CN114317715B - Mboat7的snp标志物在非肥胖型mafld诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MBOAT7的SNP标志物在非肥胖型MAFLD诊断中的应用，所述SNP为rs641738；通过对MAFLD的样本进行SNP检测，首次发现了MBOAT7基因的rs641738位点的基因型与非肥胖型MAFLD相关，可以通过检测rs641738的基因型判断受试者是否患有非肥胖型MAFLD。

Description

MBOAT7的SNP标志物在非肥胖型MAFLD诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及MBOAT7的SNP标志物在非肥胖型MAFLD诊断中的应用，具体的涉及SNP为rs641738。

背景技术

MAFLD(metabolic associated fatty liver disease，代谢相关脂肪性肝病)，曾用名非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)，在普通人群中的高度流行状态使其成为在中国最常见的慢性肝病。研究表明，MAFLD全球患病率为29.2％，我国的脂肪肝患病率为16.73％，是世界上增长最快的国家，预计到2020将达到20.21％(FAN R,WANG J,DU J.Association between body mass index and fatty liver risk:Adose-response analysis[J].Scientific reports,20188(1).)。尽管我国发展为脂肪性肝炎和肝纤维化的患者人数仍然低于西方国家，但预计到2030年将成为与MAFLD相关死亡人数最多的国家(ESTES C,ANSTEE QM,ARIAS-LOSTE MT，et al.Modeling NAFLD diseaseburden in China,France,Germany，Italy,Japan,Spain,United Kingdom,and UnitedStates for the period 2016-2030[J].Hepatol，2018,69:896-904.)。MAFLD的发病机制尚未完全明确，常无明显的临床症状，病理机制复杂，最终会进展为肝硬化及肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)。为了阻止该疾病高度流行的趋势并高效诊断这种常见病，当前需明确与之疾病发展相关的临床特征及危险因素，以便及早识别MAFLD，并在可能的情况下对患者实施更早和更积极的治疗。

随着发病率的逐年上升，MAFLD已经成为世界范围内重要的公共健康问题。MAFLD所带来的不仅仅是肝硬化乃肝癌等肝脏本身的疾病进展，与其共存的一系列代谢功能紊乱如2型糖尿病、肥胖、脂代谢异常以及心血管疾病、慢性肾病等肝外合并症更不容忽视。在日常生活和群众普遍认知中，MAFLD往往与超重和肥胖密切相关。因此在MAFLD患者的筛查中，我们也常常更多的注意到BMI升高人群，而对体型瘦小或BMI在正常值区间的人群关注度不足，造成MAFLD患者筛查的遗漏。但随着对该疾病研究的深入，人们已逐渐意识到“瘦型”或“非肥胖型”人群也在MAFLD中占有相当大的比例。

本申请拟通过检测脂肪肝患者的基因型，筛选与MAFLD相关的基因型，从而为不同亚型的MAFLD的诊断提供分子基础。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于判断非肥胖型MAFLD的SNP标志物，通过检测SNP基因型来判断非肥胖型MAFLD患者的预后。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测受试者样本中SNP标志物的试剂在制备判断非肥胖型MAFLD的产品中的应用，所述SNP为rs641738。

进一步，当rs641738C>T时，患者存在患非肥胖型MAFLD风险或者患非肥胖型MAFLD。

进一步，检测样本中SNP标志物的试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增(allele-specific PCR，AS-PCR))、等位基因特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性(SSCP)方法检测rs641738基因型的试剂。

进一步，所述样本选自血液、组织。

进一步，所述受试者为亚裔人群。

进一步，所述亚裔人群为中国人。

本发明提供了用于判断非肥胖型MAFLD的产品，所述产品包括检测受试者样本中SNP位点rs641738基因型的试剂。

进一步，所述试剂为针对rs641738的核酸亲和配体。

进一步，所述核酸亲和配体为引物或探针。

进一步，所述产品还包括处理样本的试剂。

进一步，所述产品还包括产品说明书，所述说明书记载了非肥胖型MAFLD的判断步骤，包括：

1)来自样本的核酸与检测rs641738基因型的试剂接触；

2)确定rs641738的基因型；

3)基于所述基因型判断受试者是否存在患非肥胖型MAFLD的风险或是否患非肥胖型MAFLD。

进一步，所述受试者为亚裔人群。

进一步，所述亚裔人群为中国人。

本发明提供了rs641738在构建预测非肥胖型MAFLD的计算模型中的应用。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了SNP位点rs641738的基因型与非肥胖型MAFLD相关，通过检测rs641738的基因型，可以判断受试者是否患有非肥胖型MAFLD或存在患非肥胖型MAFLD的风险。

具体实施方式

本发明通过广泛而深入的研究，首次发现了rs641738的基因型在非肥胖型MAFLD中呈现显著性差异，通过检测rs641738的基因型可以判断受试者是否患有非肥胖型MAFLD或存在患非肥胖型MAFLD的风险。

术语“SNP”(单核苷酸多态性)是指DNA中的单个碱基位置，在该单个碱基位置上存在一个群体的不同的等位基因或替代的核苷酸。该SNP位置通常前接和后接所述等位基因的高度保守序列(例如，在种群中小于1/100或1/1000的成员中不同的序列)。对于在每个SNP位置的等位基因，个体可以是纯合的或杂合的。本发明的SNP位点以“rs-”方式命名，本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中确定其确切的位置、核苷酸序列。

术语“等位基因”是指在染色体的给定基因座存在的一对或一系列形式的基因或非基因区。在正常的二倍体细胞中，存在任一种基因的两个等位基因(每个亲本一个)，其占据同源染色体上相同的相对位置(基因座)。在一个群体中，一种基因可能存在多于两个的等位基因。SNPs也具有等位基因，即，表征所述SNP的两个(或更多个)核苷酸。

术语“基因型”指存在于个体或样品中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有基因等位基因的何种组合。

术语“SNP位点的核酸亲和配体”指能够结合如上文定义的SNP位点或其附近序列的核酸分子。作为非限制性的实施方式，可以是例如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子或者本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式。

术语“核酸”意指DNA和RNA两者，两者均以任何可能的构型存在，即以双链(ds)核酸的形式，或以(ss)核酸的形式，或者以其组合形式(部分ds或ss)。这样的核酸对应于任选地包含至少一种修饰的核苷酸的至少两个连续的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

核酸也可以在核苷酸件的键的水平上被修饰(如硫代磷酸、H-磷酸酯、烷基磷酸酯)，在主链的水平上被修饰(例如α-寡核苷酸)或PNA或2′-O-烷基核糖)。这些修饰中的每一种可以联合发生，只要在核酸中存在至少一种磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA、通过酶促扩增技术获得的核酸。所述酶促扩增技术例如是PCR(聚合酶链式反应)及其RT-PCR衍生形式、PCR(修复链反应)、3SR(自动维持序列扩增)、NASBA(依赖核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)。

术语“探针”可以具有任何合适的长度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、500、1000或超过1000个核苷酸的长度。但是优选的是长度不少于10个核苷酸，并且优选的是长度不超过大约80个核苷酸；在一些实施方案中，探针的长度为大约20至60个核苷酸；在其他的实施方案中，探针的长度为大约20至40个核苷酸。

探针还可以是适当修饰的，例如通过加入标记，如荧光标记、染料、放射性标记等。可以根据本领域技术人员已知的方法，通过标准的标记技术来标记本发明的探针，例如放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素-亲和素标记、化学发光标记等。在杂交后，可以使用已知的方法来检测探针。

术语“引物”指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖DNA或依赖RNA的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模板或靶序列)互补。

本发明提供了检测样本中SNP标志物的试剂在制备判断非肥胖型MAFLD的产品中的应用，所述SNP为rs641738。

在一些实施方案中，通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增(allele-specific PCR，AS-PCR))、等位基因特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析或单链构象多态性(SSCP)方法来检测样本中的SNP。

SSCP是指单链DNA由于碱基序列不同可引起空间构象差异，这种差异会导致相同或相近长度单链DNA电泳迁移率的不同，从而可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行有效地检测。PCR-SSCP是将SSCP用于PCR扩增产物的基因突变检测的方法，PCR扩增的DNA片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链DNA扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。目前，PCR-SSCP技术被广泛应用于分子生物学的各个领域。

AS-PCR的原理是由于Taq DNA聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配无法修复，当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则扩增反应不能发生。目前，已出现了基于AS-PCR改良的一些方法，如四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplificationrefractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)、片段长度差异等位基因特异PCR(fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)、多等位基因特异扩增(PCR amplification of multiple specific alleles,PMASA)等。

直接测序检测SNP是最直接可靠的方法，检出率高达100％，代表测序技术有焦磷酸测序(Pyrosequencing)、taqman技术、微测序(SNaPshot)等。该方法通过比对不同样本中的同一基因或是基因片段的PCR扩增产物的测序结果，或是重测序分析已定位的序列标签位点(STS)及表达序列标签(EST)来检测SNP。可以将PCR产物纯化回收后通过连接到载体上进行测序，也可以对PCR产物直接进行测序。通过序列的比对，就能够准确地检测SNP的突变类型和位置。

本领域技术人员可选择任一种或几种方法(不限于上述的方法)来检测SNP位点，只要可以实现SNP位点的检测。

在本发明中，“样本”可以是来源于对象身体的任何合适的部分的任何样品。作为非限制性的实施方案，样本可以来源于纯组织或器官或细胞类型。在本发明的其他实施方案中，样本可以来源于体液，例如来源于脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液和汗水等。特别优选采用血液样品，其包含含有DNA的细胞，例如非成熟的红细胞、红细胞前体细胞、白细胞等。在本发明的上下文中使用的样品应当优选以临床可接受的方式采集，更优选以保留核酸或蛋白的方式采集。在本发明的检测步骤中，最终作为检测对象的是核酸(优选DNA)或蛋白。

本发明提供了用于判断非肥胖型MAFLD的产品，所述产品包括检测样本中SNP位点rs641738基因型的试剂。

在一些实施方案中，所述产品可以是试剂盒、芯片或试纸。

作为一种可选择的实施方式，本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于rs641738所在的序列。

所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

作为一种可选择的实施方式，本发明中的试剂盒包含一组寡核苷酸引物，所述引物足以检测和/或定量本发明所述的rs641738的基因型。寡核苷酸引物可以以冻干或重构的形式提供，或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中，以微孔板(microplate)的形式提供引物，其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔，如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增本发明所述的基因的表达产物的试剂和说明。

试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

在一些实施方案中，所述试剂为针对rs641738的核酸亲和配体。

作为非限制性的实施方式，本发明的核酸亲和配体可以包含技术人员已知的任何合适的功能组分，例如标签、荧光标记、放射性标记、染料、蛋白或抗体或肽的结合或识别位点、可用于PCR方法的另一段DNA、可用作限制性酶的识别位点的一段DNA等。核酸亲和配体还可以以催化RNA的形式提供，所述催化RNA特异性地结合并切割包含本发明的SNP的序列。

在一些实施方案中，所述核酸亲和配体为引物或探针。

本发明提供了rs641738在构建预测非肥胖型MAFLD的计算模型中的应用。

在一些实施方案中，所述计算模型以rs641738的基因型作为输入变量。

在一些实施方案中，所述计算模型还以其他与非肥胖型MAFLD相关的标志物作为输入变量。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例 研究与MAFLD相关的SNP位点

1、研究对象

纳入于吉林大学第一医院按照标准诊断为MAFLD的患者376例，同时选取对照组无肝病患者82例。

纳入标准：

(1)年龄≥18周岁；(2)具有完整的临床资料：血压、身高、年龄、体重、血常规、肝功、血脂、空腹血糖、肾功、肝脏影像学检查或者肝脏活检、FibroScan等；(3)男性饮酒折合乙醇量小于30克/每天，女性小于20克/每天。

排除标准：

(1)甲肝、乙肝、丙肝或其他病毒性肝病患者；(2)药物性肝损伤或自身免疫性肝病患者；(3)存在肝细胞癌或肝细胞癌可能(甲胎蛋白>100ng/ml且影像学提示肝脏恶性占位可能；或甲胎蛋白持续3个月>100ng/ml；(4)合并其他系统恶性肿瘤及恶性血液系统疾病；(5)既往或计划行肝脏移植者；(6)临床资料不全者。

肥胖定义：本研究分别将BMI<25kg/m²，25kg/m²<BMI<30kg/m²，BMI>30kg/m²的NAFLD人群定义为非肥胖型MAFLD、肥胖型MAFLD、严重肥胖型MAFLD。

2、使用MRI-PDFF检测脂肪含量(LFC)

每位参与者均接受MRI-PDFF检查。参与者接受腹部磁共振成像(MRI)(GEDiscovery 750 3.0T MR)。使用MRI-PDFF，通过MRI迭代分解水和脂肪，利用回波不对称性和最小二乘估计(理想IQ)精确测量(GE Discovery 750 3.0T MR)。在轴向ideal IQ检查中覆盖整个肝脏。关键参数如下：采集矩阵＝256×256，回波时间＝3，重复时间＝6ms，翻转角度＝3，视野＝480mm，厚度＝9mm。单次屏气，采集时间＝19秒。将284mm²的方形感兴趣区(ROI)分别手动放置在右后段、右前段、左外侧段和左内段的单层上。避免了肝脏病灶、大血管、伪影和胆管。测量四个ROls部分的脂肪分数，以代表肝脏的脂肪分数。在ideal IQ扫描后自动执行在线后处理，并在图像列表中生成定量脂肪分数图。然后将图像传输到工作站(AW4.5，GE医疗系统)以测量肝脂肪。具有MRI-PDFF值的参与者LFC≥5.1％诊断为MAFLD，5.2～14.0％为轻度MAFLD，≥14.1％建议中度和重度MAFLD。

3、血液基因组DNA的提取

使用Qiagen DNeasy血液试剂盒从上述队列中个体的血液中提取基因组DNA。使用Quibt3评估DNA的纯度和浓度。

4、基因型检测

检测表1所述基因的SNP位点，检测方法如下：

以DNA为模板，荧光定量PCR检测目的基因，Taqman探针法检测SNP，加入10ng基因组DNA检测每个反应。除PNPLA3外，其他所有SNP均处于Hardy-Weinberg平衡。

表1 检测位点

GENE	RS	w/v
			ADIPOQ	rs1501299	G/T
PNPLA3	rs738409	C/G
			RASGRP1	rs7403531	C/T
UQCC1	rs878639	A/G
			MBOAT7	rs641738	C/T
NOS3	rs2070744	C/T
			APLNR	rs948847	G/T
HSD17B13	rs72613567	-/A
			FAM13A	rs9991328	C/T

5、数据分析

对所获取的9个SNP分型按不同的分组分别进行卡方检验，探讨9个SNP的分型不同MAFLD分组的关系，P<0.05意味该SNP与疾病有联系。Logistic回归分析用于计算SNP分型对疾病的危险程度(OR)，OR大于1提示是脂肪肝的危险因素，OR＜1提示是脂肪肝的保护因素，分析的过程中校正了年龄，性别，BMI。

6、结果

不同基因的基因型与不同分组MAFLD之间的相关性如表2-12所示，rs738409(PNPLA3)、rs72613567(HSD17B13)、rs878639(UQCC1)与中重度MAFLD显著相关(表3)。rs641738(MBOAT7)与非肥胖型MAFLD显著相关(表4)。rs72613567(HSD17B13)与非肥胖型中重度MAFLD显著相关(表5)。

在纳入的所有人群中，HSD17B13基因rs72613567位置发生插入变异的有120人，未发生变异的有340人，LFC呈现显著性差异(表6)。在未发生变异的所有人群中，no-mildMAFLD(非MAFLD和轻度MAFLD)占比74.12％，在发生插入变异的所有人群中，no-mild MAFLD占比为56.67％(表7)。在纳入的非肥胖型人群中，发生插入变异的有52人，未发生变异的有134人(表8)。在未发生变异的非肥胖型人群中，非肥胖型轻度MAFLD占比为70.90％；在发生插入变异的非肥胖型人群中，非肥胖型轻度MAFLD占比为51.90％(表9)。

在非肥胖型人群中，MBOAT7基因rs641738位置发生基因型变异的有39人，未发生变异的有203人，LFC呈现显著性差异(表10)。在未发生变异的非肥胖型人群中，Non-obeseno MAFLD的占比为26.1％；在发生变异的非肥胖型人群中，Non-obese no MAFLD的占比为7.7％(表11)。

在纳入的所有人群中，UQCC1基因rs878639位置发生变异的有137人，未发生变异的有323人；在未发生变异的所有人群中，no-mild MAFLD占比66.56％，在发生插入变异的所有人群中，no-mild MAFLD占比为76.64％(表12)。

表2 SNP与MAFLD的相关性分析

表3 SNP与中重度MAFLD的相关性分析

表4 SNP与非肥胖型MAFLD的相关性分析

表5 SNP与非肥胖型中重度MAFLD的相关性分析

表6 所有人群中rs72613567(HSD17B13A)不同表型的LFC

表7 rs72613567(HSD17B13A)在中重度MAFLD中的表型

表8 非肥胖型MAFLD中rs72613567(HSD17B13A)不同表型的LFC

表9 rs72613567(HSD17B13A)在非肥胖型中重度MAFLD中的表型

表10 非肥胖型人群中rs641738(MBOAT7)不同表型的LFC

表11 rs641738(MBOAT7)在非肥胖型MAFLD中的表型

表12 rs878639(UQCC1)在中重度MAFLD中的表型

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测受试者样本中SNP标志物的试剂在制备预测非肥胖型MAFLD的产品中的应用，其特征在于，所述SNP为rs641738，所述受试者为亚裔人群。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当rs641738 C>T时，患者存在患非肥胖型MAFLD风险或者患非肥胖型MAFLD。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、等位基因特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性方法检测rs641738基因型的试剂。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述样本选自血液、组织。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为针对rs641738的核酸亲和配体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述核酸亲和配体为引物或探针。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品还包括处理样本的试剂。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品还包括产品说明书，所述说明书记载了非肥胖型MAFLD的判断步骤，包括：

1）来自样本的核酸与检测rs641738基因型的试剂接触；

2）确定rs641738的基因型；

3）基于所述基因型判断受试者是否存在患非肥胖型MAFLD的风险或是否患非肥胖型MAFLD。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述亚裔人群为中国人。

10.rs641738在构建预测非肥胖型MAFLD的计算模型中的应用。