CN106811545B - 一种预测高甘油三酯血症的易感性的方法与试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种预测高甘油三酯血症的易感性的方法与试剂，属于生物技术领域。一种鉴定WNT蛋白家族成分10A基因多态性位点基因型的试剂在制备用于检测受试者的高甘油三酯血症的易感性的试剂中的用途，其包括：(1)在来自所述受试者的样本中测定WNT10A基因的rs147680216位点的基因型，以及(2)将所测定的基因型与参照基因型进行比较，其中与参照基因型相比的所述基因型的差异用于评价高甘油三酯血症的易感性。本发明优点是：首次阐明了WNT10A基因多态性位点与高甘油三酯血症的相关性，提供了一种预测高甘油三酯血症易感性的方法，该方法可用于高甘油三酯血症的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。

Description

一种预测高甘油三酯血症的易感性的方法与试剂
技术领域
本发明涉及一种预测高甘油三酯血症的易感性的方法与试剂，更具体的说是通过测定与高甘油三酯血症相关基因WNT10A的多态性预测受试者对于高甘油三酯血症的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物技术领域。
背景技术
高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia，HTG)是一种异族性甘油三酯蛋白合成或降解障碍。指血中的甘油三酯以乳糜微粒和前β-脂蛋白中含量升高，是冠心病、高血压、糖尿病等代谢综合征相关疾病发生的重要危险因素。
高甘油三酯血症主要有以下临床表现：
甘油三酯高的后果是容易造成“血稠”，即血液中脂质含量过高导致的血液粘稠，在血管壁上沉积，渐渐形成小斑块，即动脉粥样硬化。而血管壁上的这些块状沉积会逐渐扩大面积和厚度，使血管内径变小、血流变慢，血流变慢又加速了堵塞血管的进程，严重时血流甚至被中断。除了血流中断，阻塞物脱落还能造成血栓；甘油三酯高的后果无论发生在哪个部位，对人体损伤都很严重。如果在心脏，可引起冠心病、心梗；在大脑，可发生脑卒中、中风；发生在眼底，会导致视力下降、失明；如在肾脏，可引起肾衰；发生在下肢，则出现肢体血流不畅导致坏死。
高甘油三酯血症主要通过血液的生化检查来检测。
正常的甘油三酯水平：儿童<l00mg/dL(1.13mmol/L)，成人<150mg/dL(1.7mmol/L)，临界性高甘油三酯血症：250—500mg/dL(2.83-5.65mmol/L)，明确的高甘油三酯血症：大于500mg/dL(5.65mmol/L)。
本发明主要针对明确的高甘油三酯血症，即血清甘油三酯水平高于500mg/dL(5.65mmol/L)。
目前主要通过单核苷酸多态性(SNP)位点与甘油三酯水平之间的关联研究来寻找可预测个体高甘油三酯血症的遗传因子。
SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1％，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1％为同型碱基之间的转换：如G/A或T/C，29.1％为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C(胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T(胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多态性的80-90％，是最常见的遗传变异。
由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达三百万个。SNP以其密度高(平均每1kb就有1个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+/－或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。
本领域的研究显示，具体的某个SNP基因型与特定疾病的相关性和预期该疾病的易感性高低之间的关系是非常复杂的。即使是同一基因上的不同SNP位点，与某一疾病的相关性或易感性之间的关系也无从互相参考，甚至同一个SNP位点对于不同人种也存在着显著的甚至是质的差别。
本发明中，我们研究了WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因与高甘油三酯血症易感性的关系。WNT是一大类与胚胎发育，干细胞维持与分化，细胞增殖、迁移、极性决定、死亡及癌症发生有关的分泌型糖蛋白家族。多项研究发现WNT10A在肿瘤细胞中高表达。WNT10A与配体结合后，激活细胞内的β-catenin，促进β-catenin的蓄积和核转位，进而激活TCF/LEF信号通路，诱导核中c-myc和Cyclin D1的激活，从而调节胞内的各种生物学过程。多项研究发现WNT10A在肿瘤细胞中高表达，如肾癌，结直肠癌等。在肿瘤中，WNT10A可促进细胞的增殖和迁移能力。目前尚无关于WNT10A基因多态性位点与高甘油三酯血症相关联的研究报道。
发明内容
本发明中，我们首次发现了WNT10A基因第3外显子区rs147680216G/A多态性位点的基因型与高甘油三酯血症易感性之间的关系。通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的WNT10A基因第1外显子区rs147680216G/A多态性位点的基因型，能够预测受试者对高甘油三酯血症的易感性：WNT10A基因第3外显子区rs147680216G/A的基因型为GG时，受试者的易感性最低；携带A等位基因时，受试者的易感性升高。
本发明提供了一种分离核酸，具有SEQ ID NO:1所示的碱基序列，其+401位即是变异位点，以字母“R”标示出。该核酸序列为WNT10A rs147680216G/A位点侧翼序列。图1为WNT10A基因结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有4个外显子，rs147680216G/A位点标在WNT10A基因图中第3外显子区的相应位置。
本发明的主要目的是提供一种预测高甘油三酯血症易感性的方法。
本发明的的第二个目的是提供一种预测高甘油三酯血症易感性的系统。
本发明的第三个目的是提供一种预测高甘油三酯血症易感性的试剂，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种鉴定WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因多态性位点基因型的试剂在制备用于检测受试者的高甘油三酯血症的易感性的试剂中的用途，其包括：(1)在来自所述受试者的样本中测定WNT10A基因的rs147680216位点的基因型，以及(2)将所测定的基因型与参照基因型进行比较，其中与参照基因型相比的所述基因型的差异用于评价高甘油三酯血症的易感性。
所述的样品包括体液。
所述的体液包括外周血、血清、血浆、痰、滑液、房水、羊水、乳汁、精液、前列腺液、考珀液、女性射出液、汗液、排泄物、泪液、囊液、胸腔积液、腹水液、心包液、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、胰液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
一种评价高甘油三酯血症易感性的方法，接收包括受试者WNT10A基因rs147680216位点的基因型的相关数据，将所述受试者的基因型与被认为具有低易感性的参照基因型进行比较，以及在受试者的基因型与参照基因型不同的情况下发出警告信号。
一种用于评价高甘油三酯血症易感性的系统，包括接收器、数据库和处理器；其中，接收器用于接收包括受试者WNT10A基因rs147680216位点的基因型的相关数据,数据库中存储有被认为具有低易感性的参照基因型数据，处理器用于将受试者的WNT10A基因rs147680216位点的基因型的相关数据与参考基因型数据进行比较，以及在受试者的基因型与参照基因型不同的情况下发出警告信号。
所述参照基因型是指rs147680216位点的基因型为GG。该基因型为非风险等位基因。
一组用于评价高甘油三酯血症易感性的引物，为序列表SEQ ID NO:2和序列表SEQID NO:3所示的核苷酸序列。
一种评价高甘油三酯血症易感性的试剂盒，由下述试剂组成：
30μL 10×PCR缓冲液；
5μL 10mMdNTP混合液；
5μL TaqDNA聚合酶,浓度为2U/μL；
2.5μL F1引物，浓度为10pmol/μL，为为序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
2.5μL R1引物10pmol/μL，浓度为10pmol/μL，为为序列表SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
235μL纯水。
使用方法：
(1)通过PCR扩增WNT10A基因的第3外显子区部分片段，制备混合液：10×PCR反应缓冲液3μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pmol/L上游引物0.5μL，10pmol/L下游引物0.5μL，基因组DNA 2μL，加纯水至30μL。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸25s，总共35个循环，72℃总延伸2min。PCR前于每一体系中加入20μL的石蜡油，以防止液体挥发。
(2)基因型判定：将PCR产物直接测序，根据荧光信号的差异判定基因型。
本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如：体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含ADI1基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含ADI1基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。
本发明优先适用于测定根据WNT10A基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定WNT10A基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。
本发明的优点是：本发明首次阐明了WNT10A基因多态性位点与高甘油三酯血症的相关性，提供了一种预测高甘油三酯血症易感性的方法，该方法可用于高甘油三酯血症的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，以便公众对发明内容有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为WNT10A基因结构及其多态性变异位点的示意图
图2A为WNT10A rs147680216位点GG基因型测序结果
图2B为WNT10A rs147680216位点GA基因型测序结果
具体实施方式
用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下：
10×PCR缓冲液：10mM Tris-HCL(pH＝8.3)，0.5M氯化钾(KCL)，10mM氯化镁(MgCL)，0.01％(W/V)白明胶
dNTP：脱氧核苷三磷酸
EDTA：乙二胺四乙酸
TE：10mM Tris-HCI(pH＝7.5)，1mM EDTA(pH＝8.0)
实施例1血液样本收集和基因组DNA的提取
(1)按按中华医学会制订的诊断标准入选病例，共选取来自广西无血缘关系的高甘油三酯血症患者100例，同地区的健康对照志愿者148例。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》：人体医学研究的伦理原则。
(2)根据下列方法，制备人基因组DNA。①首先在已标号的1.5mLEP管中加1000μL红细胞裂解液，后加入400μLEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；②13000rpm离心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480μL核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20μL蛋白酶K(用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65℃孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块)；④拿出后降至室温，加300μL蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；⑤将上清液移至新EP管中，加入670μL预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；⑥弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670μL70％乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；⑦弃上清，使管内乙醇挥发干净；⑧加入TE溶液(400μL)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/μL，置于4℃备用，剩余基因组DNA置-20℃冰箱保存。
实施例2变异位点的识别鉴定
本发明采用PCR-测序分析法对WNT10A基因的第3外显子区的+401位点(其等位位点为T/C)的基因型进行检测。图2为WNT10A基因变异位点的测序图。
1、PCR-测序引物的确定
从Genebank中查取rs147680216G/A附近的DNA碱基序列(SEQ ID N0:1)，引物设计在Oligo7.0软件下完成。目的片段定位在WNT10A基因内，全长为330bp，确定了正义链F1(+198bp-+216bp)与反义链R1(+507bp-+527bp)，特异性引物序列如下：
F1：5’-GAAGCTGCACCGCTTACAAC-3’(SEQ ID N0:2)
R1：5’-TAACACAGTTCCCCAGTGGC-3’(SEQ ID N0:3)
2、PCR-测序反应体系及条件
通过PCR扩增WNT10A基因第3外显子区部分片段，PCR反应体系为：10×PCR反应缓冲液3μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，10pmol/L上游引物0.5μL，10pmol/L下游引物0.5μL，基因组DNA 1μL，加去离子水至30μL。PCR时于每一体系中加入20μL石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95℃预变性5min，95℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸25s，总共35个循环，72℃总延伸2min。
3、测序判定基因型
PCR产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察合格后送华大基因测序部进行测序验证。结果见图2A和图2B所示。
实施例3基因SNP与高甘油三酯血症的相关性
统计方法：运用Hardy-Weinberg平衡检验研究样本的群体代表性。利用SPSS11.0软件中Pearson卡方检验计算WNT10A基因rs147680216G/A位点的等位基因、基因型在高甘油三酯血症病例组与正常对照组间的分布频率，高甘油三酯血症的患病风险OR值及其95％CI可信区间，以P<0.05为差异显著性标准。
结果：位于2q35区域的WNT10A基因上rs147680216G/A位点的基因型和等位基因频率在病例与对照组间的分布详见表1。
表1：WNT10A(rs147680216 G/A)位点的基因型和等位基因频率在病例对照组间的分布
Figure GDA0002276599460000071
注：OR：比值比；CI：可信区间。*A等位基因为易患高甘油三酯血症的风险等位基因。受试者分为高甘油三酯血症的风险等位基因(GA)携带者，和非风险等位基因(GG)携带者。
由表1可见，WNT10A(rs147680216G/A位点)的A等位基因，即在其DNA互补链上为T等位基因，在患者群体中的分布频率显著高于其在健康正常人群中的等位基因分布频率(0.050vs.0.009)，具有显著性差异(P<0.001)，而且A位点的OR值为8.879，95％CI：2.464-31.989；在高甘油三酯血症的风险等位基因(GA)携带者和非风险等位基因(GG)携带者中，风险基因型在病例组中的分布频率显著高于对照组中的(P＝0.006)，均表明WNT10A基因rs147680216G/A位点与高甘油三酯血症患病呈正相关，可能增加高甘油三酯血症发病的风险。
实施例4检测试剂盒
制备检测高甘油三酯血症相关风险的试剂盒，包含有可扩增出WNT10A基因SNP+401位点的引物对，及其他PCR-HRM相应试剂。本发明试剂盒供10人份检测应用，于-20℃避光保存，其组分、含量和来源包括：
30μL 10×PCR缓冲液(Pharmacia),
5μL 10mMdNTP混合液(Pharmacia),
5μL TaqDNA聚合酶(2U/μL)(Takara)，
2.5μL F1引物(SEQ ID N0:2)(10pmol/μL)，
2.5μL R1引物(SEQ ID N0:3)(10pmol/μL)，
235μL纯水。
经PCR-测序检测后，可轻易检测出WNT10A基因第3外显子区rs147680216G/A多态性。
本发明具有实用性的例证：
本发明的WNT10A基因多态性的检测方法可用于分析人常染色体2q35区的WNT10A基因上的rs147680216A等位基因，即在其DNA互补链上为T等位基因，应用于对高甘油三酯血症的辅助性诊断和评估个体的高甘油三酯血症患病风险如何，以利于开展高甘油三酯血症的早期干预和治疗。
利用本发明阐述WNT10A基因rs147680216G/A位点的碱基变异，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节WNT10A表达的活性分子，促进高甘油三酯血症新药研发。
本发明建立的检测WNT10A基因多态性的核酸序列和高甘油三酯血症相关位点，可高灵敏度，特异性的应用于高甘油三酯血症基因辅助诊断的试剂盒。
如上所述，得出结论，WNT10A基因rs147680216G/A位点的多态性与高甘油三酯血症具显著相关性。因此，根据本发明测定此多态性，可用于高甘油三酯血症的基因辅助诊断。
本发明叙述了WNT10A基因高甘油三酯血症相关的新突变位点，并提供了一种测定WNT10A基因多态性的方法，而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定高甘油三酯血症相关基因多态性的基因辅助诊断方法。
序列表
<110> 北京医院
<120> 一种预测高甘油三酯血症的易感性的方法与试剂
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 801
<212> DNA
<213> 人属，人种
<220>
<221> R
<222> (401)..(401)
<223> R=A or G
<400> 1
ttctttgact ctgtttcctt gtgccagact ctcctgcata ctgggcttca gtttctcctt 60
ggaatgatga gaaaggtggg ctggagaatg gggtgtcaag gcccctccag agtccatgtg 120
ttctgggtct ttaaccacag gtttccgaga gagcgctttt gcctacgcca tcgcagcagc 180
tggcgtggtg cacgccgtgt ccaatgcgtg tgccctgggc aaactgaagg cctgtggctg 240
tgatgcgtcc cggcgagggg acgaggaggc cttccgtagg aagctgcacc gcttacaact 300
ggatgcactg cagcgtggta agggcctgag ccatggggtc ccggaacacc cagccctgcc 360
cacagccagc ccaggcctgc aggactcctg ggagtggggc rgctgcagcc ccgacatggg 420
cttcggggag cgcttttcta aggactttct ggactcccgg gagcctcaca gagacatcca 480
cgcgagaatg aggcttcaca acaaccgagt tgggaggcag gtgagagccc cacccctggg 540
tctgcttcaa atctctttgc ctagggccta ccccttgccc tggcctacct ctcttctgag 600
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gcagaaacaa gccctgttgc cctggatcag cataccacct gctgagcaac ctgcttctcc 780
tacttcctcg ggtgatcacc c 801
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，F1引物
<400> 2
gaagctgcac cgcttacaac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列，R1引物
<400> 3
taacacagtt ccccagtggc 20

Claims (6)

1.一种鉴定WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因rs147680216 G/A多态性位点基因型的试剂在制备用于检测受试者的高甘油三酯血症的易感性的试剂中的用途，其包括：(1)使用所述鉴定WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因rs147680216 G/A多态性位点基因型的试剂在来自所述受试者的样本中测定WNT10A基因的rs147680216位点的基因型，以及(2)将所测定的基因型与低易感性的参照基因型进行比较，其中与参照基因型相比的所述基因型的差异用于评价高甘油三酯血症的易感性；所述参照基因型是指rs147680216位点的基因型为GG。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的样本包括体液。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述的体液包括外周血、血清、血浆、痰、滑液、房水、羊水、乳汁、精液、前列腺液、考珀液、女性射出液、汗液、泪液、囊液、胸腔积液、腹水液、心包液、乳糜、胆汁、间质液、经血、脓液、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、胰液、支气管肺抽吸液、囊胚腔液或脐带血。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述鉴定WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因rs147680216G/A多态性位点基因型的试剂包括一组用于评价高甘油三酯血症易感性的引物，为序列表SEQ ID NO:2和序列表SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述鉴定WNT蛋白家族成分10A(WNT10A)基因rs147680216G/A多态性位点基因型的试剂组成如下：
30μL 10×PCR缓冲液；
5μL 10mM dNTP混合液；
5μL TaqDNA聚合酶,浓度为2U/μL；
2.5μL F1引物，浓度为10pmol/μL，为序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
2.5μL R1引物，浓度为10pmol/μL，为序列表SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
235μL纯水。
6.一种用于评价高甘油三酯血症易感性的系统，其特征在于：包括接收器、数据库和处理器；其中，接收器用于接收包括受试者WNT10A基因rs147680216位点的基因型的相关数据,数据库中存储有被认为具有低易感性的参照基因型数据，处理器用于将受试者的WNT10A基因rs147680216位点的基因型的相关数据与参考基因型数据进行比较，以及在受试者的基因型与参照基因型不同的情况下发出警告信号；所述参照基因型是指rs147680216位点的基因型为GG。
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