CN108949947B - 与抗结核药物性肝损伤发生相关的细胞色素p450基因多态性位点 - Google Patents

与抗结核药物性肝损伤发生相关的细胞色素p450基因多态性位点 Download PDF

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Abstract

本发明提供了与抗结核药物性肝损伤发生相关的细胞色素P450基因多态性位点，具体地，本发明发现了一批与抗结核药物肝毒性相关性显著的基因多态性位点，实验结果表明，本发明提供的与抗结核药物性肝损伤发生相关的SNP位点能够作为敏感的抗结核药物性肝损伤易感生物标志，临床上可以用来评估使用抗结核药物的患者是否易于引发肝损伤，进而指导临床用药。

Description

与抗结核药物性肝损伤发生相关的细胞色素P450基因多态性 位点
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及与抗结核药物性肝损伤发生相关的药物代谢基因多态性位点。
背景技术
由服用处方药或非处方药所造成的肝脏损伤，正成为世界范围内日益关注的医疗卫生问题。已有报道显示至少有1000种药物可引起肝脏毒性。药物性肝损伤是在药物研发过程中最受食品和药品监督管理局(FDA)关注的问题，是导致新药被淘汰，药物从市场召回，以及药物使用过程中增加临床监测的重要原因。但是，目前依靠动物实验的临床前期研究很难发现药物肝毒性，而且根据一般临床研究的规模，也常常不易检出药物的肝毒性，通常只有在大规模人群使用后，才会发现药物所造成的肝损伤。然而，到目前为止有关于药物性肝损伤的危险因素，临床特征以及潜在机制的研究报道甚少。因此，研究开发更加早期的药物肝损伤的危险因素及确立易感人群的筛选方法十分有必要。
在所有可造成肝损伤的药物当中，对抗结核类药物的报道相当普遍。抗结核药物成为公认的易于导致肝脏损伤的一类药物，且与其他多种药物引起的肝脏损伤具有相似机制和病理学改变。目前，临床常用的一线抗结核药物有异烟肼(INH，H)、利福平(RFP，R)、吡嗪酰胺(PZA，Z)、乙胺丁醇(EMB，E)和链霉素(SM，S)。WHO推荐的针对结核病初治标准治疗方案为：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇联合使用2个月作为加强期，然后异烟肼和利福平联用4个月作为巩固期。
TOSTMANN等研究发现，在WHO推荐的标准抗结核药物治疗的情况下，抗结核药物性肝损(ANTI-TUBERCULOSIS DRUG-INDUCED HEPATOTOXICITY,ATDH)发生率在2％至28％之间。这个数字很大程度上取决于研究者对肝毒性的定义以及被研究人群的种族。在这些研究中，研究者发现亚洲人的发病率最高。META分析显示中国人服用抗结核药物引发肝损伤的发生率在3.6％至16.7％之间，平均发生率在10％。
目前，我国的结核发病仍具有绝对发病人数多、流动人口结核病、耐药结核病及合并艾滋感染率低的特点，这一特点适宜进行人群临床研究，并易于控制各种混杂因素对研究结果的影响。因此在中国以抗结核药物为模型进行药物肝脏毒性的研究具有独特的优势。此外，药物性肝损害的发生，常导致结核病化疗过程中部分病人治疗方案的减弱甚至中断，严重影响病人的预后，更有因急性肝损伤导致肝功能衰竭甚至死亡的可能。因此，早期识别肝损伤易感人群至关重要，不仅可以提高抗结核治疗的有效性，还避免了中断治疗的病人产生耐药的可能性，也对结核病疫情的控制提供了助力，具有积极的社会意义和经济价值。
发明内容
本发明的目的在于提供与抗结核药物性肝损伤发生相关的药物代谢基因多态性位点、相应检测试剂及其用途，以便能够对抗结核药物肝毒性易感性进行判断。
本发明的第一方面，提供了细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)基因和/或其检测试剂的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于检测被检测对象对抗结核药物肝毒性的易感性。
在另一优选例中，所述细胞色素P450基因选自下组：CYP2C18基因、CYP4B1基因或其组合。
在另一优选例中，所述检测试剂为检测选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：
(1)CYP2C18基因
rs2281891、rs1326830；和
(2)CYP4B1基因
rs2297810。
在另一优选例中，所述抗结核药物选自下组：异烟肼(INH，H)、利福平(RFP，R)、吡嗪酰胺(PZA，Z)、乙胺丁醇(EMB，E)和链霉素(SM，S)。
在另一优选例中，所述被检测对象包括：人或非人哺乳动物(如家畜、家禽、实验动物等)。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括选自下组的一个或多个基因位点和/或其检测试剂：
NR1I2：rs 6785049
NR1I2：rs2276707；和
NAT2*6：rs1799930。
在另一优选例中，如果所述被检测对象具有选自下组的一个或多个基因位点，则说明该对象对抗结核药物性肝损(ANTI-TUBERCULOSIS DRUG-INDUCED HEPATOTOXICITY,ATDH)易感：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G。
在另一优选例中，如果所述被检测对象还具有选自下组的一个或多个突变基因位点，则说明该对象对抗结核药物性肝损(ANTI-TUBERCULOSIS DRUG-INDUCEDHEPATOTOXICITY,ATDH)易感：
NR1I2基因上rs 6785049位点为G；
NR1I2基因上rs2276707位点为T；和
NAT2*6基因上rs1799930位点为A。
在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、芯片、或抗体。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：
(A)用于基因检测的特异性引物；
(B)用于基因检测的特异性探针；
(C)用于基因检测的芯片；
(D)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒用于实时荧光定量PCR检测。
在另一优选例中，所述实时荧光定量PCR中，退火温度为60-67℃之间，PCR扩增产物长度为80-300bp。
在另一优选例中，所述实时荧光定量PCR中，荧光探针退火温度为60-70℃之间。
在另一优选例中，所述探针的双末端进行化学基团的修饰，5'端修饰有荧光激发基团，3端修饰有荧光淬灭基团。
本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括细胞色素P450基因检测试剂。
在另一优选例中，所述细胞色素P450基因选自下组：CYP2C18基因、CYP4B1基因或其组合。
在另一优选例中，所述检测试剂为检测选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：
(1)CYP2C18基因
rs2281891、rs1326830；和
(2)CYP4B1基因
rs2297810。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒包括选自下组的一个或多个突变的基因位点的其检测试剂：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C→T；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C→T；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G→A。
在另一优选例中，所述试剂或试剂盒还包括检测选自下组的一个或多个突变的基因位点的检测试剂：
NR1I2基因上rs6785049位点为G→A；
NR1I2基因上rs2276707位点为C→T；
NAT2*6基因上rs1799930位点为G→A。
在另一优选例中，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：
(A)用于基因检测的特异性引物；
(B)用于基因检测的特异性探针；
(C)用于基因检测的芯片；
(D)用于检测突变的基因所对应的氨基酸突变的特异性抗体。
本发明的第三方面，提供了一种体外检测样品是否存在单核苷酸变异的方法，包括步骤：
(a)用特异性引物扩增样品的多核苷酸，得到扩增产物；和
(b)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸变异：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C→T；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C→T；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G→A。
在另一优选例中，所述检测为非诊断性的。
本发明的第四方面，提供了一种检测个体对抗结核药物性肝损(ANTI-TUBERCULOSIS DRUG-INDUCED HEPATOTOXICITY,ATDH)易感性的方法，它包括步骤：
(i)检测该个体是否存在选自下组的基因位点：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C→T；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C→T；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G→A；
如果所述个体具有选自下组的一个或多个突变基因位点，则说明该对象对抗结核药物性肝损易感：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G。
在另一优选例中，所述步骤(i)还包括检测该个体是否存在选自下组的突变基因位点：
NR1I2基因上rs6785049位点为G→A；
NR1I2基因上rs2276707位点为C→T；
NAT2*6基因上rs1799930位点为G→A；
如果所述个体还具有选自下组的一个或多个突变基因位点，则说明该个体对抗结核药物性肝损易感：
NR1I2基因上rs 6785049位点为G；
NR1I2基因上rs2276707位点为T；和
NAT2*6基因上rs1799930位点为A。
在另一优选例中，所述的个体是人。
本发明的第五方面，提供了一种分离的基因多核苷酸序列，所述的多核苷酸序列为衍生自选自下组的基因的片段：CYP2C18基因和CYP4B1基因，且所述的核苷酸序列分别具有选自下组的突变：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C→T；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C→T；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G→A。
在另一优选例中，所述多核苷酸序列长度为80-1000bp。
本发明还提供了多核苷酸序列的用途，所述的序列可用作阳性对照(标准品)。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，发现了一批与抗结核药物肝毒性相关性显著的基因多态性位点，实验结果表明，本发明提供的与抗结核药物性肝损伤发生相关的SNP位点能够作为敏感的抗结核药物性肝损伤易感生物标志物，临床上可以用来预测结核病人使用抗结核药物后罹患肝损的可能性，，进而指导临床用药。
本发明以接受抗结核药物治疗而产生肝毒性的病人为研究切入点,通过对抗结核药物治疗的队列进行跟踪分析，按照一定的纳入和排除标准将纳入人群分为DILI病例和对照，对发生DILI的病例与对照进行比较，应用药物基因组学的方法，对抗结核药物的药物代谢酶、转运体、作用靶点等基因多态与药物代谢及不良反应等进行相关性研究，以期寻找到与抗结核药物肝毒性易感性相关的基因位点，探索抗结核药物引发肝损伤的遗传高危因素。本发明旨在建立一套可以分析和筛选中国乃至亚洲人种中特异质人群，同时能早期预测肝损伤的参数模型(生物标志物)。本发明的研究结果可以广泛用于抗结核药物肝毒性的用药筛选和检测，降低肝毒性的发生，提高结核病的治疗效果，进而减少耐药结核发生率以及节约卫生资源和政府经济负担。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
术语
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
CYP基因家族
细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)又称混合功能氧化酶和单加氧酶，为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，是微粒体混合功能氧化酶系中最重要的一族氧化酶。按照氨基酸序列可将它分为不同的亚家族。
CYP2C18基因
目前本领域中对CYP2C18研究不多，其功能定位尚不清楚。仅知道CYP2C18位于细胞内质网中，但是其对应的底物未被确定。有研究文献显示，CYP2C家族参与有机磷农药及氨基甲酸酯类等杀虫剂的代谢过程，其中单核苷酸多态位点rs2281891的多态性与CYP2C18酶活性相关。此外，还有研究显示CYP2C18可能参与华法林的代谢过程。
CYP4B1基因
细胞色素P450酶是一种加单氧酶，可以催化多种反应，包括药物代谢以及胆固醇、类固醇和脂类的合成。CYP4B1作为细胞色素P450超家族中的一员，被发现有两个转录变异体(transcript variants)，编码稍有差异的两个亚型(isoforms)。研究证实CYP4B1酶位于细胞的内质网中，主要表达于肺组织。在啮齿类动物研究中证实，其同源蛋白可以代谢某些特定的致癌物。
NR1I2基因
NR1I2基因编码的蛋白是细胞核受体超家族的成员。细胞核受体是由一个配体结合域(ligand-binding domain)和一个DNA结合域(DNA-binding domain)组成的转录因子。NR1I2是细胞色素酶CYP3A4的转录调控因子，被配体激活后，与RXR结合形成异源二聚体，进而与CYP3A4基因启动子区的反应元件结合，调控CYP3A4的基因转录过程。NR1I2可被一系列诱导CYP3A4的化合物激活，其中包括地塞米松和利福平。此基因的几个编码着不同亚型的替代剪接体已经被报道，其中的一些剪接体使用非AUG(即CUG)翻译起始密码子。还有更多的NR1I2的替代剪接体存在，但是他们没有被充分研究。
NAT2基因
N-乙酰转移酶2(NAT2)是人体内重要的Ⅱ相代谢酶，在芳香胺类和肼类化学物质代谢中起重要作用。NAT2的多态性是在研究异烟肼代谢过程中发现的，该基因的多态性与NAT2的代谢活性密切相关。在异烟肼剂量相同的情况下，NAT2多态性的存在使个体间异烟肼的血药浓度存在着显著差异，从而决定了是否发生肝损伤等不良反应。根据异烟肼乙酰化代谢快慢,可将人群分为三类：慢型乙酰化代谢者、中间型乙酰化代谢者、快型乙酰化代谢者。
本发明的主要优点在于：
(1)首次发现了一类与抗结核药物肝毒性易感性相关的基因突变位点。
(2)建立了一种简便、准确、快速、高效地确定用药患者对抗结核药物肝毒性敏感性的方法；
(3)对于结核患者，提供了更准确、更有效的指导抗结核药物用药的方法。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1 研究对象与方法
1临床病例收集
在上海市范围内选择了三家结核病定点治疗医院，按照预定的纳入排除标准收集首次诊断并接受抗结核药物治疗的病人，在知情同意的基础上对纳入病例进行了为期6个月的抗结核治疗跟踪观察，最终获得完成6个月随访且临床资料信息完整的初治病例共139例。采集的临床信息包括年龄、体重、既往病史(包括甲肝、乙肝、血吸虫病、肝脏纤维化、脂肪肝、酒精性肝硬化及其他相关肝损病史)、吸烟饮酒史、过敏史、抗结核药物治疗方案、临床常规检测指标等。这项研究得到上海市疾病预防控制中心伦理审核委员会的认可，符合世界医学会赫尔辛基宣言：人体医学研究的伦理原则。
1.1纳入排除标准
1.1.1病例纳入标准：
1)年龄：超过18岁；
2)在病例纳入点诊断的结核病人能进行含异烟肼、利福平等一线药物的治疗；
3)同意签署知情同意书；
4)患者接受抗结核药物治疗的时间等同于、或超过发生肝毒性的时间。
1.1.2病例排除标准：
1)在纳入点就诊前已诊断为结核病且正在接受抗结核药物治疗；
2)孕妇或哺乳期妇女；
3)治疗前ALT≥正常值上限的2倍或有实验室黄疸；
4)患有自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管性，或其它慢性胆管疾病等所有能被误诊为DILI的疾病；
5)由非抗结核药物，如对乙酰氨基酚所引起的肝脏毒性；
6)存在过敏、不耐受、或有抗结核药物引起的副作用；
7)被诊断为血液播散型的结核病人。
1.2生物样本采集及临床指标检测
随访6个月期间，监测所有纳入病例在接受抗结核药物治疗过程中的血液常规学和血液生化学指标。同时采集外周血生物样本以备后续药物基因组学检测分析。
1.2.1血液学指标检测：使用EDTA抗凝真空采血管采集的2ml全血(1管)，于全自动血细胞计数仪进行常规血液学指标检测，当指标发生异常时，进行人工镜检。
1.2.2生化学指标检测：使用真空采血管采集的全血，分离血清，于全自动快速血液生化分析仪进行ALT、ALP、TB等生化学指标的检测。
1.2.3免疫学指标检测：使用真空采血管采集全血，分离血清，运用HBV检测仪进行乙肝指标检测，并使用ELISA酶联免疫吸附测定方法进行丙肝指标的检测。
1.3肝损伤诊断标准及研究队列分组
结合国内外文献报道及实际情况，将肝损伤的诊断标准设定为ALT和/或TB的2倍正常上限值(ALT>80IU/L和/或TB>40μmol/L)。按此标准将根据139例纳入病例在6个月期间的血液生化学指标监测结果将队列分为抗结核药物性肝损伤组(病例组，34例)和对照组(105例)。
1.4两组人群的基本情况及均衡性分析
利用SPSS软件对相关影响因素进行单因素组间比较，结果显示性别、年龄、肝病史、糖尿病史、吸烟、饮酒因素的分布差异均无统计学意义(表2)。
表2两组研究对象基本信息的比较
Figure BDA0001304608300000091
[注]：$采用χ2检验；#采用t检验；与对照组比较，*p＜0.05
2药物基因组学分析：
采用Affymetrix公司研发的DMET(Drug Metabolizing Enzymes andTransporters)Plus芯片，对34例DILI病例及105例对照的血液样本进行药物基因组学分析。该芯片广泛覆盖相关药物基因组学标记(231个相关基因上的1,936个基因变异标记)，包括SNP、拷贝数和插入缺失标记。100％覆盖药物吸收、分布、代谢和排出(ADME)相关的核心基因(32条基因)，以及覆盖95％的核心标记(185个变异标记)。除了ADME核心内容外，还广泛覆盖了外源生物体和环境毒素的肝解毒相关普通和功能性变异。通过药物基因组学来检测个体的基因指纹，进而确定遗传特征与药物肝毒性作用的关系。具体实验可分为以下几大步骤：
2.1全血DNA提取与纯化：在开始治疗前0周，使用EDTA抗凝真空采血管抽取每个参加者2ml全血。应用全自动系统Autopure LS(QIAGEN公司)进行全血DNA提取与纯化。抽提出的DNA将被保存在-70℃。
2.2退火及扩增：使用96孔板进行mPCR的制备及稀释。将gDNA样品转移至退火板，加入退火混合液，并同时加入已稀释的mPCR产物，加热16～18个小时进行退火。退火后，将Gap Fill混合液加至退火板，并将板内样品转移至实验板。加热实验板42分钟并在此期间分别加入dNTP混合液，Exo混合液以及Universal Amp混合液进行扩增。
2.3质控：终止PCR反应，将PCR清洗混合液加入样品，加热实验板进行清洗。对所有DNA样品进行质控胶电泳分析以检测PCR产物。片段化DNA以方便样本杂交，对片段化后的DNA样本进行再一次的质控胶电泳分析以检测DNA片段的大小。
2.4标记与杂交：将样品转移至标记板中，加入标记混合液并加热。将已变性的DNA样本注入DMET Plus芯片，放到49℃的杂交培养箱内16～18小时，让其完成杂交。
2.5芯片扫描与数据分析：使用Fluidics Station 450洗涤芯片并对其进行染色，然后使用GeneChip Scanner 3000 7G对芯片进行扫描。对得到的大量数据，我们将使用Affymetrix公司提供的专为DMET Plus芯片开发的AffymetrixGeneChip Command Console分析软件，进行数据分析。
3统计分析：
采用Plink软件进行基因关联性分析筛选出与抗结核药物性肝损伤发生相关的基因位点，同时运用Hardy-Weinberg平衡检验分析样本的群体代表性。采用SPSS17.0计算各基因多态位点在病例组和对照组间的分布频率、OR值及其95％CI可信区间，以p＜0.05为差异显著性标准。
研究结果
通过DMET Console将芯片数据导出，然后采用Plink软件对DMET Plus芯片上的1936个位点进行初步筛选。排除掉5个为拷贝数变异(Copy Number Variant)、1383个单态位点(MAF＜0.05)、10个标记检出率低于90％的位点、8个位于X-染色体的位点、6个三等位基因位点、4个哈温不平衡位点(p＜0.0001)，最终得到520个药物代谢基因变异标记。进而，我们采用Fisher精确检验对520个药物代谢基因变异标记位点进行关联性分析，从中筛选出与抗结核药物性肝损伤发生相关的SNP位点(见表2)。
表2.使用Plink软件筛选出的与ATDH发生相关的位点
Figure BDA0001304608300000101
针对以上筛选出的位点，采用分子流行病学研究中常用的共显性模型、显性模型及隐性模型这三种遗传模型来估计各位点上不同等位基因与表型之间的关系，进一步判断上述SNP位点的基因多态性是否与ATDH发生风险存在关联。最终得到6个与ATDH发生相关的位点，其分布于4个基因上，包括CYP2C18，CYP4B1，NR1I2，NAT2*6基因(见表3)。其详细结果如下：
(1)CYP2C18基因上rs2281891位点的T等位基因，在病例组中的分布频率显著低于其在对照组人群中的分布频率，同时显性模型中(TT+CT vs.CC)，其基因型在病例组中的分布频率也显著低于对照组人群(OR＝0.202,95％CI：0.081-0.505)，表明rs2281891位点的T等位基因可能与ATDH的发生呈负相关，有可能降低ATDH的发生风险。此外，该基因上rs1326830位点的A等位基因，在病例组中的分布频率也显著低于其在对照组人群中的分布频率，同时显性模型中(AA+CA vs.CC)，其基因型在病例组中的分布频率也显著低于对照组人群(OR＝0.317,95％CI：0.113-0.888)，表明rs1326830位点的A等位基因也可能与ATDH的发生呈负相关，有可能降低ATDH的发生风险。
(2)CYP4B1基因上rs2297810位点的A等位基因，在病例组中的分布频率显著低于其在对照组人群中的分布频率，同时显性模型中(AA+GA vs.GG)，其基因型在病例组中的分布频率也显著低于对照组人群(OR＝0.379,95％CI：0.165-0.870)，表明rs2297810位点的A等位基因可能与ATDH的发生呈负相关，有可能降低ATDH的发生风险。
(3)NR1I2基因上rs2276707位点的T等位基因，在病例组中的分布频率显著高于其在对照组人群中的分布频率，同时共显性模型、显性模型结果均表明rs2276707位点的T等位基因可能与ATDH的发生呈正相关，有可能增加ATDH的发生风险。而该基因上的rs6785049位点的A等位基因与ATDH的发生呈负相关，有可能降低ATDH的发生风险(详见表3)。
(4)NAT2*6基因上rs1799930位点的A等位基因，在病例组中的分布频率显著高于其在对照组人群中的分布频率，同时显性模型中(AA+GA vs.GG)，其基因型在病例组中的分布频率也显著高于对照组人群(OR＝3.327,95％CI：1.466-7.656)，表明rs1799930位点的A等位基因可能与ATDH的发生呈正相关，有可能增加ATDH的发生风险。
综上所述，本发明发现了6个与抗结核药物性肝损伤发生相关的SNP位点，可以作为敏感的抗结核药物肝损伤易感性生物标志。
表3.研究人群中病例对照间6个SNP位点的基因型分布及与ATDH发生的关联分析
Figure BDA0001304608300000111
Figure BDA0001304608300000121
[注]：*采用χ2检验；**线性趋势分析；黑色加粗显示为OR值有统计学意义，p＜0.05
实施例2
本实施例提供了一种检测抗结核药物肝损伤易感性的试剂盒。
本试剂盒可对人基因组中的如下位点进行SNP鉴定检测：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C→T；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C→T；和
CYP4B1基因上rs2297810位点。
试剂盒主要试剂
(1)多态位点扩增引物
上游引物(F)和下游引物(R)(表4)
(2)多态位点测序引物
测序引物(S)(表4)；
(3)PCR主要试剂：Taq酶，10×PCR Buffer，dNTPMixtur，ddH2O；
(4)焦磷酸测序主要试剂：70％乙醇溶液，磁珠，变性缓冲液，退火缓冲液，结合缓冲液，洗涤缓冲液，底物(ASP,荧光素)，酶混合溶液(DNA聚合酶、荧光素酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、三磷酸腺苷双磷酸酶)，A/T/C/G碱基。
表4.引物序列表
Figure BDA0001304608300000131
检测原理
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。其原理为：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。该技术操作简便、检测成本较低、样本用量小、快捷、准确等特点。
实验步骤
1.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)
取50ng基因组DNA，上下游引物各0.2μmol/L，Taq酶，10×PCR Buffer，dNTPMixtur，ddH2O组成25μl反应体系，见下表。
表5.PCR反应体系
Figure BDA0001304608300000141
操作过程：
(1)将Taq酶、10×PCR Buffer、dNTP Mixture、上下游引物置于冰上，取200μlEP管、1.5mL EP管备用；
(2)在1.5mL EP管内按比例(见上表)加入ddH2O、PCRmix、引物F、R，混合均匀并分装至200μlEP管中；
(3)根据PCR反应体系中基因组DNA终浓度约为2ng/μl计算每个样本中吸取DNA模板的体积，并加入装有步骤(2)中混合液的200μlEP管中，最后加水补至25μl混合均匀，4000r/min离心5秒，放入PCR仪。
(4)PCR反应条件：94℃预变性50s，94℃变性30s，根据引物Tm值分别取不同退火温度退火30s，72℃延伸1min，38个循环后72℃延伸10min。
(5)DNA扩增片段检测：取5μl PCR产物于含0.5μg/mL溴乙啶(EB)的2.0％琼脂糖凝胶中在220V电压条件下电泳15min，100bp DNALadderⅠ作为Marker标记DNA分子量，使用凝胶成像分析系统读胶并拍照。
2.焦磷酸测序
(1)在反应孔中，加入20μlPCR产物，17μl结合缓冲液，3μl磁珠，混匀后室温振荡(13000rpm)20min，使生物素和磁珠充分结合；
(2)在接近15min时候，拿出96孔反应板，在相应样品空中加入40μl退火缓冲液和1μl测序引物(100μm),并放入样品前处理前的指定位置，待用；
(3)拿出振荡结合好的反应板，用真空吸取液体，将吸头放入70％乙醇待液体从管中流出开始计时10s，将吸头直立，待管中没有液体流出时(约3s)，放入变性缓冲液中10s，和上述类似，然后放入洗涤缓冲液里面10s；
(4)之后将刷头对准96孔反应板并在孔上方3mm处停住，停真空泵电源，等待3s后将刷头放入96孔反应板，振荡，待珠子和单链脱落于孔中；
(5)最后，将该板放加热模块80℃加热2min,冷却到室温；
(6)在试剂舱相应加样孔内分别加入A/T/C/G碱基、底物以及酶混合溶液，并同冷却好的96孔反应板一起放入ProMark96ID中测序。
使用本实施例中的试剂盒，对随机选取的500个正在使用抗结核药物治疗的患者的血液样本进行SNP检测，进一步通过常规方法对肝损伤进行确认。随访期为患者开始接受抗结核药物治疗至6个月随访结束或期间肝损发生时，共确认122例肝损患者。检测结果如下，其中肝损发生率＝该基因型肝损患者数/该基因型患者总数：
表6. 500例验证人群中肝损发生人数及基因型
Figure BDA0001304608300000151
Figure BDA0001304608300000161
从表6中可以看出，以CYP2C18基因rs2281891位点为例，基因型为CC的患者，罹患肝损伤的发生率为TT基因型的6倍多；而rs1326830位点中，基因型为CC的患者，罹患肝损伤的发生率为AA基因型的2倍多。
表7显示了本发明的肝损伤易感等位基因位点。
表7.经验证的人群中肝损伤易感等位基因
Figure BDA0001304608300000162
以上结果表明对根据本发明的肝损易感等位基因位点进行检测，可以有效的预测结核病人使用抗结核药物后罹患肝损的可能性，辅助性判断患者是否容易罹患肝损伤，进而指导临床用药。本发明建立了一种简便、准确、快速、高效地确定用药患者对抗结核药物肝毒性敏感性的方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.细胞色素P450(Cytochrome P450, CYP)基因和/或其检测试剂的用途，用于制备试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒用于检测被检测对象对抗结核药物肝毒性的易感性；所述细胞色素P450基因为CYP2C18基因或CYP2C18基因与CYP4B1基因的组合；
所述检测试剂为检测选自下组的一个或多个基因位点的检测试剂：
(1) CYP2C18基因
rs2281891、rs1326830；和
(2) CYP4B1基因
rs2297810；
所述细胞色素P450基因具有选自下组的一个或多个基因位点：
CYP2C18基因上rs2281891位点为C；
CYP2C18基因上rs1326830位点为C；和
CYP4B1基因上rs2297810位点为G。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述抗结核药物选自下组：异烟肼(INH，H)、利福平(RFP，R)、吡嗪酰胺 (PZA，Z)、乙胺丁醇 (EMB，E)和链霉素(SM，S)。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括选自下组的一个或多个基因位点和/或其检测试剂：
NR1I2：rs 6785049
NR1I2：rs2276707；和
NAT2*6：rs1799930。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，如果所述被检测对象还具有选自下组的一个或多个突变基因位点，则说明该对象对抗结核药物性肝损（Anti-tuberculosis Drug-induced Hepatotoxicity, ATDH）易感：
NR1I2基因上rs 6785049位点为G；
NR1I2基因上rs2276707位点为T；和
NAT2*6基因上rs1799930位点为A。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒含有一种或多种选自下组的试剂：
(a) 用于基因检测的特异性引物；
(b) 用于基因检测的特异性探针；
(c) 用于基因检测的芯片。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂或试剂盒用于实时荧光定量PCR检测。
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