CN103710445B - 预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，属于医学生物技术领域。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的BAG6基因SNP位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性。本发明的优点是：首次阐述了BAG6基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒

技术领域

本发明涉及预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，更具体的说是通过测定与AS相关基因BAG6的多态性预测受试者对于强直性脊柱炎的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。

背景技术

强直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4～10:1。病变常首先发生于骶髂关节，少数重症患者表现为整个脊柱强直。此外，部分患者伴有不同程度的髋关节、眼、肺、心血管、肾等脊柱外病变。AS在白种人群中的发病率约为1%～3%，我国AS患病率约为0.2-0.6%，其中60%以上的患者伴有髋关节受累，致使20%以上AS患者残疾，炎症主要累及关节囊、肌腱和韧带的骨附着点，导致局部关节粘连强直，活动受限。临床上至今尚缺乏可明显缓解和控制疾病发展的药物。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。

目前进行AS遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1%为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C（胞嘧啶）是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T（胸腺嘧啶），SNP包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。

由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高（平均每1kb就有1个）、代表性强（位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平）、遗传稳定性好（同微卫星多态性比较而言）、易于自动化分析（因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“＋/－或1/0”直接分型）等特点成为很好的遗传标志。

1973年，Brewerton等首先发现了与AS强相关的人类白细胞抗原-B27（HLA-B27）。随着研究的进展，与AS相关的其他易感基因如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）陆续被识别。

BAG6（BCL2-associated athanogene6，BCL2关联凋亡基因6）基因位于6q21.3，又称HLA-B基因相关转录因子3（BAT3），最初是在爪蟾卵提取物中纯化得到的，蛋白分子量为150KDa。研究表明其与果蝇的凋亡诱导因子Reaper在细胞核中相互作用。BAG-6蛋白存在于细胞核中并通过BAG结构域与Hsc70/Hsp70结合。另有研究证实BAG-6可与凋亡诱导因子AFI结合并增强其稳定性。BAG-4和BAG-6与凋亡相关蛋白结合表现出的抗凋亡功能可能促进了上皮性卵巢癌的侵袭浸润。

目前尚无任何关于BAG6基因与AS相关联的研究结果。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂。

本发明的第二个目的是提供一种检测强直性脊柱炎易感性基因的方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，为序列表SEQ ID No.1所示碱基序列。该核酸序列为BAG6基因全长序列。字母“R”为BAG6基因第1内含子区31607013多态性位点，位于该序列的331位。图1为BAG6基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有4个外显子，31607013标在BAG6基因图中第1内含子区的相应位置。

一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，检测受试者BAG6基因第1内含子区31607013位点的基因型，基因型为AA时，受试者的易感性最低；携带G等位基因时，受试者的易感性升高。

一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ IDNo.2和序列表SEQ ID No.3所示。该引物对可以特异性地扩增出包含有SEQ ID No.1所示序列中31607013位点的产物。

本发明提供了一种检测强直性脊柱炎易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增BAG6基因31607013位置的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分和含量如下：

一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，由以下试剂组成：

（1）10μL10×PCR缓冲液；

（2）2μL10mMdNTP混合液；

（3）2μL TaqDNA聚合酶，2unit/μL；

（4）1μL F1引物，为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

（5）1μL R1引物，为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

（6）8μL10×LC-Green Plus饱和荧光染料；

（7）2μL寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5μL组成，浓度为10pmol/μL，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

（8）64μL纯水。

使用方法：

（1）PCR扩增：通过PCR扩增BAG6基因的第1内含子区部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM/LdNTP0.2μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，10pM/L上游引物0.1μL，10pM/L下游引物0.1μL，1×LC-Green Plus饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL）（序列见表1），基因组DNA1μL，加纯水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸4s，总共45个循环，72℃总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃2min。PCR前于每一体系中加入20μL的石蜡油，以防止液体挥发。

（2）基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR-I96上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。

BAG6基因第1内含子区31607013多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。

本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如：体液（血液、腹水及尿液等）、组织细胞（如肝组织）等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含BAG6基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含BAG6基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。

在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据BAG6基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定BAG6基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。

本发明的优点是：本发明首次阐明了BAG6基因多态性位点与AS的相关性，提供了一种预测AS易感性的方法，该方法可用于AS的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步叙述，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为BAG6基因结构及其多态性变异位点的示意图

图2为BAG6基因31607013位点经HRM方法的基因分型图

图3为BAG6基因31607013位点的测序结果

具体实施方式

用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下：

10×PCR缓冲液：10mM Tris-HCI(pH=8.3)，500mM氯化钾（KCl），10mM氯化镁（MgCl₂），0.01%(W/V)白明胶

dNTP：脱氧核苷三磷酸

EDTA：乙二胺四乙酸二钠

TE：10mM Tris-HCl(pH=7.5)，1mM EDTA(pH=8.0)

实施例1：血液样本收集和基因组DNA的提取：

一.病例入选：

1.按纽约1984年的修订诊断标准入选病例，共选取来自宁夏地区无血缘关系的AS患者350例（年龄：8-71岁，平均27岁），同地区的健康对照志愿者360例（年龄：18-21岁，平均19岁）。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》人体医学研究的伦理原则。

二.根据下列方法，制备人基因组DNA。

1.在已标号的1.5mLEP管中加1000μL红细胞裂解液，后加入400μLEDTA抗凝血（抗凝血加入前颠倒混匀3-5次），颠倒混匀，室温静置10分钟；

2.13000rpm离心30秒后，除去上清液；

3.在所得沉淀中加480μL核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20μL蛋白酶K（用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K），颠倒混匀，65℃孵箱10分钟，（期间不时上下混匀，确保无凝块）；

4.拿出后降至室温，加300μL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；

5.将上清液移至新EP管中，加入670μL预冷的异丙醇，充分颠倒混匀（10次以上），可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；

6.弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670μL70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；

7.弃上清，使管内乙醇挥发干净；

8.加入TE溶液(400μL)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/μL，置于4℃备用，剩余基因组DNA置-20℃冰箱保存。

实施例2SNP的识别鉴定

本发明采用PCR-高分辨率熔解曲线（HRM）分析法和PCR测序技术同时对BAG6基因的第1内含子区的31607013位置（其等位位点为A/G）的基因型进行检测。

从Genebank中查取31607013位置附近的DNA碱基序列（SEQ ID NO.1），引物设计在Oligo7.0软件下完成。目的片段定位在BAG6基因第1内含子区，全长47bp，特异性引物序列如下：

F1：5’-ATATCAGACTGGAGCTAAAGAG-3’（SEQ ID NO.2）

R1：5’-CCTTTCTCCAACCTGCTTACT-3’（SEQ ID NO.3）

2）PCR-HRM反应体系及条件

通过PCR扩增BAG6基因第1内含子区部分片段，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM/LdNTP0.2μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，10pM/L上游引物0.1μL，10pM/L下游引物0.1μL，10×LC-Green Plus饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL）（序列见表1），基因组DNA1μL，加去离子水至10μL。PCR时于每一体系中加入20μL石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸4s，总共45个循环，72℃总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃2min。

表1：高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度

三.HRM判定基因型

将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR-I96上进行HRM分析：从40℃开始，以0.3℃/s的斜率采集熔解曲线，到98℃结束，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，判定基因型。

四.测序判定基因型

从所得的不同基因型的个体中分别随机抽取3例样本进行测序验证。测序样本重新进行PCR扩增，测序引物序列为：F2：5’-GATGAGGAAGGGCCATAGAG-3’（SEQID NO.8），R2：5’-GCATCTGGGAAGGCTTGAC-3’（SEQ ID NO.9），扩增片段长275bp。PCR反应总体系为30μL，包含：基因组DNA2μL，10×PCRBuffer3μL，10mMdNTP0.5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，上下游引物（10pM/μL）各0.5μL，纯水补充至总体积30μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min后进入主循环，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸20s，45个循环，72℃延伸2min。PCR产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。

实施例3基因SNP与强制性脊柱炎（AS）的相关性

一.统计方法：

运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算BAG6基因31607013位置的等位基因、基因型在AS病例组与正常对照组间的分布频率，AS的患病风险OR值及其95%CI可信区间，以P<0.05为差异显著性标准。

二.结果：位于6p21.3区域的BAG6基因上31607013位置的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布详见表2。

表2BAG6基因31607013位点的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布

注：OR：比值比；CI：可信区间。*G等位基因为易患AS的风险等位基因。受试者分为AS的风险等位基因（AG）（GG）携带者，和非风险等位基因（AA）携带者。基因型的卡方值通过比较非风险等位基因型AA与风险等位基因型（AG+GG）得出。

由表2可见，BAG6基因31607013位置的G等位基因，即在其DNA互补链上为C等位基因，在患者群体中的分布频率显著高于其在健康正常人群中的等位基因分布频率（11.1%vs.0.9%），具有显著性差异（P=2.67×10^-14），而且G位点的OR值为92.2，95%CI：6.9-27.3；在AS的风险等位基因（AG+GG）携带者和非风险等位基因（AA）携带者中，风险基因型在病例组中的分布频率显著高于对照组中的（P＜0.05），均表明BAG6基因31607013位置与AS患病呈正相关，可能有增加AS发病的风险。因此，受试者BAG6基因第1内含子区31607013位点的基因型为AA时，受试者的易感性最低；携带G等位基因时，受试者的易感性升高。

实施4检测试剂盒

制备检测AS相关风险的试剂盒，包含有可扩增出BAG6基因31607013位置的引物对，及其他PCR-HRM相应试剂。

本发明试剂盒供10人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分、含量和来源包括：

10μL10×PCR缓冲液（Pharmacia）,

2μL10mMdNTP混合液（Pharmacia）,

2μL TaqDNA聚合酶（2unit/μL）（Takara）

1μL上游引物F1（SEQ ID No.2）（10pM/μL）

1μL下游引物R1（SEQ ID No.3）（10pM/μL）引物，

8μL10×LC-Green Plus饱和荧光染料（美国Idaho公司），

2μL寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5μL组成，浓度为10pmol/μL，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

64μL纯水。

经PCR-HRM检测后，可轻易检测出BAG6基因第1内含子区31607013多态性。

采用本发明试剂盒测定AS患者和正常人BAG6基因第1内含子区31607013多态性。随机抽取AS患者基因组DNA和正常人基因组DNA各10例。

一.方法：

1.PCR扩增：通过PCR扩增BAG6基因的第1内含子区部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液1μL，10mM/LdNTP0.2μL，TaqDNA聚合酶0.2μL，10pM/L上游引物0.1μL，10pM/L下游引物0.1μL，1×LC-Green Plus饱和荧光染料0.8μL，寡核苷酸内参0.2μL（高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05μL）（序列见表1），基因组DNA1μL，加纯水至10μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸4s，总共45个循环，72℃总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理：95℃30s，25℃2min，94℃30s，24℃2min。PCR前于每一体系中加入20μL的石蜡油，以防止液体挥发。

2.基因型判定：将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR-I96上进行HRM分析，用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析，根据熔解曲线的差异判定基因型。

二.结果：

结果显示，AS患者样本BAG6基因第1内含子区31607013多态性位点的基因型为AG的3例，AA的7例；对照组基因型均为AA。本方法可以有效测定出BAG6基因第1内含子区31607013多态性，AA时，受试者的易感性最低；携带G等位基因时，受试者的易感性升高。

本发明具有实用性的例证：

本发明的BAG6基因多态性的检测方法可用于分析人常染色体6p21.3区的BAG6基因上的罕见变异位点的G等位基因，即在其DNA互补链上为C等位基因，应用于对AS的辅助性诊断和评估个体的AS患病风险如何，以利于开展AS的早期干预和治疗。

利用本发明阐述BAG6基因31607013位置的碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节BAG6表达的活性分子，促进AS新药研发。

本发明建立的检测BAG6基因多态性的核酸序列和AS相关位点，可高灵敏度，特异性的应用于AS基因辅助诊断的试剂盒。

如上所诉，得出结论，BAG6基因31607013位置的多态性与AS具显著相关性。因此，根据本发明测定此多态性，可用于AS的基因辅助诊断。

本发明叙述了BAG6基因AS相关的新突变位点，并提供了一种测定BAG6基因多态性的方法，而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定AS相关基因多态性的基因辅助诊断方法。

Claims (1)

1.一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成：

(1)10μL 10×PCR缓冲液；

(2)2μL 10mMdNTP混合液；

(3)2μL TaqDNA聚合酶，2unit/μL；

(4)1μL F1引物，为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

(5)1μL R1引物，为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/μL；

(6)8μL 10×LC-Green Plus饱和荧光染料；

(7)2μL寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5μL组成，浓度为10pmol/μL，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；

(8)64μL纯水。