NGS 분석을 추가 실시하여, 최종적으로 30명의 정상군 및 30명의 파킨슨병 환자를 대상으로 나노스트링 기법으로 바이오마커 miRNA를 선발하였으며, 파킨슨병 특이적 바이오마커 6종을 최종 선별하였다. 상기 나노스트링 기법은 Nanostrings의 nCounter expression array를 제조자의 매뉴얼에 따라 사용하여 분석하였다. 최종 선별된 6종의 miRNA 바이오마커는 하기 표 2에 정리된 바와 같다.
실시예 3. 발굴된 파킨슨병 miRNA 바이오마커 검증
3-1. miRNA 바이오마커 발현 분석
정상군 및 파킨슨병 환자군의 혈액 샘플로부터 XENOPURE Blood Small RNA Purification Kit (XENOHELIX)을 사용하여 RNA를 정제하였다. 100 ng의 전혈 RNA 및 2 fmol의 각 타겟 센서 DNA를 혼합한 후 2 ㎕의 반응용 완충용액(reaction Buffer, 200 mM Tris-HCl, 100 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 20 mM MgSO4, 1% Triton X-100(pH 8.8 at 25℃), 1 ㎕의 2.5 mM dNTP 및 2 unit의 DNA 폴리머라제(Xeno T-POL)를 혼합하였다. 혼합액을 95℃에서 3 분간 가열한 후 63℃에서 10 분간 인큐베이션(incubation)하여 각 센서 DNA에 상보적인 DNA를 합성하였다. 음성 대조군(negative control, NTC)으로 RNA 대신 증류수를 넣고 동일한 반응을 진행하였다. 이후 60℃에서 10분간 뉴클레아제(nuclease)를 처리하여 비특이적인 결합을 끊고 ssDNA 센서를 제거한 후 컬럼(column)에 통과시켜 남아있는 센서와 RNA를 추가적으로 제거하였다. 5 ㎕ 샘플을 각 타겟 센서 특이적 프라이머를 이용하여 95℃ 3분 1 사이클, 95℃ 10초, 60℃ 30초, 40 사이클 조건으로 qPCR을 수행하여 Cq 값을 판독하였다.
상기 miRNA 바이오마커 검출을 위해 사용된 센서 DNA 서열은 하기 표 3에 정리된 바와 같다.
또한, qPCR 수행시 이용된 프라이머 서열은 하기 표 4에 정리된 바와 같다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, PD1 내지 PD6의 바이오마커 모두 정상군 및 파킨슨병 환자군 샘플에서 차등적인 발현이 나타났으며, 정상군 대비 파킨슨병 환자군에서 발현이 증가되어 있음을 확인하였다.
3-2. ROC 분석
상기 실시예 2에서 발굴된 6종 miRNA 바이오마커의 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)를 검증하기 위하여, ROC(receiver operating characteristic)의 곡선하면적(area under the ROC curve; AUC) 값을 확인하였다. 상기 ROC 분석은 특정 진단 방법에서 민감도(sensitivity) 및 특이도(specificity)의 상관관계를 표현하는 그래프로, 특정 진단 모델의 정확도(accuracy)를 나타낼 수 있다. 본 발명의 "민감도"는 특정 진단 모델을 이용할 때, 실제 질환을 가지고 있는 개체를 양성으로 판정하는 비율을 의미하며, 본 발명의 "특이도"는 특정 진단 모델을 이용할 때, 실제 질환을 가지고 있지 않은 개체를 음성으로 판정하는 비율을 의미한다.
이러한 ROC 분석에서 특이도와 민감도가 모두 높을 경우 검사의 정확도가 높아지게 되며, 예를 들어, 전체 면적이 1이라 할 때, AUC가 AUC가 0.5 이상, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상 또는 0.9 이상일 때 정확도가 더 높다고 판단할 수 있으며, ROC 그래프에서 곡선이 왼쪽 상단 꼭지점에 가까울수록 정확도가 더 높다고 판단할 수 있다. 또한, ROC 곡선에서, 곡선하면적(AUC)이 클수록 해당 진단 모델의 정확도가 높다고 판단할 수 있다.
그 결과, 도 2 내지 도 7에 나타난 바와 같이 PD1 내지 PD6 바이오마커 모두 정상군에 비해 낮은 Cq 값을 나타내어 발현이 증가되어 있으면서도 0.8 이상의 높은 AUC 값을 나타내어 본 발명에서 발굴된 바이오마커의 정확도가 높음을 확인하였다. 특히, PD1(도 2), PD2(도 3), PD3(도 4), PD5(도 6)의 경우에는 0.9 이상의 극히 높은 AUC 값을 나타내었는 바, 파킨슨병 진단에 있어 특이도 및 민감도가 극히 높아 매우 높은 정확도를 나타냄을 확인하였다.
3-3. PD1 및 PD2 다중변수를 이용한 파킨슨병 진단 분석
본 발명에서 발굴한 바이오마커를 다중변수로서 조합 적용하여 파킨슨병 진단을 검증하였다. 구체적으로, 66명의 정상인(HC), 43명의 파킨슨병 환자(PD), 15명의 파킨슨병 치매 환자(Parkinson's disease with dementia, PDD), 3명의 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies, DLB) 11명의 알츠하이머 환자(Alzheimer's disease, AD )를 세브란스 병원 내에서 모집하였다. 이후 참가자의 사전 동의를 얻어 혈액 샘플로부터 상기 실시예 3-1과 동일한 방식으로 마커의 발현을 확인하고, 바이오마커의 다중변수를 적용한 co-efficiency 값을 정상인과 각 환자군에서 비교하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, PD1 및 PD2의 다중변수를 적용한 co-efficiency 값으로 정상인과 각 질환의 환자군을 유의미하게 구분할 수 있음을 확인하였다.
즉, 본 발명에서 발굴된 바이오마커는 개별 적용시 파킨슨병을 진단할 수 있을 뿐 아니라 다중변수로서 조합 적용 시 파킨슨병과 알츠하이머 치매 질환을 구분 진단에 있어 큰 효용을 나타낼 수 있다.
실시예 4. 통계학적 분석
본 발명에서의 모든 통계학적 분석은 각 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 분산 분석 (ANOVA)을 적용하였으며, 각 마커 및 조합 마커에 대한 진단 값은 수신자 작동 특성 곡선 (ROC) 및 ROC 곡선하면적 (AUC)을 분석하여 계산되었다. 신뢰 구간을 추정하는 방법 중 하나인 Wilson/Brown 방법을 통하여 ROC 곡선을 기반으로 최상의 통계적 컷오프 값을 계산한 후 선택한 컷오프 포인트에 대한 민감도, 특이성, 정확도, 양성 예측 값 및 음성 예측 값을 일반화된 추정 방정식 방법을 사용하여 평가하였다. 본 발명의 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 9.5.1(GraphPad Software, Boston, MA, USA)를 사용하여 수행되었고, P - 값 (p - value)이 0.0001 미만인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<이 발명을 지원한 국가연구개발사업>
[과제고유번호] 1711179400
[과제번호] RS-2022-00141618
[부처명] 과학기술정보통신부
[과제관리(전문)기관명] (재단)범부처전주기의료기기연구개발사업단
[연구사업명] 범부처전주기의료기기연구개발(과기부)
[연구과제명] miRNA 바이오마커 신속탐지 제노센서 기반 파킨슨병 진단시
스템 상용화
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] ㈜제노헬릭스
[연구기간] 2022.04.01 ~ 2025.12.31
Claims (16)
- miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는, 파킨슨병 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,miR-144-3p 및 let-7d-5p를 포함하는, 파킨슨병 진단용 바이오마커 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 miR-144-3p는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고,상기 let-7d-5p는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지고,상기 let-7b-5p는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지고,상기 miR-19b-3p는 서열번호 4의 염기서열로 이루어지고,상기 miR-20b-5p는 서열번호 5의 염기서열로 이루어지고,상기 miR-126-3p는 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 것인, 파킨슨병 진단용 바이오마커 조성물.
- miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 파킨슨병 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서,miR-144-3p 및 let-7d-5p의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 파킨슨병 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서,miRNA에 대한 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것인, 파킨슨병 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서,상기 조성물은 파킨슨병 및 알츠하이머병을 구분하여 진단할 수 있는 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
- 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 파킨슨병 진단용 키트.
- a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 파킨슨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제9항에 있어서,상기 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p의 발현 수준이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 파킨슨 병으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 파킨슨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제9항에 있어서,상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것인, 파킨슨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
- a) 시료에 파킨슨병 치료제의 후보 물질을 처리하는 단계; 및b) 상기 후보 물질이 처리된 시료에서 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 파킨슨병 치료제의 스크리닝 방법.
- 제12항에 있어서,상기 b) 단계에서 측정된 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 후보 물질을 처리하지 않은 시료에서 보다 억제되는 경우, 처리된 후보 물질을 파킨슨병 치료제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 파킨슨병 치료제의 스크리닝 방법.
- a) 개체로부터 분리된 시료에서 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA에 대한 발현 수준을 측정하는 단계; 및b) 상기 miRNA 발현 수준을 정상 대조군 시료의 해당 miRNA 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 파킨슨병의 진단 방법.
- 제14항에 있어서,상기 miR-144-3p, let-7d-5p, let-7b-5p, miR-19b-3p, miR-20b-5p 및 miR-126-3p의 발현 수준이 정상 대조군 대비 증가한 경우, 파킨슨 병으로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 파킨슨병의 진단 방법.
- 제 14항에 있어서,상기 시료는 혈액, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨인 것인, 파킨슨병의 진단 방법.
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