WO2017026692A1 - 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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WO2017026692A1
WO2017026692A1 PCT/KR2016/007905 KR2016007905W WO2017026692A1 WO 2017026692 A1 WO2017026692 A1 WO 2017026692A1 KR 2016007905 W KR2016007905 W KR 2016007905W WO 2017026692 A1 WO2017026692 A1 WO 2017026692A1
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gene
obesity
lpar5
early diagnosis
group
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PCT/KR2016/007905
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최명숙
정운주
류리
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경북대학교 산학협력단
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the early diagnosis of obesity and its use, and more particularly, a composition for the early diagnosis of obesity, an early diagnosis method, and metabolism comprising an agent for measuring the mRNA or protein level of Lpar5 gene expression is reduced only in mild obesity group
  • the present invention relates to a method for screening a substance for treating a syndrome.
  • Obesity is more serious than its own risk because of the many complications that can be caused by obesity.
  • Obesity is known to increase metabolic syndrome such as hypertension, hyperlipidemia, diabetes, fatty liver, joint abnormalities, and cancer risk.
  • metabolic syndrome such as hypertension, hyperlipidemia, diabetes, fatty liver, joint abnormalities, and cancer risk.
  • the World Health Organization reported that people who are obese compared to those of normal weight are more than twice as likely to have high blood pressure, diabetes, dyslipidemia (2.5 times hypertension, 2 times diabetes, 2.3 times hypercholesterolemia) Hypertriglyceridemia 2.4 times).
  • Dyslipidemia is a change in lipids caused by obesity, which leads to an increase in triglyceride (TG), an increase in free fatty acid (FFA), a decrease in HDL-cholesterol and a high density lipoprotein (HDL) dysfunction, LDL -Increased cholesterol and normal, postprandial hyperlipidemia and accumulation of atherosclerotic remnant lipoproteins, and excess production of apolipoprotein B (Apo B) in the liver.
  • TG triglyceride
  • FFA free fatty acid
  • HDL high density lipoprotein
  • Obesity dyslipidemia due to obesity is due to insulin resistance and this lipid change increases the risk of cardiovascular disease.
  • Metabolic syndrome is a metabolic abnormality that is accompanied by diseases such as obesity, elevated blood pressure, dyslipidemia, and elevated blood sugar, and its mechanism is not firmly established. Metabolic syndrome is known to slow down or prevent the onset by improving lifestyle, but when it occurs, it increases the risk of developing type 2 diabetes, cardiovascular disease, cancer (breast cancer, colon cancer, etc.), shortens lifespan and increases mortality. Prevention is important because it can bring and degrade the quality of life. Therefore, in order to prevent metabolic syndrome and related complications caused by obesity, it is important to lower the risk of developing related diseases by early diagnosis of obesity.
  • Lpar5 gene was reduced only in the mild obese group, and thus, Lpar5 gene was discovered as a biomarker for early obesity diagnosis.
  • the present inventors have studied to discover genetic markers for early diagnosis of obesity and related complications. As a result, the expression of Lpar5 gene is reduced in the mild obese group compared to the normal group classified according to the body mass index. As a result of taking soybean alcohol extract in mild obese group having metabolic syndrome, the present invention was completed by finding that the expression of Lpar5 gene increased with metabolic syndrome.
  • an object of the present invention is to provide a composition for the early diagnosis of obesity comprising the agent for measuring the mRNA level of the Lpar5 gene or the protein encoded by the gene and its use.
  • Another object of the present invention is to provide an early diagnosis method for obesity, which comprises measuring the expression level of mRNA or protein of Lpar5 gene.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a metabolic syndrome therapeutic substance using the Lpar5 gene.
  • the present invention provides a composition for the early diagnosis of obesity, comprising an agent for measuring the mRNA level of the Lpar5 gene or the protein encoded by the gene.
  • the agent for measuring the mRNA level may be a sense and antisense primer, or probe that complementarily binds to the mRNA of the gene.
  • the agent for measuring the protein level may be an antibody that specifically binds to the protein encoded by the gene.
  • the present invention also provides a kit for premature obesity, comprising the composition.
  • the present invention also provides a method for premature diagnosis of obesity comprising measuring the expression level of mRNA of the Lpar5 gene or a protein encoded by the gene in a biological sample derived from the subject.
  • the expression level of the mRNA is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase) protection assay (RPA), RNA sequencing, microarray, and northern blotting.
  • PCR polymerase chain reaction
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • Real-time PCR real-time polymerase chain reaction
  • RNase protection assay RNase protection assay
  • RNA sequencing microarray
  • microarray and northern blotting.
  • the protein expression level is Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation) At least one method selected from the group consisting of flow cytometry, immunofluorescence, ouchterlony, complement fixation assay, and protein chip. Can be measured.
  • the present invention also provides a method for screening a metabolic syndrome therapeutic material, comprising the following steps.
  • test substance that increases the expression of the Lpar5 gene as a therapeutic agent for metabolic syndrome compared to a control that has not been treated with the test substance.
  • the candidate material may be selected from the group consisting of compounds, microbial cultures or extracts, natural product extracts, nucleic acids, and peptides.
  • the present invention provides for the early diagnosis of obesity of the Lpar5 (NCBI accession number: HQ995529) gene.
  • Lpar5 gene according to the present invention is significantly reduced in mild obesity group with metabolic syndrome compared to the normal group classified by body mass index, and metabolism according to the increase in the expression of Lpar5 gene when taking terokaphan enhanced soybean leaf extract It was confirmed that the syndrome was improved. Therefore, the Lpar5 gene is expected to be useful as a biomarker for early diagnosis, drug response diagnosis, obesity related complications, and screening for the development of therapeutic substances. .
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a schematic experimental design for classifying Korean male volunteers according to body mass index (BMI) and identifying genes whose expression changes in peripheral blood mononuclear cells.
  • BMI body mass index
  • Figure 3 shows the results of analyzing the expression of gene transcripts in peripheral blood mononuclear cells of the normal control group (Normal) and obesity group (Obese A and Obese B), showing that the Lpar5 gene expression is significantly reduced only in the mild obesity group .
  • FIG. 4 is a schematic experimental design for analyzing blood lipid content and transcripts of peripheral blood mononuclear cells by terokapane-enhanced soybean extract in Korean adult men and women with metabolic syndrome including overweight and obesity .
  • Figure 5 is the result of measuring the lipid and glucose content in the blood after taking terocaphan fortified soybean extract for 12 weeks.
  • Figure 6 shows that the expression of Lpar5 gene in peripheral blood mononuclear cells increased after taking terokaphan enhanced soybean leaf extract for 12 weeks.
  • the present inventors completed the present invention by finding a gene whose expression was significantly reduced only in the mild obese group compared to the normal group as a result of studying the genetic marker for early diagnosis of obesity and related complications.
  • the present invention provides a composition for early diagnosis of obesity, comprising an agent for measuring the mRNA of the Lpar5 (NCBI accession number: HQ995529) gene or the protein level encoded by the gene.
  • the obesity a disease of the early diagnosis of the present invention means a state in which fat cells proliferate and differentiate due to metabolic disorders, and thus fat is accumulated excessively, and includes metabolic syndrome with dyslipidemia. This can lead to related complications.
  • Obesity in the present invention means a body mass index (BMI) 25 kg / m 2 or more.
  • Diagnosis used in the present invention, in a broad sense, means to determine the actual condition of the patient in all aspects. The content of the judgment is the name of the disease, the etiology, the type of disease, the seriousness, the detailed mode of the condition, the presence or absence of complications, and the prognosis. Diagnosis in the present invention is to determine the onset of obesity and the level of obesity, and early diagnosis means to diagnose when the disease is not long, and in the present invention, the body weight index 25 or more 27.5 kg / m 2 level of mild obesity Including obesity is determined in.
  • Korean adult male volunteers were classified into normal group, mild obese group, and moderate obese group according to body mass index and their blood lipid content was measured and analyzed, and peripheral blood mononuclear cells (PBMC) isolated from blood were analyzed.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • RNA was extracted from and analyzed for gene transcript profiles by microarray. As a result, it was found that dyslipidemia not only occurred in the mild obese group but also in the moderate obese group (see Example 2), and it was confirmed that Lpar5 gene was significantly reduced only in the mild obese group through the transcript profile analysis (Example 3 Reference).
  • the agent for measuring the mRNA level of the Lpar5 gene may be, but is not limited to, sense and antisense primers or probes that complementarily bind to the mRNA of the gene.
  • primer refers to an oligonucleotide synthesized for use in diagnosis, DNA sequencing, etc. as a short gene sequence that is a starting point for DNA synthesis.
  • the primers can be synthesized in a conventional length of 15 to 30 base pairs, but may vary depending on the purpose of use, and may be modified by methylation, capping, or the like by a known method.
  • probe refers to a nucleic acid capable of specifically binding to mRNA of several to several hundred bases in length, which has been produced through enzymatic chemical separation or purification. The presence of mRNA can be confirmed by labeling radioisotopes or enzymes, and can be designed and modified by known methods.
  • the agent for measuring the protein level of the Lpar5 gene may be an antibody that specifically binds to a protein encoded by the gene, but is not limited thereto.
  • antibody includes immunoglobulin molecules that are immunologically reactive with specific antigens, and include both monoclonal and polyclonal antibodies.
  • antibodies include forms produced by genetic engineering such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterologous antibodies (eg, bispecific antibodies).
  • Monoclonal antibodies can be prepared using methods using hybridoma cells, or phage antibody library techniques, and the techniques required for this procedure are well known in the art and can be readily performed.
  • Polyclonal antibodies can be obtained by injecting a protein antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.
  • the present invention also provides a kit for premature obesity diagnosis comprising the composition.
  • the diagnostic kit of the present invention consists of one or more other component compositions, solutions or devices suitable for analytical methods.
  • the kit of the present invention may be used to perform genomic DNA derived from a sample to be analyzed, a primer set specific for the marker gene of the present invention, an appropriate amount of DNA polymerase, a dNTP mixture, a PCR buffer, and water to perform PCR. It may be a kit comprising.
  • the PCR buffer may contain KCl, Tris-HCl and MgCl 2 .
  • the components necessary for performing electrophoresis to confirm amplification of PCR products may be further included in the kit of the present invention.
  • kit of the present invention may be a kit including essential elements necessary for performing RT-PCR.
  • RT-PCR kits include enzymes such as test tubes or other appropriate containers, reaction buffers, deoxynucleotides (dNTPs), Taq-polymerases and reverse transcriptases, as well as individual primer pairs specific for the marker gene, DNase, RNase inhibitors, DEPC - May include DEPC-water, sterile water, and the like. It may also include primer pairs specific for the genes used as quantitative controls.
  • the kit of the present invention may be a kit containing essential elements necessary for carrying out the DNA chip.
  • the DNA chip kit may include a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached with a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative gene or a fragment thereof.
  • the kit of the present invention may be in the form of a microarray having a substrate on which the marker gene of the present invention is immobilized.
  • the kit of the present invention may be a kit comprising the necessary elements necessary to perform an ELISA.
  • ELISA kits include antibodies specific for the marker protein and include agents that measure the protein level.
  • the ELISA kit may comprise reagents capable of detecting antibodies that have formed an “antigen-antibody complex”, such as labeled secondary antibodies, chromopores, enzymes, and substrates thereof. It may also include antibodies specific for quantitative control proteins.
  • antigen-antibody complex means a combination of a protein encoded by a gene and an antibody specific thereto.
  • the amount of antigen-antibody complex formed can be measured quantitatively through the magnitude of the signal of the detection label.
  • detection labels may be selected from the group consisting of enzymes, fluorescent materials, ligands, luminescent materials, microparticles, redox molecules and radioisotopes, but are not limited thereto.
  • the present invention also provides a method for premature diagnosis of obesity comprising measuring the expression level of mRNA of the Lpar5 gene or a protein encoded by the gene in a biological sample derived from the subject.
  • the biological sample derived from the subject may include tissue, cells, whole blood, blood, saliva, sputum, cerebrospinal fluid and urine, more preferably blood, and more preferably peripheral blood mononuclear cells in blood. May be, but is not limited to this.
  • the expression level of the mRNA is polymerase chain reaction (PCR), reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time polymerase chain reaction (Real-time PCR), RNase protection assay (RNase) by conventional methods known in the art protection assay (RPA), RNA sequencing, microarray, or northern blotting, but may be measured by one or more methods selected from the group consisting of, but not limited to. .
  • the protein expression level is Western blotting, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, enzyme immunoassay (ELISA), immunoprecipitation (immunoprecipitation) by conventional methods known in the art
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme immunoassay
  • immunoprecipitation immunoprecipitation
  • the term "information providing method for early diagnosis of obesity" used in the present invention is to provide objective basic information necessary for early diagnosis of obesity as a preliminary step for diagnosis and excludes the clinical judgment or findings of the doctor.
  • the present invention comprises the steps of treating a test substance to a cell expressing the Lpar5 gene; Measuring the expression level of the gene in the cell; And selecting a test substance that increases the expression of the Lpar5 gene as a therapeutic agent for metabolic syndrome, compared to a control that has not been treated with the test substance.
  • Korean adult men and women volunteers who have metabolic syndrome including overweight, obesity, and dyslipidemia are classified into normal group, terokapane fortified material group, and soybean leaf extract in the terokaphan fortified material group.
  • dyslipidemia was improved (see Example 4-1), and analysis of blood lipid content showed that the expression of Lpar5 gene mRNA was increased (see Example 4-2).
  • the candidate material may be selected from the group consisting of compounds, microbial cultures or extracts, natural product extracts, nucleic acids, and peptides, preferably may be natural extracts, for example, terokaphan fortified soybean leaf extract, This is not restrictive.
  • the cell may be appropriately selected and used by those skilled in the art without any limitation as long as it is a cell capable of expressing the gene.
  • BMI body mass index
  • Blood was collected from the volunteers of the group classified in Example 1-1 in a fasting state for 12 hours, placed in a heparin-coated tube, and centrifuged at 1,000 ⁇ g for 15 minutes at 1,000 ⁇ g to separate plasma.
  • the amounts of lipids, apolipoproteins, glucose, insulin, cholesterol, and tumor necrosis factor- ⁇ contained in were measured.
  • Serum triglycerides, total cholesterol, high density lipoprotein cholesterol, and glucose content were measured using a kit supplied by Asan Pharm.
  • Free fatty acids content was measured by Wako Chemicals. It measured using the kit of the company.
  • apolipoprotein A1 (apo A1) and apolipoprotein B (apo B) contents were measured using enzyme kits (enzymatic kits).
  • HDL-cholesterol to total cholesterol ratio HTR
  • HTR (HDL-cholesterol / total cholesterol) ⁇ 100.
  • Atherosclerosis index (AI) was calculated according to Equation 2 shown below.
  • HOMA-IR Homeostatic index of insulin resistance
  • HOMA-IR fasting glucose [mmol / L] x fasting insulin [ ⁇ U / mL]) / 22.51
  • PBMC gene transcript analysis was performed by performing microarray using RNA extracted from PBMC of each group volunteers.
  • RNA was amplified and purified using Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (Ambion) to obtain a biotinylated cRNA.
  • 750 ng of biotinylated cRNA per volunteer (sample) was hybridized to Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChips at 58 ° C. for 16-18 hours.
  • Array signals were detected using Amersham Cy3-streptavidin (GE Healthcare), and BeadChips were scanned using an Illumina BeadArray Reader.
  • the amount of free fatty acids (FFA), triglycerides (TG), and total cholesterol (TC) increased in Obese A and Obese B groups compared to the normal group, and the amount of HDL-cholesterol was increased. Decreased.
  • the ratio of HDL-cholesterol (HTR) and arteriosclerosis index (AI) to total cholesterol according to Equation 1 and Equation 2 of Example 1-2 was measured in both Obese A and Obese B.
  • the ratio of HDL-cholesterol to total cholesterol was decreased, and the arteriosclerosis index was significantly increased.
  • the ratio of apolipoprotein B (apolipoprotein B; Apo B) to apolipoprotein A1 (apolipoprotein A1; Apo A1) was also increased.
  • Example 1-2 In order to detect genes whose expression was changed in the obese group (Obese A and Obese B) compared to the normal control group (Normal), the method of Example 1-2 in each group of volunteers classified according to the method of Example 1-1 RNA was extracted from the PBMCs separated from each other, and microarrays were performed according to the method of Example 1-3, and then the standardized data were analyzed and analyzed.
  • the Lpar5 gene was found to have reduced expression only in the mild obese group compared to the normal control group.
  • Example 4-1 Based on the results of Example 4-1, mRNA sequencing was performed after extracting RNA from peripheral blood mononuclear cells in blood in the mild obese group whose metabolic syndrome was improved by taking soybean extract. was performed to analyze the gene expression pattern.
  • the expression of Lpar5 gene in the mild obesity group with metabolic syndrome was significantly reduced, and it was confirmed that the metabolic syndrome was improved by increasing its expression. It can be used as an important biomarker for early diagnosis, drug response diagnosis, and screening for the development of therapeutic substances for the prevention or treatment of related complications. Furthermore, it can be used as the main material for the prevention, improvement of the disease, or the development of therapeutic substances. .

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Abstract

본 발명은 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 경도비만군에서만 발현이 감소하는 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 조기진단용 조성물, 조기진단을 위한 정보제공방법, 및 대사증후군 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 Lpar5 유전자는 체질량지수를 기준으로 분류한 정상군과 비교하여 대사증후군을 보유한 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소되어 있으며, 테로카판 강화 콩잎주정추출물 복용시 Lpar5 유전자의 발현증가에 따라 대사증후군이 개선됨을 확인하였다. 따라서 Lpar5 유전자는 대사증후군을 포함하는 비만 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위한 조기진단, 약물반응 진단, 비만 관련 합병증 치료 타겟, 및 치료 물질 개발 스크리닝을 위한 바이오마커로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 경도비만군에서만 발현이 감소하는 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 조기진단용 조성물, 조기진단방법, 및 대사증후군 치료 물질 스크리닝 방법에 관한 것이다.
최근 정신 및 사회적 요인을 포함한 유전, 질병, 약물 등의 다양한 원인에 의해 전 세계적으로 비만 인구가 점점 증가하고 있는 추세이며, 이에 따라 비만으로 인해 유발되는 관련 합병증 환자들도 증가하고 있다. 2010년 세계 보건기구(WHO)에 따르면, 과체중 성인 인구는 전 세계적으로 약 16억 명, 비만인은 약 4억 명으로 집계되었으며, 매년 260만 명이 비만과 과체중으로 사망한다고 보고되었다. 국내의 경우 2013년도 통계청 자료에 따르면 성인 비만 유병률은 2012년 기준 32.8%로 전년도에 비해 증가했다고 보고된 바 있다. 이처럼 비만은 생명을 위협하고 삶의 질을 떨어뜨리는 하나의 질병으로써 전 세계적으로 비만의 예방 및 치료에 대한 관심과 그 중요성이 커지고 있다.
비만은 그 자체의 위험성보다 비만으로 인해 유발될 수 있는 여러 합병증 때문에 그 심각성이 더욱 크게 인식되고 있다. 비만은 고혈압, 고지혈증, 당뇨병 등의 대사증후군, 지방간, 관절 이상, 및 암 발병 위험을 증가시킨다고 알려져 있다. 2010년 세계보건기구에서 발표한 바에 따르면, 정상 체중인 사람에 비해 비만인 사람에게서 고혈압, 당뇨병, 이상지질혈증이 동반될 위험이 2배 이상(고혈압 2.5배, 당뇨병 2배, 고콜레스테롤혈증 2.3배, 고중성지질혈증 2.4배) 높게 나타났다.
이상지질혈증은 비만으로 인한 혈중 지질 변화로써 중성지방(triglyceride; TG) 증가, 유리지방산(free fatty acid; FFA) 증가, HDL-콜레스테롤 감소 및 고밀도지질단백질(high density lipoprotein; HDL) 기능장애, LDL-콜레스테롤 증가 및 정상, 식후 고지혈증과 죽상경화성잔여 지단백(atherogenic remnant lipoprotein) 축적, 간에서의 아포지질단백 B(apolipoprotein B; Apo B) 과잉 생성 등이 나타난다. 비만에 의한 이상지질혈증은 인슐린 저항성에서 기인하는 것으로 이러한 지질변화는 심혈관계 질환의 위험성을 증가시킨다.
대사증후군은 비만, 혈압상승, 이상지질혈증, 혈당 상승 등의 질환이 함께 동반되어 나타나는 대사적 이상상태로, 그 기전이 확실히 정립되어 있지 않다. 대사증후군은 생활습관 개선을 통해 발병을 늦추거나 예방할 수 있다고 알려져 있으나, 발병하면 제2형 당뇨병, 심혈관질환, 암(유방암, 대장암 등) 등의 발생 위험을 증가시켜 수명을 단축시키고 사망률 증가를 가져올 수 있으며, 삶의 질을 저하시키므로 예방이 중요하다. 따라서 비만으로 인한 대사증후군 및 관련 합병증의 예방을 위해서는 무엇보다 비만을 조기진단함으로써 관련 질병들의 발병위험을 낮추는 것이 중요하다.
이에, 본 발명자들은 경도비만군에서만 Lpar5 유전자의 발현이 감소되어 있음을 확인하여 비만 조기진단용 바이오마커로써 Lpar5 유전자를 발굴하였다.
본 발명자들은 비만과 관련 합병증의 조기진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 연구한 결과, 체질량지수에 따라 분류된 정상군에 비하여 경도비만군에서 Lpar5 유전자의 발현이 감소되어 있고, 비만과 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군을 보유한 경도비만군에 콩잎주정추출물을 복용시킨 결과 대사증후군 개선과 함께 Lpar5 유전자의 발현이 증가함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 조기진단용 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 조기진단방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 Lpar5 유전자를 이용하여 대사증후군 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 조기진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 비만 조기진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 조기진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) Lpar5 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Lpar5 유전자의 발현을 증가시키는 시험물질을 대사증후군 치료 물질로 선정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의, 비만 조기진단용도를 제공한다.
본 발명에 따른 Lpar5 유전자는 체질량지수를 기준으로 분류한 정상군과 비교하여 대사증후군을 보유한 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소되어 있으며, 테로카판 강화 콩잎주정추출물 복용시 Lpar5 유전자의 발현증가에 따라 대사증후군이 개선됨을 확인하였다. 따라서 Lpar5 유전자는 대사증후군을 포함하는 비만 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위한 조기진단, 약물반응 진단, 비만 관련 합병증 치료 타겟, 및 치료 물질 개발 스크리닝을 위한 바이오마커로써 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 한국남성 지원자들을 체질량지수(BMI)에 따라 분류하고 말초혈액단핵세포에서 발현이 변화하는 유전자를 발굴하기 위한 개략적인 실험디자인을 그림으로 도시한 것이다.
도 2는 정상대조군(Normal)과 비만군(Obese A 및 Obese B)의 혈중 지질 함량을 측정하여 나타낸 결과이다.
도 3은 정상대조군(Normal)과 비만군(Obese A 및 Obese B)의 말초혈액단핵세포에서 유전자 전사체의 발현을 분석한 결과, Lpar5 유전자가 경도비만군에서만 유의하게 발현이 감소되어있음을 보여주는 결과다.
도 4는 과체중, 비만을 포함한 대사증후군을 보유한 한국인 성인 남녀를 대상으로 테로카판 강화 콩잎주정추출물에 의한 혈중 지질함량 및 말초혈액단핵세포의 전사체 분석을 위한 개략적인 실험디자인을 그림으로 도시한 것이다.
도 5는 테로카판 강화 콩잎주정추출물을 12주 동안 복용한 후 혈중 지질 및 포도당 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 테로카판 강화 콩잎주정추출물을 12주 동안 복용한 후 말초혈액단핵세포의 Lpar5 유전자의 발현이 증가하였음을 보여주는 결과이다.
본 발명자들은 비만과 관련 합병증의 조기진단을 위한 유전자 마커를 발굴하기 위해 연구한 결과, 정상군과 비교하여 경도비만군에서만 발현이 유의하게 감소된 유전자를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비만 조기진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조기진단 대상 질병인 “비만(obesity)”은 대사 장애로 인하여 체내에 지방세포가 증식 분화하고 이로 인하여 지방이 과잉으로 축적된 상태를 의미하며, 이상지질혈증을 동반하는 대사증후군을 포함하여 관련 합병증을 유발할 수 있다. 에너지 흡수량이 소비량에 비해 상대적으로 증가하는 경우, 지방세포의 수와 부피가 증가되는 과정을 거쳐 결과적으로 지방조직의 질량이 증가된다. 본 발명에서 비만은 체질량지수(BMI) 25 ㎏/m2 이상을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “진단”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 및 예후 등이다. 본 발명에서 진단은 비만의 발병 여부 및 비만 수준 등을 판단하는 것이며, 조기진단은 병이 발병한지 얼마 되지 않았을 때 진단하는 것을 의미하고 본 발명에서는 체질량지수 25 이상 27.5 ㎏/m2의 경도비만 수준에서 비만으로 판정되는 것을 포함한다.
본 발명의 일실시예에서는, 한국인 성인남성 지원자들을 체질량지수에 따라 정상군, 경도비만군, 및 중등도비만군으로 분류하고 이들의 혈중 지질함량을 측정하여 분석하였으며, 혈액에서 분리한 말초혈액단핵세포(PBMC)로부터 RNA를 추출하여 마이크로어레이를 통해 유전자 전사체 프로파일을 비교 분석하였다. 그 결과 중등도비만군뿐 만 아니라 경도비만군에서도 이상지질혈증이 나타남을 알 수 있었으며(실시예 2 참조), 전사체 프로파일 분석을 통해 경도비만군에서만 Lpar5 유전자가 유의하게 감소되어있음을 확인하였다(실시예 3 참조).
상기 Lpar5 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “프로브(probe)”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
상기 Lpar5 유전자의 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, “항체”란 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 단클론항체는 하이브리도마 세포를 이용한 방법, 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 상기 과정에 필요한 기술은 당업계에 잘 알려져 있어 용이하게 실시할 수 있다. 다클론항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비만 조기진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 Lpar5 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 조기진단방법을 제공한다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있고, 보다 바람직하게는 혈액일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 혈액 내 말초혈액단핵세포일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 마이크로어레이(microarray), 또는 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "비만의 조기진단을 위한 정보제공방법"은 진단을 위한 예비적 단계로써 비만의 조기진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 Lpar5 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계; 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Lpar5 유전자의 발현을 증가시키는 시험물질을 대사증후군 치료 물질로 선정하는 단계를 포함하는, 대사증후군 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 과체중, 비만, 및 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군을 보유한 한국인 성인남녀 지원자들을 정상군, 테로카판 강화 소재군으로 분류하고 상기 테로카판 강화 소재군에 콩잎주정추출물을 복용시킨 결과 이상지질혈증이 개선됨을 관찰하였으며(실시예 4-1 참조), 혈중 지질함량을 분석한 결과 Lpar5 유전자 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였다(실시예 4-2 참조).
따라서 상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 바람직하게는 천연물 추출물일 수 있으며, 예컨대, 테로카판 강화 콩잎주정추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 세포는 상기 유전자를 발현할 수 있는 세포라면 그 종류에 제한 없이 당업자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 실험 디자인
한국인 성인 남성을 대상으로 혈중 지질농도를 측정하고 혈액 내 말초혈액단핵세포의 유전자 전사체를 비교 분석함으로써 비만도에 따라 발현이 변화하는 유전자들을 발굴하기 위하여, 도 1에 나타낸 바와 같이 지원자를 모집하여 실험을 디자인하고 진행하였다.
구체적으로, 20~59세 연령대의 남성 지원자들을 대상으로 1차 스크리닝을 통해 총 37명의 대상자를 선정하였으며, 도 1에 나타낸 바와 같이, 체질량지수(body mass index; BMI)를 기준으로 3그룹 즉, 체질량지수가 18.5 이상 23 미만(18.5≤BMI<23 kg/m2, n=11)인 지원자를 정상대조군(Normal), 체질량지수가 25 이상 27.5 미만(25≤BMI<27.5 kg/m2, n=14)인 지원자를 경도비만군(Obese A), 체질량지수가 27.5 이상 30 미만(27.5≤BMI<30 kg/m2, n=12)인 지원자를 중증도비만군(Obese B)으로 분류하였다.
1-2. 혈중 지질 수준 측정 및 분석
상기 실시예 1-1에서 분류한 그룹의 지원자들로부터 12시간의 공복 상태에서 혈액을 채취하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담고 1,000 × g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 혈장을 분리한 후 혈장에 포함된 지질, 아포지질단백질, 포도당, 인슐린, 콜레스테롤, 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 양을 측정하였다. 혈중 트리글리세리드(triglycerides), 총 콜레스테롤(total cholesterol), HDL-콜레스테롤(high density lipoprotein cholesterol), 및 포도당 함량은 Asan Pharm에서 공급된 키트를 사용하여 측정하였으며, 유리 지방산(free fatty acids) 함량은 Wako Chemicals사의 키트를 이용하여 측정하였다. 또한, 아포지질단백질 A1(apo A1)과 아포지질단백질 B(apo B) 함량은 효소키트(enzymatic kits)를 사용하여 측정하였다.
총 콜레스테롤에 대한 HDL 콜레스테롤의 비율(HDL-cholesterol to total cholesterol ratio; HTR)은 하기에 나타낸 수학식 1에 따라 계산하였다.
[수학식 1]
HTR = (HDL-콜레스테롤/총 콜레스테롤) × 100.
동맥경화지수(Atherogenic index; AI)는 하기에 나타낸 수학식 2에 따라 계산하였다.
[수학식 2]
AI = (총 콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤)/HDL-콜레스테롤
또한, 인슐린저항성 항상성 지수(Homeostatic index of insulin resistance; HOMA-IR)는 하기에 나타낸 수학식 3에 따라 계산하였다.
[수학식 3]
HOMA-IR = 공복상태 포도당 농도(fasting glucose) [mmol/L] × 공복상태 인슐린 농도(fasting insulin) [μU/mL])/22.51
1-3. PBMCs 분리 및 RNA 추출
상기 실시예 1-1에서 분류한 정상대조군(Normal), 경도비만군(Obese A), 및 중등도비만군(Obese B)의 지원자들 중 18명(Normal=4, Obese A=7, 및 Obese B= 7)을 무작위로 선정하고 이들로부터 혈액을 채취하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담은 후 Ficoll-Paque 시약(GE Healthcare)을 이용한 밀도구배 침전법(density gradient sedimentation)을 통해 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell; PBMCs)를 분리하였다. 이후 분리된 PBMC에 TRIzol(Invitrogen)을 처리하고 제조사의 프로토콜에 준하여 PBMC로부터 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA의 순도와 농도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하여 측정하였다.
1-4. 마이크로어레이(microarray)
상기 실시예 1-2의 방법에 따라 각 그룹 지원자들의 PBMC로부터 추출한 RNA를 이용하여 마이크로어레이를 실시함으로써 PBMC 유전자 전사체 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 추출된 RNA에 대하여 Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion)를 사용하여 RNA를 증폭시키고 정제하여 biotinylated cRNA를 얻었다. 지원자(샘플) 당 biotinylated cRNA 750 ng을 58℃에서 16-18시간 동안 Illumina HumanHT-12 v4 Expression BeadChips에 혼성화시켰다. Amersham Cy3-스트렙타비딘(GE Healthcare)을 사용하여 어레이 시그널을 검출하였고, BeadChips은 Illumina BeadArray Reader를 사용하여 스캔하였다. 이후 Illumina BeadStudio software를 사용하여 raw data를 얻었으며, 표준화(normalization) 과정을 거친 후 단순선형회귀분석법을 이용하여 PBMC에서 유의하게 발현이 변화된 유전자(a false-discovery rate of <5%, p value of <0.05, 및 fold change of >1.3)를 추출하였다.
실시예 2. 혈중 지질함량 분석
체질량지수에 따라 분류된 정상대조군(Normal), 경도비만군(Obese A), 및 중등도비만군(Obese B)의 혈중 지질함량을 분석하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 각 그룹의 지원자들로부터 채취한 혈액으로부터 혈중 지질, 아포지질단백질, 포도당, 인슐린, 콜레스테롤, 및 TNF-α의 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Normal군에 비하여 Obese A와 Obese B군에서 혈중 유리지방산(FFA), 중성지방(TG), 및 총콜레스테롤(TC) 양이 증가하였고, HDL-콜레스테롤 양이 감소하였다. 상기 측정값들을 이용해 실시예 1-2의 수학식 1 및 수학식 2에 따라 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율(HTR)과 동맥경화지수(AI)를 측정한 결과 Obese A와 Obese B 모두에서 총콜레스테롤에 대한 HDL-콜레스테롤의 비율은 감소하였고, 동맥경화지수는 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한, 아포지질단백질 A1(apolipoprotein A1; Apo A1)에 대한 아포지질단백질 B(apolipoprotein B; Apo B)의 비율 또한 증가한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 중등도비만군뿐 만 아니라 경도비만군에서도 이상지질혈증이 나타남을 알 수 있었다.
실시예 3. 비만군에서 발현이 변화된 유전자 확인
정상대조군(Normal)에 비하여 비만군(Obese A 및 Obese B)에서 발현이 변화한 유전자를 검출하기 위하여, 실시예 1-1의 방법에 따라 분류된 각 그룹의 지원자에서 실시예 1-2의 방법으로 PBMC를 분리하여 이로부터 RNA를 추출하고, 실시예 1-3의 방법에 따라 마이크로어레이를 수행한 후 도출된 데이터를 표준화하고 분석하였다.
분석 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Normal군과 비교하여 Obese A군에서 Lpar5 유전자의 발현이 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 그러나 Lpar5 유전자는 Obese A군에서만 발현이 감소하였을 뿐 Obese B 군에서는 발현의 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
상기 결과를 통해, 정상대조군에 비해 경도비만군에서만 발현이 감소되어 있는 Lpar5 유전자를 발굴하였다.
실시예 4. Lpar5 유전자 발현변화에 따른 대사증후군 개선 확인
상기 실시예 2 및 3의 결과를 바탕으로, 경도비만군에 테로카판 강화 콩잎주정추출물을 복용시킨 후 혈중 지질농도 및 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소된 Lpar5 유전자 발현량 변화를 분석하고자 하였다.
이를 위해, 도 4에 나타낸 바와 같이, 35-65세 연령의 체질량지수가 25 이상 27 미만의 과체중, 비만, 및 이상지질혈증을 포함하는 대사증후군을 보유한 성인남녀(25≤BMI<27 ㎏/m2, n=49)를 대상으로 하여 대조군과 테로카판 강화 소재군으로 분류하고, 테로카판 강화 소재군에는 12주 동안 콩잎주정추출물을 복용하도록 하였다.
4-1. 혈중 지질함량 감소 확인
대사증후군을 보유한 성인남녀에게 12주 동안 콩잎주정추출물을 복용시킨 후 실시예 1-2의 방법에 따라 혈액을 채취하여 혈중 지질농도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군(placebo)과 비교하여 콩잎주정추출물을 복용한 군(PT)에서 혈중 유리지방산(FFA), TNF-α, 포도당(glucose) 양이 감소하였고, 상기 실시예 1-2의 수학식 3에 따라 계산한 인슐린저항성 항상성 지수(HOMA-IR) 또한 감소하였다. 반면 혈중 HDL-콜레스테롤 양은 증가한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 콩잎주정추출물 복용에 의해 대사증후군이 개선되었음을 알 수 있었다.
4-2. Lpar5 유전자 발현 증가 확인
실시예 4-1의 결과를 바탕으로, 콩잎주정추출물 복용에 의해 대사증후군이 개선된 경도비만군에서 실시예 1-3의 방법에 따라 혈액 내 말초혈액단핵세포로부터 RNA를 추출한 후 mRNA 시퀀싱(sequencing)을 수행하여 유전자 발현패턴을 분석하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 콩잎주정추출물을 복용한 경우 Lpar5 유전자 mRNA의 발현이 복용 전에 비하여 1.5배 이상 높게 증가한 것을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 콩잎주정추출물 복용을 통한 대사증후군 개선이 Lpar5 유전자의 발현증가에 의한 것임을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에서는 Lpar5 유전자가 대사증후군을 보유한 경도비만군에서 발현이 유의하게 감소되어 있고, 이의 발현증가에 의해 대사증후군이 개선되는 효과를 확인하였는바, Lpar5 유전자는 의료산업분야에서 대사증후군을 포함하는 비만 관련 합병증의 예방 또는 치료를 위한 조기진단, 약물반응 진단, 치료물질 개발 스크리닝에 중요한 바이오마커로 이용될 수 있으며, 나아가 상기 질환의 예방, 개선, 또는 치료물질 개발의 주요한 소재로 활용될 수 있을 것이다.

Claims (10)

  1. Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비만 조기진단용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 유전자가 코딩하는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제 1 항의 조성물을 포함하는, 비만 조기진단용 키트.
  5. 피검체 유래의 생물학적 시료에서 Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 비만 조기진단방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 mRNA의 발현수준은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 비만 조기진단방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 비만 조기진단방법.
  8. 하기의 단계를 포함하는, 대사증후군 치료 물질의 스크리닝 방법:
    (a) Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자를 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포에서 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 Lpar5 유전자의 발현을 증가시키는 시험물질을 대사증후군 치료 물질로 선정하는 단계.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 후보물질은 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물 추출물, 핵산, 및 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  10. Lpar5(NCBI 접근(accession) 번호: HQ995529) 유전자의, 비만 조기진단용도.
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