CN106834501B

CN106834501B - 与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用

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Publication number: CN106834501B
Application number: CN201710126858.6A
Authority: CN
Inventors: 米杰; 张美仙; 吴建新; 赵小元; 吴丽君; 程红; 侯冬青
Original assignee: Capital Institute of Pediatrics
Current assignee: Capital Institute of Pediatrics
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2017-03-06
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2037-03-06
Also published as: CN106834501A

Abstract

本发明涉及一种与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用。本发明公开了一种与中国儿童肥胖相关的生物标志物，所述生物标志物包括以下中国儿童肥胖易感性SNP位点中的一种或两种：易感SNP位点(1)：rs1059491具体为chr16:28603655，c.704A>C，p.N235T；易感SNP位点(2)：rs768847893具体为chrX:3241682，c.2044C>T，p.R682C。本发明发现了两个易感SNP位点并研究了其在儿童肥胖辅助检测的应用前景，本发明提供的肥胖相关的基因位点可能是肥胖的早期生物标志物，为进一步研究肥胖的遗传分子机制，探索肥胖早期防治的药物靶点提供了新的方向。

Description

与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用。

背景技术

肥胖是一种常见的营养代谢性疾病。2002年WHO将肥胖列为造成人类疾病负担的全球一级风险因素之一，预防肥胖症的流行也是21世纪前50年世界各国面临的最大公共卫生挑战之一。家系分析和双生子研究表明遗传因素在肥胖发生中起着非常重要的作用。与人体体脂相关的40％以上的基因变异可以产生遗传差异。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是1996年由美国麻省理工学院的人类基因组研究中心学者Lander提出的一类分子遗传标记，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP仅涉及到单个碱基的变异，有转换、颠换、插入和缺失等不同形式。SNP为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等都可能与SNP有关。

全基因组关联研究(GWAS)正是以SNP为遗传标记的研究复杂性疾病遗传易感性的有效策略。到目前为止，应用GWAS策略已成功地发现了大量肥胖的易感基因位点。例如，FTO基因位于第16号染色体(16q12.2)，含有9个外显子，基因长度为410.50kb，广泛表达于人体组织的各发育阶段，且在下丘脑、骨骼肌及脂肪等组织中高表达。它是GWAS发现与普通人群肥胖关联的第一个基因。2007年，Frayling TM等最初进行FTO与2型糖尿病的关联研究时，在控制BMI后，FTO与2型糖尿病之间的联系消失，从而意外地发现FTO基因与肥胖相关。此后，FTO基因变异与BMI及肥胖的关联陆续在不同种族人群中得到重复，其中位于第1内含子的rs9939609是重复性最好的多态性位点。FTO基因多态性陆续被证实与肥胖或2型糖尿病的遗传易感性有关。

尽管对与肥胖和肥胖相关的性状关联的基因和基因位点的认识逐渐增加，但临床上还没有发现有用的遗传变异可作为针对肥胖的个体尤其儿童进行早期筛查和干预的有效产品。最近的研究甚至得出结论，在一组肥胖相关的候选基因中的普通SNP在调控由某些膳食诱导的体重改变中，即使发挥作用的话，也仅发挥较小的作用。

鉴于目前还没有与肥胖相关早期生物标志物和早期诊断试剂盒，如能发现相应的标记物和研制相应的诊断试剂盒，将为探索肥胖早期防治的药物靶点提供新的方向，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。

发明内容

本发明的目的是针对上述技术问题，首先利用高通量外显子测序技术发现一种与中国儿童肥胖相关的生物标志物。

本发明的第二个目的是提供所述生物标记物在预测儿童肥胖诊断试剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供儿童肥胖易感性辅助诊断试剂盒。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

本发明通过两阶段病例-对照研究中国儿童肥胖的功能性编码变异。首先，选择一组具有肥胖家族史的严重肥胖儿童和一组消瘦儿童进行全基因组外显子测序。在测序数据中提取已知肥胖相关基因和新发现基因外显子区域的非同义单核苷酸变异(single-nucleotide variants,SNVs)(包括错义变异、无义变异、终止密码变异和剪接变异)进行关联分析，筛选出83个可能与肥胖相关(P<0.05)的变异。然后，将筛选出的83个变异位点在2480例肥胖儿童和3854例对照儿童中进行基因分型，分析验证这些变异与儿童肥胖的关联。本发明最后确认两个基因位点与中国儿童肥胖及相关评价指标关联的基因位点。

其中，SULT1A2(磺基转移酶家族，胞浆1A成员2，sulfotransferase family,cytosolic,1A,phenol-preferring,member 2)基因与肥胖研究热点区域16p11.2很接近。SULT1A2基因编码一个具有耐热酶活性二苯酚硫酸基转移酶，是硫酸代谢的关键酶，催化多种激素，包括蛋白质磺酸盐激素、雌激素、雌激素烷基酚和17β-雌二醇等分泌型激素。位于SULT1A2基因的非同义编码变异rs1059491(chr16:28603655，c.704A>C，p.N235T)与儿童BMI、FMP和一般性肥胖在全基因组水平具有正向关联，且男女一致。rs1059491是第235个密码子改变的多态性，可以导致氨基酸改变，由天冬酰胺突变为苏氨酸，为错义变异。该位点rs1059491(c.704A/C，p.N235T)在不同人群中的突变频率差异较大，通过不同软件预测均表明，rs1059491:p.Asn235Thr(c.704A/C)与基因功能相关(“deleterious”SIFT和“probably damaging”PolyPhen-2)。

MXRA5(基质重塑关联5，matrix-remodelling associated 5)基因位于Xp22.33，含7个外显子。MXRA5基因编码基质重塑关联蛋白5，该蛋白包含7个富含亮氨酸重复序列和12个免疫球蛋白样C2型结构域，是一个具有血管内皮生长因子受体的蛋白多糖，在细胞粘附和基质重建中起到关键作用。位于该基因上的突变位点rs768847893(chrX:3241682，c.2044C>T，p.R682C)是一个新的非同义变异，该位点与女性儿童腰围和腹型肥胖罹患风险在全基因组水平具有显著关联，经多重检验校正后仍具有统计学意义。通过SIFT、PolyPhen-2软件预测进一步表明该变异属于功能性变异，具有致病性。

基于此，本发明首先提供了一种与中国儿童肥胖相关的生物标志物，所述生物标志物包括以下中国儿童肥胖易感性SNP位点中的一种或两种：

易感SNP位点(1)：rs1059491具体为chr16:28603655，c.704A>C，p.N235T；

易感SNP位点(2)：rs768847893具体为chrX:3241682，c.2044C>T，p.R682C。

优选的，所述肥胖包括一般性肥胖、体脂肥胖和腹型肥胖。更优选的，所述一般性肥胖和体脂肥胖的评价指标为BMI和FMP，腹型肥胖的评价指标为WC和WHtR。其中，BMI指体质指数，FMP指体脂百分比，WC指腰围，WHtR指腰围身高比。

进一步地，本发明提供了所述生物标记物在预测中国儿童肥胖早期诊断试剂中的应用。

更进一步地，本发明提供了一种儿童一般性肥胖早期辅助检测试剂盒，其包括检测样本中易感SNP位点(1)rs1059491的基因型的试剂。

优选的，所述试剂盒评价儿童肥胖的评价指标为BMI和FMP。

为了更精确和更全面的检测儿童肥胖症，所述试剂盒还包括检测样本中易感SNP位点(2)rs768847893的基因型的试剂。

再进一步地，本发明提供了一种女性儿童腹型肥胖早期辅助检测试剂盒，其包括检测样本中易感SNP位点(2)rs768847893的基因型的试剂。

优选的，所述试剂盒评价女性儿童腹型肥胖的评价指标为BMI、WC和WHtR。

优选的，所述试剂盒可以为采用本领域已知的任何技术检测SNP的试剂，只要其能够检出样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)是否存在等位基因突变。其包括但不限于下面列举的各实施方式。

在第一实施方式中，该试剂盒包括利用测序法检测样本中易感SNP位点(1)rs1059491位点C等位基因存在，和/或易感SNP位点(2)rs768847893位点T等位基因存在的试剂。测序法是本领域所公知的技术，所需的引物等试剂，本领域普通技术人员均可根据需要自行选择(参见ABI、Beckman等公司测序仪相关使用说明)，在此不再赘述。利用该试剂盒，通过测序法可以直接测得样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)的序列，从而判断其是否携带相应位点等位基因的变异，进而判断其肥胖的易感性。

在第二实施方式中，所述试剂盒包括利用Taqman探针SNP检测法检测样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)基因型的试剂。其中所用Taqman探针为针对易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)设计的探针，该探针可以使用试剂公司提供的探针；也可使用软件自行设计，如PREMIER Biosoft公司的Beacon Designer 7.5。

在第三实施方式中，所述试剂盒为利用PCR-单链构象多态性法检测样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)基因型的试剂盒。该试剂盒中包括用于扩增易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)的引物，PCR试剂、对照样本和检测构象的电泳所需试剂。所述电泳优选非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对照样本中包括易感SNP位点(1)AA纯合子的阴性对照样本和位点CC纯合子的阳性对照样本中的至少一个，另外同时还可以包括易感SNP位点(2)CC纯合子的阴性对照样本，和位点TT纯合子的阳性对照样本中的至少一个，此外还可以包括也可以不包括杂合子相应杂合子的对照样本。优选同时包括上述三类对照样本。待测样本扩增产物与对照样本的扩增产物同时电泳，比较其电泳结果可以得出待测样本中是否携带相应等位基因变异的检测结果。

上述第一、第二和第三实施方式的试剂盒中包括设计用于扩增易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)的引物，该引物具有如下特征：1)扩增产物长度在100-300bp之间；2)引物长度在15～30碱基之间；3)G+C含量在40％～60％之间；4)碱基随机分布；5)引物自身不能有连续4个碱基的互补；和6)引物之间不能有连续4个碱基的互补。

该引物可以采用软件来设计，(如使用Primer5、Oligo6等)，例如，可以采用如下所述引物对：易感SNP位点(1)引物序列如SEQIDNO：1-2所示，易感SNP位点(2)引物序列如SEQIDNO：3-4所示。此外，本发明提供了所述引物对在制备儿童肥胖易感性的试剂盒中的用途，如果样本中检测到易感SNP位点(1)携带C等位基因和/或易感SNP位点(2)携带T等位基因的存在，则说明提供该样本的个体具备儿童肥胖易感性。所制备试剂盒为上述试剂盒中的至少一种，也可以是利用其他本领域已知的技术鉴定该SNP存在的其他试剂盒。

本发明提供了两个易感SNP位点与既往研究报道的基因位点比较，本发明是在中国儿童中采用二代测序技术发现的，并经过一代测序验证其真实性。儿童期是研究肥胖遗传易感性的最佳窗口期，受生活行为和环境因素的干扰小，表型单纯明确，是遗传外显性最高的时期，易于探索肥胖的遗传因素。

本发明有益效果：

本发明通过发现了两个易感SNP位点并研究了其在儿童肥胖辅助检测的应用前景，本发明提供的肥胖相关的基因位点可能是肥胖的早期生物标志物，为进一步研究肥胖的遗传分子机制，探索肥胖早期防治的药物靶点提供了新的方向。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明中术语解释如下：

本文使用的术语“引物”指存在于纯化的限制性消化物中或合成产生的寡核苷酸，置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，即存在核苷酸和诱导剂(如DNA聚合酶)以及适当的温度和pH时，所述寡核苷酸能作为合成的起始点。引物可以为单链或双链，并且必须具有足够的长度，以在诱导剂存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度会取决于许多因素，包括温度、引物来源和使用的方法。例如，就诊断应用而言，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物一般含有15-25或更多的核苷酸，尽管也可以含有更少的核苷酸。引物合适长度的确定中涉及的因素为本领域普通技术人员所公知。一般而言，根据本领域熟知的标准方法设计和选择本发明的引物，参阅Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)General Concepts for PCR Primer Design.《PCR Primer，ALaboratory Manual》(Dieffenbach，CW和Dveksler，G.S.编辑)Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，133-155。

体质指数(BMI)：即身体质量指数，简称体质指数又称体重指数(英文为Body MassIndex，简称BMI)，是用体重公斤数除以身高米数平方得出的数字，是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一个标准。

体脂百分比(FMP)：通过测量人体成分而获得脂肪和非脂肪含量，以体脂肪含量除以体重得到的百分比，即体脂百分比(英文为Fat Mass Percentage，简称FMP)，用以评价人体是否肥胖及肥胖程度。

腰围(WC)：英文全称Waist Circumference，是反映脂肪总量和脂肪分布的综合指标，世界卫生组织推荐的测量方法是：被测者站立，双脚分开25至30厘米，体重均匀分配。测量位置在水平位髂前上嵴和第12肋下缘连线的中点。将测量尺紧贴而不压迫皮肤，在正常呼气末读数，测量值精确到0.1厘米。

腰围身高比(WHtR)：英文全称Waist-to-Height Ratio，即腰围除以身高所得的数值，用以间接反映脂肪在腹部的聚积。由于WHtR考虑了身高因素，几乎不受年龄和性别的影响，所以在儿童中使用WHtR≥0.5(即腰围超过身高的一半以上)定义腹型肥胖非常简便。

一般性肥胖：以BMI为评价指标，采用国际肥胖问题工作组(IOTF)推荐的学龄儿童青少年超重和肥胖筛查BMI界值诊断肥胖、正常和消瘦。

体脂肥胖：采用《中国学龄儿童青少年超重和肥胖预防与控制指南》推荐的标准，以FMP为评价指标，男性FMP≥20％，女性14岁及以下FMP≥25％，女性15岁及以上FMP≥30％为肥胖。

腹型肥胖：分别以WC和WHtR为评价指标，采用中国学龄儿童青少年按年龄和性别的腰围第90百分位(P90)诊断腹型肥胖；或以WHtR≥0.5为腹型肥胖。

SIFT：SIFT分值(version 4.0.3b)，表示该变异对蛋白序列的影响，包含两组数据，Score(Scaled Probabilities for Entire Protein)给出了所提交氨基酸每个位点发生突变后的计算分数，该值越小越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大，只要分数小于0.05就认为可能影响到蛋白质功能；Predict是预测的结果用T或者D表示，D:Deleterious有害的(sift<＝0.05)，T:tolerated可以忍耐的突变(sift>0.05))。

PolyPhen-2：利用PolyPhen-2基于HumanDiv数据库预测该变异对蛋白序列的影响，用于复杂疾病。该列包含两个值，第一个是PolyPhen-2分值，数值越大越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；第二个是预测的结果用D或P或B表示，D:Probably damaging非常有可能有害(>＝0.957)，P:possibly damaging可能有害(0.453<＝pp2_hdiv<＝0.956)，B:benign中性(pp2_hdiv<＝0.452)。

Mutation Taster：Mutation Taster分值(version 2.3)，表示该变异对蛋白序列的影响，包含两组数据，Score给出了所提交氨基酸每个位点发生突变后的计算分数，该分数为0～1，该值越大越“有害”，表明该SNP导致蛋白结构或功能改变的可能性大；Predict是预测结果用A、D、N或者P表示，其中A：disease causing automatic致病性突变，D：diseasecausing可能为致病性突变，N：polymorphism多态可能无害，P：polymorphism automatic多态无害。

MAF：英文全称minor allele frequency，即较少等位基因频率，通常是指在给定人群中的不常见的等位基因发生频率。MAF广泛应用于复杂疾病的全基因组关联研究。在关联研究中，较小的MAF将会使统计效能降低，从而造成假阴性的结果。为了研究人群中罕见突变与疾病的关联，通常通过加大样本量的方法来弥补MAF降低所带来的统计效能的损失。

本发明的技术方案中：

外显子测序实验是采用Agilent SureSelect Human All Exon 70M(V4+UTRs)外显子组液相捕获芯片捕获全基因组外显子，构建外显子组文库，在Illumina HiseqTM 2000高通量测序平台进行双端测序，要求测序深度达到50倍。

基因分型实验是将筛选出的83个变异位点在2480例肥胖儿童和3854例对照儿童中进行基因分型，分析验证这些变异与儿童肥胖的关联。根据基因位点序列信息，设计并合成PCR反应和单碱基扩增引物，使用Sequenom MassARRAY高通量的基因型检测技术完成基因分型。

具体实施方案如下：

实施例1样品的收集和样品资料的整理

发明人于2004年4月至2014年12月在北京和通化地区中小学校收集了大量的肥胖病例对照儿童血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了6334例符合下列标准的样本进行全基因组外显子测序和单个SNP Sequenom MassARRAY基因分型的实验样品：

1、经国际肥胖问题工作组(IOTF)推荐的体质指数(BMI)分类标准明确诊断的肥胖病例；

2、汉族儿童，年龄6-18岁；

3、对照包括正常体重和消瘦儿童，排除超重儿童。

并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。

实施例2外周血DNA提取

在上述符合条件的所有样本，使用离心柱法(DNA小量提取试剂盒，QIAGEN公司，德国)提取人类基因组DNA。具体步骤为：

1、向1.5mL离心管加入20μL蛋白酶K；

2、加入200μL白细胞混合液，如果体积不足200μL，用磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffer saline，PBS)补足；

3、加入200μL buffer AL(裂解液)，漩涡振荡15秒，快速离心；

4、56℃水浴10分钟；

5、快速离心，避免管盖上留有溶液；

6、加入200μL无水乙醇，漩涡振荡15秒，快速离心；

7、将所有溶液转移到QIAamp离心柱中，10000rpm离心2分钟，弃收集管，将离心柱转移到新的收集管(试剂盒提供)；

8、向离心柱上加入500μL bufferAW1(洗涤液1)，10000rpm离心2分钟，弃收集管，将离心柱转移到新的收集管(试剂盒提供)；

9、向离心柱上加入500μL bufferAW2(洗涤液2)，10000rpm离心5分钟，弃收集管，将离心柱转移到新的收集管(试剂盒没有提供，可用1.5mL离心管代替)，12000rpm离心3分钟；

10、将离心柱转移到新的1.5mL Eppendorf管，向离心柱上加入200μL bufferAE(DNA溶解液)，室温放置5分钟，13000rpm离心3分钟；

11、弃去离心柱，盖上管盖。-20℃保存备用。

实施例3外周血DNA中SNP的全外显子组检测

在上述符合条件的19例严重肥胖儿童和15例消瘦儿童中进行全基因组外显子测序，比较两组儿童外显子测序数据获得候选基因位点。具体步骤为：

1、DNA质检：采用紫外/可见分光光度计(DU800，贝克曼，美国)或(NanoDrop 2000，赛默飞世尔，美国)，读取A230nm、A260nm、A280nm吸光度值，按公式计算DNA浓度(g/L)＝A260nm×50，并通过OD比值(A260/A280、A260/A230)鉴定DNA纯度。A260/A280比值低提示有蛋白质残留，但如果操作过程中使用了苯酚，则更可能是苯酚残留，A260/A280比值偏高提示可能由于核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)没有去除干净。A260/A230比值低提示残存的盐或小分子杂质污染，过高一定有未知的杂质。

在DNA初步定量基础上，进一步采用琼脂糖凝胶电泳检测(胶浓度：0.8％，电压：120V，时间：20min)精确定量DNA。电泳后出现弱带或主带之外存在杂带，说明DNA可能有降解现象或存在杂质，如果电泳后出现一条强带，则说明提取的DNA质量较高。外显子测序要求DNA浓度≥50ng/μL，总量不低于5ug，OD260/280在1.8～2.0之间，OD260/230在2.0左右，样本无RNA污染，无降解或者轻微降解。Sequenom SNP基因分型要求DNA浓度大于25ng/μL，DNA体积大于10μL，纯度要求OD 260/280为1.7～2.0之间，琼脂糖电泳须有大于10kb的明亮的单一条带，无RNA和蛋白污染。

2、外显子捕获：采用Agilent SureSelect Human All Exon 70M(V4+UTRs)外显子组液相捕获芯片进行杂交捕获，平均捕获效率70％。其大致流程是将打断后的基因组DNA与SureSelect诱饵共孵，通过含有链酶亲和素标记的磁珠(streptavidin magnetic beads)，钓出RNA诱饵-DNA杂合体，洗脱磁珠，降解RNA诱饵，富集目的区域，再进行高通量测序。

3、外显子组文库构建：对质检合格的DNA样品，采用Illumina标准的DNA true-seq建库流程构建外显子组文库。文库构建流程简述如下：

(1)取5μg基因组DNA，在适当体系中以Bioruptor做随机机械化打断，使片段主带在200bp附近，切胶回收150-250bp片段；

(2)对DNA片段做末端修复和3’末端加A尾；

(3)连接测序接头(adapter)，连接产物纯化后进行聚合酶链式反应(polymerasechain reaction，PCR)扩增，扩增产物纯化为预文库；

(4)取一定量预文库以外显子组捕获试剂盒中的探针做杂交捕获。按照Agilent捕获芯片的流程进行捕获。杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，产物回收即为终文库，琼脂糖凝胶电泳跑小样确认；

(5)利用定量PCR的方法对文库进行最终的质检，用以判断文库insert的大小以及上机前文库的最终浓度，合格文库安排上机测序。

4、外显子组测序：对构建好的外显子组文库，采用Illumina HiseqTM 2000高通量测序仪进行双末端(pair-end)测序，测序模式为100PE，测序试剂为V3，测序深度为50×。Illumina Hiseq2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理采用可逆终止法的边合成边测序(sequencing by synthesis，SBS)技术。

5、数据分析与处理：在肥胖病例组和对照组中发现的基因型分布频率有显著差异的SNP，其中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)外显子关联分析结果如表1所示。

表1外显子测序样本中两个易感SNP位点的突变频率及与肥胖的关联

序号	Chr	SNP	BP(hg19)	Allele(Ref/Alt)	F_case	F_control	P	OR	Depth
										1	16	rs1059491	28603655	T/G	0.00	0.10	0.046	0.00	4
2	X	rs768847893	3241682	G/A	0.20	0.00	0.001	-	73

注：Allele(Ref/Alt)：参考等位基因/突变等位基因；F_case：病例组中突变等位基因频率；F_control：对照组中突变等位基因频率。

实施例4单个SNP的Sequenom MassARRAY基因分型

在上述符合条件的2480例肥胖学龄儿童和3854例对照(3207名正常体重儿童和647名消瘦儿童)中，将上述全外显子测序发现与肥胖显著相关的83个SNP在SequenomMassARRAY基因分型平台上进行检测，具体步骤为：

1、进行Sequenom MassARRAY基因分型。对全外显子组测序发现的与肥胖有关的83个SNP设计特异性扩增引物和特异性延伸引物；扩增反应的体系包括：0.625μL PCRbuffer(10*)，0.1μL dNTPmix(25mM)，0.325μL MgCl₂(25mM)，0.2L HotStar Taq(5U/μL)，每对正向和反向扩增引物的混合物1μL(0.5uM)和1.75μL双蒸水，加入1μL的DNA样本进行PCR扩增反应。延伸反应的体系包括：EXTENDMix液2μL(其中各延伸反应引物混合物0.94μL，iPLEX酶0.041μL，延伸混合物0.2μL)。加入SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理后的PCR产物9μL进行单碱基延伸反应。使用的仪器为ABI9700型PCR仪。纯化的产物4000rpm离心4分钟，沉淀树脂后使用MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪转移至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上，进行MALDI-TOF质谱分析。其中，表1中SULT1A2和MXRA5基因的SNP设计特异性扩增引物和特异性延伸引物如表2所示。

表2两个易感SNP位点质谱法中的引物序列

2、基因型判读：采用TYPER4.0软件(sequenom)进行。

3、数据处理和分析：对基因分型数据进行如下质量控制：①样本检出率>90％，剔除基因型缺失率超过10％的样本；②位点检出率>90％，剔除基因型缺失率超过10％的位点；③检测准确率>99％；④对照组应通过哈迪-温伯格检验P>1.0E-4；⑤MAF>0.1％。

对经过数据质控后的SNPs进行单位点关联分析。采用相加遗传模型(additivemodel)，利用多元线性回归模型分析SNPs与肥胖相关数量性状体质指数(BMI)、体脂百分比(FMP)、腰围(WC)及腰围身高比(WHtR)的关联，用偏回归系数(β)和标准误(SE)表示每增加一个等位基因引起的BMI、FMP、WC及WHtR改变的单位值；比较每个SNP的三种基因型在病例组和对照组中分布频率的差异，并用多因素logistic回归模型分析SNPs与儿童不同肥胖表型的关联，关联强度用比值比(odds ratio，OR)和95％可信区间(confidence interval，CI)表示。年龄和性别作为协变量进行调整。当病例或对照个数小于5个时，采用Fisher精确概率检验。

4、结果：调整年龄和性别后，位于第16号染色体SULT1A2基因的非同义编码变异rs1059491(chr16:28603655，c.704A>C，p.N235T)与BMI(β＝1.93，P＝6.44×10^-18)和FMP(β＝3.35，P＝4.93×10^-13)在全基因组水平具有正向关联，且男女一致，控制错误发现率(FDR)校正多重检验后仍有统计学意义，结果见表3。多因素logistic回归分析同样显示rs1059491与一般性肥胖关联达到全基因组显著性水平，OR为2.28(95％CI：1.94-2.69，P＝2.57×10^-23)，经多重检验校正后，P值仍可达1.97×10^-21，结果见表4。

采用同样方法分析SNPs与腹型肥胖及其评价指标(WC和WHtR)的关联，结果显示X染色体MXRA5基因上的非同义变异(chrX:3241682，c.2044C>T，p.R682C)与女性BMI(β＝1.34，P＝0.006695)、WC(β＝4.70，P＝8.71×10^-7)及WHtR(β＝0.022，P＝0.0001234)均呈正向关联，结果见表3。该位点与女性腹型肥胖在全基因组水平也具有显著关联，OR为3.63(95％CI：2.49-5.29，P＝1.99×10^-11)，经Bonferroni校正和FDR方法校正多重检验后仍具有统计学意义(P＝1.32×10^-10)，结果见表4。

表3两个易感SNP与不同肥胖评价指标(BMI、FMP、WC和WHtR)之间的关联

表3注：调整年龄和性别，字体加粗表示P<0.05，*采用Benjamini和Hochberg建立的控制错误发现率方法校正多重检验后仍然P<0.05.Chr，染色体；Position：所在染色体位置；SNP，单核苷酸多态性；A1，主要等位基因；A2，较少等位基因；β，偏回归系数；SE，偏回归系数的标准误；BMI，体质指数；FMP，体脂百分比；WC，腰围；WHtR，腰围身高比。

表4两个易感SNP与儿童不同肥胖表型的关联

表4注：调整年龄和性别，字体加粗表示P<0.05，*采用Benjamini和Hochberg建立的控制错误发现率方法校正多重检验后仍然P<0.05.Chr，染色体；Position：所在染色体位置；SNP，单核苷酸多态性；A1，主要等位基因；A2，较少等位基因；OR，比值比；CI，可信区间。

实施例5应用SIFT和PolyPhen-2等程序预测SNP的蛋白功能

本发明对阳性关联的两个SNP位点，应用SIFT、PolyPhen-2和Mutation Taster等程序进行蛋白功能预测，SIFT结果显示rs1059491和rs768847893都是有害的，PolyPhen-2结果显示rs1059491和rs768847893都是非常有很能有害，两个位点预测结果都为致病性变异，具体信息参见表5。

表5两个SNP位点的功能预测结果

实施例6一代测序验证

应用Sanger测序技术对rs1059491和rs768847893两个阳性位点进行验证，结果显示该两个位点为真实存在的变异。Sanger测序交由北京诺赛基因组研究中心有限公司按照本领域技术人员已熟知的Sanger测序技术来完成，测序中所用引物信息如表6所示。

表6两个易感SNP位点一代测序引物序列

因此，本发明人证明了rs1059491能够很好地预测中国儿童一般性肥胖的罹患风险，rs768847893能够很好地预测中国女童腹型肥胖的罹患风险。实施例7用于儿童肥胖辅助诊断SNP试剂盒的制作

组装本发明所述的用于儿童肥胖的试剂盒，具体有如下三种方案：

试剂盒1：所述试剂盒包括特异扩增rs1059491位点在内的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

试剂盒2：所述试剂盒包括特异扩增rs768847893位点在内的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

试剂盒3：所述试剂盒包括特异扩增rs1059491位点在内的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，和扩增rs768847893位点在内的核苷酸序列的引物对如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

所述试剂盒还包括PCR试剂、对照样本和检测构象的电泳所需试剂。PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl₂，双蒸水，Taq酶等。所述电泳优选非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对照样本中包括易感SNP位点(1)AA纯合子的阴性对照样本和位点CC纯合子的阳性对照样本中的至少一个，另外同时还可以包括易感SNP位点(2)CC纯合子的阴性对照样本，和位点TT纯合子的阳性对照样本中的至少一个，此外还可以包括也可以不包括杂合子相应杂合子的对照样本。优选同时包括上述三类对照样本。待测样本扩增产物与对照样本的扩增产物同时电泳，比较其电泳结果可以得出待测样本中是否携带相应等位基因变异的检测结果。

此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其他组织样品，通过最精简和特异的引物对检测SNP，再通过SNP谱辅助判断肥胖，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高肥胖诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 首都儿科研究所

<120> 与中国儿童肥胖相关的单核苷酸多态性位点及其应用

<130> P1638

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcaggcttga ttcgcacact 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggcacgga agaagaccat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccagcgctcc ggattaatct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccagccgaga aagacacagt 20

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acgttggatg atgctgtggt ccatgaactc 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

acgttggatg acacgtcgtt caaggagatg 30

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agttcaagga gatgaagaag a 21

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgttggatg tcatcctcca cgatgtcttc 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acgttggatg tctggcttgc catccaaaag 30

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgccatccaa aagaggcaga 20

Claims

1.一种与中国儿童肥胖相关的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物包括以下中国儿童肥胖易感性SNP位点中的一种或两种：易感SNP位点(1)：rs1059491具体为chr16:28603655，c.704A>C，p.N235T；易感SNP位点(2)：rs768847893具体为chrX:3241682，c.2044C>T，p.R682C。

2.如权利要求1所述的生物标志物，其特征在于，所述肥胖包括一般性肥胖、体脂肥胖和腹型肥胖，所述一般性肥胖和体脂肥胖的评价指标为BMI和FMP，所述腹型肥胖的评价指标为WC和WHtR；所述易感SNP位点(1)主要与一般性肥胖、体脂肥胖相关，所述易感SNP位点(2)主要与腹型肥胖相关。

3.权利要求1或2所述生物标记物在制备预测中国儿童肥胖早期诊断试剂中的应用。

4.一种儿童一般性肥胖早期辅助检测试剂盒，其特征在于，其包括检测样本中易感SNP位点(1)rs1059491的基因型的试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测样本中易感SNP位点(2)rs768847893的基因型的试剂。

6.一种女性儿童腹型肥胖早期辅助检测试剂盒，其特征在于，其包括检测样本中易感SNP位点(2)rs768847893的基因型的试剂。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒评价女性儿童腹型肥胖的评价指标为BMI、WC和WHtR。

8.如权利要求4-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括利用测序法检测样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)基因型的试剂。

9.如权利要求4-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括利用Taqman探针SNP检测法检测样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)基因型的试剂。

10.如权利要求4-7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为利用PCR-单链构象多态性法检测样本中易感SNP位点(1)和/或易感SNP位点(2)基因型的试剂盒。