CN110819713B

CN110819713B - Snp标志物在胰腺癌预后中的应用

Info

Publication number: CN110819713B
Application number: CN201911149335.9A
Authority: CN
Inventors: 王成锋; 陈应泰; 孙跃民
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2039-11-21
Also published as: CN110819713A

Abstract

本发明公开了SNP标志物在胰腺癌预后中的应用，通过对IOERT‑LAPC的样本进行测序，本发明首次发现了rs1026654与IOERT‑LAPC患者的生存期相关，进一步使用sanger测序在IOERT‑LAPC患者中进行验证，发现当rs1026654的基因型为AA时，患者的预后较好，当rs1026654基因型为AG或GG时，预后较差，提示可以通过检测rs1026654的基因型判断IOERT‑LAPC患者的预后。

Description

SNP标志物在胰腺癌预后中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及SNP标志物胰腺癌预后中的应用，具体的涉及SNP为rs1026654。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度高的消化道肿瘤，在常见肿瘤中占第13位，因肿瘤导致死亡的主要原因中占第四位，其死亡率几乎等于发病率(Oberstein P E,OliveKP.Pancreatic cancer:why is it so hard to treat？[J].Therap Adv Gastroenterol,2013,6(4):321-337.)。胰腺癌的高死亡率在发达国家呈现明显趋势，在欧盟28个国家中胰腺癌将超过乳腺癌成为第三大致死原因。近年来由于发展中国家人口逐步适应发达国家的生活方式，比如吸烟、高热量食物、较少的体育锻炼，胰腺癌死亡率也逐渐上升。手术根治虽然是最有效的治疗措施，但只适合20％的患者(Siegel R L,Miller K D,Jemal A.Cancerstatistics,2015[J].CA Cancer JClin,2015,65(1):5-29.)。吉西他滨是目前治疗胰腺癌的一线用药，缓解率却低于12％。

胰腺癌起病隐匿、早期诊断困难、远处转移、化疗抵抗，大多数胰腺癌患者发现时已处于中晚期，失去根治的机会，由于胰腺癌具有快速增殖能力和高度侵袭转移倾向，发病机制复杂和不确定，目前仍缺乏有效的系统治疗手段。

术中电子线放疗(intraoperative electron radiotherapy，IOERT)是在手术中对不能切除的肿瘤或切除肿瘤后的瘤床、残存肿瘤和淋巴引流区给予一次大剂量照射。由于术中定位精确、病灶受量佳、正常组织保护好及治疗时间短等优势，可用于胰腺癌的治疗中。

本申请拟通过检测IOERT治疗的胰腺癌患者的基因组，筛选与IOERT治疗生存期相关的基因型，为胰腺癌的诊断以及治疗和预后提供分子基础。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于判断胰腺癌预后的SNP标志物，通过检测SNP基因型来判断胰腺癌患者的预后。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测样本中SNP标志物的试剂在制备判断胰腺癌预后的产品中的应用，所述SNP为rs1026654。

进一步，所述胰腺癌为经术中电子线放疗治疗的胰腺癌。

进一步，所述胰腺癌为经术中电子线放疗治疗的局部晚期胰腺癌。

进一步，当rs1026654的基因型为AA时，患者的预后较好，当基因型为AG或GG时，预后较差。

进一步，检测样本中SNP标志物的试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增(allele-specific PCR，AS-PCR))、等位基因特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性(SSCP)方法检测rs1026654基因型的试剂。

SSCP是指单链DNA由于碱基序列不同可引起空间构象差异，这种差异会导致相同或相近长度单链DNA电泳迁移率的不同，从而可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行有效地检测。PCR-SSCP是将SSCP用于PCR扩增产物的基因突变检测的方法，PCR扩增的DNA片段在变性剂条件下，通过高温处理使双链DNA扩增片段解旋并且维持单链状态，进一步进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。目前，PCR-SSCP技术被广泛应用于分子生物学的各个领域。

AS-PCR的原理是由于Taq DNA聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配无法修复，当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因不互补配对时，则扩增反应不能发生。目前，已出现了基于AS-PCR改良的一些方法，如四引物扩增受阻突变体系PCR(tetra-primer amplificationrefractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS-PCR)、片段长度差异等位基因特异PCR(fragment length discrepant allele specific PCR,FLDAS-PCR)、多等位基因特异扩增(PCR amplification of multiple specific alleles,PMASA)等。

直接测序检测SNP是最直接可靠的方法，检出率高达100％，代表测序技术有焦磷酸测序(Pyrosequencing)、taqman技术、微测序(SNaPshot)等。该方法通过比对不同样本中的同一基因或是基因片段的PCR扩增产物的测序结果，或是重测序分析已定位的序列标签位点(STS)及表达序列标签(EST)来检测SNP。可以将PCR产物纯化回收后通过连接到载体上进行测序，也可以对PCR产物直接进行测序。通过序列的比对，就能够准确地检测SNP的突变类型和位置。

本领域技术人员可选择任一种或几种方法(不限于上述的方法)来检测SNP位点，只要可以实现SNP位点的检测。

在本发明中，“样本”可以是来源于对象身体的任何合适的部分的任何样品。作为非限制性的实施方案，样本可以来源于纯组织或器官或细胞类型。在本发明的其他实施方案中，样本可以来源于体液，例如来源于脑脊液、血液、血清、痰、唾液、黏膜刮除物、组织活检、泪分泌物、精液和汗水等。特别优选采用血液样品，其包含含有DNA的细胞，例如非成熟的红细胞、红细胞前体细胞、白细胞等。在本发明的上下文中使用的样品应当优选以临床可接受的方式采集，更优选以保留核酸或蛋白的方式采集。在本发明的检测步骤中，最终作为检测对象的是核酸(优选DNA)或蛋白。

本发明提供了用于判断胰腺癌预后的产品，所述产品包括检测样本中SNP位点rs1026654基因型的试剂。在本发明中，所述产品可以是试剂盒、芯片或试纸。

进一步，所述胰腺癌为经术中电子线放疗治疗的胰腺癌。

进一步，所述试剂为针对rs1026654的核酸亲和配体。

进一步，所述核酸亲和配体为引物或探针。

进一步，所述引物的序列如SEQ ID NO.1～2所示。

进一步，所述产品还包括产品说明书，所述说明书记载了胰腺癌预后的判断步骤，包括：

1)来自样本的核酸与检测rs1026654基因型的试剂接触；

2)确定rs1026654的基因型；

3)基于所述基因型判断胰腺癌的预后；优选的，当rs1026654的基因型为AA时，患者的预后较好，当基因型为AG或GG时，预后较差。

在本发明中，SNP(单核苷酸多态性)是指DNA中的单个碱基位置，在该单个碱基位置上存在一个群体的不同的等位基因或替代的核苷酸。该SNP位置通常前接和后接所述等位基因的高度保守序列(例如，在种群中小于1/100或1/1000的成员中不同的序列)。对于在每个SNP位置的等位基因，个体可以是纯合的或杂合的。本发明的SNP位点以“rs-”方式命名，本领域技术人员能够根据上文的rs-命名，从适合的数据库和相关的信息系统如单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中确定其确切的位置、核苷酸序列。

术语“等位基因”是指在染色体的给定基因座存在的一对或一系列形式的基因或非基因区。在正常的二倍体细胞中，存在任一种基因的两个等位基因(每个亲本一个)，其占据同源染色体上相同的相对位置(基因座)。在一个群体中，一种基因可能存在多于两个的等位基因。SNPs也具有等位基因，即，表征所述SNP的两个(或更多个)核苷酸。

术语“基因型”指存在于个体或样品中的等位基因的同一性。典型地，其指与感兴趣的特定基因相关的个体的基因型；在多倍体个体中，其指个体携带有基因等位基因的何种组合。

术语“SNP位点的核酸亲和配体”指能够结合如上文定义的SNP位点或其附近序列的核酸分子。作为非限制性的实施方式，可以是例如RNA、DNA、PNA、CAN、HNA、LNA或ANA分子或者本领域技术人员已知的任何其他合适的核酸形式。

作为非限制性的实施方式，本发明的核酸亲和配体可以包含技术人员已知的任何合适的功能组分，例如标签、荧光标记、放射性标记、染料、蛋白或抗体或肽的结合或识别位点、可用于PCR方法的另一段DNA、可用作限制性酶的识别位点的一段DNA等。核酸亲和配体还可以以催化RNA的形式提供，所述催化RNA特异性地结合并切割包含本发明的SNP的序列。

术语“核酸”意指DNA和RNA两者，两者均以任何可能的构型存在，即以双链(ds)核酸的形式，或以(ss)核酸的形式，或者以其组合形式(部分ds或ss)。这样的核酸对应于任选地包含至少一种修饰的核苷酸的至少两个连续的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。

核酸也可以在核苷酸件的键的水平上被修饰(如硫代磷酸、H-磷酸酯、烷基磷酸酯)，在主链的水平上被修饰(例如α-寡核苷酸)或PNA或2′-O-烷基核糖)。这些修饰中的每一种可以联合发生，只要在核酸中存在至少一种磷酸酯。所述核酸可以是天然的或合成的、寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖体RNA、信使RNA、转移RNA、通过酶促扩增技术获得的核酸。所述酶促扩增技术例如是PCR(聚合酶链式反应)及其RT-PCR衍生形式、PCR(修复链反应)、3SR(自动维持序列扩增)、NASBA(依赖核酸序列的扩增)、TMA(转录介导的扩增)。

术语“探针”可以具有任何合适的长度，例如15、20、30、40、50、100、150、200、300、500、1000或超过1000个核苷酸的长度。但是优选的是长度不少于10个核苷酸，并且优选的是长度不超过大约80个核苷酸；在一些实施方案中，探针的长度为大约20至60个核苷酸；在其他的实施方案中，探针的长度为大约20至40个核苷酸。

探针还可以是适当修饰的，例如通过加入标记，如荧光标记、染料、放射性标记等。可以根据本领域技术人员已知的方法，通过标准的标记技术来标记本发明的探针，例如放射性标记、酶标记、荧光标记、生物素-亲和素标记、化学发光标记等。在杂交后，可以使用已知的方法来检测探针。

术语“引物”指天然存在的寡核苷酸(例如限制性片段)或合成产生的寡核苷酸，其能够用作引物延伸产物合成的起始点，当处于适当的条件(例如缓冲液、盐、温度和pH)以及存在核苷酸和用于核酸聚合的试剂(例如依赖DNA或依赖RNA的聚合酶)的条件下，所述引物延伸产物与核酸链(模板或靶序列)互补。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了SNP位点rs1026654的基因型与胰腺癌的预后相关，通过检测rs1026654的基因型，可以判断受试者接受IOERT治疗后的预后情况，当基因型为AA时，患者的预后较好，当基因型为AG或GG时，预后较差。

附图说明

图1是rs1026654不同基因型的生存曲线图；

图2是验证组rs1026654不同基因型的生存曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与胰腺癌预后相关的SNP位点

1、研究对象

中国国家癌症中心自2008年1月至2013年11月收集的44例经IOERT治疗的组织学确认为局部晚期胰腺癌(IOERT-LAPC)患者的血液样本，所有的患者未发生肿瘤转移。

2、血液基因组DNA的提取

使用血液DNA提取试剂盒SK8224提取血液样本中的基因组DNA，具体操作详见说明书。

3、基因型检测

将提取的DNA使用Illumina HumanOmni5-4v1进行测序。

4、数据分析

使用GenomeStudio进行基因型调用，排除基因型调用率低于95％的样品；对数据进行相关性分析，排除基因型调用率低于95％，最小等位基因频率小<0.05，哈迪-温伯格(Hardy-Weinberg)P值<1.0e-5的SNPs。

选择GenABEL(版本1.8-0)以及R包(版本2.42-3)评估SNPs与IOERT-LAPC患者的生存期之间的相关性，总体存活期(OS)为主要终点，OS的从手术日期开始计算，并通过Kaplan-Meier进行估算，最后一次的随访日期作为截尾时间，截尾日期内死亡的样本标记为1，存活的样本标记为0，应用Cox比例风险(coxph)模型和相加模式遗传模型，计算每种SNP的风险比，β效应大小，β效应大小的标准误差和p值。应用Function survdiff检测不同的基因型组的生存曲线差异。

5、结果

测序结果显示，rs1026654与IOERT-LAPC患者生存期相关，rs1026654与IOERT-LAPC的关联性如表1所示，rs1026654不同基因型的生存曲线如图1所示，当基因型为AA时，患者的预后较好，当基因型为AG或GG时，预后较差。

表1 rs1026654与IOERT-LAPC的关联性

实施例2验证rs1026654与IOERT-LAPC生存期的相关性

1、研究对象

国家癌症中心自2013年12月至2017年4月收集的83例经IOERT治疗的组织学确认为局部晚期胰腺癌(IOERT-LAPC)患者的血液样本，所有的患者未发生肿瘤转移，排除无随访记录等的无效样本17例，最终纳入研究的病例为66例。

2、血液基因组DNA的提取

使用上海生工的快速DNA提取试剂盒SK8224提取血液中的DNA，具体步骤详见操作说明书。

3、PCR扩增目的基因

1)设计引物

根据rs1026654上下游的序列设计PCR引物，具体引物序列如下：

正向引物5’-TGGTGGCAGAGTGAACTCATAGA-3’(SEQ ID NO.1)，

反向引物5’-ATAAATACAATTAAAAGGCAGCCA-3’(SEQ ID NO.2)

2)配制25μl扩增体系：

表2PCR扩增体系

试剂	体积
		正向引物	0.5μl
反向引物	0.5μl
		生工PCR Mix	3μl
DNA模板	1μl
		ddH<sub>2</sub>O	20μl

3)反应条件

95℃3min，(94℃0.5min,58℃0.5min,72℃0.5min)×35，72℃10min，使用ABI3730XL进行测序。

4、数据分析

选择GenABEL(版本1.8-0)以及R包(版本2.42-3)评估rs1026654与IOERT-LAPC患者的生存期之间的相关性，绘制Kaplan-Meier生存曲线，应用Cox比例风险(coxph)模型和相加模式遗传模型，计算每种SNP的风险比，β效应大小，β效应大小的标准误差和p值。

5、结果

单变量Cox比例风险(HR＝2.326，95％CI:1.114-4.856，p＝0.025)以及Kaplan-Meier生存曲线图(图2)显示，rs1026654与生存期之间的相关性是显著的，当rs1026654的基因型为AA时，患者的预后较好，当rs1026654基因型为AG或GG时，预后较差。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> SNP标志物在胰腺癌预后中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggtggcaga gtgaactcat aga 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ataaatacaa ttaaaaggca gcca 24

Claims

1.检测样本中SNP标志物的试剂在制备判断胰腺癌预后的产品中的应用，其特征在于，所述SNP为rs1026654。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述胰腺癌为经术中电子线放疗治疗的胰腺癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述胰腺癌为经术中电子线放疗治疗的局部晚期胰腺癌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，当rs1026654的基因型为AA时，患者的预后较好，当基因型为AG或GG时，预后较差。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过直接测序、单碱基延伸、等位基因特异性探针杂交、等位基因特异性引物延伸、等位基因特异性扩增、等位基因特异性核苷酸掺入、5'核酸酶消化、分子信标测定、寡核苷酸连接测定、大小分析和单链构象多态性方法检测rs1026654基因型的试剂。

6.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述样本为血液。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂为针对rs1026654的核酸亲和配体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核酸亲和配体为引物或探针。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO.1~2所示。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品还包括产品说明书，所述说明书记载了胰腺癌预后的判断步骤，包括：

1）来自样本的核酸与检测rs1026654基因型的试剂接触；

2）确定rs1026654的基因型；

3）基于所述基因型判断胰腺癌的预后；当rs1026654的基因型为AA时，患者的预后较好，当基因型为AG或GG时，预后较差。