CN118291617A - 用于检测肺癌的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种用于检测肺癌的组合物及其用途，所述组合物包括：用于检测目标基因甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因中的一种、两种、或三种。本申请还提供了包括所述组合物的试剂盒，以及所述组合物在制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学领域，涉及基因检测，具体的是涉及一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物及其相应的试剂盒和用途。
背景技术
癌症是一种因细胞增殖性异常而导致的疾病，同时也是一个主要的公共健康难题。肺癌是全球发病率最高、死亡率最高的癌症之一。在我国，肺癌发病率、死亡率也居首位，是严重威胁人民健康的疾病之一。
肺癌发病隐匿，多数早期肺癌患者的癌灶未能及时被发现，大多肺癌病人被发现和确诊时疾病已进展为中晚期，失去手术或治疗的最佳机会，这也是肺癌死亡率高居不下的原因之一。根据国家癌症中心发表在《柳叶刀·全球健康》(Lancet Global Health)杂志中的研究，我国2012年到2015年确诊的肺癌患者总体5年生存率较低，为19.7％。肺癌患者往往处于晚期时才被发现和确诊，丧失了最佳的治疗时机。如果能早发现、早治疗，势必能有效的改善患者的预后，提高5年存活率、降低死亡率。但是，肺癌目前仍然缺乏理想的早期辅助诊断手段。
目前临床上应用于肺癌早期筛查和诊断的技术手段主要包括影像学检查、血液学检查和病理学检查等，但这些手段都存在一定的局限性：如通过手术或穿刺获取肺癌组织进行病理学检查是肺癌诊断的金标准，但存在操作难度大、对患者创伤性大以及组织检测异质性等问题；目前影像学检查主要是利用低剂量螺旋CT(LD-CT)进行胸部扫描，该技术能够通过提高早期肺癌的检出率而降低总体肺癌死亡率，但同时其较高的假阳性率和可能造成的辐射伤害等都引人担忧；临床上常用血清学的肿瘤标志物，如肺癌五项(CEA、CYFRA21-1、SCC、Pro-GRP、NSE)等，作为肺癌的辅助诊断手段，但这些传统的血清学肿瘤标志物对早期肺癌的检测灵敏度较低，无法满足早期筛查的要求。
近年来，越来越多的研究表明DNA甲基化与肺癌等疾病的发生发展息息相关。作为表观遗传学领域的研究重点之一，DNA甲基化是指基因组DNA序列上的CpG二核苷酸中的5’端胞嘧啶在DNA甲基转移酶的催化下转变为5’端甲基胞嘧啶的过程。目前已经证实抑癌基因启动子区域的异常高甲基化会抑制相应抑癌基因的转录，使基因表达减少或沉默，导致基因的抑癌功能减弱或缺失，进而促进肺癌的发生和发展。DNA的异常甲基化通常发生在癌症的超早期，是肿瘤生长的“种子”因素，并且随着癌症病程的发展，DNA的甲基化状态也会发生动态变化，可以直接反映肿瘤病灶的生长情况，因此，利用DNA甲基化检测进行肺癌早期筛查和辅助诊断具有巨大的应用潜力。
实现肺癌早筛的一条重要途径是基于基因测序技术的液体活检，其中检测用到的样本多为外周血中的循环游离DNA(Cell-free DNA，cfDNA)。cfDNA中一部分是由癌细胞凋亡或坏死过程中产生并释放的，称为循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA，ctDNA)，ctDNA上特定位点的甲基化异常即表征了癌症的发生和发展。因此，以血浆cfDNA为检测样本，配以对肺癌检测灵敏度高和特异性高的甲基化基因标志物，即可实现对肺癌的早期筛查和辅助诊断。
发明内容
基于此，针对现有肺癌检测技术存在的检测不便、假阳性高、灵敏度低、漏诊率高、成本高、不能早期诊断的问题，本申请提供了一种用于检测肺癌的组合物，本申请提供的组合物能够灵敏和特异地检测肺癌，本申请还提供了包含所述组合物的试剂盒以及其在检测肺癌中的用途。本申请提供的试剂盒具有良好的肺癌检测灵敏性和特异性，能够方便、快捷、有效地检测肺癌。
本申请提供了一种用于体外检测肺癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法，以及用于检测肺癌的用途。
具体来说，本申请涉及以下内容：
1.一种用于体外检测肺癌的组合物，所述组合物包括：
用于检测目标基因甲基化状态的核酸，
其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因靶序列的甲基化来表征，
其中，所述目标基因为PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因中的一种、两种或三种。
2.根据项1所述的组合物，其中，所述PTPRU基因的靶序列如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
3.根据项1所述的组合物，其中，所述PRKCB基因的靶序列如SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
4.根据项1所述的组合物，其中，所述GAREM2基因的靶序列如SEQ ID NO：9或SEQID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示。
5.根据项1～4中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
引物，所述引物为所述目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
6.根据项1～5中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因靶序列中的至少15个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
7.根据项1～6中任一项所述的组合物，其还包括：
将目标基因靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
8.根据项1-7中任一项所述的组合物，其中所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
9.根据项8所述的组合物，其中，
所述至少9个核苷酸的片段，其为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，或者其为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列，或者其为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列；
所述至少15个核苷酸的片段，其为SEQ ID NO：15的序列，或SEQ ID NO：18的序列，或SEQ ID NO：21的序列；
所述阻断剂的序列为SEQ ID NO：22的序列、SEQ ID NO：23的序列、或SEQ ID NO：24的序列。
10.一种用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：
所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
所述SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
所述SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
11.根据项10所述的寡核苷酸，其还包括：
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
12.根据项11所述的寡核苷酸，其还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
13.一种用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：
SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列。
14.根据项13所述的寡核苷酸，其还包括：
SEQ ID NO：15的序列。
15.根据项14所述的寡核苷酸，其还包括：SEQ ID NO：22的序列。
16.一种用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：
SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列。
17.根据项16所述的寡核苷酸，其还包括：
SEQ ID NO：18的序列。
18.根据项17所述的寡核苷酸，其还包括：SEQ ID NO：23的序列。
19.一种用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：
SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列。
20.根据项19所述的寡核苷酸，其还包括：
SEQ ID NO：21的序列。
21.根据项20所述的寡核苷酸，其还包括：SEQ ID NO：24的序列。
22.PTPRU基因在制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
23.PRKCB基因在制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
24.GAREM2基因在制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
25.一种试剂盒，其包括项1～9中任一项所述的组合物或包括项10～21中任一项所述的寡核苷酸。
26.根据项25所述的试剂盒，其还包含选自下述的至少一种其它组分：
三磷酸核苷、DNA聚合酶和所述DNA聚合酶功能所需的缓冲液。
27.根据项25或26所述的试剂盒，其还包含：说明书。
28.根据项1～9中任一项所述的组合物或项10～21中任一项所述的寡核苷酸在用于制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
29.根据项22-24以及28中任一项所述的用途，其中，所述用于体外检测肺癌的试剂盒通过包括如下步骤的方法来检测肺癌：
1)分离待测生物样品中的包括目标基因靶序列或其片段的DNA样品；
2)确定所述目标基因靶序列的甲基化状态；
3)通过所述目标基因靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对肺癌的体外检测。
30.根据项29所述的用途，其中，所述方法包括如下步骤：
提取待测生物样品的基因组DNA；
使用试剂处理提取的基因组DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；
将试剂处理过的DNA样品与DNA聚合酶和目标基因靶序列的引物接触，并在优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂的存在下进行DNA聚合反应；
用探针检测扩增产物；以及
基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。
31.根据项30所述的用途，其中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。
32.一种检测肺癌的方法，其包括如下步骤：
分离待测生物样品中的包括目标基因靶序列或其片段的DNA样品；
确定所述目标基因靶序列的甲基化状态；以及
通过所述目标基因靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对肺癌的体外检测。
33.一种检测肺癌的方法，其包括如下步骤：
提取待测生物样品的基因组DNA；
使用试剂处理提取的基因组DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；
将试剂处理过的DNA样品与DNA聚合酶和目标基因靶序列的引物接触，并在优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂的存在下进行DNA聚合反应；
用探针检测扩增产物；以及
基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。
34.根据项32或33所述的方法，其中，
所述目标基因为PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因中的一种、两种或三种。
35.根据项34所述的方法，其中，所述PTPRU基因的靶序列如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
36.根据项34所述的方法，其中，所述PRKCB基因的靶序列如SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
37.根据项34所述的方法，其中，所述GAREM2基因的靶序列如SEQ ID NO：9或SEQID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示。
38.根据项33所述的方法，其中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。
39.根据项33所述的方法，其中，所述引物为：
所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
所述SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
所述SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
40.根据项33所述的方法，其中，所述阻断剂为优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
41.根据项33所述的方法，其中，所述探针为：
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
42.根据项39所述的方法，其中，所述引物为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，或者其为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列，或者其为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列。
43.根据项40所述的方法，其中，所述阻断剂为SEQ ID NO：22的序列、SEQ ID NO：23的序列、或SEQ ID NO：24的序列。
44.根据项41所述的方法，其中，所述探针为SEQ ID NO：15的序列，或SEQ ID NO：18的序列，或SEQ ID NO：21的序列。
本申请具有以下有益效果：
通过检测PTPRU基因、PRKCB基因和/或GAREM2基因这三个肺癌甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测这3个基因的甲基化状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。通过对肺癌患者和正常对照个体的外周血样本的检测显示：本申请描述的组合物和检测方法能够灵敏和特异地检测肺癌，包括两种不同细胞类型的常见肺癌：腺癌和鳞癌，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。因此，本申请提供了一种可用于体外检测肺癌的组合物和检测方法，具有重要的临床应用价值。
本申请的其他特点和优势将由下面的具体说明和权利要求书作详细的描述。
附图说明
本申请的上述及其他特征将通过下面结合附图及其详细描述做进一步说明。应当理解的是，这些附图仅示出了根据本申请的若干示例性的实施方式，因此不应被视为是对本申请保护范围的限制。
图1是PTPRU基因在肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、正常人血浆游离DNA(cfDNA)和正常人白细胞(WBC)中的平均甲基化水平比较的结果图。
图2是PRKCB基因在肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、正常人血浆游离DNA(cfDNA)和正常人白细胞(WBC)中的平均甲基化水平比较的结果图。
图3是GAREM2基因在肺腺癌(LUAD)、肺鳞癌(LUSC)、正常人血浆游离DNA(cfDNA)和正常人白细胞(WBC)中的平均甲基化水平比较的结果图。
图4是使用本申请的组合物和检测方法对阳性对照样本(HeLa细胞系DNA与正常人白细胞的细胞系DNA的混合物，其中HeLa细胞系DNA处于高/全甲基化状态，可作为检测靶标；正常人白细胞的细胞系DNA处于低/非甲基化状态，可作为检测背景。每个PCR反应中HeLa细胞系DNA和正常人白细胞的细胞系DNA投入量分别为175pg和15.75ng)和阴性对照样本(正常人白细胞的细胞系DNA，正常人白细胞的细胞系DNA通常处于低/非甲基化状态，可作为阴性对照)的检测结果。结果显示：本申请提供的组合物和检测方法对阳性对照样本的检测结果为阳性，对正常人白细胞的细胞系DNA的检测结果为阴性，其中，图4(上)为对阳性对照样本中PTPRU、PRKCB和GAREM2基因的甲基化状态检测结果，图4(下)为对正常人白细胞的细胞系DNA中PTPRU、PRKCB和GAREM2基因的甲基化状态检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非特别指明，本申请所使用的试剂和材料均可通过商业途径获得。
除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和基因学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，1984版)；Animal CellCulture(R.I.Freshney，1987版)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR：The Polymerase Chain Reaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、探针、阻断剂和试剂盒可以采用本领域公知的标准技术制备。
除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本申请所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
定义
本申请的“癌症前期”表示处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。
本申请中的“严紧杂交条件”和“高度严紧”指的是探针与其靶子序列杂交的条件，典型的在核酸复杂的混合物中。严紧的条件是依赖于序列的，并且在不同的环境下是不同的。较长的序列在较高的温度中特异性的杂交。关于核酸杂交的详细的指导可以参考Tijssen，生物化学和分子生物学技术-核酸探针杂交，“杂交原理和核酸试验策略的回顾”。通常，严紧条件是在限定的离子强度pH下低于特定核酸的熔点(Tm)大约5-10℃。在Tm的温度(在所限定的离子强度，pH和核酸浓度)下，50％的和靶点互补的探针均衡地和靶点序列杂交。还可以通过增加去稳定剂来实现严紧条件。对于选择性或者特定的杂交，正信号为背景杂交的两倍，优选10倍。示例性的严紧杂交条件如下：在50％甲酰胺,5x SSC和1％的SDS的溶液中在42℃杂交，或者在5x SSC和1％的SDS的溶液中在65℃杂交，然后在0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中在65℃洗涤。
并且，如果核酸所编码的多肽是实质性相似的话，即使不能在严紧条件下杂交的核酸仍然是实质性相似的。这种情况下，典型地，核酸在中等严紧杂交条件下进行杂交。作为示例的，“中等严紧杂交条件”包括在40％甲酰胺，1M的氯化钠和1％的SDS的溶液中在37℃杂交，并且在1xSSC的溶液中在45℃洗涤。本领域的普通技术人员可以很显然地在现有技术中获得对于取得获得相同的严紧度的条件的指导。对于PCR而言，36℃左右的温度典型地适用于低度严紧扩增，而基于引物的长度，退火温度的范围则在32℃至48℃之间。对于高度严紧的PCR扩增，一般是在62℃，而基于引物的长度和特异性，高度严紧杂交的退火温度的范围则在50℃至65℃之间。对于高度严紧和低度严紧扩增的循环条件，典型的，包括：在90-95℃下持续变性阶段30秒至2分钟，持续退火阶段30秒至2分钟，在约72℃下持续扩展阶段1至2分钟。关于低度和高度严紧扩增反应的工具和指导可以在现有技术中获得。
本申请中的“寡核苷酸”指由两个或者两个以上的核苷酸构成的分子，优选为由三个以上的核苷酸构成的分子，其精确大小可以依靠许多因素，这些因素反过来又是由寡核苷酸的最终功能和用途决定的。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包括10个核苷酸至100个核苷酸的长度。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包括10个核苷酸至30个核苷酸的长度，或者可以具有20和25个核苷酸的长度。在一些特定的具体实施方式中，短于这些长度的寡核苷酸也是合适的。
本申请的“引物”表示当置于能诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诸如DNA或RNA聚合酶的诱发剂的存在下并且在合适的温度和pH下，能够作为合成起始点的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长而使其在诱发剂的存在下能引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，为了诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于约9、10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。参与确定引物合适长度的因素是本领域技术人员熟知的。
本申请的“引物对”表示与靶DNA分子相反链杂交或与侧翼连接待扩增的核苷酸序列的靶DNA区域杂交的引物对。
本申请的“引物位点”表示引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
本申请的“探针”，当涉及核酸序列时，以其通常含义使用，表示在规定条件下能与靶序列杂交并且可以用于检测该靶序列的存在的选择的核酸序列。本领域技术人员应当理解，在某些情况下，探针也可以用作引物，并且引物可以用作探针。
本申请的“DNA甲基化”是指甲基添加到胞嘧啶(C)的5位，这通常(但不必须)是在CpG(胞嘧啶之后为鸟嘌呤)二核苷酸的情况下。本文所用的“增加的甲基化程度”或“显著的甲基化程度”是指DNA序列中至少存在一个甲基化的胞嘧啶核苷酸，其中正常对照样品(例如从非癌细胞或组织样品提取的DNA样品或对DNA残基的甲基化进行处理的DNA样品)中对应的C是非甲基化的，在某些实施方案中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个C可以是甲基化的，其中对照DNA样品中的这些位置的C是非甲基化的。
在实施方案中，多种不同的方法可用于检测DNA甲基化改变。检测DNA甲基化的方法包括，例如，利用southern或聚合酶链反应(PCR)分析的甲基化敏感的限制性内切核酸酶(MSRE)测定、甲基化特异性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、重亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(MS-SSCA)、组合重亚硫酸氢盐限制分析(COBRA)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)、甲基化特异性熔解曲线分析(MS-MCA)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)。这些测定可以是PCR分析、利用荧光标记的定量分析或southern印记分析。
本申请的“甲基化测定”指确定DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
本申请的“检测”表示观察生物样品中的标志物或标志物改变(例如标志物甲基化状态的改变或核酸或蛋白序列的表达水平)的任何过程，无论实际上是否检测到标志物或标志物改变。换言之，探测样品的标志物或标志物改变的行为是“检测”，即使标志物被测定为不存在或低于灵敏度水平。检测可以是定量、半定量或非定量观察，并且可以基于与一个或多个对照样品的比较。应当理解，检测本文公开的肺癌包括检测癌症前期细胞，所述癌症前期细胞开始发展为肺癌细胞或将要发展为肺癌细胞，或具有增加的发展为肺癌细胞的倾向。检测肺癌还可以包括检测可能的死亡概率或疾病条件的可能的预后。
本申请的“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个核酸分子之间的序列相似性。可以比较每个序列中的位置来测定“同源性”、“同一性”或“相似性”，为了比较的目的可以将所述序列进行比对。当比较的序列中的等同位置被相同碱基占据时，所述分子在该位置是相同的；当等同位点被相同或相似氨基酸(例如，在空间性质或带电性质上相似)残基占据时，所述分子可以称为在该位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性百分比的表达是指比较的序列所共享的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本申请的序列共享小于40％同一性，优选小于25％同一性。在比较2个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或多余残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具体实施方案中，对于两个或更多个序列或子序列，按照使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法进行测定或通过例如国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information(NCBI))在线提供的手动比对和肉眼检查进行测定，当在比较窗或指定区域上为最大对应性进行比较和比对时，如果它们的序列在规定的区域上同一性为约60％，或约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，可以认为是基本或显著同源的、相似的或同一的。该定义也涉及或可以用于测试序列的互补物。因此，在本文背景允许的程度下，例如，如果核苷酸序列可以被预测为天然存在于DNA双链体中，或可以以互补链中的一条或两条的形式天然存在，则与规定靶序列或其变体互补的核苷酸序列自身被视为与靶序列是“相似的”，并且当涉及“相似的”核酸序列时，包括单链序列、其互补序列、双链的链复合物、能够编码相同或相似多肽产物的序列、以及上述任意一项的任何容许的变体。相似性必须限制为单一核酸链序列的分析的情况可以包括例如细胞中特定RNA序列或编码序列的表达的检测和定量。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在实施方案中，同一性或相似性可以是在长度为至少约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25或更多核苷酸的区域上，或在长度为多于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或多于约100个核苷酸的区域上。
本申请的“扩增”表示由核酸的一个具体基因座得到多个拷贝的过程，所述核酸例如基因组DNA或cDNA。可以使用多种已知手段中的任何一种实现扩增，所述手段包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、基于转录的扩增和链置换扩增(SDA)。
本申请的“基于荧光的实时PCR”表示这样的方法：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在该PCR技术中，有一个很重要的概念，循环阈值，也称为Ct值。C代表Cycle，t代表threshold(阈值)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。例如，荧光阈值(threshold)的设定方法如下：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
本申请的“实时PCR的cut off值”表示针对某一个生物标记物的判断样本阴阳性的一个临界Ct值。根据本申请的某些具体实时方式，“临界Ct值(Cut Off值)是根据一定数量的样本数据，基于统计学处理而得到的”，该临界Ct值可以根据所需要的灵敏度或特异性的要求不同而不同。
本申请的“灵敏度”表示从一定癌症样本中检测出癌症的比例，其计算公式为：灵敏度＝(检测到的癌症/所有的癌症)，而“特异性”表示一定正常人样本中检测出正常的比例，其计算公式为特异性＝(未检测到的阴性/总的阴性)。
本申请的“标记”或“可检测的部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制备为可检测的蛋白，例如，通过将放射性标记并入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。
可以使用多种不同方法检测核酸分子。核酸检测方法包括，例如，PCR和核酸杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹或原位杂交)。具体而言，能够扩增靶核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用于PCR反应。PCR方法通常包括以下步骤：获得样品、从所述样品分离核酸(例如，DNA、RNA或两者)和使所述核酸与一种或多种寡核苷酸引物接触，所述引物在能使模板核酸扩增发生的条件下特异性地与模板核酸杂交。在模板核酸的存在下，产生扩增产物。核酸扩增和扩增产物检测的条件是本领域技术人员已知的。已开发出多种对于基础PCR技术的改进，包括但不限于，锚定PCR、RACE PCR、RT-PCR和连接酶链式反应(LCR)。扩增反应中的引物对必须与模板核酸的相对链退火，并且应该彼此保持合适的距离，使得聚合酶能有效地跨过区域进行聚合并使得可以例如使用电泳来容易地检测扩增产物。例如，可以使用诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)的计算机程序来设计寡核苷酸引物，以助于设计具有相似熔解温度的引物。通常，寡核苷酸引物长度为9-30或40或50个核苷酸(例如，长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)，但是寡核苷酸引物可以更长或更短，只要使用合适的扩增条件。
通常使用可检测的标记实现扩增产物或杂交复合物的检测。术语“标记”，当涉及核酸时，意图包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至核酸的核酸直接标记，以及通过与直接标记了可检测的物质的另一试剂进行反应的核酸间接标记。可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；冷光材料的实例包括鲁米诺；生物冷光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母蛋白。间接标记的实例包括用生物素将核酸进行末端标记，使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测该核酸。
概述
一方面，本申请提供了一种用于体外检测肺癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的靶序列内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因靶序列的甲基化来表征，其中，所述目标基因为PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因中的一种、两种或三种。
本申请提供了一组在肺癌中发出异常甲基化的目标基因靶序列，包括PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2的靶序列，PTPRU基因的靶序列如SEQ ID NO：1-4中任一个所示，PRKCB基因的靶序列如SEQ ID NO：5-8中任一个所示，GAREM2基因的靶序列如SEQ ID NO：9-12中任一个所示。
本领域技术人员也可以理解，所述PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2的靶序列并不局限于上述列出的具体的序列。PTPRU基因的靶序列应该涵盖与SEQ ID NO：1-4中任一个所示的序列相比，包含一个或两个或三个以上的核苷酸突变，但实质上仍然与其实质功能相同的序列，也包含与SEQ ID NO：1-4中任一个所示的序列相比，具有95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。PRKCB基因的靶序列应该涵盖与SEQ ID NO：5-8中任一个所示的序列相比，包含一个或两个或三个以上的核苷酸突变，但实质上仍然与其实质功能相同的序列，也包含与SEQ ID NO：5-8中任一个所示的序列相比，具有95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。GAREM2的靶序列应该涵盖与SEQ ID NO：9-12中任一个所示的序列相比，包含一个或两个或三个以上的核苷酸突变，但实质上仍然与其实质功能相同的序列，也包含与SEQ ID NO：9-12中任一个所示的序列相比，具有95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
PTPRU基因的靶序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：1
PTPRU基因的靶序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：2
PTPRU基因的靶序列的互补序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：3
PTPRU基因的靶序列的互补序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：4
PRKCB基因的靶序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：5
PRKCB基因的靶序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：6
PRKCB基因的靶序列的互补序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：7
PRKCB基因的靶序列的互补序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：8
GAREM2基因的靶序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：9
GAREM2基因的靶序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：10
CGCGTCGAGCGTTTGGTGCGCGATAGCGTTTTTTATTGTCGCGAGCGTTTCGATTTCGACGAGTATTTTACGGTCGTGCGCGAGGCGTTAGCGGAGTTCGTCGAAGATTGCGTTAGTTCGCGTCGCGCGCGTTTTTGTTTGTTCGCGTCGCGCGTTTTCGGGTTCGTTCG
GAREM2基因的靶序列的互补序列(5’-3’)如下：
SEQ ID NO：11
CGGGCGAGCCCGGGGGCGCGCGGCGCGGGCAGGCAGAGGCGCGCGCGGCGCGGGCTGGCGCAGTCTTCGGCGAGCTCCGCTGGCGCCTCGCGCACGGCCGTGGAGTACTCGTCGGGGTCGAAGCGCTCGCGGCAGTAGGAGGCGCTGTCGCGCACCAGGCGCTCGACGCGCGGGTCCCCGGCCAGCAGGCCCTGCGGCAGCGCGAAGCGCGGCGTGTCCGTGAGCAGCAGGAAGTGCAGCGGCGCCGGGCCCTCGCGGCGCAGCGCCAGCCCCAGCACCACCGTCTTGGAGATGATGCTA
GAREM2基因的靶序列的互补序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：SEQID NO：12
CGGGCGAGTTCGGGGGCGCGCGGCGCGGGTAGGTAGAGGCGCGCGCGGCGCGGGTTGGCGTAGTTTTCGGCGAGTTTCGTTGGCGTTTCGCGTACGGTCGTGGAGTATTCGTCGGGGTCGAAGCGTTCGCGGTAGTAGGAGGCGTTGTCGCGTATTAGGCGTTCGACGCGCGGGTTTTCGGTTAGTAGGTTTTGCGGTAGCGCGAAGCGCGGCGTGTTCGTGAGTAGTAGGAAGTGTAGCGGCGTCGGGTTTTCGCGGCGTAGCGTTAGTTTTAGTATTATCGTTTTGGAGATGATGTTAPTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因的靶序列及相关序列如表1所示：
表1：PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因的靶序列及相关序列
优选地，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括目标基因靶序列中的至少9个核苷酸的片段，其中所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。在某些优选实施方式中，如使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括目标基因靶序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段，优选至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
更优选地，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因靶序列中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。在某些优选实施方式中，如使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括在中等严紧或严紧条件下，杂交于目标基因靶序列进行亚硫酸氢盐转化后序列中的至少15个核苷酸的片段，优选至少16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
优选地，所述组合物还包括将目标基因靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。更优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐。
优选地，用于检测目标基因甲基化状态的核酸还包括优先与处于非甲基化状态的DNA结合的阻断剂。
优选地，所述组合物包括如表2中所示的最佳引物、探针和/或表4中所示阻断剂中的一种或多种：
表2：本申请使用的最佳引物和探针序列
| 序列编号 | 序列名称 | 具体核苷酸序列(5’-3’) |
| SEQ ID NO：13 | PTPRU_F | TCGCGCGGTGTAGTAGG |
| SEQ ID NO：14 | PTPRU_R | CGAAAAATCCCGATCTCGC |
| SEQ ID NO：15 | PTPRU_P | CGGTTAAATGGGGTTCGGG |
| SEQ ID NO：16 | PRKCB_F | ATTTTTTGTAGTTATTGTATCG |
| SEQ ID NO：17 | PRKCB_R | AAAAAATCCCTAACGCGA |
| SEQ ID NO：18 | PRKCB_P | CGCGCGTAGGGTATTTTTTCGG |
| SEQ ID NO：19 | GAREM2_F | GAGTATTTTACGGTCGTGC |
| SEQ ID NO：20 | GAREM2_R | ACGCGAACTAACGCAAT |
| SEQ ID NO：21 | GAREM2_P | TTCGACGAACTCCGCTAACG |
表2中的“F”表示正向引物；“R”表示反向引物；“P”表示探针。
表3：本申请使用的探针序列的一种荧光标记方式
| 序列编号 | 序列名称 | 具体核苷酸序列(5’-3’) | 5’标记 | 3’标记 |
| SEQ ID NO：15 | PTPRU_P | CGGTTAAATGGGGTTCGGG | FAM | BHQ1 |
| SEQ ID NO：18 | PRKCB_P | CGCGCGTAGGGTATTTTTTCGG | VIC | BHQ1 |
| SEQ ID NO：21 | GAREM2_P | TTCGACGAACTCCGCTAACG | Cy5 | BHQ3 |
表4：本申请采用的阻断剂
| 序列编号 | 序列名称 | 具体核苷酸序列(5’-3’) |
| SEQ ID NO：22 | PTPRU_B | CAATCTCACTCTAACCCAAACCCCATTTAACCAT |
| SEQ ID NO：23 | PRKCB_B | AACACAACACTACCCTCAAAAACCCAAAAAAATACCCTACACA |
| SEQ ID NO：24 | GAREM2_B | TGGTTGTGTGTGAGGTGTTAGTGGAGTTTGTTG |
表4中“_B”表示阻断剂。
另一方面，本申请提供用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：SEQ ID NO：1或SEQID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
优选地该用于体外检测肺癌的寡核苷酸包括：对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段；和/或对SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或对SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
本申请的用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其还包括：在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
优选地该用于体外检测肺癌的寡核苷酸包括：在中等严紧或严紧条件下杂交于对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或在中等严紧或严紧条件下杂交于对SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6或SEQID NO：7或SEQ ID NO：8或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段；和/或在中等严紧或严紧条件下杂交于对SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或SEQID NO：11或SEQ ID NO：12或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
本申请的用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其还包括：优先与处于非甲基化状态的DNA结合的阻断剂。
在一个具体的实施方式中，用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列。其还包括：SEQ ID NO：15的序列。其还包括：SEQ ID NO：22的序列。
在另一个具体的实施方式中，用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的序列。其还包括：SEQ ID NO：18的序列。其还包括：SEQ ID NO：23的序列。
在另一个具体的实施方式中，用于体外检测肺癌的寡核苷酸，其包括：SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列，其还包括：SEQ ID NO：21的序列。其还包括：SEQ ID NO：24的序列。
另一方面，本申请提供了包括所述组合物的试剂盒。该试剂盒还包含选自下述的至少一种其它组分：三磷酸核苷、DNA聚合酶和所述DNA聚合酶功能所需的缓冲液。
本申请还涉及PTPRU基因和/或PRKCB基因和/或GAREM2基因在制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
其中，所述PTPRU基因，英文名称protein tyrosine phosphatase，receptortype，U，位于人类的第1号染色体的p35.3区域，编码一种酪氨酸磷酸酶，属于酪氨酸磷酸酶家族[protein tyrosine phosphatase(PTP)family]。酪氨酸磷酸酶能够作为一类信号分子调控一系列的细胞过程，包括细胞生长、细胞分化、细胞周期和致癌转化等。本基因编码的酪氨酸磷酸酶包含一个胞外结构域、一个跨膜结构域和两个胞内催化结构域，是一种受体型酪氨酸磷酸酶，可能在细胞间识别和粘附过程中发挥作用。
所述PRKCB基因，英文名称protein kinase C beta type，位于人类第16号染色体p12区域，属于蛋白激酶C家族[Protein kinase C(PKC)family]，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该家族成员能够磷酸化多种靶标蛋白，进而参与调控不同的细胞信号途径；同时，该家族成员还是佛波酯(一类促癌因子)的主要受体，参与调控癌症的发生发展。家族中不同成员具有不同的表达谱，且在细胞中发挥不同的作用。本基因编码的蛋白激酶C具有多重细胞功能，包括B细胞活化、诱导细胞凋亡、内皮细胞增殖和肠道糖类吸收等。
所述GAREM2基因，英文名称GRB2-associated and regulator of MAPK protein2，位于人类的第2号染色体的p23.3区域，编码一种衔接蛋白，在细胞表面上皮生长因子受体和MAPK/ERK信号途径之间起到连接作用。通常通过响应细胞表面上皮生长因子受体和/或胞质酪氨酸激酶的刺激信号，引起胞内的信号级联反应，激活MAPK/ERK信号转导途径，参与调控细胞增殖等过程。
再一方面，本申请提供了一种体外检测肺癌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)分离待测生物样品中的目标基因靶序列或其片段；
2)确定所述目标基因靶序列的甲基化状态；
3)通过所述目标基因靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对肺癌的体外检测。
根据某些优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：
1)提取待测生物样品的基因组DNA；
2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即目标基因靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；
3)将经步骤2)处理过的DNA样品与DNA聚合酶和所述目标基因靶序列的引物接触，使得所述经处理的目标基因靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的目标基因靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的目标基因靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；
4)用探针检测扩增产物；以及
5)基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。
优选地，典型的引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1-4中任一个、SEQ ID NO：5-8中任一个和SEQ ID NO：9-12中任一个的至少9个核苷酸的片段。
优选地，典型的探针包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NO：1-4中任一个、SEQ ID NO：5-8中任一个和SEQ ID NO：9-12中任一个的至少15个核苷酸的片段。
优选地，典型的阻断剂其为优先与处于非甲基化状态的DNA结合的阻断剂。
优选地，所述引物、探针中的一种或多种如前述表2所示。所述阻断剂中的一种或多种如前述表4所示。
并且，所述接触或扩增包括使用至少一种如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
据某些优选实施方式，所述目标基因靶序列中至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由实时PCR反应的临界Ct值确定的。通过利用实时PCR反应分析生物样本中DNA的方法，能方便地实现针对目标基因靶序列甲基化状态的检测，并且能根据PCR反应的临界Ct值来快速、便捷地判断受检样本是否呈阳性，因而提供了一种无创、快速的肺癌体外检测方法。
所述的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。优选的生物样品为血浆。
本申请还提供了包括所述组合物的试剂盒。典型地，所述试剂盒包括用于容纳患者生物样品的容器。并且，所述试剂盒也包括使用和解释检测结果的说明。
本申请提供了一种通过检测目标基因靶序列的甲基化状态，体外无创检测肺癌的方法。本发明人发现，在肺癌组织中PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因靶序列的甲基化状态和正常肺组织的所述基因靶序列的甲基化状态存在显著性差异：在肺癌组织中，PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因靶序列发生甲基化，而在正常肺组织中，PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因靶序列不发生甲基化。因此本申请提供了一种通过检测样本中的PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因靶序列甲基化状态对肺癌进行体外检测的方法，本申请提供的方法能够无创、快速地检测肺癌。
本申请还提供一种能够灵敏和特异地检测目标基因靶序列甲基化状态的组合物；以及一种可用于体外无创检测肺癌的方法和试剂盒。
下述描述为本申请的组合物、试剂盒、核酸序列以及检测方法的实施例。
在某些实施方式中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。优选地，该试剂是亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰。5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应；在随后的碱性水解后，没有甲基化的胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶；但在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。由此原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的5-甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。因此，典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定目标基因靶序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。此外，本申请的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG二核苷酸序列的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG二核苷酸序列的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)，而不是甲基化状态。相应地，术语甲基化状况或甲基化状态还应被认为是指反映CpG二核苷酸序列甲基化状态的值。
在某些实施方式中，本申请的方法具体包括：1)提取待测生物样品的基因组DNA；2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即目标基因靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；3)将经步骤2)处理过的DNA样品与DNA聚合酶和所述目标基因靶序列的引物接触，使得所述经处理的目标基因靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的目标基因靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的目标基因靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；4)用探针检测扩增产物；5)以及基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG-二核苷酸的甲基化状态。
典型地，所述接触或扩增包括使用至少一种如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用PCR；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。优选地，用PCR方式来测定甲基化状态，诸如“基于荧光的实时PCR技术”、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)等测定方法被用于测定目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作。简言之，“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增水平以及在荧光检测扩增水平上产生序列差别。“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化状态的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的CpG二核苷酸的荧光探针存在下，PCR反应提供了甲基化特异的扩增。用于起始DNA量的无偏移对照由以下反应提供：其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸。“基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等。TaqMan探针为荧光报道物(RPRKCBrter)和淬灭分子(Quencher)双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂可以包括，但不限于：用于目标基因靶序列PCR引物；非特异扩增阻断剂；TaqMan或Lightcycler探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶等。
实施例
实施例1
通过分析413例肺腺癌组织样本及332例肺鳞癌组织样本与656例正常人WBC(白细胞)样本和23例正常人血浆样本的全基因组甲基化芯片(Illumina公司的HumanMethylation450k芯片)数据进行对比分析，本申请人发现PTPRU、PRKCB和GAREM2基因在肺腺癌和肺鳞癌组织中的甲基化率显著高于正常人血浆和正常人WBC(结果如图1-3所示)。
进一步地，本申请人通过分析PTPRU、PRKCB和GAREM2基因在全基因组甲基化芯片上的探针序列及相应的甲基化率数据，发现了这三个目标基因在肺癌组织和正常人WBC和血浆样本中甲基化差异最明显的序列片段，从而确定为这三个目标基因的靶序列。PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因的靶序列及相关序列如前面表1所示。
实施例2
根据PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因的靶序列设计引物、探针和阻断剂，设计的最佳引物探针序列如表2和表5所示；阻断剂序列如前述表4所示：
表5：针对PTPRU、PRKCB和GAREM2基因的最佳引物和探针
| 序列编号 | 序列名称 |
| SEQ ID NO：13 | PTPRU_F |
| SEQ ID NO：14 | PTPRU_R |
| SEQ ID NO：15 | PTPRU_P |
| SEQ ID NO：16 | PRKCB_F |
| SEQ ID NO：17 | PRKCB_R |
| SEQ ID NO：18 | PRKCB_P |
| SEQ ID NO：19 | GAREM2_F |
| SEQ ID NO：20 | GAREM2_R |
| SEQ ID NO：21 | GAREM2_P |
正常人白细胞的细胞系DNA通常处于低/非甲基化状态，可作为阴性对照，本实施方案中所用的DNA量为15.75ng/反应；Hela细胞系DNA处于高/全甲基化状态，本实施方案中以HeLa细胞系DNA和正常人白细胞的细胞系DNA的混合物为阳性对照，其中每个PCR反应中HeLa细胞系DNA和正常人白细胞的细胞系DNA的投入量分别为175pg和15.75ng。
将DNA样本首先进行亚硫酸氢盐转化，以转化后的BisDNA(亚硫酸氢盐转化的DNA)为模板，利用上述引物探针进行实时PCR扩增。以β肌动蛋白(ACTB)基因为内参，通过使用与β肌动蛋白基因序列互补的引物来创建β肌动蛋白基因扩增子，并且用特定的探针检测β肌动蛋白基因扩增子。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行两次或三次实时PCR检测。
采用本申请的引物以及扩增酶扩增经处理的DNA的片段时，可在同一个反应容器中同时进行几种DNA片段的扩增。优选地，所述扩增产物的长度为100至2,000个碱基对。当所要检测的生物样本的基因组DNA是处于甲基化和非甲基化状态的混合物时，尤其是在处于甲基化状态的DNA远远少于处于非甲基化状态的DNA的情况下，如：癌症患者血浆游离DNA，为了提高PCR扩增引物的扩增特异性，本申请采用了在PCR反应体系中使用目标基因靶序列特异的阻断剂。阻断剂核苷酸序列的5’端与正向(F)或者反向(R)引物的3’端核苷酸序列有大于或等于5个核苷酸的重叠区域；阻断剂与正向(F)或者反向(R)引物互补于目标基因靶序列DNA的同一条链；阻断剂的解链温度高于正向(F)或者反向(R)引物超过(包括)5℃；阻断剂的核苷酸序列包含至少一个CpG二核苷酸序列，并与亚硫酸氢盐转化后的未发生甲基化的目标基因靶序列DNA的序列互补。因此，当所要检测的生物样本的基因组DNA是处于甲基化和非甲基化状态的混合物时，尤其是在处于甲基化状态的DNA远远少于处于非甲基化状态的DNA的情况下，处于非甲基化状态的DNA经亚硫酸氢盐转化后，会优先与阻断剂相结合，从而抑制DNA模板与PCR引物结合，因而不发生PCR扩增，而处于甲基化状态的DNA不与阻断剂相结合，因而与引物结合，发生PCR扩增。之后，直接或间接地检测通过扩增获得的片段。优选的是标记物为荧光标记物、放射性核素或可附着的分子片段的形式。
表6：本申请所用PCR体系的一种组成
表6中的“_F”表示正向引物；“_R”表示反向引物；“_P”表示探针；“_B”表示阻断剂。
在本申请中，可以利用各种商业用实时PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行实时PCR的检测。根据某些具体实施方式，在Life Technologies仪器(7500)上进行实时PCR的检测。PCR反应混合物由经亚硫酸氢盐转化的DNA模板25pg-100ng和300-600nM引物和阻断剂、150-300nM探针、1-10UTaq聚合酶、50-400μM的各个dNTP、1至10mM的MgCl2和ddH2O至最终的20μl至100μl的体积，优选50μl的体积。本申请所用的PCR体系的一种组成如表6所示。在90至99℃持续3-60分钟，以用预循环扩增样品，紧接着在50至72℃进行1至30秒的35-55个循环的退火，在50至72℃下退火及延伸5至90秒，在90至99℃下变性5至90秒。其中采用的DNA模板可根据需要添加内参基因，以及阳性对照或阴性对照。所用的优选PCR扩增程序为：94℃，20min；(93℃，30s；65℃，35s-读取荧光信号)45个循环；40℃，10s。
结果如图4所示，当以阳性对照样本为模板时，PTPRU、PRKCB和GAREM2基因均能够有效扩增；而当以低/未甲基化的DNA为模板时，除内参基因ACTB外，其余目的基因均无扩增。
实施例3
3.1以16例肺癌组织样本(肺腺癌和肺鳞癌各8例)和24例正常人WBC样本为检材，提取基因组DNA，经亚硫酸氢盐转化为BisDNA，以10ng/反应的模板量，按照实施例2中的PCR反应体系和反应程序对PTPRU、PRKCB和GAREM2基因的甲基化进行检测。所述DNA的提取和处理可以采用现有技术中的任何标准手段来进行，具体而言，在本实施例中，所有的样品DNA的提取和亚硫酸氢盐DNA修饰是通过使用博尔诚公司的血浆处理试剂盒提取的。
最后测得16例肺癌组织和24例正常人WBC样本对于目的基因靶序列的实时PCR的Ct值(cutoff值)。根据PCR结果，三个基因Ct值(cut off值)的临界值均选择Ct＝37，如表7所示，利用PTPRU、PRKCB和GAREM2基因单独检测肺癌的灵敏度分别为75％、37.5％和25％；三个基因联合判读的灵敏度达到87.5％。目的基因靶序列的甲基化具有良好的特异性，PRKCB和GAREM2的特异性均达到100％，PTPRU的特异性为95.8％，因此联合判读的特异性也为95.8％，结果如表8所示。
表7：利用PTPRU、PRKCB和/或GAREM2基因检测肺癌的灵敏度
表8
表8中特异性的计算公式：特异性＝检测到的阴性数/总的阴性数，如表8中第三列PTPRU的特异性为检测到的阴性数23除以总的正常样本数24，即23/24＝95.8％。
3.2以12例肺癌和20例正常人血浆样本(3.5mL)为检材，提取血浆游离DNA，经亚硫酸氢盐转化为BisDNA，按照实施例2中的PCR反应体系和反应程序对PTPRU、PRKCB和GAREM2基因的甲基化进行检测。结果如表9所示，利用PTPRU、PRKCB和GAREM2基因单独检测肺癌的灵敏度分别为58.3％、50％和33.3％；三个基因联合判读的灵敏度达到75％。目的基因靶序列的甲基化具有良好的特异性，PRKCB和GAREM2的特异性均达到100％，PTPRU的特异性为95％，因此联合判读的特异性也为95％，结果如表10所示。
表9：利用PTPRU、PRKCB和/或GAREM2基因检测肺癌的灵敏度
表10
上述实验结果表明了目标基因靶序列的甲基化DNA是肺癌的一种标识物。通过本申请的目标基因靶序列甲基化DNA检测，可以实现体外无创检测肺癌，并能够提高肺癌的检出率。
综上所述，本申请利用以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过检测目标基因靶序列及其片段的甲基化的核酸序列，实现了利用目标基因靶序列甲基化生物标记物来对肺癌进行体外检测，从而有效提高了肺癌体外检测的灵敏度并保持了检测的高特异性。通过利用实时PCR分析血浆样本游离DNA的方法，能够方便地实现针对目标基因靶序列甲基化状态的检测，并且能够根据实时PCR的Ct值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，提供了一种无创、便捷的肺癌体外检测方法。
尽管在此公开了本申请的各个方面和实施例，但其他方面和实施例对于本领域技术人员而言也是显而易见的。在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，而非限制目的。
Claims (10)
1.一种用于体外检测肺癌的组合物，所述组合物包括：
用于检测目标基因甲基化状态的核酸，
其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因靶序列的甲基化来表征，
其中，所述目标基因为PTPRU基因、PRKCB基因和GAREM2基因中的一种、两种或三种。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述PTPRU基因的靶序列如SEQ ID NO：1或SEQID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述PRKCB基因的靶序列如SEQ ID NO：5或SEQID NO：6或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述GAREM2基因的靶序列如SEQ ID NO：9或SEQID NO：10或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
引物，所述引物为所述目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因靶序列中的至少15个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的组合物，其还包括：
将目标基因靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中，
所述至少9个核苷酸的片段，其为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列，或者其为SEQID NO：16和SEQ ID NO：17的序列，或者其为SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的序列；
所述至少15个核苷酸的片段，其为SEQ ID NO：15的序列，或SEQ ID NO：18的序列，或SEQ ID NO：21的序列。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的组合物在用于制备用于体外检测肺癌的试剂盒中的用途。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118291617A true CN118291617A (zh) | 2024-07-05 |
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