CN117305450A - 用于检测膀胱癌相关基因甲基化的核酸组合物及其相应的试剂盒和用途 - Google Patents

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CN117305450A CN202311160140.0A CN202311160140A CN117305450A CN 117305450 A CN117305450 A CN 117305450A CN 202311160140 A CN202311160140 A CN 202311160140A CN 117305450 A CN117305450 A CN 117305450A
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吴振
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    • C12Q2600/154—Methylation markers

Abstract

本申请提供了一种用于检测膀胱癌的组合物及其用途，所述组合物包括：用于检测目标基因甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为RALB基因。本申请还提供了包括所述组合物的试剂盒，以及所述组合物在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。

Description

用于检测膀胱癌相关基因甲基化的核酸组合物及其相应的试 剂盒和用途
技术领域
本申请属于分子生物学领域，涉及基因检测，具体的是涉及一种用于检测膀胱癌相关基因甲基化的核酸组合物及其相应的试剂盒和用途。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。世界范围内，膀胱癌发病率位居恶性肿瘤的第9位，男性恶性肿瘤的第7位(9.5/10万)，女性为10位以后(2.410/10万)；死亡率居恶性肿瘤的第13位，男性死亡率为(3.2/10万)，女性为(0.9/10万)。膀胱癌存在地域、种族及性别的差异。各年龄段均可发病，高发年龄50～70岁，男性发病率为女性的3～4倍。相同分期的膀胱癌患者，男性预后优于女性患者。膀胱癌是严重威胁人民健康的恶性肿瘤之一，早期膀胱癌患者如果能得到及时诊断，可以增加手术保留膀胱的机会，提高患者生活质量和总体生存率。
目前临床上应用于膀胱癌筛查和诊断的手段主要包括尿细胞学检查，肿瘤标记物检查以及影像学检查(包括超声检查、CT及CT尿路造影(computed tomogr aphyurography，CTU)、MRI及磁共振尿路成像(magnetic resonanceurography，MRU)、静脉尿路造影(intravenous urography，IVU)、胸部X线摄片或胸部CT等)。其中，尿脱落细胞学检查的敏感性为13％～75％，特异性为85％～100％。其敏感性与肿瘤分级呈正相关，高级别肿瘤(包括原位癌)阳性率达84％；G1和低级别肿瘤的敏感性为16％。另外，因尿液肿瘤标志物检测的敏感性高但特异性较低，临床上尚未广泛应用。目前膀胱镜检查和活检是诊断膀胱癌最可靠的方法。但这种有创筛查有可能引起泌尿男生殖系统感染、尿道及膀胱出血、尿道损伤和尿道狭窄等并发症。
发明内容
基于现有膀胱癌检测中存在的问题，本申请的目的在于提供一种无创且准确率较高的筛查手段，即通过本申请的用于体外检测膀胱癌的组合物进行膀胱癌的筛查。
本申请具体技术方案如下：
1.一种用于体外检测膀胱癌的组合物，所述组合物包括：
用于检测目标基因甲基化状态的核酸，
其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因的靶序列的甲基化来表征，
其中，所述目标基因为RALB。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述RALB基因的靶序列为如SEQ ID NOs：1-4中任一项所示的序列或包含SEQ ID NOs：1-4中任一项所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
引物，所述引物为所述目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因的靶序列中的至少15个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其还包括：
将目标基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中，
所述至少9个核苷酸的片段，其为如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述至少15个核苷酸的片段，其为如SEQID NO：7所述的序列。
9.一种RALB基因的靶序列在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述RALB基因的靶序列为如SEQ ID NOs：1-4中任一项所示的序列或包含SEQ ID NOs：1-4中任一项所示的序列。
11.一种用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其包括：
SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
12.根据权利要求11所述的寡核苷酸，其还包括：
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
13.根据权利要求11或12所述的寡核苷酸，其还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
14.一种用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其包括：
SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列。
15.根据权利要求14所述的寡核苷酸，其还包括：
SEQ ID NO：7的序列。
16.一种试剂盒，其包括权利要求1-8中任一项所述的组合物或包括权利要求11-15中任一项所述的寡核苷酸。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其还包含选自下述的至少一种其它组分：
三磷酸核苷、DNA聚合酶和所述DNA聚合酶功能所需的缓冲液。
18.根据权利要求16或17所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于检测的样本包括：细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。
19.根据权利要求16-18任一项所述的试剂盒，其还包含：说明书。
20.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物或权利要求11-15中任一项所述的寡核苷酸在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。
21.根据权利要求20所述的用途，其中，所述用于体外检测膀胱癌的试剂盒通过包括如下步骤的方法来检测膀胱癌：
1)分离待测生物样品中的包括目标基因的靶序列或其片段的DNA样品；
2)确定所述目标基因的靶序列的甲基化状态；
3)通过所述目标基因的靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对膀胱癌的体外检测。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述方法包括如下步骤：
提取待测生物样品的基因组DNA；
使用试剂处理提取的基因组DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；
将试剂处理过的DNA样品与DNA聚合酶和目标基因的靶序列的引物接触，进行DNA聚合反应；
用探针检测扩增产物；以及
基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。
23.根据权利要求22所述的用途，其中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。
24.一种检测膀胱癌的方法，其包括如下步骤：
分离待测生物样品中的包括目标基因的靶序列或其片段的DNA样品；
确定所述目标基因的靶序列的甲基化状态；以及
通过所述目标基因的靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对膀胱癌的体外检测；
所述目标基因为RALB基因。
25.一种检测膀胱癌的方法，其包括如下步骤：
提取待测生物样品的基因组DNA；
使用试剂处理提取的基因组DNA，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基；
将试剂处理过的DNA样品与DNA聚合酶和目标基因的靶序列的引物接触，进行DNA聚合反应；
用探针检测扩增产物；以及
基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态；
所述目标基因为RALB基因。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中，所述RALB基因的靶序列如SEQ IDNOs：1-4中任一项所示的序列或包含SEQ ID NOs：1-4中任一项所示的序列。
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述试剂为亚硫酸氢盐试剂。
28.根据权利要求25所述的方法，其中，所述引物为：
所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
29.根据权利要求25所述的方法，其中，所述探针为：
在中等严紧或严紧条件下杂交于所述SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述引物如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的序列。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述探针为如SEQ ID NO：7所述的序列。
本申请具有以下有益效果：
本申请筛选出了能够灵敏和特异地检测膀胱癌相关标志物，并确定了相关标志物的甲基化区域。通过检测RALB基因的甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测所述基因的甲基化状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。通过对膀胱癌患者和正常对照个体的外周血样本的检测显示：本申请描述的组合物和检测方法能够灵敏和特异地检测膀胱癌，从而保证了检测结果的正确性和可靠性。因此，本申请提供了一种可用于体外检测膀胱癌的组合物、试剂盒和检测方法，能够方便、快捷、有效地检测膀胱癌，具有重要的临床应用价值。
本申请利用表观基因组和生物信息学技术，通过分析膀胱癌的基因组甲基化数据，寻找到了多个与膀胱癌相关的甲基化基因，并确定了膀胱癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列，并且通过这个甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测该基因的甲基化的状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。
本申请所述的组合物以非侵入性的方式用于无症状人群的筛查，降低了侵入性检测造成的危害，所述的组合物具有更高的灵敏度和准确度，能够实现实时监测。
具体实施方式
下面对本申请做以详细说明。虽然显示了本申请的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
除非另有说明，本申请的实施将采用常规的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和基因学技术，其均在本领域常规技术手段的范围内。在文献中对此类技术进行了详细说明如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版(Sambrook等，1989)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，1984版)；Animal CellCulture(R.I.Freshney，1987版)；Methods in Enzymology丛书(美国学术出版社有限公司)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等，1987版，和定期更新)；PCR：ThePolymerase Chain Reaction(Mullis等，1994版)。本申请中使用的引物、探针、阻断剂和试剂盒可以采用本领域公知的标准技术制备。
除非另有定义，本申请所使用的技术和科学术语与本申请所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
定义
本申请的“癌症前期”表示处于转化为癌细胞的早期阶段或倾向于转化为癌细胞的细胞。这样的细胞可以表现出一种或多种具有癌细胞特征的表型性状。
本申请中的“严紧杂交条件”和“高度严紧”指的是探针与其靶子序列杂交的条件，典型的在核酸复杂的混合物中。严紧的条件是依赖于序列的，并且在不同的环境下是不同的。较长的序列在较高的温度中特异性的杂交。关于核酸杂交的详细的指导可以参考Tijssen，生物化学和分子生物学技术-核酸探针杂交，“杂交原理和核酸试验策略的回顾”。通常，严紧条件是在限定的离子强度pH下低于特定核酸的熔点(Tm)大约5-10℃。在Tm的温度(在所限定的离子强度，pH和核酸浓度)下，50％的和靶点互补的探针均衡地和靶点序列杂交。还可以通过增加去稳定剂来实现严紧条件。对于选择性或者特定的杂交，正信号为背景杂交的两倍，优选10倍。示例性的严紧杂交条件如下：在50％甲酰胺，5x SSC和1％的SDS的溶液中在42℃杂交，或者在5x SSC和1％的SDS的溶液中在65℃杂交，然后在0.2xSSC和0.1％SDS的溶液中在65℃洗涤。
并且，如果核酸所编码的多肽是实质性相似的话，即使不能在严紧条件下杂交的核酸仍然是实质性相似的。这种情况下，典型地，核酸在中等严紧杂交条件下进行杂交。作为示例的，“中等严紧杂交条件”包括在40％甲酰胺，1M的氯化钠和1％的SDS的溶液中在37℃杂交，并且在1xSSC的溶液中在45℃洗涤。本领域的普通技术人员可以很显然地在现有技术中获得对于取得获得相同的严紧度的条件的指导。对于PCR而言，36℃左右的温度典型地适用于低度严紧扩增，而基于引物的长度，退火温度的范围则在32℃至48℃之间。对于高度严紧的PCR扩增，一般是在62℃，而基于引物的长度和特异性，高度严紧杂交的退火温度的范围则在50℃至65℃之间。对于高度严紧和低度严紧扩增的循环条件，典型的，包括：在90-95℃下持续变性阶段30秒至2分钟，持续退火阶段30秒至2分钟，在约72℃下持续扩展阶段1至2分钟。关于低度和高度严紧扩增反应的工具和指导可以在现有技术中获得。
本申请中的“寡核苷酸”指由两个或者两个以上的核苷酸构成的分子，优选为由三个以上的核苷酸构成的分子，其精确大小可以依靠许多因素，这些因素反过来又是由寡核苷酸的最终功能和用途决定的。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包括10个核苷酸至100个核苷酸的长度。在某些具体实施方式中，寡核苷酸可以包括10个核苷酸至30个核苷酸的长度，或者可以具有20和25个核苷酸的长度。在一些特定的具体实施方式中，短于这些长度的寡核苷酸也是合适的。
本申请的“引物”表示当置于能诱发与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即在核苷酸和诸如DNA或RNA聚合酶的诱发剂的存在下并且在合适的温度和pH下，能够作为合成起始点的寡核苷酸，无论它是纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的。引物可以是单链或双链的，并且必须足够长而使其在诱发剂的存在下能引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，为了诊断和预后应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少或多于约9、10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。参与确定引物合适长度的因素是本领域技术人员熟知的。
本申请的“引物对”表示与靶DNA分子相反链杂交或与侧翼连接待扩增的核苷酸序列的靶DNA区域杂交的引物对。
本申请的“引物位点”表示引物杂交的靶DNA或其它核酸的区域。
本申请的“探针”，当涉及核酸序列时，以其通常含义使用，表示在规定条件下能与靶序列杂交并且可以用于检测该靶序列的存在的选择的核酸序列。本领域技术人员应当理解，在某些情况下，探针也可以用作引物，并且引物可以用作探针。
本申请的“DNA甲基化”是指甲基添加到胞嘧啶(C)的5位，这通常(但不必须)是在CpG(胞嘧啶之后为鸟嘌呤)二核苷酸的情况下。本文所用的“增加的甲基化程度”或“显著的甲基化程度”是指DNA序列中至少存在一个甲基化的胞嘧啶核苷酸，其中正常对照样品(例如从非癌细胞或组织样品提取的DNA样品或对DNA残基的甲基化进行处理的DNA样品)中对应的C是非甲基化的，在某些实施方式中，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个C可以是甲基化的，其中对照DNA样品中的这些位置的C是非甲基化的。
在实施方案中，多种不同的方法可用于检测DNA甲基化改变。检测DNA甲基化的方法包括，例如，利用southern或聚合酶链反应(PCR)分析的甲基化敏感的限制性内切核酸酶(MSRE)测定、甲基化特异性或甲基化敏感的PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、高分辨率熔解(HRM)分析、重亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序、甲基化特异性单链构象分析(MS-SSCA)、组合重亚硫酸氢盐限制分析(COBRA)、甲基化特异性变性梯度凝胶电泳(MS-DGGE)、甲基化特异性熔解曲线分析(MS-MCA)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)。这些测定可以是PCR分析、利用荧光标记的定量分析或southern印记分析。
本申请的“甲基化测定”指确定DNA序列内一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
本申请的“检测”表示观察生物样品中的标志物或标志物改变(例如标志物甲基化状态的改变或核酸或蛋白序列的表达水平)的任何过程，无论实际上是否检测到标志物或标志物改变。换言之，探测样品的标志物或标志物改变的行为是“检测”，即使标志物被测定为不存在或低于灵敏度水平。检测可以是定量、半定量或非定量观察，并且可以基于与一个或多个对照样品的比较。应当理解，检测本文公开的膀胱癌包括检测癌症前期细胞，所述癌症前期细胞开始发展为膀胱癌细胞或将要发展为膀胱癌细胞，或具有增加的发展为膀胱癌细胞的倾向。检测膀胱癌还可以包括检测可能的死亡概率或疾病条件的可能的预后。
本申请的“同源性”、“同一性”和“相似性”表示2个核酸分子之间的序列相似性。可以比较每个序列中的位置来测定“同源性”、“同一性”或“相似性”，为了比较的目的可以将所述序列进行比对。当比较的序列中的等同位置被相同碱基占据时，所述分子在该位置是相同的；当等同位点被相同或相似氨基酸(例如，在空间性质或带电性质上相似)残基占据时，所述分子可以称为在该位置是同源的(相似的)。同源性/相似性或同一性百分比的表达是指比较的序列所共享的位置上相同或相似氨基酸的数量的函数。“无关的”或“非同源的”序列与本申请的序列共享小于40％同一性，优选小于25％同一性。在比较2个序列时，残基(氨基酸或核酸)的缺失或多余残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。在具体实施方案中，对于两个或更多个序列或子序列，按照使用具有下文所述的默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法进行测定或通过例如国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information(NCBI))在线提供的手动比对和肉眼检查进行测定，当在比较窗或指定区域上为最大对应性进行比较和比对时，如果它们的序列在规定的区域上同一性为约60％，或约65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高，可以认为是基本或显著同源的、相似的或同一的。该定义也涉及或可以用于测试序列的互补物。因此，在本文背景允许的程度下，例如，如果核苷酸序列可以被预测为天然存在于DNA双链体中，或可以以互补链中的一条或两条的形式天然存在，则与规定靶序列或其变体互补的核苷酸序列自身被视为与靶序列是“相似的”，并且当涉及“相似的”核酸序列时，包括单链序列、其互补序列、双链的链复合物、能够编码相同或相似多肽产物的序列、以及上述任意一项的任何容许的变体。相似性必须限制为单一核酸链序列的分析的情况可以包括例如细胞中特定RNA序列或编码序列的表达的检测和定量。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。在实施方案中，同一性或相似性可以是在长度为至少约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23、24、25或更多核苷酸的区域上，或在长度为多于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或多于约100个核苷酸的区域上。
本申请的“扩增”表示由核酸的一个具体基因座得到多个拷贝的过程，所述核酸例如基因组DNA或cDNA。可以使用多种已知手段中的任何一种实现扩增，所述手段包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、基于转录的扩增和链置换扩增(SDA)。
本申请的“基于荧光的实时PCR”表示这样的方法：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在该PCR技术中，有一个很重要的概念，循环阈值，也称为Ct值。C代表Cycle，t代表threshold(阈值)，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。例如，荧光阈值(threshold)的设定方法如下：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省(默认)设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
本申请的“实时PCR的cut off值”表示针对某一个生物标记物的判断样本阴阳性的一个临界Ct值。根据本申请的某些具体实时方式，“临界Ct值(Cut Off值)是根据一定数量的样本数据，基于统计学处理而得到的”，该临界Ct值可以根据所需要的灵敏度或特异性的要求不同而不同。
本申请的“灵敏度”表示从一定癌症样本中检测出癌症的比例，其计算公式为：灵敏度＝(检测到的癌症/所有的癌症)，而“特异性”表示一定正常人样本中检测出正常的比例，其计算公式为特异性＝(检测到的阴性/总的阴性)。
本申请的“标记”或“可检测的部分”是可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组分。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，ELISA中常用的酶)、生物素、地高辛或半抗原和可以被制备为可检测的蛋白，例如，通过将放射性标记并入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。
可以使用多种不同方法检测核酸分子。核酸检测方法包括，例如，PCR和核酸杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹或原位杂交)。具体而言，能够扩增靶核酸的寡核苷酸(例如，寡核苷酸引物)可以用于PCR反应。PCR方法通常包括以下步骤：获得样品、从所述样品分离核酸(例如，DNA、RNA或两者)和使所述核酸与一种或多种寡核苷酸引物接触，所述引物在能使模板核酸扩增发生的条件下特异性地与模板核酸杂交。在模板核酸的存在下，产生扩增产物。核酸扩增和扩增产物检测的条件是本领域技术人员已知的。已开发出多种对于基础PCR技术的改进，包括但不限于，锚定PCR、RACE PCR、RT-PCR和连接酶链式反应(LCR)。扩增反应中的引物对必须与模板核酸的相对链退火，并且应该彼此保持合适的距离，使得聚合酶能有效地跨过区域进行聚合并使得可以例如使用电泳来容易地检测扩增产物。例如，可以使用诸如OLIGO(Molecular Biology Insights Inc.，Cascade，Colo.)的计算机程序来设计寡核苷酸引物，以助于设计具有相似熔解温度的引物。通常，寡核苷酸引物长度为9-30或40或50个核苷酸(例如，长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸)，但是寡核苷酸引物可以更长或更短，只要使用合适的扩增条件。
通常使用可检测的标记实现扩增产物或杂交复合物的检测。术语“标记”，当涉及核酸时，意图包括通过将可检测的物质偶联(即，物理连接)至核酸的核酸直接标记，以及通过与直接标记了可检测的物质的另一试剂进行反应的核酸间接标记。可检测的物质包括各种酶、辅基、荧光材料、冷光材料、生物冷光材料和放射性材料。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括抗生物素蛋白链菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯代三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；冷光材料的实例包括鲁米诺；生物冷光材料的实例包括荧光素酶、虫荧光素和水母蛋白。间接标记的实例包括用生物素将核酸进行末端标记，使得可以用荧光标记的抗生物素蛋白链菌素检测该核酸。
概述
一方面，本申请提供了一种用于体外检测膀胱癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的靶序列内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因的靶序列的甲基化来表征，其中，所述目标基因为RALB基因。
本申请提供了一组在膀胱癌中发出异常甲基化的目标基因的靶序列，包括RALB基因的靶序列，RALB基因的靶序列为如SEQ ID NOs：1-4中任一项所示的序列或包含SEQ IDNOs：1-4中任一项所示的序列。
本领域技术人员也可以理解，所述RALB基因的靶序列并不局限于上述列出的具体的序列。RALB基因的靶序列应该涵盖与SEQ ID NOs：1-4中任一个所示的序列相比，包含一个或两个或三个以上的核苷酸突变，但实质上仍然与其实质功能相同的序列，也包含与SEQID NOs：1-4中任一个所示的序列相比，具有95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
RALB基因的核苷酸序列(5’-3’)如下：
RALB基因的核苷酸序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
RALB基因的核苷酸序列的反向互补序列(5’-3’)如下：
RALB基因的核苷酸序列的反向互补序列在亚硫酸氢盐处理后的序列(5’-3’)如下：
表1RALB基因的靶序列
靶序列名称 序列号
RALB基因的核苷酸序列 SEQ ID NO：1
RALB基因的核苷酸序列在亚硫酸氢盐处理后的序列 SEQ ID NO：2
RALB基因的核苷酸序列的互补序列 SEQ ID NO：3
RAL基因的核苷酸序列的互补序列在亚硫酸氢盐处理后的序列 SEQ ID NO：4
优选地，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，其中所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。在某些优选实施方式中，如使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括目标基因的靶序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段，优选至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
更优选地，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因的靶序列中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。在某些优选实施方式中，如使用亚硫酸氢盐对待测样本DNA进行转化，用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括在中等严紧或严紧条件下，杂交于目标基因的靶序列进行亚硫酸氢盐转化后序列中的至少15个核苷酸的片段，优选至少16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个或更多个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
优选地，所述组合物还包括将目标基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。更优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐。
用于检测目标基因甲基化状态的核酸还可以包括优先与处于非甲基化状态的DNA结合的阻断剂。
优选地，所述组合物包括如表2中所示的引物、探针中的一种或多种。
优选地，所述组合物包括如表2中所示的引物、探针中的一种或多种。
表2本申请使用的引物、探针和阻断剂序列
序列编号 序列名称 具体核苷酸序列(5’-3’)
SEQ ID NO：5 RALB_F AGAGAAATTTTTTTAAAGTGAC
SEQ ID NO：6 RALB_R AAAAAAAACTACAAAAAAAACC
SEQ ID NO：7 RALB_P TTCGGATTTAGAATTCGAAGT
表2中的“F”表示正向引物；“R”表示反向引物；“P”表示探针。
优选地，本申请使用的探针的剂序列为SEQ ID NO：7，序列名称为RALB_P，5’与3’的荧光标记方式分别为FAM及BHQ1。
在某些实施方式中，所述组合物还包括将基因的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。优选地，该试剂是亚硫酸氢盐。DNA的亚硫酸氢盐修饰为已知的用于评估CpG甲基化状态的工具。在真核细胞的DNA中，5-甲基胞嘧啶是最常见的共价碱基修饰。5-甲基胞嘧啶不能通过测序来鉴定，因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为。此外，在PCR扩增过程中，5-甲基胞嘧啶携带的表观遗传信息则完全丢失。最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异反应；在随后的碱性水解后，没有甲基化的胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶；但在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。由此原始的DNA以此方式被转变，使得原来在其杂交行为上不能与胞嘧啶区分开的5-甲基胞嘧啶现在可作为仅剩的胞嘧啶被常规的已知分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。所有这些技术都基于不同的碱基配对特性，现在可被充分利用了。因此，典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化测定的联合使用，用于确定目标基因的靶序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化状态。此外，本申请的方法适于分析异质的生物样品，例如血液或粪便中的低浓度肿瘤细胞。因此，当分析这种样品中CpG二核苷酸序列的甲基化状态时，本领域技术人员可以使用定量测定法来确定特定CpG二核苷酸序列的甲基化水平(例如百分比、份数、比率、比例或程度)，而不是甲基化状态。相应地，术语甲基化状况或甲基化状态还应被认为是指反映CpG二核苷酸序列甲基化状态的值。
另一方面，本申请提供用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其包括：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少9个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
优选地该用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸包括：对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少9个核苷酸的片段。
本申请的用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其还包括：在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
优选地该用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸包括：在中等严紧或严紧条件下杂交于对SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或其互补序列进行亚硫酸氢盐转化后的序列中的至少15个核苷酸且包含至少一个CpG二核苷酸序列的片段。
本申请的用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，还可以包括：优先与处于非甲基化状态的DNA结合的阻断剂。
在一个具体的实施方式中，用于体外检测膀胱癌的寡核苷酸，其包括：SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的序列。其还包括：SEQ ID NO：7的序列。
另一方面，本申请提供了包括所述组合物的试剂盒。该试剂盒还包含选自下述的至少一种其它组分：三磷酸核苷、DNA聚合酶和所述DNA聚合酶功能所需的缓冲液。
典型地，所述试剂盒还包括用于容纳患者生物样品的容器。并且，所述试剂盒也包括使用和解释检测结果的说明。
本申请还涉及上述组合物和寡核苷酸在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。
本申请还涉及RALB基因在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。
其中，所述RALB基因定位于人类基因组，该基因编码一种GTP结合蛋白，属于小GTP酶超家族和Ras蛋白家族，GTP结合蛋白介导由某些细胞表面受体占据启动的跨膜信号传导。
本申请提供了一种体外检测膀胱癌的方法，所述方法包括以下步骤：
1)分离待测生物样品中的目标基因的靶序列或其片段；
2)确定所述目标基因的靶序列的甲基化状态；
3)通过所述目标基因的靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对膀胱癌的体外检测。
根据某些优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：
1)提取待测生物样品的基因组DNA；
2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即目标基因的靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；
3)将经步骤2)处理过的DNA样品与DNA聚合酶和所述目标基因的靶序列的引物接触，使得所述经处理的目标基因的靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的目标基因的靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的目标基因的靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；
4)用探针检测扩增产物；以及
5)基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。
优选地，典型的引物包括所述目标基因的靶序列的片段，所述目标基因的靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NOs：1-4中任一个的至少9个核苷酸的片段。
优选地，典型的探针包括所述目标基因的靶序列的片段，所述目标基因的靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQ ID NOs：1-4中任一个的至少15个核苷酸的片段。
优选地，所述引物、探针中的一种或多种如前述表2所示。
并且，所述接触或扩增包括使用至少一种如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶、使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶、使用聚合酶链式反应(PCR)、产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
优选地，用PCR方式来测定甲基化状态，诸如“基于荧光的实时PCR技术”、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)等测定方法被用于测定目标基因的靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。其中，“基于荧光的实时PCR”测定为高通量定量甲基化测定，其使用基于荧光的实时PCR(TaqMan)技术，在PCR步骤后不需要进一步的操作。简言之，“基于荧光的实时PCR”方法以基因组DNA的混合样品开始，该混合样品根据标准操作在亚硫酸氢钠反应中被转变为甲基化依赖的序列差异的混合池。随后在“偏移的(biased)”反应(采用重叠已知CpG二核苷酸的PCR引物)中进行基于荧光的PCR。可在扩增水平以及在荧光检测扩增水平上产生序列差别。“基于荧光的实时PCR”测定可以用作基因组DNA样品中甲基化状态的定量测试，其中序列区分发生在探针杂交水平上。在该定量方式中，在重叠特定的CpG二核苷酸的荧光探针存在下，PCR反应提供了甲基化特异的扩增。用于起始DNA量的无偏移对照由以下反应提供：其中引物和探针都不覆盖任何CpG二核苷酸。“基于荧光的实时PCR”方法可与任何适合的探针一起使用，如“TaqMan”、“Lightcycler”等。TaqMan探针为荧光报道物(RTSPYL5rter)和淬灭分子(Quencher)双标记的，并被设计为特异于相对高GC含量区，以至于其在PCR循环中以比正向或反向引物高约10℃的温度熔解。这使得TaqMan探针在PCR退火/延伸步骤中保持充分杂交。当Taq聚合酶在PCR中酶合成新链时，其最终会遇到退火的TaqMan探针。Taq聚合酶5’至3’内切酶活性随后将通过消化TaqMan探针而顶替它，从而释放荧光报道物分子用于采用实时荧光检测系统定量检测其现在未被淬灭的信号。用于“基于荧光的实时PCR”分析的典型试剂可以包括，但不限于：用于目标基因的靶序列PCR引物；非特异扩增阻断剂；TaqMan或Lightcycler探针；优化的PCR缓冲液以及脱氧核苷酸；以及Taq聚合酶等。
在某些优选实施方式中，所述目标基因的靶序列中至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态是由实时PCR反应的临界Ct值确定的。通过利用实时PCR反应分析生物样本中DNA的方法，能方便地实现针对目标基因的靶序列甲基化状态的检测，并且能根据PCR反应的临界Ct值来快速、便捷地判断受检样本是否呈阳性，因而提供了一种无创、快速的膀胱癌体外检测方法。
所述的生物样品选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合，优选为尿液和血浆，进一步优选为尿液。根据前人研究，针对膀胱癌检测优选的生物样品为尿液。例如：Emil Christensen，el ta[Cell-Free Urine and Plasma DNA MutationalAnalysis Predicts Neoadjuvant Chemotherapy Response and Outcome in Patientswith Muscle-Invasive Bladder Cancer]在2017年同时比较了血浆和尿液样本。结果显示：与血浆样本相比，尿液上清液和尿液沉淀中的肿瘤DNA水平较高(P＜0.001)。
本申请发明人发现，在膀胱癌组织中RALB基因的靶序列的甲基化状态和正常肝组织的所述基因的靶序列的甲基化状态存在显著性差异：在膀胱癌组织中，RALB基因的靶序列发生甲基化，而在正常肝组织中，RALB基因的靶序列不发生甲基化。因此本申请提供了一种通过检测样本中的RALB基因的靶序列甲基化状态对膀胱癌进行体外检测的方法，本申请提供的方法能够无创、快速地检测膀胱癌。
实施例
本申请对试验中所用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述，在下面的实施例中，如果无其他特别的说明，％表示wt％，即重量百分数。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1样本搜集
下载TCGA中450k甲基化芯片癌组织数据，共涉及26种肿瘤7769个癌组织样本，其中包括肾上腺皮质癌(80)、膀胱癌(412)、急性髓细胞样白血病(140)、脑低级别胶质瘤(654)、乳腺癌(740)、宫颈癌(286)、结直肠癌(348)、食管癌(183)、葡萄膜黑色素瘤(80)、头颈鳞状细胞癌(527)、肾癌(660)、肝癌(377)、肺腺癌(425)、肺鳞癌(372)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(29)、卵巢浆液性囊腺癌(10)、胰腺癌(184)、间皮瘤(116)、前列腺癌(488)、皮肤黑色素瘤(104)、肉瘤(117)、胃癌(397)、睾丸癌(134)、胸腺癌(94)、甲状腺癌(506)、子宫内膜癌(309)。针对健康人群，搜集38例健康人的尿液，进而进行全基因组甲基化测序(WholeGenome Bisulfite equencing，WGBS)。
实施例2引物和探针测试
针对健康尿液样本，计算对应WGBS对应450k区域的探针β值第三四分位数(Q3)，又称”较大四分位数”，筛选Q3＜0.02的位点，结果为List1。针对450K芯片组织数据，计算对应450K对应区域的每个探针β值第一四分位数(Q1)，Q1又称”较小四分位数”，筛选Q1＞0.1的位点，结果为List2。取List1和List2交集得到65739个差异甲基化区域。
在上述标志物中选择膀胱癌特有的标志物，得到123个标志物。同时要求，TCGA中450k芯片膀胱癌(412)与癌旁组织(21)的甲基化水平的差值大于0.2，最终得到79个差异甲基化区域。
针对上述的79个差异甲基化区域设计探针捕获，利用博尔诚尿液样本数据(膀胱癌样本个数＝25，健康人样本个数＝38)进行验证，最终验证RALB基因的差异区间。根据所得到的靶序列区域，定制PCR探针组合物。正常人白细胞的细胞系DNA通常处于低/非甲基化状态，可作为阴性对照，本实施方式中所用的DNA量为20ng/反应；人体基因组DNA甲基转移酶处理产物通常处于高/全甲基化状态，本实施方式中将人体基因组DNA甲基转移酶处理产物与正常人WBC细胞系基因组DNA进行混合，每个反应的模板投入量分别为350pg和15.75ng，可作为目标基因靶序列甲基化状态检测的阳性参考品，可作为阳性对照。本实施方案中所用的DNA量为200pg/反应。
将DNA样本首先进行亚硫酸氢盐转化，以转化后的BisDNA为模板，利用上述引物探针进行实时PCR扩增。每个样品进行至少一次的实时PCR，在某些具体实施方式中，进行两次或三次实时PCR检测。引物探针测试的PCR体系如下表3所示。
表3引物探针测试的PCR体系
体积(μl) 终浓度
Taq DNA Polymerase(Biochain) 1.2 /
4.2×buffer(Biochain) 11.9 11
RALB_1F(10μM) 1.0 200nM
RALB_1R(10μM) 1.0 200nM
RALB_1P(10μM) 1.0 200nM
BisDNA 4.0 /
H2O 22.525 /
Total 42.625 /
注：“F”表示正向引物；“R”表示反向引物；“P”表示探针。
所用的PCR扩增程序为：94℃，20min；(62℃，5s；65℃，35s-读取荧光信号；93℃，30s)45个循环；40℃，10s，当以人体基因组DNA甲基转移酶处理产物与正常人WBC细胞系基因组DNA混合物转化的BisDNA为模板时，RALB基因能够有效扩增，而当正常人WBC细胞系DNA转化的BisDNA为模板时，RALB基因无扩增。
实施例3膀胱癌组织和正常人尿液样本测试
选择16例膀胱癌组织样本(10ng/反应)和16例正常人尿液样本(20mL)，提取基因组DNA，经亚硫酸氢盐转化为BisDNA后，按照表3中的PCR反应体系和实施例1中的反应程序对RALB基因的甲基化进行检测，最后测得16例膀胱癌组织和16例正常人尿液对于目的基因靶序列的实时PCR的Ct值。RALB基因Ct值的临界值均选择Ct＝38.5。如表4、表5所示，利用RALB基因检测膀胱癌的灵敏度，特异度分别为93.75％，100％。阳性预测值和阴性预测值分别为100.00％和94.12％，如表6所示，可用于膀胱癌的早期筛查和实时监测。
表4RALB基因在膀胱癌组织和正常人尿液样本的阳性临床检测结果
表5灵敏度和特异度
表6阳性预测值和阴性预测值
从上表可以看出，RALB基因检测膀胱癌组织的灵敏度和正常人WBC特异性分别为93.75％和100％，因此，推测RALB基因可用于膀胱癌的早期筛查和实时监测。
实施例4膀胱癌尿液样本和正常人尿液样本测试
选择16例膀胱癌尿液样本(20mL)、和16例正常人尿液样本(20mL)，提取基因组DNA，经亚硫酸氢盐转化为BisDNA后，按照实施例1中的PCR反应体系，对RALB基因进行甲基化检测。最后测得16例膀胱癌尿液样本和16例正常人尿液对于目的基因靶序列的实时PCR的Ct值。根据PCR结果，RALB基因Ct值的临界值为Ct＝38.5，如表7和表8，利用尿液检测RALB基因的CT值，其灵敏度，特异度分别为81.25％，93.75％，阳性预测值和阴性预测值分别为92.86％和83.33％，如表9所示。
表7RALB基因在膀胱癌尿液和正常人尿液的临床检测结果
表8灵敏度和特异度
表9阳性预测值和阴性预测值
从上表可以看出通过利用实时PCR分析尿液样本DNA的方法，能够方便地实现针对目标RALB基因靶序列甲基化状态的检测，并且能够根据实时PCR的CT值来快速、便捷地判断样本是否呈阳性，因此本申请提供了一种无创、便捷的膀胱癌体外检测方法，而且还能够提高膀胱癌的检出率。
综上所述，本申请利用以上所述的组合物、核酸序列、试剂盒及其用途，以及上述检测方法，通过检测目标基因的靶序列及其片段的甲基化的核酸序列，实现了利用目标基因的靶序列甲基化生物标记物来对膀胱癌进行体外检测，从而有效提高了膀胱癌体外检测的灵敏度和特异性。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于体外检测膀胱癌的组合物，所述组合物包括：
用于检测目标基因甲基化状态的核酸，
其中，所述目标基因甲基化状态由所述目标基因的靶序列的甲基化来表征，
其中，所述目标基因为RALB。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述RALB基因的靶序列为如SEQ ID NOs:1-4中任一项所示的序列或包含SEQ ID NOs:1-4中任一项所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
引物，所述引物为所述目标基因的靶序列中的至少9个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸包括：
探针，所述探针为在中等严紧或严紧条件下杂交于所述目标基因的靶序列中的至少15个核苷酸的片段，
所述片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其还包括：
将目标基因的靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述用于检测目标基因甲基化状态的核酸还包括：
优先与处于非甲基化状态的靶序列结合的阻断剂。
7.根据权利要求3所述的组合物，其中，
所述至少9个核苷酸的片段，其为如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的序列。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中，所述至少15个核苷酸的片段，其为如SEQ IDNO:7所述的序列。
9.一种RALB基因的靶序列在制备用于体外检测膀胱癌的试剂盒中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述RALB基因的靶序列为如SEQ ID NOs:1-4中任一项所示的序列或包含SEQ ID NOs:1-4中任一项所示的序列。
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