CN102421798A - 与dickkopf-1或dickkopf-4或两者的结合分子的组合物及使用方法 - Google Patents

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Abstract

提供了使用结合蛋白质靶Dickkopf-1(DKK1)、Dickkopf-4(DKK4)或两者(其中，与DKK1或DKK4或两者的特异性在本文中称为“DKK1/4”)的结合分子及其片段的方法。

Description

与DICKKOPF-1或DICKKOPF-4或两者的结合分子的组合物及使用方法
发明背景
Wnt信号传导通路涉及对胚胎发育和致瘤性过程的控制。胞外Wnt蛋白负责胚胎发生过程中的多种细胞类型的生长和分化，并对许多癌症的发展有贡献。
存在至少两个抑制Wnt信号传导的蛋白质家族，即分泌性frizzled相关家族和Dickkopf(DKK)家族。DKK家族目前含有四个家族成员，即DKK1(人DNA登录号：NM_012242；PRT登录号：O94907)、DKK2(人登录号：NM_014421；PRT登录号：NP_055236)、DKK3(人登录号：NM_015881；PRT登录号：AAQ88744)，和DKK4(人登录号：NM_014420；PRT登录号：NP_055235)。
Dickkopf-1(DKK1)是Wnt/β-catenin信号传导通路的分泌性抑制剂。参见例如Niehrs的PCT公开号WO9922000；McCarthy的WO9846755；Shulok等人的WO2007/084344。DKK1具有抑制Wnt诱导的轴复制(axisduplication)的能力，遗传分析表示DKK1在上游作用来抑制Wnt信号传导。DKK1与LRP6拮抗性的相互作用，阻断Wnt介导的信号激活。参见例如Mao等人，2001Nature 411：321。DKK1还在脂肪生成、软骨发生、胃肠道上皮增殖的增殖、骨丢失相关性风湿病，和启动毛囊基板形成中发挥作用。参见Online Mendelian Inheritance中的Man(“OMIM”)登录号605189。
Dickkopf-4(DKK4)表征较差，但也是Wnt通路的分泌性抑制剂。DKK4表现出沉积在患阿兹海默氏病的斑块中，并在肌肉、小脑、T细胞、食管和肺中表达。参见OMIM登录号605417。
对治疗癌症、骨密度异常和代谢紊乱的组合物和方法存在需要，包括干扰或中和DKK1和/或DKK4介导的对Wnt信号传导的拮抗作用的此类活性剂。
Wnt蛋白在细胞发育中发挥重要作用，并已知调控脂肪生成。Wnt10b过表达的ob/ob和agouti小鼠具有显著更少的脂肪组织，并且更耐受葡萄糖和对胰岛素敏感。
发明概述
本发明涉及特异性针对Dickkopf-1(DKK1)、Dickkopf-4(DKK4)或两者(其中，对DKK1或DKK4或两者的特异性在本文中称为“DKK1/4”)的结合分子的组合物以及使用方法，用于治疗与DKK1/4相关的骨、骨密度、代谢、糖尿病、癌症等的异常。
本发明的实施方案在本文中提供了选择性结合和中和DKK1和/或DKK4多肽或其片段的结合分子或其抗原结合部分，及其在治疗疾病中的用途。
在某些实施方案中，本发明提供了治疗与DKK1和/或DKK4(DKK1/4)的表达相关的病症或病况的方法。DKK1或DKK4相关性疾病包括但不限于骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤、重要性不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)或良性单克隆丙种球蛋白病、平台型(plateau)和郁积型(smoldering)骨髓瘤)；恶性纤维状组织细胞增多症(MFH)(也称为高度未分化多形性肉瘤)；神经母细胞瘤；β地中海贫血；炎性肠病；和骨疾。其他疾病或病症包括但不限于例如：骨疾，包括但不限于骨折愈合、骨溶解性病损——尤其是与骨髓瘤(尤其是多发性骨髓瘤、MGUS、平台型和郁积型骨髓瘤)相关的骨溶解性病损和转移、或者与下述的癌症或其转移相关的骨溶解性病损和转移：骨、乳房、结肠、黑色素细胞、肝细胞、上皮、食道、脑、肺、前列腺或胰腺；与移植相关的骨丢失；骨质减少、骨质疏松、骨密度异常、骨肉瘤和骨质溶解。其他疾病或病症包括但不限于例如：癌症、各种肌肉和代谢疾病、阿兹海默氏病、风湿病、结肠炎和/或不想要的脱发。还包括脂肪生成、软骨发生和色素沉着的病症。其他病症包括但不限于心血管疾病，例如：冠状动脉病、血管钙化、跛行、动脉粥样硬化、动脉硬化、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、心肌病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、低血压、中风、局部缺血、缺血再灌注损伤、动脉瘤、再狭窄和血管狭窄。已知DKK1和Wnt通路基因在多种这类疾病中具有改变的表达，包括MFH(也称为高度未分化多形性肉瘤)(Matushanasky等人，2007 J.Clin.Invest.117：3248-3257)；炎性肠病(You等人，2008 Dig.Dis.Sci.53：1013-1019)；骨肉瘤(Lee等人，2007 Brit.J.Cancer 97：1552-1559；Gregory等人，2003 J.Biol.Chem.278：28067-28078)；骨髓(骨骼肌)转移(Granchi等人，2008 Int.J.Cancer 123：1526-1535)；和肺癌和食道鳞状细胞癌(ESCC)(Yamabuki等人，2007 Cancer Res.67：2517-2525)。与DKK1或DKK4相关的特定肌肉和代谢疾病包括：抗胰岛素性、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、低胰岛素血症、糖尿病(尤其是2型糖尿病，或糖皮质激素或其它药物相关性糖尿病)、肥胖、体重减轻、持续体重减轻(weight loss maintenance)、神经性厌食、贪食症、恶病质、X综合征、代谢综合征、餐后高血糖症、餐后高脂血症和/或高甘油三酯血症、低血糖症、高血糖症、高尿酸血症、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高脂血症、血脂异常、混合型血脂异常、高甘油三酯血症、胰腺炎和非酒精性脂肪肝病；以及肌肉创伤、萎缩、消耗、变性、修复、再生。在相关的实施方案中，待治疗的癌症是骨髓瘤，例如MGUS、多发性骨髓瘤或郁积型或平台型骨髓瘤、下述的癌症或其转移：骨、乳房、结肠、黑色素细胞、肝细胞(例如肝细胞癌(HCC))、上皮、食道、脑、肺、前列腺或胰腺。
方法涉及向需要其的对象施用有效量的包括本发明的结合分子的药物组合物。
本发明的中和性DKK1/4结合分子适合治疗患有或有风险患胆固醇相关性病症的人类患者，包括但不限于：升高的胆固醇或与升高的胆固醇相关的病况，例如脂类病症(例如，高脂血症、I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症、继发性高甘油三酯血症、高胆固醇血症、黄瘤病、胆固醇乙酰转移酶缺陷)。DKK1/4结合分子还适合治疗患有心血管疾病的人类患者，和有风险患该病的患者，例如由于存在一种或多种风险因子(例如，高血压、吸烟、糖尿病、肥胖或高同种半胱氨酸血症)的。
在某些实施方案中，任何上述方法都还涉及施用化疗活性剂或其他药用活性剂。在相关的实施方案中，化疗剂是抗癌剂。在另一个相关的实施方案中，化疗剂是抗骨质疏松剂。在一个实施方案中，将结合分子与一种或多种骨合成代谢疗法、体重减轻疗法和/或糖尿病疗法组合施用。
在一个实施方案中，结合分子是DKK1/4中和性结合分子(即，特异性的中和DKK1或DKK4或两者)。在多个实施方案中，DKK1/4中和性结合分子的抗原结合部分不结合DKK2或DKK3。
在一个实施方案中，结合分子或其抗原结合部分排列在免疫球蛋白样支架内，例如选自如人、人源化、人体工程(humaneering)、鲨鱼或骆驼(camelid)支架的构架，和/或额外的是重组的、嵌合的或移植CDR的抗体。例如，设计将人抗鼠抗体反应最小化的技术(Kalobios的人体工程技术或PDL的人源化技术)被认为落入本发明的范围内。此外，特异性针对DKK1或DKK4的抗原结合部分可以在非免疫球蛋白样支架内，包括例如排列在源自adnectin、纤维蛋白原、锚蛋白的重复等构架类型内的。
在一个实施方案中，DKK1结合分子的特征是具有特异性针对靶蛋白DKK1的抗原结合区，和结合分子或功能片段结合DKK1或其片段。在相关的实施方案中，DKK4结合分子的特征是具有特异性针对靶蛋白DKK4的抗原结合区，并且结合分子或功能片段结合DKK4或其片段。在一个实施方案中，结合分子或其抗原结合部分结合DKK1或DKK4多肽或两者，但不结合DKK2或DKK3多肽。
在另一个实施方案中，结合分子或其抗原结合部分是单克隆的。在另一个实施方案中，抗原结合部分是多克隆的。在多个实施方案中，DKK1结合分子或其抗原结合部分结合由DKK1或DKK4多肽的30个连续的氨基酸组成的肽。在一个实施方案中，本发明的结合分子结合包含不连续的氨基酸的DKK1或DKK4表位。
在相关的实施方案中，通过至少一个下列测定来确定与DKK1或DKK4的结合：抑制DKK1或DKK4对Wnt信号转录的拮抗作用；表面等离振子共振亲和测定、酶联免疫吸附测定结合；基于电化学发光的结合分析；FMAT、SET、SPR、ALP、TopFlash、生物标记物例如骨钙蛋白(OCN)、I型前胶原含氮前肽(P1NP)和护骨蛋白(OPG)的血清浓度，以及与细胞表面受体例如Frizzled(Fz)、LRP(LRP5/6)或Kremen(Krm)的结合。在某些实施方案中，DKK1结合分子或抗原结合部分具有至少一个下列特性：与DKK1的选择性比与人DKK2或DKK3的大至少103-倍、104-倍或105-倍；与DKK1或DKK4的结合具有小于100nM、50nM、10nM、1.0nM、500pM、100pM、50pM或10pM的Kon；与DKK1具有小于10-2每秒、10-3每秒、10-4每秒或10-5每秒的脱离速率。
在相关的实施方案中，本发明的结合分子与DKK1和/或DKK4竞争结合LRP5/6。在相关的实施方案中，本发明的结合分子与DKK1和/或DKK4竞争结合Krm。
在另一个实施方案中，本发明提供了任何上述结合分子或其功能性片段的分离的抗原结合区，及其氨基酸序列。因而，在某些实施方案中，本发明提供了选自SEQ ID NO：2-20和SEQ ID NO：40-72的分离的氨基酸序列，以及这些序列的保守的或人体工程变体。
在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的结合分子的核苷酸序列和多肽序列，尤其包括DKK1/4抗体的，重链和轻链的CDR1、CDR2和CDR3区，以及各种构架区和支架的核苷酸序列和多肽序列。
在一个实施方案中，优化序列用于表达、生产和临床应用。为临床应用而优化的特征包括但不限于例如半衰期、药物动力学(PK)、抗原性、效应子功能、FcRn清除率和患者应答，包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。
在其他实施方案中，本发明提供了与表18所述的任何一个或多个加阴影的CDR区(SEQ ID NO：49-98)具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列，其中表18提供了本发明抗体的重链可变区(SEQ ID NO：2-20)和轻链可变区(SEQ ID NO：21-39)。在一个实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO：40-48的任何一个或多个所提供的VH链亚类的CDR共有序列，和/或SEQ ID NO：113-118的任何一个或多个所提供的VL链亚类的CDR共有序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。表18的克隆支架序列显示在SEQ ID NO：125-130中。
表18提供了SEQ ID NO：2-39的重链和轻链可变区。SEQ ID NO：99、101、103、105、107、109和111提供了本发明抗体的优化的LC和HC变体的DNA序列，而SEQ ID NO：100、102、104、106、108、110和112分别提供了所编码的多肽序列。在一个实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO：2-39和100、102、104、106、108、110与112所述的任何一个或多个序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO：99、101、103、105、107、109和111所述的任何一个或多个序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的核苷酸序列。
优化的VL链的序列，更具体的是它的DNA正义链、它的相应的反义链及其编码的多肽，分别提供在SEQ ID NO：119-121中。优化的VH链的序列，更具体的是它的DNA正义链、它的相应的反义链及其编码的多肽，分别提供在SEQ ID NO：122-124中。在一个实施方案中，本发明提供了与SEQ IDNO：121或124所述的序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列。在一个相关的实施方案中，本发明提供了与SEQ IDNO：119-120和122-123所述的序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，任何上述分离的抗体是IgG。在相关的实施方案中，任何上述分离的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体是IgE、IgM、IgD或IgA。在相关的实施方案中，本发明选自单克隆或多克隆抗体组合物。在其他实施方案中，抗体是嵌合的、人源化的、人体工程的、重组的，等。
功能性片段包括Fv和Fab片段(包括单链版本，例如scFv)，以及本发明抗体的其他抗原结合区，包括与非免疫球蛋白支架和重链抗体例如骆驼和鲨鱼抗体和纳米抗体相连的那些。在相关的实施方案中，上述分离的抗体是IgG。在另一个相关的实施方案中，上述分离的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体是IgE、IgM、IgD或IgA。在相关的实施方案中，本发明是多克隆抗体组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的人或人源化结合分子或其功能性片段，其具有特异性针对DKK1的表位的抗原结合区，并且结合分子或功能片段结合DKK1或DKK4，或者另外阻断DKK1或DKK4与细胞表面受体(例如受体如LRP5/6、Kremen、Frizzled)的结合。在某些实施方案中，结合分子或其片段预防、治疗或缓解骨溶解性病损的发展。在其他实施方案中，本发明的抗DKK组合物预防、治疗或缓解与DKK1-或DKK4-相关的癌症或疾病。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的人或人源化结合分子或其功能性片段，其具有特异性针对靶DKK1或DKK4的表位的抗原结合区，和所述表位含有来自这样的多肽片段的6个或更多个氨基酸残基，所述多肽片段包含DKK1和/或DKK4的CYS1-接头-CYS2结构域。在相关的实施方案中，表位是构象表位。在一个实施方案中，表位位于CYS2结构域中。在特定的实施方案中，表位包括修饰的氨基酸残基。在相关的实施方案中，表位含有至少一个糖基化的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本发明提供了这样的药物组合物，所述药物组合物具有至少一个任意或多种上述结合分子或功能性片段或保守变体，以及其可药用的载体或赋形剂。
在另一个实施方案中，任意上述人的或人源化的结合分子或其片段是合成的。
在另一个实施方案中，本发明提供了任何上述结合分子或其功能性片段以及额外的治疗剂的药物组合物。额外的治疗剂可以选自抗癌剂；抗骨质疏松剂；抗生素；抗代谢剂；抗糖尿病剂；抗炎剂；抗血管发生剂；生长因子；骨合成代谢剂、体重减轻疗法、抗糖尿病剂、降血脂剂(hypylipidemic agent)、和减肥药(anti-obesity agent)、抗高血压剂、和/或过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂，和细胞因子。
本发明还涉及用下述药剂的组合的预防或治疗哺乳动物特别是人中的与DKK1、DKK4或DKK1/4相关的疾病或病症的方法，所述药剂组合包括：
(a)本发明的DKK1/4结合分子；和
(b)一种或多种药用活性剂；和任选的
(c)可药用的载体；
其中至少一种药用活性剂是抗癌治疗剂。
本发明还涉及药物组合物，包括：
(a)DKK1/4中和剂；和
(b)药用活性剂；和任选的
(c)可药用的载体；
其中至少一种药用活性剂是骨合成代谢剂、体重减轻治疗剂或糖尿病治疗剂。
本发明还涉及商业化包装或产品，包括：
(a)DKK1/4中和性结合分子的药物制剂；和
(b)同时的、共同的、分别的或顺序的使用的药用活性剂的药物制剂；
其中至少一种药用活性剂是抗癌治疗剂、骨合成代谢剂、体重减轻治疗剂或糖尿病治疗剂。
附图简介
图1显示了抗DKK1/4抗体与人DKK1具有高亲和力(2pM)，其结合动力学对于具有该亲和力的抗体是典型的。
图2A显示了全长和截短的DKK1的示意图。
图2B描述了中和性抗DKK1/4抗体与DKK1蛋白的结合。
图3显示了抗DKK1/4抗体竞争性抑制DKK1与LRP6结合。
图4显示了抗DKK1/4抗体重新激活被DKK1抑制的Wnt信号传导，表观EC50为0.16nM。
图5显示了建立的体外测定，用于测量多能性小鼠细胞系C3H10T1/2(10T1/2)的Wnt介导的成骨细胞分化。
图6显示了抗DKK1/4抗体3次给药对肿瘤生长的效应。
图7显示了在用PBS、IgG和抗DKK1/4(抗体)处理的动物中的百分比钙化骨骼。
图8显示了抗DKK1/4抗体表现出类似Zometa的抗溶骨活性。
图9显示了抗DKK1/4抗体的骨合成代谢效率是剂量依赖性的，最小有效剂量在20和60μg/只小鼠3x/周之间。
图10A和图10B显示了Wnt1和DKK1对分化标志物的RNA表达的影响，其中GLUT4蛋白质的表达随Wnt3a和DKK1增加。
图11是用Wnt3a、DKK1和MOR4910(“BHQ880”)处理的细胞的分化标志物PPARγ、C/EBP2和AP2的表达水平的图示。
图12描述了用Western印迹分析的GLUT4水平。
发明详述
本发明涉及分离的DKK1/4结合分子，特别是人抗体的用途，所述分子特异性结合DKK1或DKK4，且抑制DKK1或DKK4的功能特性。在一个实施方案中，DKK1/4结合分子(结合DKK1和/或DKK4的分子)不特异性的结合DKK2或DKK3。
如本文中使用的，“DKK1相关的疾病或病症”或者“DKK4相关的疾病或病症”，或者可选的“DKK1/4相关的疾病或病症”(与DKK1和/或DKK4相关的疾病或病症)，包括但不限于骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤、MGUS、平台型和郁积型骨髓瘤)、恶性纤维状组织细胞增多症或组织细胞瘤(MFH)、神经母细胞瘤、β地中海贫血、肠易激惹综合征、炎性肠病和骨病症。如本文中使用的，对DKK1或DKK4或两者的指代都称为“DKK1/4”。其他此类疾病或病症包括但不限于例如：骨病症，包括但不限于骨折愈合、骨溶解性病损和转移；与移植相关的骨丢失；骨质减少、骨质疏松、骨密度异常、骨肉瘤和骨质溶解。其他此类疾病或病症包括但不限于例如：癌症、各种肌肉和代谢疾病、阿兹海默氏病、风湿病、结肠炎和/或不想要的脱发。还包括脂肪生成、软骨发生和皮肤色素沉着的病症。其他疾病或病症包括但不限于心血管疾病。在相关的实施方案中，待治疗的癌症是：骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤、MGUS、平台型和郁积型骨髓瘤)、下述的癌症或者其转移：骨、乳房、结肠、黑色素细胞、肝细胞、上皮、食道、脑、肺、前列腺或胰腺。如果对象患有或有风险患升高的胆固醇或与升高的胆固醇相关的病况，例如脂类病症(例如，高脂血症、I型、II型、III型、IV型或V型高脂血症、继发性高甘油三酯血症、高胆固醇血症、黄瘤病、胆固醇乙酰转移酶缺陷)，或者如果对象患有心血管疾病或有风险患此类病症，例如由于存在一种或多种风险因子(例如，高血压、吸烟、糖尿病、肥胖或高同种半胱氨酸血症)，则所述对象可能也具有DKK1/4相关性疾病或病症。本申请呈递的数据显示，用DKK1抗体MOR4910处理3T3L1成纤维细胞，抑制其分化为脂肪细胞。对脂肪细胞的抑制可用于与脂肪细胞活性和体脂相关的代谢疾病和病况，例如，肥胖、持续体重减轻和高脂血症，以及癌症患者中的体脂降低。
方法涉及向需要其的对象施用有效量的包含本发明的结合分子的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的结合分子是源自特定重链和轻链序列的抗体，和/或包括特定的结构特征，例如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供了分离的抗体，制备此类抗体的方法，包含此类抗体的免疫缀合物和双特异性分子，以及含有本发明的抗体、免疫缀合物或双特异性分子的药物组合物。如本文提供的，本发明还涉及使用所述抗体抑制与DKK1或DKK4或两者相关的病症或病况的方法。
为了更便于理解本发明，首先定义某些术语。在详细描述中列出其它定义。
术语“免疫应答”指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性损害、破坏或从人体清除侵入性病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌性细胞，或者(在自身免疫或病理炎症的情况下)正常人细胞或组织。
“信号转导通路”指多种信号转导分子之间的生物化学关系，所述分子在信号从细胞的一部分传递到细胞的另一部分中起作用。本文所用的短语“细胞表面受体”包括例如，分子或分子复合体，其能够接受信号并且能够将这种信号经细胞的质膜传递。本发明的“细胞表面受体”的实例是DKK1或DKK4蛋白质分子结合的受体。这类细胞表面受体包括但不限定于Frizzled(Fz)、LRP(LRP5和LRP6)和Kremen(Krm)。
如本文中使用的，术语“结合分子”指特异性识别和结合靶分子的表位的免疫球蛋白和非免疫球蛋白部分。
如本文中使用的，“DKK1/4结合分子”是特异性结合DKK1或DKK4或两者的多肽。在一个实施方案中，DKK1/4结合分子优先结合DKK1，与结合DKK4的亲和力相差约10倍至约1000倍。在一个实施方案中，亲和力的差异是100倍。在一个实施方案中，DKK1/4结合分子不识别DKK2或DKK3多肽。DKK1/4结合分子的实例包括但不限于至少一个CDR片段。本发明的具体的CDR片段可以是本领域已知的多种支架，包括但不限于例如抗体或抗体片段，或特异性识别和结合一种或多种靶分子的表位的免疫球蛋白或非免疫球蛋白部分。
本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、单链抗体及其片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留母体抗体的抗原结合功能的其他片段。同样地，抗体可指免疫球蛋白或糖蛋白，或其片段或部分，或指包括修饰的免疫球蛋白样构架内包含的抗原结合部分的结构，或指包含非免疫球蛋白样构架或支架的结构内包括的抗原结合部分。
本文所用的术语“单克隆抗体”指含有同源抗体群体的抗体组合物。该术语未限定关于抗体的种类或来源，也未旨在由制备的方式所限定。该术语包括全部免疫球蛋白以及片段如Fab、F(ab)2、Fv，以及保留抗体的抗原结合功能的其他片段。在本发明中可使用任一哺乳动物种类的单克隆抗体。然而，实践中，由于大鼠或鼠细胞系在用于制备产生单克隆抗体所需的杂交细胞系或杂交瘤中的实用性，抗体一般将是大鼠或鼠源性的。
本文所用的术语“多克隆抗体”指含有异源抗体群体的抗体组合物。多克隆抗体常源自免疫动物或所选人类的混合血清。
本文所用的短语“单链抗体”指通过测定结合抗体的结合结构域(重链和轻链)，以及提供允许保持结合功能的连接部分制备的抗体。实质上，这形成仅具有结合抗原所需可变结构域的部分的极短缩抗体。单链抗体的测定和构建描述于Ladner等人的美国专利号4,946,778。
“天然存在的抗体”是糖蛋白，其包含通过二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(本文中简写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中简写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。可以将VH和VL进一步细分为高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布着更保守的称作构架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个DR组成，它们从氨基末端到羧基末端以下面的顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述组织或因子包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)指结合靶标的蛋白质序列，例如一个或多个CDR。它包括例如，全长抗体、一个或多个抗体片段，和/或保留抗原(如DKK1)特异性结合能力的非免疫球蛋白相关的支架上的CDR。抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内包括的结合片段的实例包括Fab片段、由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含通过二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，1989Nature 341：544-546)；和分离的互补决定区(CDR)。
本文所用的“抗原”或“表位”可互换使用，指靶蛋白上的多肽序列，所述多肽序列由抗体、抗体片段、结合分子或其等价体的抗原结合部分特异识别。抗原或表位包括在靶序列内连续或非连续的至少六个氨基酸。构象表位可包括非连续残基，并且任选可包括天然或人工修饰的氨基酸残基。对残基的修饰包括但不限定于，磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、泛素化、呋喃化等。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以用重组方法通过合成接头连接，所述接头使得它们成为一条蛋白质链，其中VL和VH区配对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人，1988 Science 242：423-426；和Huston等人，1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。此类单链抗体意在被术语抗体的“抗原结合部分”包括。使用本领域技术人员已知的常规技术得到这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
如本文描述的，保守变体包括任何鉴定的氨基酸序列中的氨基酸残基，特别是蛋白质工程领域任一普通技术人员众所周知的保守改变。
本文所用的“分离的抗体”指抗体，其基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体(例如，特异结合DKK1的分离的抗体基本上无特异结合不同于DKK1的抗原的抗体)。然而，特异结合DKK1的分离的抗体可以与其他抗原，如来自其他物质的DKK1分子，或其他家族成员如DKK4或相关的侧向同源物具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上无其他细胞物质和/或化学品。
本文所用的术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区都来自人来源的序列。此外，如果抗体含有恒定区，那么该恒定区也来自此类人序列，例如，人种系序列，或者人种系序列的突变形式。本发明的人抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变导入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不意在包括这样的抗体，其中来自另一哺乳动物物种如小鼠的种系的CDR序列已经被嫁接到人构架序列上。
术语“人单克隆抗体”指显示出单结合特异性的抗体，其具有可变区，其中构架区和CDR区都来自人序列。在一个实施方案中，通过杂交瘤产生人单克隆抗体，杂交瘤包括来自转基因非人动物，例如转基因小鼠的B细胞，其具有包含与永生细胞融合的人重链转基因和轻链转基因的基因组。
本文所用的术语“人源化抗体”指衍生自人类免疫球蛋白序列的免疫球蛋白构架区的至少一部分。已移植到人类构架序列上的“人源化”抗体如具有CDR序列的抗体源自其他物种的种系，特别是哺乳动物种如小鼠。技术实例包括PDL的人源化技术。
本文所用的术语“人工程化的抗体”指结合相同表位但序列不同的抗体。技术实例包括通过Kalobios的人工程化技术制备的人工程化抗体，其中抗原结合区序列是源于例如突变而非源于保守性氨基酸取代。
本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从对于人免疫球蛋白基因为转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或从其制备的杂交瘤分离的抗体，从被转化而表达人抗体的宿主细胞分离的抗体，例如，从转染瘤分离的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和通过涉及将人免疫球蛋白基因序列的全部或部分剪接成其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来自人种系免疫球蛋白序列。然而，在一些实施方案中，此类重组人抗体可以进行体外诱变(或者，当使用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管来自并且涉及人种系VH和VL序列，但是可以不天然在体内存在于人抗体种系所有组成成分。
本文所用的“同种型”指重链恒定区基因提供的抗体类别(例如IgA、IgD、IgM、IgE、IgG如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。本文所用的“特异性结合人DKK1”的抗体意指以5x 10-9M或更小、2x 10-9M或更小，或1x 10-10M或更小的KD结合到人DKK1的抗体。“与不同于人DKK1的抗原交叉反应”的抗体意指以0.5x 10-8M或更小、5x 10-9M或更小，或2x 10-9M或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指以1.5x 10-8M或更大，或5-10x 10-8M或1x 10-7M或更大的KD结合该抗原的抗体。在某些实施方案中，不与所述抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中显示出对于这些蛋白质的基本上检测不到的结合。
本文所用的“抑制DKK1结合细胞表面受体”的结合分子如LRP、Fz或Krm，指以1nM或更小，0.75nM或更小，0.5nM或更小，或0.25nM或更小的K抑制DKK1结合受体的结合分子。
本文所用的“骨质溶解”指骨密度的减少，其可能由于多种作用机理，包括例如，减少的成骨细胞活性、增加的破骨细胞活性。骨质溶解因此包含通常影响骨矿物质密度的机理。本文所用的“抑制骨质溶解活性”的结合分子意指通过增加骨形成或阻碍骨再吸收来抑制骨密度损失的结合分子。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语″Kdis″或″KD，″意指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文所用的，术语″KD″意指解离常数，其从Kd与Ka的比(即Kd/Ka)得到并且表达为摩尔浓度(M)。可以使用本领域成熟的方法测定抗体的KD值。用于测定抗体KD的方法是通过使用表面等离振子体共振，或者使用生物传感器系统，如Biacore
Figure BDA0000106019950000151
系统。
本文所用的术语“亲和力”指在单个抗原位点上结合分子例如抗体和抗原之间相互作用的强度。在每一抗原位点，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力与抗原在多位点相互作用；相互作用越强，亲和力越强。
本文所用的术语“抗体亲抗原性”指结合分子-抗原复合物全部的稳定性或强度的度量。它由三种主要因素调节：结合分子表位亲和力；结合分子和抗原两者的效价；以及相互作用部分的结构排列。最终这些因素限定结合分子的特异性，即特定结合分子结合到精确的抗原表位的可能性。
为获得更高抗体亲抗原性探针，可构建二聚缀合物(连结FACS标记的两分子JWJ-1)，从而使得低亲和力相互作用(如与种系抗体)通过FACS更易检测到。此外，增加结合抗原的抗体亲抗原性的其他方法包括产生DKK1或DKK4结合分子的任一本文描述的纤连蛋白结构的二聚体或多聚体。可通过各个分子间的共价结合产生这类多聚体，例如，通过模拟天然C至N端结合或通过模拟经其恒定区保持在一起的抗体二聚物。设计进入Fc/Fc界面的键可以是共价的或非共价的。此外，在DKK1或DKK4杂化物中可使用不同于Fc的二聚化或多聚化配偶体以创建这种更有序的结构。
本文所用的术语“交叉反应”指结合分子或结合分子群体结合其他抗原表位。这可由结合分子的低抗体亲抗原性或特异性，或由具有同样或非常相似表位的多个不同抗原引起。当需要大体结合到抗原相关组时，或当抗原表位序列在进化中不是高度保守而尝试跨种标记时，交叉反应有时是所期望的。
本文所用的术语IgG抗体的“高亲和力”或“高特异性”指对靶抗原具有10-8M或更小、10-9M或更小，或10-10M或更小的KD的抗体。然而，“高亲和力”结合可因其他抗体同种型而不同。例如，IgM同种型的“高亲和力”结合指具有10-7M或更小，或10-8M或更小的KD的抗体。
本文所用的术语“对象”包括任何人或非人动物。
术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、奶牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。术语“非人细胞”指不是人起源的任何细胞，其为真核的或原核的，尤其包括脊椎动物、无脊椎动物、微生物、真菌或其他来源的细胞。
本文所用的术语“优化”指已被改变成此类氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列使用在产生的细胞或有机体中优选的密码子，和/或已被改变成除去潜在的剪接供体或剪接受体位点的核酸序列。对于多种物种的优化的密码子表是本领域众所周知的。剪接供体或受体位点的序列也是本领域公知的并且潜在的剪接位点可通过例如分析转录或表达数据来鉴定。产生的细胞包括但不限定于，原核细胞，例如如细菌(大肠杆菌(E.coli))的原核细胞，或真核细胞，例如酵母(如毕赤酵母属(Pichia))、真菌细胞、杆状病毒感染的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、骨髓瘤细胞或人细胞。将优化的核苷酸序列设计成完全保留或尽可能多地保留由也被认为是“母本”序列的启动核苷酸序列最初编码的氨基酸序列和残基数。本文已将优化序列设计成具有在产生的细胞中优选的密码子，然而本文也预见其他真核或原核细胞中这些序列的优化表达。优化核苷酸序列编码的氨基酸序列任选称为优化的。
在相关的实施方案中，本发明的中和抗-DKK1/4组合物的多肽序列以及编码它们的核苷酸进行生产和临床用途的优化。临床使用优化的特征包括但不限定于，例如，半寿期、药物代谢动力学(PK)、抗原性、效应功能、FcRn清除，以及包括抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖细胞毒性(CDC)活性的患者应答。
如本文中使用的，“与DKK1相关的疾病”和/或“与DKK4相关的疾病”(“与DKK1/4相关的疾病”)包括但不限于骨溶解性病损——尤其是与骨髓瘤(尤其是多发性骨髓瘤、MGUS、平台型和郁积型骨髓瘤)相关的骨溶解性病损；或者与下述的癌症或其转移转移相关的骨溶解性病损：骨、乳房、结肠、黑色素细胞、肝细胞、上皮、食道、脑、肺、前列腺或胰腺；与移植相关的骨丢失。其他疾病或病症包括但不限于例如：骨肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌(HCC)、骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤、MGUS、平台型和郁积型骨髓瘤)、糖尿病、肥胖、肌肉萎缩、阿兹海默氏病、骨质疏松、骨质减少、风湿病、结肠炎和/或不想要的脱发。
本文所用的“治疗”是以预防发展或改变病症的病状为目的进行的干预。“治疗”指治疗性处理和预防或预止性措施。需要治疗的个体包括患有病症的个体以及待预防病症的个体。在肿瘤(如癌症)治疗中，治疗剂可直接减少肿瘤细胞的病状，或使肿瘤细胞更易感于通过其他的活性剂如辐射和/或化学疗法的治疗。癌症的“病状”包括危害患者健康的所有现象。这非限定地包括异常或无法控制的细胞生长、转移、干扰邻近细胞的正常功能、异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、炎症或免疫应答的抑制或恶化等。
患有临床疾病、生物化学疾病、放射性疾病或主观疾病(如骨质溶解)的患者治疗，可包括减轻一些或全部这类症状或减少患病诱因。
通常，本发明的中和抗-DKK1/4组合物预防、治疗或改善与DKK1、DKK4或该两者有关，而不是与DKK2、DKK3或Wnt途径的其他调节剂有关的Wnt相关疾病。
本发明的多个方面进一步详细描述于下面部分。
Wnt途径是充质干细胞(MSC)分化成成骨细胞的主要调节因子。它也是活性成骨细胞的重要存活因子。Dickkopf-1(DKK1)是主要在成人骨中表达的Wnt途径拮抗物并且在患有骨质溶解性损伤的骨髓瘤患者中被增量调节。中和抗-DKK1/4的结合分子确实是合成代谢剂，其通过增加成骨细胞的活性同时减少破骨细胞活性来起作用。相反，目前的药物如作为合成代谢剂销售的PTH，实际上增加了成骨细胞和破骨细胞相关的标记。
本发明提供的是选择用于结合DKK1的多克隆和单克隆抗体。在一个实施方案中，本发明的抗体具有针对人DKK1小于10pM的亲和力。在某些实施方案中，抗DKK1抗体与DKK4(Kd～300pM)交叉反应而不与DKK2交叉反应(应用现有方法不可检测)。
在一个实施方案中，将抗-DKK1或抗-DKK4结合分子的表位定位到Cys-2结构域(第189-263位氨基酸)，其被认为负责LRP6和Kremen的结合。在一个实施方案中，该表位包括DKK1或DKK4多肽的Cys-2结构域的至少六个且至多三十个氨基酸残基。在一个实施方案中，表位包括至少六个连续的氨基酸的一段序列。在另一实施方案中，结合位点是非线性的，即包括非连续性的氨基酸残基。在某些实施方案中，结合取决于N-糖基化。仅仅预知Cys-2结构域中的残基256处的一个N-糖基化位点。
在某些实施方案中，本发明的结合分子在小鼠中显示剂量线性药物代谢动力学(AUC)，在小鼠中剂量超过20-200μg/小鼠时具有35-96小时的剂量依赖性终末半寿期。
因此，“抑制”依据本领域公知并描述于本文的方法学测定的一种或多种这些DKK1功能性质(例如，生物化学活性、免疫化学活性、细胞活性、生理学活性或其他生物学活性)的结合分子，将被认为与相对于缺乏结合分子时(例如，或当无相关特异性的对照结合分子存在时)所显示的特定活性的统计学显著降低相关。抑制DKK1活性的结合分子影响这类统计学显著降低至少10％的测量参数，至少50％、80％或90％，并且在某些实施方案中本发明结合分子可抑制大于95％、98％或99％的DKK1功能性活性。
Dickkopf家族成员
本发明的DKK多肽包括DKK1(SEQ ID NO：1)和DKK4(SEQ ID NO：133)，以及DKK2(SEQ ID NO：131)和DKK3(SEQ ID NO：132)。DKK家族成员具有示于表A-DKK1家族成员堆积(pileup)中的两个CYS结构域(CYS1和CYS2)。DKK蛋白质包含酸性N端信号肽、由分枝连接区(divergent linker region)隔开的含半胱氨酸残基簇的两个CYS结构域，以及潜在的C末端N糖基化位点。DKK4中的CYS2结构域具有可在质膜上促进WNT/DKK相互作用的脂质结合功能。OMIM登录号605417。
Figure BDA0000106019950000191
Figure BDA0000106019950000201
抗DKK1和DKK4的抗体结合分子
在一个实施方案中，本发明的结合分子特异性针对人DKK蛋白。在一个实施方案中，本发明的结合分子特异性针对人DKK1或DKK4蛋白，或两者。
DKK1或DKK4中和结合分子与肿瘤诱发相关的Wnt途径修饰不同。Wnt途径由细胞外配基、受体和DKK1仅是拮抗物之一的复杂网络调节。由于成人中DKK1的限制性表达及其与其他Wnt拮抗物的功能冗余，中和DKK1的结合分子不太可能引起Wnt信号传导或所致的肿瘤发生的广泛激活。这另外由两个观察所支持：首先，激活的LRP5突变(抑制DKK结合)诱导高骨量表型但没有明显增加癌症风险[Moon 2004]，而DKK1杂合裸细胞或双脊小鼠(Doubleridge mice)具有降低的DKK1水平、高骨量表型，但未报道具有增加的肿瘤形成概率[MacDonald 2004]。
抗DKK1结合分子应积极影响骨髓瘤诱导的溶骨性疾病而不增加从头的(de novo)肿瘤发生的风险。期望与抗肿瘤化学疗法以及可能与抑制破骨细胞功能的抗骨再吸收药物组合使用这类结合分子。本文中提供了其他的治疗组合。
中和DKK1、DKK4或两者的结合分子可以是抗体。
多克隆抗体
本发明的抗体可以是多克隆抗体，尤其是人的多克隆抗体。多克隆源自免疫的动物或选定的人的混合血清。
单克隆抗体
在一个实施方案中，本发明的抗体是如实施例1-8所述的分离的和结构表征的人单克隆抗体。所述抗体的VH氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：2-20。所述抗体的VL氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：21-39。
可将抗体的VH氨基酸序列优化，例如示于SEQ ID NO：124中的序列，以用于在哺乳动物细胞中表达。可将抗体的VL氨基酸序列优化，例如示于SEQ ID NO：121中的序列，以用于在哺乳动物细胞中表达。同样，可将序列优化用于在例如酵母、细菌、仓鼠和其他细胞中表达，这取决于优选的特征优化表达系统。本发明的其他抗体包括已经被突变，然而在CDR区中与上述序列中描述的CDR区具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸。
在一个实施方案中，全长的优化的轻链亲本核苷酸序列显示在SEQ IDNO：99、101、103和105中。全长的优化的重链亲本核苷酸序列显示在SEQID NO：107、109和111中。此类全长LC和HC核苷酸序列可经进一步优化用于在哺乳动物细胞中表达。由这些优化的轻链亲本核苷酸序列编码的全长轻链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：100、102、104和106中。由这些优化的重链亲本核苷酸序列编码的全长重链氨基酸序列显示在SEQ ID NO：108、110和112。本发明的其他抗体包括已突变，但仍与本文和上文所述的本发明序列具有至少60、70、80、90、95、96、97、98或99百分比同一性的氨基酸或核酸。
因为这些抗体的每一种都可以结合DKK1，所以，可以将VH、VL序列、全长轻链和全长重链序列(核苷酸序列和氨基酸序列)“混合和匹配”以产生本发明的其他抗DKK1结合分子。可以使用上述和实施例中所述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合和匹配的”抗体的DKK1结合。当VH和VL链被混合和匹配时，来自具体VH/VL配对的VH序列应该用结构上相似的VH序列置换。同样，来自具体VH/VL配对的VL序列应该用结构上相似的VL序列置换。同样，来自具体全长重链/全长轻链配对的全长轻链序列应该用结构上相似的全长轻链序列置换。本发明抗体的VH、VL、全长轻链和全长重链序列尤其服从混合和匹配，因为这些抗体使用来自相同种系序列的VH、VL、全长轻链和全长重链序列，并且从而显示出结构相似性。
因此，一方面，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其具有：包含选自SEQ ID NO：2-20和124的氨基酸序列的VH区；以及包含选自SEQ ID NO：21-39和121的氨基酸序列的VL区；其中该抗体特异性结合DKK1。
重链和轻链组合的实例包括：包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的VH区和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的VL区；或包含SEQ ID NO：3的VH区和包含SEQ ID NO：22的VL区；或包含SEQ ID NO：4的VH区和包含SEQ ID NO：23的VL区；或包含SEQ ID NO：5的VH区和包含SEQ IDNO：24的VL区；或包含SEQ ID NO：6的VH区和包含SEQ ID NO：25的VL区；或包含SEQ ID NO：7的VH区和包含SEQ ID NO：28的VL区；或包含SEQ ID NO：8的VH区和包含SEQ ID NO：29的VL区；或包含SEQID NO：9的VH区和包含SEQ ID NO：30的VL区；或包含SEQ ID NO：10的VH区和包含SEQ ID NO：31的VL区；或包含SEQ ID NO：11的VH区和包含SEQ ID NO：32的VL区；或包含SEQ ID NO：12的VH区和包含SEQ ID NO：33的VL区；或包含SEQ ID NO：124的VH区和包含SEQ IDNO：121的VL区。
在另一个方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，具有：包含选自的SEQ ID NO：108、110和112的氨基酸序列的全长重链；和包含选自的SEQ ID NO：100、102、104和106的氨基酸序列的全长轻链。
因此，全长重链和全长轻链组合的实例分别包括：SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：100；或SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：102；或SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：104；或SEQ ID NO：112和SEQ ID NO：106。
在另一个方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括由选自SEQ ID NO：107、109和111的核苷酸序列编码的全长重链；和由选自SEQ ID NO：99、101、103和105的核苷酸序列编码的全长优化轻链。
因此，可组合的分别编码全长重链和轻链的核苷酸的实例包括：SEQID NO：107和99；或SEQ ID NO：109和101；或SEQ ID NO：111和103；或SEQ ID NO：111和105。
在另一个方面，本发明提供了这样的抗体，所述抗体包括抗体的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合。本发明抗体的VH链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2-20中。其各自的VH CDR1氨基酸序列由SEQ IDNO：49-52提供。其各自的VH CDR2氨基酸序列由SEQ ID NO：53-63提供。其各自的VH CDR3氨基酸序列由SEQ ID NO：64-69提供。本发明抗体的VLκ和λ轻链的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：21-39中。其各自的VL CDR1氨基酸序列由SEQ ID NO：70-74提供。其各自的VL CDR2氨基酸序列由SEQID NO：75-79提供。其各自的VL CDR3氨基酸序列由SEQ ID NO：80-98提供。使用Kabat系统描述CDR区(Kabat，E.A.，等人，1991Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and人Services，NIH Publication No.91-3242)。
考虑到这些抗体的每一种可以结合DKK1并且抗原结合特异性主要通过CDR1、2和3区提供，可以将VH CDR1、2和3序列与VL CDR1、2和3序列“混合和匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以被混合和匹配，尽管每个抗体必须含有VH CDR1、2和3和VL CDR1、2和3)以产生本发明的其他抗DKK1结合分子。可以使用上文和实施例中描述的结合测定法(例如，ELISA)测试此类“混合和匹配的”抗体的DKK1结合。当混合和匹配VH CDR序列时，来自具体VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。同样，当混合和匹配VL CDR序列时，来自具体VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列应该用结构上相似的CDR序列置换。此外，具体VH或VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列可特定或随机突变以产生可检测亲和力或结合特性的抗体。技术人员将容易显而易见的是，对于本发明的单克隆抗体，通过用来自本文所示CDR序列的结构上相似的序列替代一个或多个VH和/或VL CDR序列，可以产生新的VH和VL序列。
分离的单克隆抗体或其抗原结合部分具有：包含选自SEQ ID NO：2-5、8-11、20的氨基酸序列的VH区CDR1以(序列号)49-52提供；包含选自SEQID NO：2-20的氨基酸序列的VH区CDR2以SEQ ID NO：53-63提供；包含选自SEQ ID NO：2-20的氨基酸序列的VH区CDR3以SEQ ID NO：64-69提供；包含选自SEQ ID NO：21-39的氨基酸序列的VL区CDR1以SEQ ID NO：70-74提供；包含选自SEQ ID NO：21-39的氨基酸序列的VL区CDR2以SEQID NO：75-79提供；并且包含选自SEQ ID NO：21-39的氨基酸序列的VL区CDR3以SEQ ID NO：80-98提供；其中所述抗体特异性结合DKK1。
在一个实施方案中，本发明的抗体由包含SEQ ID NO：69的VH区CDR3和包含SEQ ID NO：80的VL区CDR3组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体由包含SEQ ID NO：64的VH区CDR3和包含SEQ ID NO：81的VL区CDR3组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体由包含SEQ ID NO：65的VH区CDR3和包含SEQ ID NO：82的VL区CDR3组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体由包含SEQ ID NO：66的VH区CDR3和包含SEQ ID NO：87的VL区CDR3组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体由包含SEQ ID NO：67的VH区CDR3和包含SEQ ID NO：92的VL区CDR3组成。
在一个实施方案中，本发明的抗体由包含SEQ ID NO：68的VH区CDR3和包含SEQ ID NO：98的VL区CDR3组成。
如本文所用的，人抗体包含重链或VL区或全长重链或轻链，如果该抗体的可变区或全长链从使用人种系免疫球蛋白基因的系统得到，那么所述可变区或全长链是特定种系序列的“产物”或“来自”该特定种系序列。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“来自”所述序列的人抗体可以如下鉴定：通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与人抗体的序列最接近(即，最大的％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或者“来自”所述序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或者有意引入位点定向诱变而与种系序列相比含有氨基酸差异。然而，所选的人抗体通常与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少90％同一并且含有这样的氨基酸残基，当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)比较时，所述氨基酸残基将所述人抗体鉴定为人的。在一些情况中，人抗体可以在氨基酸序列上与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％、或至少95％、或甚至至少96％、97％、98％、或99％同一。通常，来自具体人种系序列的人抗体将显示出与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过10个氨基酸差异。在一些情况中，人抗体可以显示出与种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
同源抗体
在另一实施方案中，本发明的抗体具有全长重链和轻链氨基酸序列，全长重链和轻链核苷酸序列，可变区重链和轻链核苷酸序列，或可变区重链和轻链氨基酸序列，其与本文所述抗体的氨基酸和核苷酸序列同源，并且其中所述抗体保留本发明中和抗DKK 1/4组合物所希望的功能性质。
例如，本发明提供分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包括VH区和VL区，其中：VH区包含与选自SEQ ID NO：2-20和124的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；VL区包含与选自SEQ ID NO：21-39和121的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；该抗体特异性结合DKK1和/或DKK4，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体中和DKK1蛋白质与LRP6、Fz和/或Krm的结合，或抗体中和DKK4蛋白质与LRP、Pz和/或Krm的结合。
在另一实例中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：108、110和112的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：100、102、104和106的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在另一实施例中，本发明提供分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：107、109和111的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：99、101、103和105的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在另一实例中，本发明提供已进行细胞中表达的优化的分离的单克隆抗体或抗原结合部分，其包括全长重链和全长轻链，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：108-110的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：104-107的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在另一实例中，本发明提供已进行细胞中表达的优化的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括VH区和VL区，其中：全长重链包含与选自SEQ ID NO：121的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；全长轻链包含与选自SEQ ID NO：120的核苷酸序列至少80％同源的核苷酸序列；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下性质：抗体抑制DKK1与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
如本文所用的，两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是这两个序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性等于相同位置数/位置总数×100)，考虑缺口数、每个缺口的长度，它们被引入以进行两个序列的最佳比对。可以使用如下面的非限制性实例中所述的数学算法完成序列的比较和两个序列之间同一性百分数的确定。
可以使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.，4：11-17，1988)的算法，使用PAM120权重残基表、缺口长度罚分12和缺口罚分4，确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数，该算法已经被结合到ALIGN程序(版本2.0)中。此外，可以使用整合到GCG软件包(可以在http://www.gcg.com得到)的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol，Biol.48：444-453，1970)算法，使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，和缺口权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6确定两个氨基酸序列之间的同一性百分数。
额外或备选地，本发明的蛋白质序列还可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如鉴定相关的序列。可以使用Altschul，等人，1990J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(版本2.0)进行此类搜索。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3进行BLAST蛋白质搜索来得到与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了得到用于比较目的的缺口比对，可以用如Altschul等人，1997Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的缺口BLAST。当利用BLAST和缺口BLAST时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明的抗体具有由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的VH区和由CDR1、CDR2和CDR3序列组成的VL区，其中这些CDR序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的中和抗DKK1/4组合物的所需功能性质。因此，本发明提供了分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，由组成为CDR1、CDR2和CDR3序列的VH区，和组成为CDR1、CDR2和CDR3序列的VL区组成，其中：VH可变区的CDR1序列选自SEQ ID NO：49-52，及其保守性修饰；VH可变区的CDR2序列选自SEQ ID NO：53-63，及其保守性修饰；VH可变区的CDR3序列选自SEQ ID NO：64-69，及其保守性修饰；VL可变区的CDR1序列选自SEQ ID NO：70-74，及其保守性修饰；VL可变区的CDR2序列选自SEQ ID NO：75-79，及其保守性修饰；VL可变区的CDR3序列选自SEQ ID NO：80-98，及其保守性修饰；所述抗体特异性结合DKK1；且所述抗体表现出至少一种下列功能特性：所述抗体抑制DKK1蛋白与DKK1受体的结合，或者所述抗体抑制DKK1受体结合以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在其他的实施方案中，本发明抗体具有全长重链序列和全长轻链序列，其中一种或多种这些序列具有基于本文描述的抗体或其保守修饰的特定氨基酸序列，并且其中所述抗体保留本发明的中和抗DKK1/4组合物的所希望的功能性质。因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括全长重链序列和全长轻链序列，其中：全长重链具有选自SEQ IDNO：108、110和112的氨基酸序列及其保守修饰；并且全长轻链具有选自SEQ ID NO：100、102、104和106的氨基酸序列及其保守修饰；该抗体特异性结合DKK1；并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在其他的实施方案中，为在细胞中表达进行优化的本发明抗体具有VH区序列和VL区序列，其中这些序列中的一个或多个具有基于本文所述抗体的特定氨基酸序列或者其保守修饰，并且其中所述抗体保留本发明的中和抗DKK1/4组合物的所需功能性质。因此，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括VH区和VL区，其中：VH区具有选自SEQ IDNO：124的氨基酸序列及其保守修饰；VL区具有选自SEQ ID NO：121的氨基酸序列及其保守修饰；该抗体特异性结合DKK1，并且抗体显示至少一种以下功能性质：抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨质溶解，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善骨溶解性病损，或抗体抑制DKK1受体的结合，以预防或改善癌症。
在多种实施方案中，抗体可以显示出本文讨论的功能性质的一种或多种、两种或多种，或三种或多种。该抗体可以是例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
本文所用的术语“保守序列修饰”意指氨基酸修饰，其不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，如位点定向诱变和PCR介导的诱变向本发明的抗体中引入修饰。
保守氨基酸取代是其中将氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分枝侧链氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。从而，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以用来自相同侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试经改变的抗体所保留的功能。
结合到与本发明的中和抗DKK1/4组合物相同表位的抗体
在另一实施方案中，本发明提供了结合与本文提供的本发明的多种中和抗DKK1/4组合物相同表位的抗体。此类额外的抗体可以基于它们在标准DKK1结合测定法中与本发明的其他抗体交叉竞争(即，以统计学显著方式竞争性抑制结合)来鉴定。受试抗体抑制本发明的抗体与人DKK1结合的能力表明该受试抗体与本发明抗体竞争结合人DKK1；根据非限制性理论，这种抗体可以与它所竞争的抗体结合人DKK1上相同或相关的(例如，结构上相似或空间上接近的)表位。在一些实施方案中，与本发明的抗体结合人DKK1上相同表位的抗体是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以如实施例中所述的制备和分离。
骆驼的和其他的重链抗体
获自包括新界成员如美洲驼(llama)物种(羊驼(Lama paccos)、原驼(Lama glama)和瘦驼(Lama vicugna))的骆驼和单峰骆驼家族成员(双峰驼(Camelus bactrianus)和Camelus dromaderius)的抗体蛋白质已为人类对象表征了大小、结构复杂性和抗原性。哺乳动物该家族的某些IgG抗体缺乏轻链。它们因此在结构上不同于在其他动物的抗体中发现的典型的四链四级结构(含两条重链和两条轻链)。见PCT/EP93/02214(WO 94/04678，公开于1994年3月3日)。
鉴定为VHH的小单链可变域的骆驼抗体区可通过基因工程获得以产生对靶标具有高亲和力的小蛋白质，结果形成已知为“骆驼抗体”的低分子量的源自抗体的蛋白质。见美国专利号5,759,808，出版于1998年6月2日，也见Stijlemans，B.等人2004J Biol Chem 279：1256-1261，Dumoulin，M.等人，2003 Nature 424：783-788，Pleschberger，M.等人2003 BioconjugateChem 14：440-448，Cortez-Retamozo，V.等人2002 Int J Cancer 89：456-62，以及Lauwereys，M.等人1998 EMBO J 17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的工程化文库通过商业途径获得，例如，来自Ablynx、Ghent、Belgium。与非人源的其他抗体一样，可重组改变骆驼抗体的氨基酸序列以获得更相似于人类序列的序列，即可将纳米抗体“人源化”。因此可将骆驼抗体对人类的天然低抗原性进一步降低。
骆驼抗体具有人类IgG分子的大约十分之一的分子量，并且该蛋白质具有仅仅几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是骆驼纳米抗体结合到对于较大抗体蛋白质是功能不可见的抗原位点的能力，即骆驼纳米抗体可用作检测抗原的试剂，否则使用典型的免疫学技术是隐蔽的，以及作为可能的治疗制剂。因此小尺寸的另一个结果是骆驼纳米抗体由于能够抑制结合到靶蛋白的凹槽或窄裂缝中的特异位点，因而能够提供比典型抗体更相似于典型低分子量药物的功能的能力。
低分子量和紧凑尺寸进一步导致骆驼纳米抗体极端耐热，对极端pH和蛋白酶解消化稳定，并且是低抗原性的。另一个结果是骆驼纳米抗体易于从循环系统转移进组织，并且甚至穿过血脑屏障而可以治疗影响神经组织的病症。纳米抗体可进一步促进穿过血脑屏障的药物转运。参见美国专利申请20040161738，2004公开于8月19日。组合这些对人类低抗原性的特征显示很大的治疗潜力。另外，这些分子在原核细胞如大肠杆菌中可完整表达并且作为与噬菌体的融合蛋白表达并具有功能。
因此，本发明的特征是对DKK1具有高亲和力的骆驼抗体或纳米抗体。在本文的某些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼类动物中天然产生的，即用DKK1或其肽片段免疫后的骆驼产生的，对其他抗体使用本文所述技术。备选地，中和抗DKK1/4骆驼纳米抗体是工程化的，即使用如本文实施例中所述的以DKK1和/或DKK4作为靶标的筛选程序，通过例如从噬菌体展示文库中选择产生适当突变的骆驼纳米抗体蛋白质。工程化的纳米抗体可进一步通过基因工程定制，使其在受体对象中具有从45分钟到两周的半寿期。
除了骆驼抗体，重链抗体天然产生于其他动物，所述动物包括但不限定于例如鲨鱼和河豚鱼的某些物种(参见例如PCT公开WO 03/014161)。尽管源自这些重链抗体的可变域可使用于本发明，但源自骆驼的重链抗体和/或其可变结构域序列的用途优选最优化、人源化、人工程化等和/或用于人类临床用途。
工程化和修饰的抗体
还可以使用具有本文所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为起始物质进一步制备本发明的抗体以工程化修饰的抗体，该修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的形式。通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)，例如，一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的可变区，可以工程化抗体。额外或备选地，通过修饰恒定区内的残基，例如，以改变抗体的效应功能来工程化抗体。
可以进行的一种类型的可变区工程化是CDR嫁接。抗体主要通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。为此，各抗体之间CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列更多样化。因为CDR序列负责多数抗体-抗原相互作用，所以可能通过构建表达载体表达重组抗体，其模拟特定天然存在的抗体的性质，所述表达载体包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列，其嫁接到来自具有不同性质的不同抗体的构架区上(见例如，Riechmann，L.等人，1998 Nature 332：323-327；Jones，P.等人，1986 Nature 321：522-525；Queen，C.等人，1989 Proc.Natl.Acad.See.U.S.A.86：10029-10033；winter的美国专利号5,225,539，和Queen等人的美国专利号530101；5585089；5693762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的单克隆抗体，或其抗原结合部分，包括这样的VH区和VL区，所述VH区分别包含：具有选自SEQID NO：49-52和40-43的氨基酸序列的CDR1区；具有选自SEQ ID NO：53-63和44-47的氨基酸序列的CDR2区；具有选自SEQ ID NO：64-69和48的氨基酸序列的CDR3区；所述VL区分别包含具有选自SEQ ID NO：70-74、113和116的氨基酸序列的CDR1区；具有选自SEQ ID NO：75-79、114和117的氨基酸序列的CDR2区；和组成为选自SEQ ID NO：80-98、115和118的氨基酸序列的CDR3区。因而，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，但可能含有与这类抗体不同的构架序列。
此类构架序列可以从公共DNA数据库或公布的参考文献得到，其包括种系抗体基因序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在″VBase″人种系序列数据库(可以在英特网网址www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获取)，以及在Kabat，E.A.，等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242；Tomlinson，I.M.，等人，1992 J.fol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等人，1994 Eur.JImmunol.24：827-836中找到，将它们都明确引入本文作为参考。
用于本发明抗体的构架序列的实例是与所选的本发明抗体使用的构架序列，例如，本发明的单克隆抗体使用的共有序列和/或构架序列结构上相似的那些构架序列。可以将VH CDR1、2和3序列，和VL CDR1、2和3嫁接在构架区上，该构架区具有与该构架序列所来源的种系免疫球蛋白基因中发现的相同序列，或者可以将CDR序列嫁接在构架区上，该构架区与种系序列相比具有一个或多个突变。例如，已经发现在一些情况中，有益的是突变构架区内的残基以保持或增强抗体的抗原结合能力(见，例如，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
另一类型的可变区修饰是突变VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基从而提高目的抗体的一种或多种结合性质(例如，亲和力)，称作“亲和力成熟”。可以进行位点定向诱变或者PCR介导的诱变以以导入突变，并且可以用如本文所述的和实施例中提供的体外或体内测定法评估对抗体结合或者其他目的功能性质的影响。可以引入保守修饰(如上文讨论)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了分离的中和性抗DKK1/4组合物，或其抗原结合部分，由这样的VH区和VL区组成，所述VH区具有：选自SEQ ID NO：49-52的氨基酸序列或相比SEQ ID NO：49-52具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列组成的VH CDR1区；具有选自SEQ ID NO：53-63的氨基酸序列或相比SEQ ID NO：53-63具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的的VH CDR2区；具有选自SEQ ID NO：64-69的氨基酸序列或相比SEQ ID NO：64-69具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的的VH CDR3区；所述VL区具有：具有选自SEQ ID NO：70-74的氨基酸序列或相比SEQ ID NO：70-74具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR1区；具有选自SEQ ID NO：75-79的氨基酸序列或相比SEQ ID NO：75-79具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR2区；和具有选自SEQ ID NO：80-98的氨基酸序列或相比SEQ ID NO：80-98具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列的VL CDR3区。
本发明的经工程化的抗体包括这样的抗体，其中已经对VH和/或VL内的构架残基进行修饰以例如改善抗体的性质。通常，进行此类构架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是“回复突变”一个或多个构架残基成对应的种系序列。更特别地，已经经历体细胞突变的抗体可以含有与该抗体所来源的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与该抗体所来源的种系序列可以鉴定此类残基。为了使构架区序列回复到它们的种系构型，可以例如通过位点定向诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”成种系序列。此类“回复突变”抗体也意在被本发明包括。
另一类型的构架修饰涉及突变构架区内，或者甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以除去T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也称作“去免疫”并且在Carr等人的美国专利公布号20030153043中进一步详细描述。
作为在构架或CDR区内进行修饰，额外或备选地可以工程化本发明的抗体以包括Fc区内的修饰，通常改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半寿期、补体固定、Fc受体结合，和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以连接到抗体)或经修饰而改变它的糖基化，再次改变该抗体的一种或多种功能性质。这些实施方案的每一个都在下面详细描述。Fc区内的残基编号为Kabat的EU指数编号。
在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区使得改变，例如，增加或减少铰链区中半胱氨酸残基的数目。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基数目以例如方便轻链和重链的装配或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，将抗体的Fc铰链区突变以降低该抗体的生物学半寿期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变导入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，使得该抗体相对于天然Fc铰链结构域SpA结合具有受损的葡萄球菌A蛋白(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一实施方案中，修饰抗体以增加其生物学半寿期。多种方法是可能的。例如，可以导入一个或多个下面的突变：T252L、T254S、T256F，如Ward的美国专利号6,277,375所述。备选地，为了延长生物学半寿期，可以在抗体的CH1或CL区内改变以含有从IgG的Fc区的CH2结构域的两个环得到的回复受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中描述。
在其他实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基用不同的氨基酸残基置换以改变抗体的效应子功能来改变Fc区。例如，一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得该抗体对于效应配体具有改变的亲和力但是保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如，Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详述。
在另一实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同氨基酸残基置换使得该抗体具有改变的C1q结合和/或减小或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详述。
在另一实施方案中，改变一个或多个氨基酸残基从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。
在另一实施方案中，通过修饰一个或多个氨基酸修饰Fc区以增加该抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法在Presta的PCT公布号WO 00/42072中进一步描述。此外，已经为人IgG1对FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点作图并且已经描述了具有提高的结合的变体(见Shields，R.L.等人，2001 J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化抗体(即，缺少糖基化的抗体)。可以改变糖基化以例如，增加抗体对“抗原”的亲和力。此类糖类修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，其导致去除一个或多个可变区构架糖基化位点，从而去除该位点的糖基化。此类无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述。
额外或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化抗体或者具有增加的等分GlcNac结构的抗体。已经表明此类改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。通过例如在具有改变的糖基化系统的宿主细胞中表达抗体完成此类糖类修饰。具有改变的糖基化系统的细胞已经在本文中描述并且可以用作宿主细胞，在其中表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能被破坏的FUT8基因的细胞系，所述FUT8基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的糖类的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(也见Shields，R.L.等人，2002J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了细胞系，其被工程化而表达修饰糖蛋白的岩藻糖基转移酶(例如，β(1，4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII)，使得在该工程化细胞系中表达的抗体显示出增加的等分GlcNac结构，其导致抗体增加的ADCC活性(也见Umana等人，1999Nat.Biotech.17：176-180)。
本发明设想的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化，例如，以延长该抗体的生物学(例如，血清)半寿期。为了聚乙二醇化抗体，通常将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，如PEG的活性酯或醛衍生物在这样的条件下反应，在所述条件下，一个或多个PEG基团变得附着到抗体或抗体片段。通过用反应性PEG分子(或其类似的反应性水溶性聚合物)进行酰化反应或烷基化反应，可以进行聚乙二醇化。本文所用的术语“聚乙二醇”意在包括任一形式的PEG，其已经被用于衍生其他蛋白质，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基聚乙二醇或者聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。聚乙二醇化蛋白质的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
工程化抗体的方法
如上面讨论，具有本文所示的VH和VL序列，或全长重链和轻链序列的抗DKK1抗体可以用于通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或其连接的恒定区而产生新的抗DKK1/4抗体。从而，在本发明的另一方面，本发明的抗DKK1抗体的结构特征用于产生结构相关的抗DKK1/4抗体，其保留本发明抗体的至少一种功能性质，如结合人DKK1或DKK4或其两者，以及也抑制DKK1或DKK4或其两者的一种或多种功能性质。
可以用标准分子生物学技术制备和表达改变的抗体序列。所改变的抗体序列编码的抗体是保留本文所述的中和抗DKK1/4组合物的一种、一些或所有功能性质的抗体，其功能性质包括但不限于，特异性结合人DKK1；和显示出至少一种下面的功能性质的抗体：该抗体抑制DKK1蛋白质与DKK1受体的结合，或该抗体抑制DKK1受体结合，以预防或改善骨质溶解；或该抗体抑制DKK1受体结合，以预防或改善骨溶解性病损；或该抗体抑制抑制DKK1受体结合，以预防或改善癌症。
可以使用本领域中可得的和/或本文所述的标准测定法，如实施例中给出的那些(例如，ELISA)评估改变的抗体的功能性质。
在工程化本发明抗体的方法的一些实施方案中，可以沿着抗DKK1抗体编码序列的全部或者部分随机或者选择性导入突变，并可以对得到的经修饰的抗DKK1抗体筛选如本文所述的结合活性和/或其他功能性质。突变方法已经在本领域描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接装配，或者其组合产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法优化抗体的理化性质的方法。
抗体的Fc恒定区对确定血清半寿期和效应功能，即抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性是至关重要的。可设计Fc片段的特定突变以改变效应功能和/或血清半寿期(参见例如Xencortechno1ogy，也参见例如WO2004029207)。
改变抗体的效应功能和血清半寿期的一种方法是嫁接具有适当效应功能的Fc片段的抗体片段的可变区。可针对细胞杀伤活性来选择IgG1或IgG4同种型，而IgG2同种型可用于沉默或中和抗体(不具有细胞杀伤活性)。
通过用血清蛋白如HSA或结合到这种血清蛋白的蛋白质如HSA结合蛋白制备抗体可变区的嵌合融合物，以获得具有长血清半寿期的沉默抗体。
效应功能也可通过调节抗体的糖基化模式来改变。Glycart(例如US6,602,684)、Biowa(例如US6,946,292)和Genentech(例如WO03/035835)已将哺乳动物细胞系工程化为产生具有增加的或减少的效应功能的抗体。具体地，非岩藻糖基化的抗体将具有增强的ADCC活性。Glycofi也已开发能产生抗体的特定糖形的酵母细胞系。
更完整的公开可见于Shulok等人的WO2007/084344。
编码本发明抗体的核酸分子
本发明的另一个方面涉及编码本发明抗体的核酸分子。全长轻链亲本核苷酸序列的实例可见于Shulok等人的WO2007/084344。
本发明单克隆抗体的制备
可以通过多种技术产生单克隆抗体(mAb)，所述技术包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein，1975 Nature 256：495的标准体细胞杂交技术。可以使用多种用于产生单克隆抗体的技术，例如，B淋巴细胞的病毒或癌基因转化。
可以如Shulok等人的WO2007/084344中提供的制备本发明的杂交瘤、嵌合或人源化抗体。
药物组合物
另一方面，本发明提供了组合物，例如，药物组合物，其含有本发明的中和抗DKK1/4组合物或其抗原结合部分之一或组合，与可药用载体一起配制。此类组合物可以包括本发明的抗体或免疫缀合物或双特异性分子之一或组合(例如，两种或多种不同抗体的组合)。例如，本发明的药物组合物可以包含结合靶抗原上不同表位或者具有互补活性的抗体(或者免疫缀合物或双特异性分子)的组合。
也可以以组合疗法，即与其他药剂相组合来施用本发明的药物组合物。
在一个实施方案中，将本发明的DKK1/4结合分子与唑来膦酸组合施用。
在一个实施方案中，组合疗法可以包括本发明的抗DKK1抗体组合至少一种其他的抗炎剂或抗骨质疏松剂，或组合骨合成代谢、体重减轻疗法和/或糖尿病疗法。可用于组合疗法中的治疗剂的实例更详细的描述在下文中使用本发明抗体的章节中。
本文所用的“可药用载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂，等等。载体应该适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或灌注)，或者直接注射到溶解性病损中，例如骨中。取决于施用途径，活性化合物，即抗体、免疫缀合物，或双特异性分子可以用材料包衣以保护化合物免于酸和可以失活该化合物的其他自然条件的作用。
本发明的药物化合物可以包括一种或多种可药用盐。“可药用盐”指保留亲本化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何不希望的毒理学效应的盐(见例如，Berge，S.M.，等人，1977 J.Pharm.Sci.66：1-19)。此类盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括来自无毒无机酸的盐，如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸的盐，等等，以及来自无毒有机酸的盐，所述无毒有机酸为如脂肪族一或二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸，等等。碱加成盐包括来自碱土金属如钠、钾、镁、钙等等的那些盐，以及来自无毒有机胺的盐，所述无毒有机胺为如N，N′-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因，等等。
本发明的药物组合物还可以包括可药用抗氧化剂。可药用抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等等；油可溶的抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α生育酚，等等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸，等等。
可以用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物，植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小，和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。微生物存在的防止可以通过本领域已知的消毒程序，例如辐射、过滤，或包括抗细菌和抗真菌剂来确保，所述抗细菌和抗真菌剂为例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸。还希望在组合物中包括等渗剂，如糖、氯化钠等等。此外，通过包括延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶可以引起可注射药物形式的延长吸收。
可药用载体包括无菌水溶液或分散体和无菌粉剂，其用于临时制备无菌注射液或分散体。此类介质和试剂在药用活性剂中的用途是本领域已知的。除了与活性化合物不相容的常规介质或试剂之外，预期其用于本发明的药物组合物。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。
治疗组合物通常必须是在生产和保存条件下是无菌的和稳定的。可以将组合物配制成溶液剂、微乳剂、脂质体或适于高药物浓度的其他有序结构。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)，和其合适的混合物。可以保持适当流动性，例如，通过使用包衣，如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂。在许多情况中，可以在组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇，如甘露醇，山梨醇，或者氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延缓吸收的物质，如单硬脂酸盐和明胶来实现。
通过将活性化合物以所需的量在合适的溶剂中与上面列举的成分之一或者组合掺和，如果需要，接着无菌微量过滤来制备无菌注射溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌载体制备分散体，所述载体含有基本分散介质和来自上面列举的那些成分的所需的其他成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其之前无菌过滤溶液的任何额外的所需成分的粉末。
可以与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将取决于被治疗的对象、具体施用方式而变。可以与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果的组合物的量。通常，以百分比计，该量将为约0.01％到约99％活性成分、约0.1％到约70％，或约1％到约30％活性成分与可药用载体组合。
调节剂量方案以提供最佳的目的应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次快速浓注，可以随时间施用几个分份剂量，或者可以根据治疗情况的紧迫性成比例地减小或增加剂量。特别有利的是以剂量单位形式配制肠胃外组合物以容易施用和剂量统一。如本文所用的剂量单位形式指适宜作为待治疗对象的单一剂量的物理上分散的单位；每个单位含有预定量的活性成分，所述量经计算以与所需的药物载体结合产生所希望的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规格由如下决定并且直接依赖于：活性化合物的独特特征和待实现的具体治疗效果，和本领域中配制用于治疗个体中敏感性的这种活性化合物的固有局限性。
为了施用抗体，剂量范围在从约0.0001至200mg/kg，更常见约0.01至约50mg/kg的宿主体重。例如，剂量可以是至少约0.3mg/kg体重，1mg/kg体重，3mg/kg体重，5mg/kg体重，或10mg/kg体重，或40mg/kg体重，在1-100mg/kg体重的范围内，和/或少于约0.3、1、3、5、10、20、40、50或60mg/kg体重。示例性的治疗方案需要每周施用1次，每2周1次、每3周1次、每4周1次、每月1次、每3个月1次、或每3至6个月1次。本发明的抗DKK1/4抗体的剂量方案包括静脉内施用1mg/kg体重或3mg/kg体重或40mg/kg体重，并使用下列给药规程之一给予抗体：每4周施用6次剂量，然后每3个月；每3周；施用3mg/kg体重1次，然后每3周施用1mg/kg体重；或者每28天施用40mg/kg体重。根据结果优化最终的剂量和给药方案，例如骨强度和/或抗肿瘤效应，这在不借助过度的实验的条件下落入本领域技术人员的知识范围内。
在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在这种情况下施用的每种抗体的剂量落入所指出的范围内。通常在多个时机施用抗体。单次剂量之间的间隔可以是例如每周、每月、每3月或每年。间隔也可以是不规则的，通过测量患者中针对靶抗原或某些生物标记物如OCN、OPG或PINP的抗体的血液水平来指示。在一些方法中，调节剂量以实现血浆抗体浓度为约1-1000μg/ml并且在一些方法中为约25-300μg/ml。
备选地，可以作为持续释放制剂施用抗体，在该情况中，需要低频率的施用。剂量和频率取决于抗体在患者中的半寿期而变。通常，人抗体显示出最长的半寿期，其次是人源化抗体、嵌合抗体，和非人抗体。剂量和施用频率可以随着治疗是预防性还是治疗性的而变。在预防性应用中，在长时间期间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者终生持续接受治疗。在治疗应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对高剂量直到疾病的进展减慢或者终止或者直到患者显示出疾病况状的部分或完全减轻。之后，可以对患者施用预防方案。
本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变，从而获得的活性成分的量对于具体患者、组合物和施用方式实现所希望的治疗应答，而对该患者无毒性。所选的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括使用的本发明的具体组合物或者其酯、盐或酰胺的活性，施用途径，施用时间，使用的具体化合物的排泄速率，治疗持续时间，与所用的具体组分组合使用的其他药物、化合物和/或物质、被治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和以前的医疗史，和医学领域中公知的其他因素。
本发明抗DKK1抗体的“治疗有效剂量”可以导致疾病症状严重性的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加，或者由于疾病折磨而引起的病损或残疾的预防。
可以使用本领域已知的一种或多种的各种方法，通过一种或多种施用途径施用本发明的组合物。如技术人员将理解，施用途径和/或方式将取决于所希望的结果而变。本发明抗体的施用途径包括静脉内、肌内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱其他肠胃外施用途径，例如，通过注射或输注。如本文使用的短语“肠胃外施用”指不同于经肠和局部施用的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下腔、脊柱内、硬膜外和intrastemal注射和输注。
备选地，本发明的抗体可以通过非肠胃外途径施用，如局部、表皮或粘膜施用途径，例如，鼻内、口腔、阴道、直肠、舌下或局部。
可以用保护活性化合物免于快速释放的载体制备活性化合物，如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂，和微囊化递送系统。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的许多方法被申请专利或者是本领域技术人员公知的。见例如，Sustained and Controlled Release Drug DeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
治疗组合物可以用本领域已知的医学装置施用，例如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；4,596,556；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196和4,475,196中显示的装置。这些专利通过引用整合到本文中。许多其他植入物、递送系统和模块都是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，可以配制本发明的人单克隆抗体以确保在体内适当分配。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，可以将它们用例如脂质体配制。关于生产脂质体的方法，见例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可以包含一种或多种部分，其被选择性运输到特定细胞或器官中，从而增强定向药物递送(见，例如，V.V.Ranade，1989 J.Cline Pharmacol.29：685)。示例性定向部分包括叶酸或生物素(见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷类(Umezawa等人，1988 Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人，1995 FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，1995 Antimicrob.Agents Chernother.39：180)；表面活性剂A蛋白受体(Briscoe等人，1995 Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等人，1994 J.Biol.Chem.269：9090)；也见K.Keinanen；M.L.Laukkanen，1994 FEBSLett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler，1994 Immnunomethods4：273。
组合
额外的治疗剂可选自：抗癌剂；抗骨质疏松剂；抗生素；抗代谢剂；抗炎剂；抗血管发生剂；生长因子；骨合成代谢剂、体重减轻疗法、抗糖尿病剂、降血脂剂、和减肥药(anti-obesity agent)、抗高血压剂、和/或过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂，和细胞因子。
本发明还涉及用下述药剂的组合的预防或治疗哺乳动物特别是人中的与DKK1、DKK4或DKK1/4相关的疾病或病症的方法，所述药剂组合包括：
(a)本发明的DKK1/4结合分子；和
(b)一种或多种药用活性剂；和任选的
(c)可药用的载体；
其中至少一种药用活性剂是抗癌治疗剂。
本发明还涉及药物组合物，包括：
(a)DKK1/4中和剂；和
(b)药用活性剂；和任选的
(c)可药用的载体；
其中至少一种药用活性剂是骨合成代谢剂、体重减轻治疗剂或糖尿病治疗剂。
本发明还涉及商业化包装或产品，包括：
(a)DKK1/4中和性结合分子的药物制剂；和
(b)同时的、共同的、分别的或顺序的使用的药用活性剂的药物制剂；
其中至少一种药用活性剂是抗癌治疗剂、骨合成代谢剂、体重减轻治疗剂或糖尿病治疗剂。
额外的治疗剂可选自抗癌剂；抗骨质疏松剂；抗生素；抗代谢剂；抗糖尿病剂；抗炎剂；抗血管发生剂；生长因子；骨合成代谢剂；体重减轻疗法；降血脂剂；和减肥药；抗高血压剂，和/或过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂，和细胞因子，或任何一种或多种本文提供的药用活性剂。
药用活性剂
术语“药用活性剂”是涵盖许多具有不同作用机理的药用活性剂的广义范畴。若干这些药用活性剂和DKK1/4中和抗体/组合物的组合可导致癌症治疗的改进。通常，药用活性剂依据其作用机理分类。许多可获得的物质是多种肿瘤发生途径的抗代谢物，或与肿瘤细胞的DNA反应。也有抑制酶例如拓扑异构酶I和拓扑异构酶II的活性剂，或抗有丝分裂的活性剂。提供其他活性剂用于治疗与DKK1、DKK4或两者相关的非肿瘤疾病。
术语“药用活性剂”尤其指不同于中和抗DKK1/4组合物或其衍生物的任何药用活性剂。它包括但不限定于：
1.芳化酶抑制剂；
2.抗雌激素物质、抗雄激素物质或促性腺激素释放因子激动剂；
3.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂；
4.微管活性剂、烷化剂、抗肿瘤的抗代谢物或铂(platin)化合物；
5.靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性、或者蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，或进一步的抗血管发生的化合物或诱导细胞分化过程的化合物；
6.单克隆抗体；
7.环加氧酶抑制剂、双磷酸盐、类肝素酶抑制剂、生物反应调节剂；
8.Ras致癌同种型抑制剂；
9.端粒末端转移酶抑制剂；
10.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂；
11.用于治疗血液性恶性肿瘤的活性剂或者靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；
12.HSP90抑制剂；
13.抗增殖性抗体；
14.组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；
15.靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物；
16.促生长素抑制素受体拮抗剂；
17.抗白血病的化合物；
18.肿瘤细胞损伤方式；
19.EDG结合剂(EDG binder)；
20.核糖核苷酸还原酶抑制剂；
21.S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；
22.VEGF或VEGFR的单克隆抗体；
23.光动力学治疗；
24.血管稳定(Angiostatic)类固醇；
25.包含皮质类固醇的植入物；
26.AT1受体拮抗剂；
27.ACE抑制剂；
28、抗糖尿病剂；
29、降血脂剂；
30、减肥药；
31、抗高血压剂；和
32、过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂。
这些术语的更详细的定义可见于Shulok等人的WO2007/084344中。
考虑本发明抗体和下列治疗剂之间的具体组合。治疗癌症考虑的组合伴侣是抗雌激素物质，包括但不限于他莫西芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、雷洛昔芬(raloxifene)和盐酸雷洛昔芬(raloxifenehydrochloride)。治疗癌症考虑的组合伴侣是蛋白质-酪氨酸激酶，例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC)；酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)或嘧啶氨基苯甲酰胺(pyrymidylaminobenzamide)和其衍生物(AMN107)。治疗癌症或增殖性疾病考虑的组合伴侣是一种或多种单克隆抗体，包括但不限于贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、denosumab、抗CD40、抗GM-CSF和托西莫单抗(tositumomab)。治疗癌症或骨相关疾病考虑的组合伴侣是双磷酸盐(bisphosphonate)，包括但不限于etridonic acid、氯膦酸(clodronic acid)、替鲁膦酸(tiludronic acid)、帕米膦酸(pamidronic acid)、阿伦膦酸(alendronic acid)、伊班膦酸(ibandronic acid)、利塞膦酸(risedronic acid)和唑来膦酸(zoledronic acid)。治疗糖尿病考虑的组合伴侣是一种或多种抗糖尿病剂，包括但不限于胰岛素、胰岛素衍生物和模拟物；胰岛素促分泌物例如磺酰脲(sulfonylurea)，如格列吡嗪(Glipizide)、格列本脲(glyburide)和亚莫利(Amaryl)；促胰岛素磺酰脲受体配体例如氯茴苯酸(meglitinide)，如那格列奈(nateglinide)和瑞格列奈(repaglinide)；蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)抑制剂例如PTP-112；GSK3(糖原合成酶激酶3)抑制剂例如SB-517955、SB-4195052、SB-216763、NN-57-05441和NN-57-05445；RXR配体例如GW-0791和AGN-194204；钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白抑制剂例如T-1095；糖原磷酸化酶A抑制剂例如BAY R3401；双胍类例如二甲双胍(metformin)；α葡萄糖苷酶抑制剂例如阿卡波糖(acarbose)；GLP-1(高血糖素样肽-1)、GLP-1类似物例如Exendin-4和GLP-1模拟物；和DPPIV(二肽基肽酶IV)抑制剂例如vildagliptin；thiazoladinedione。治疗肥胖考虑的组合伴侣是一种或多种减肥药，包括但不限于奥利司他(orlistat)或利莫那班(rimonabant)、西布曲明(sibutramine)或芬特明(phentermine)。
其他药用活性剂包括但不限于植物生物碱、激素剂和拮抗剂、生物反应调节剂(例如淋巴因子或干扰素)、反义寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，包括沉默性RNA(siRNA)；或者混杂活性剂，或具有其他或未知的作用机理的活性剂。
在提供所引用的专利申请或科技出版物的情况，特别是这些公开物中的化合物权利要求、工作实施例的药物制剂和最终产品，其主题物质，药物制剂及其权利要求因此引入本申请作为参考。这里公开的同样包括相应的立体异构体以及相应的晶体变型，例如溶剂化物和多晶型物。在这里所公开的组合中用作活性成分的化合物可以分别如所引用文件中所描述的那样来进行制备和给药。
通过代码编号、通用名称或商业名称鉴定的活性剂结构可以从实际版次的标准提纲“默克索引”或诸如“国际专利(Patents International)(IMS世界出版物)”的数据库中获得。其中相应的内容在此引用作为参考。
应当清楚的是，在提及组分(a)和(b)是指也包括任一活性物质的可药用盐。例如，如果由组分(a)和/或(b)构成的活性物质含有，至少一个碱性中心，它们可以形成酸加成盐。如果需要，也可以形成含有另一个存在的碱性中心的相应的酸加成盐。含有酸根(例如COOH)的化合物也可以与碱形成盐。组分(a)和/或(b)中所包含的活性物质或其可药用盐中也可以以氢氧化物的形式应用或包括其他用于结晶的溶剂。
因而，在第一个方面，本发明涉及预防或治疗哺乳动物中，优选人类患者中与DKK1和/或DKK4(DKK1/4)相关的疾病、病症或病况的方法，包括用药学有效量的组合同时或依次处理患者，所述组合是：
(a)中和性抗DKK1/4组合物；和
(b)药用活性剂。
在一个实施方案中，本发明提供了这样的制品，包括：
(a)中和性抗DKK1/4组合物；和
(b)一种或多种药用活性剂，所述药用活性剂选自芳化酶抑制剂；抗雌激素物质；抗雄激素物质；促性激素释放素拮抗剂；拓扑异构酶I抑制剂；拓扑异构酶II抑制剂；微管活性剂；烷化剂；抗肿瘤的抗代谢物；铂(platin)化合物；靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性或者蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物、抗血管发生化合物；诱导细胞分化过程的化合物；单克隆抗体；环加氧酶抑制剂；双磷酸盐；类肝素酶抑制剂；生物反应调节剂；Ras致瘤同种型的抑制剂；端粒末端转移酶抑制剂；蛋白酶抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂；蛋白酶体抑制剂；靶向，降低或抑制Flt-3活性的物质；HSP90抑制剂；抗增殖抗体；HDAC抑制剂；靶向，降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶的活性/功能的化合物；生长素抑制素受体拮抗剂；抗白血病的化合物；肿瘤细胞损伤方式；EDG结合剂；核糖核苷酸还原酶抑制剂；S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；VEGF或VEGFR的单克隆抗体；光动力学治疗；血管稳定类固醇；包含皮质类固醇的植入物；AT1受体拮抗剂；以及ACE抑制剂、骨合成代谢剂、体重减轻疗法、抗糖尿病剂、降血脂剂、减肥药、抗高血压剂，和/或过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂；或本文提供的其他药用活性剂。
组分(a)和/或(b)的任一组合，包括施用这两种组分治疗温血动物的方法，包括同时、分别或依次使用这两种组分的药物组合物，该组合在增殖性疾病的进程延缓或治疗中的用途，或制备用于该目的的药物制剂的用途，或包括组分(a)和/或(b)的这类组合的商品，全部如上所提及或定义，随后提及作为本发明的组合(因此该术语指可在适当时代替该术语的任一这些实施方案)。
同时施用可以例如以两种或多种活性成分的一种固定组合的形式发生，或者通过同时施用分别配制的两种或多种活性成分。在一个实施方案中，依次使用(施用)意指在一个时间点施用组合的一种(或多种)组分，在不同的时间点施用其他组分。在一个实施方案中，所述组合表现得比独立施用的单个组分更有效(尤其表现出协同作用)。在一个实施方案中，分别使用(施用)意指组合的组分的施用在不同的时间点彼此独立。在一个实施方案中，分别使用意指这样的施用组分(a)和(b)，使得两种化合物没有以重叠方式(同时的)存在的重叠的可测量的血液水平。
在一个实施方案中，组合两种或多种依次的、分别的和同时的施用是可能的。在一个实施方案中，组合组分-药表现出联合的治疗效应，超过了独立使用组合组分-药时可见的效应，所述独立使用的时间间隔很大使其疗效的相互影响不可见。在一个实施方案中，发生了协同效应。
本文所用的术语“延缓进程”指向处于待治疗疾病的首发发作或复发的前期或早期的患者施用该组合，其中，例如诊断患者相应疾病的前期形式，或哪些患者患有病况，例如在医学治疗或由意外产生的病况期间，在该情况下很可能产生相应的疾病。
“联合治疗活性”或“联合治疗效应”意指可以(以长期(chronically)交替的方式，例如依次特异性的方式)分别给予化合物，给予的时间间隔使得治疗对象表现出相互作用(联合治疗效应)。在一个实施方案中，治疗对象是温血动物，尤其是人。在一个实施方案中，观察到的相互作用是协同的。在此情况下例如可以通过跟踪血液水平来确定，显示两种化合物至少在某些时间间隔中同时存在于受治人的血液中。
在一个实施方案中，“药学有效的”指治疗上或者也可以预防上有效的对抗增殖性疾病进展的量。
术语“商业包装”或“产品”在本文中尤其定义“套件(kit of parts)”，表示上文定义的组分(a)和(b)可以独立给药，或者通过使用含有区别量的(a)和(b)的不同的固定组合，即，同时的或在不同的时间点。此外，这类术语包括这样的商业包装，所述商业包装包含(尤其是组合了)作为活性成分的组分(a)和(b)，以及对其在延迟增殖性疾病的进展或治疗增殖性疾病中同时或依次(长期交替的、以时间特异性依次的或分别的)使用的说明。然后，可以例如同时或长期交替的施用套件的零部件(parts)，即，在不同的时间点并以相等或不等的时间间隔施用任何零部件(part)。在一个实施方案中，选择的时间间隔使得组合使用零部件治疗疾病的效应大于通过仅使用任何一种组合伴侣(a)和(b)所获得的效应(如根据标准方法可确定的)。为了例如应对受治的患者亚群体的需要，或单个患者的需要，可以改变在组合制品中施用的组合伴侣(a)与组合伴侣(b)的总量比例，所述不同的需要可以是患者的特定的疾病、年龄、性别、体重等导致的。在一个实施方案中，存在至少一种有益效应，例如组合伴侣(a)和(b)的相互增强效应，特别是大于累加效应，因而这可以用更低剂量的每种组合药物来实现，所述剂量各自低于在不用组合而仅用单种药物治疗的情况下可耐受的，而产生额外的有利效应，例如较低的副作用或在原本无效剂量的一种或两种组合伴侣(组分)(a)和(b)的条件下组合的治疗效应。在一个实施方案中，组合伴侣(a)和(b)存在强烈的协同作用。
在使用商业包装的组分(a)和(b)的组合的情况下，还可以同时、依次和分别的使用任何组合，意味着组分(a)和(b)可以在一个时间点同时施用，再于其后的时间点长期的(例如，大于3-4周的每日给药)施用具有较低宿主毒性的一种组分，之后再施用其他组分，或者于更靠后的时间点仍施用两种组分的组合(出于最佳的抗肿瘤效应的依次药物组合疗程)，或诸如此类。
本发明的组合还可以与其他治疗组合应用，例如手术干扰、高温和/或辐射疗法。
本发明的药物组合物可以通过常规手段制备，并且是适合肠内的(例如口服或直肠)和肠胃外施用于哺乳动物的，包括人，包含治疗有效量的VEGF抑制剂和至少一种药用活性剂，单独的或与一种或多种可药用的载体组合，尤其是适合肠内的或肠胃外应用的。
药物组合物包含以下的活性成分(各种情况下均为重量比重量)，从约0.00002至约100％，尤其是例如在即用的输注稀释液的情况下，从0.0001至0.02％，或者例如在注射或输注浓缩液的情况下，尤其是肠胃外的制剂的情况下，从约0.1％至约95％，或从约1％至约90％，或从约20％至约60％；至少约0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2.5、5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％的任一种，和/或不超过约0.0001、0.001、0.01、0.1、1、2.5、5、10、15、20、25、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％的任一种。本发明的药物组合物可以是例如单位剂量形式，例如安培剂、小瓶、锭剂、片剂、输注袋或胶囊的形式。
在本发明的制剂中的每种组合伴侣的有效剂量都可根据所使用的特定化合物或药物组合物、施用模式、治疗的病况和治疗病况的严重程度而改变。具有普通技术的内科医师、临床医师或兽医可以方便的确定预防、治疗或抑制病况进展所必需的每种活性成分的有效量。
在一个实施方案中，向温血动物尤其是人施用Tyrphostin(酪氨酸磷酸化抑制剂)，尤其是Adaphostin，剂量在约1-6000mg/天、更多或25-5000mg/天，或50-4000mg/天的范围内。在一个实施方案中，除非本文另外提及，所述化合物每天施用1至5次，尤其是1-4次。
用于肠内的或肠胃外施用的组合治疗的药物制剂是例如单位剂量形式如糖衣片剂、胶囊剂、栓剂以及安瓿剂。如不另作说明，这些制剂通过常规方法制备，例如借助于常规混合、粒化、糖衣化、溶解或冻干过程。每一剂型各个剂量所含组合伴侣的单位含量本身不需构成有效量，因为需要的有效量可通过施用多个剂量单位来达到。本领域的专业技术人员具备确定组合组分的适宜药学有效量的能力。
在一个实施方案中，化合物或其可药用盐是以片剂、胶囊剂或糖浆剂的形式作为口服药物制剂，或如果合适作为肠胃外注射剂来施用的。
在口服施用的组合物制备中，可施用任一可药用介质例如水、乙二醇、油、乙醇、调味剂、防腐剂、着色剂。可药用载体包括淀粉、糖类、微晶纤维素、稀释剂、粒化剂、润滑剂、结合剂、崩解剂。
活性成分的肠胃外施用可使用活性成分的溶液、还有悬液、特别是等渗水溶液或悬液，在为仅包含活性成分或包含活性成分和载体(例如甘露醇)的冻干组合物时是可能的，所述溶液或悬液可在使用之前制备。该药物组合物可以进行灭菌，和/或包含诸如防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂的赋形剂，并且通过本身已知的方式、例如通过常规的溶解或冻干过程的方式进行制备。所述溶液或悬液可以包含增加粘度的物质，例如羧甲基纤维素纳、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯酮或者明胶。油中悬液包含作为油成分的、通常用于注射目的的植物的、合成的或者半合成油。
等渗剂可选自本领域任意公知的例如甘露醇、葡聚糖、葡萄糖和氯化钠。输注制剂可用含水介质稀释。作为稀释剂应用的含水介质的量依据输注溶液中活性成分的需要浓度来选择。输注溶液可包括用于静脉内施用的制剂中通常应用的其他赋形剂例如抗氧化剂。
本发明还涉及本文所用的术语“联合制剂”，其定义的尤其是一种“套件(kit of parts)”，其指的是如上所定义的组合伴侣(a)和(b)可独立地进行给药或通过使用具有不同数量的组合伴侣(a)和(b)的不同固定组合来进行给药，即可以同时或在不同的时间点进行给药。然后套件的各部分可以例如同时给药或长期交错给药，即套件的任何部分可以在不同的时间点以相同或不同的时间间隔进行给药。在联合制剂中用于进行给药的组合伴侣(a)与组合伴侣(b)的总量的比例可以变化，例如，为了符合所治疗的患者亚人群的需要或单个患者的需要(这些患者由于年龄、性别、体重等的不同而具有不同的需要)而进行变化。
已全面的描述了本发明，并通过下列实施例和权利要求进一步示例，所述实施例和权利要求仅作示例而并非意在还限制。本领域技术人员可认识到或能够使用不超过常规的实验验证本文所述的具体程序的多种等价体。此类等价体落入本发明和权利要求的范围内。在本申请全文引用的所有参考文献的内容，包括出版的专利和公开的专利申请，都通过引用整合到本文中。
实施例
实施例1：从HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000551
文库中制备人DKK1特异性抗体
抗人DKK1蛋白质的治疗抗体可通过使用作为抗体变体蛋白质来源的市售噬菌体展示文库MorphoSys HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000552
文库，来挑选具有高结合亲和力的克隆来产生。HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000553
是Fab文库(Knappik等人，2000J.Mol.Biol.296：57-86；Krebs等人，2001 J Immunol.Methods 254：67-84；Rauchenberger等人，2003 J Biol Chem.278(40)：38194-38205)，其中所有六个CDR通过适当的突变而多样化，并且应用CysDisplayTM技术将Fab片段连接到噬菌体表面(WO 01/05950 Lδhning 2001)。
常规程序：噬菌粒回复、噬菌体扩增以及纯化
HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000554
文库在含有34μg/ml氯霉素和1％葡萄糖(2xYT-CG)的标准丰富细菌培养基(2xYT)中扩增。在OD600nm为0.5时用VCSM13辅助噬菌体感染细胞(于37℃静置温育细胞和噬菌体的混合物30分钟，接着于37℃以250转/分钟振荡30分钟)后，将细胞离心(4120g，5分钟，4℃)、重悬于2xYT/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素/0.25mM IPTG中，并于22℃生长过夜。在该阶段结束时通过离心将细胞移出，且从上清液中用PEG沉淀噬菌体两次，重悬于PBS/20％甘油中并于-80℃保存。
两轮筛选之间的噬菌体扩增如下进行：以DKK1蛋白质挑选后对用噬菌体感染的对数中期的大肠杆菌菌株TG1细胞进行洗脱，并且涂布于补充有1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素的LB琼脂上(LB-CG平板)。该平板于30℃温育过夜后，将细菌克隆从琼脂表面刮下，并用于接种到2xYT-CG肉汤以使OD600nm达到0.5，然后加入VCSM 13辅助噬菌体以获得如上所述的生产性感染。
使用Strep-Tactin磁珠进行溶液淘选(solution panning)的预试验
已报道Strep-tag II对Strep-Tactin基质具有低亲和力(依据Voss和Skerra，1997 Protein Eng.10：975-982，KD约1μM)，因此，进行预试验以评估使用Strep-Tactin包被的MagStrep小珠在抗体选择期间捕获抗原且在淘选期间避免抗原丢失的适宜性。
为此，8mg的MagStrep小珠与46μg的His-Strep标记的DKK1于室温温育1h并且样品分装进四个预封盖的Eppendorf管中。一管作为阳性对照(未洗涤)并且依据HuCAL GOLD手册的淘选部分以不同严格性洗涤其他三个样品。使用山羊抗DKK1抗体和铷标记的抗山羊检测抗体，在BioVeris中对His-Strep标记的DKK1与MagStrep磁珠(获自IBA的Strep-Tactin包被的磁珠，
Figure BDA0000106019950000562
德国)的结合进行检测。
当未洗涤的小珠与那些用不同HuCAL
Figure BDA0000106019950000563
严格性洗涤的小珠比较时，没有检测到明显的His-Strep标记的DKK1从Strep-Tactin包被的小珠丢失。因此，His-Strep标记的DKK1似乎适用于用Strep-Tactin包被的磁珠(MagStrep磁珠)进行的溶液淘选。
通过从文库中淘选DKK1特异性抗体来筛选
为了筛选识别人DKK1的抗体，应用两种淘选策略。
总的来说，将HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000564
噬菌体抗体分成包括VH主基因的不同组合的四个集合(包含VH 1/5λκ的1集合；包含VH3λκ的2集合；包含VH2/4/6λκ的3集合；以及包含VH 1-6λκ的4集合)。这些集合单独地接受两轮捕获于Strep Tactin磁珠(Mega Strep小珠，IBA)上的His-Strep标记的DKK1的溶液淘选，并且仅对于第三轮挑选，在捕获于Strep Tactin磁珠上的His-Strep标记的DKK1上或在由Streptavidin小珠(Dynabeads
Figure BDA0000106019950000571
M-280 Streptavidin，Dynal)捕获的APP标记的人DKK1蛋白质上都含生物素化的抗APP抗体。
详细地，为了使用结合StrepTactin磁珠的His-Strep标记的DKK1进行溶液淘选，应用以下方案：通过将预封盖的管子(1.5ml Eppendorf管)用以PBS 1∶1稀释的1.5ml 2x ChemiBLOCKER于4℃处理过夜来准备。预封闭的小珠通过如下处理来制备：580μl(28mg的小珠)StrepTactin磁珠用580μl PBS洗涤一次并重悬于580μl Ix ChemiBLOCKER(稀释于一倍体积的Ix PBS)中。小珠的封闭在预封盖的管子中于4℃过夜进行。
为每一淘选条件而稀释于终体积为500μl的PBS中的噬菌体颗粒与500μl 2x ChemiBLOCKER/0.1％Tween混合，并且于室温下在摇床(rotating wheel)上保持1小时。为去除StrepTactin或小珠结合的噬菌体而进行两次噬菌体颗粒的预吸附：将160μl封闭的StrepTactin磁珠(4mg)加入到封闭的噬菌体颗粒中，并且于室温在摇床上温育30分钟。通过磁性装置(Dynal MPC-E)分离小珠后，噬菌体上清液(约1.1ml)转移到新鲜的、封盖的反应管中，并且使用160μl封闭的小珠重复预吸附30分钟。然后，将400nM或100nM His-Strep标记的DKK1加入到新的、封盖的1.5ml反应管中的封闭的噬菌体颗粒中，并且混合物于室温下在摇床上温育60分钟。
噬菌体抗原复合物可使用分别加入到400nM或100nM噬菌体淘选集合中的320μl或160μl封闭的StrepTactin磁珠来捕获，然后于室温下在摇床上温育20分钟。结合到StrepTactin磁珠的噬菌体颗粒再次用磁性颗粒分离器收集。
小珠然后用PBS/0.05％Tween(PBST)洗涤七次，接着仅用PBS另外洗涤三次。噬菌体颗粒从StrepTactin磁珠中的洗脱通过向每一管中加入10mM Tris-HCl、pH 8.0中的200μl 20mM DTT进行10分钟。收集洗脱液，小珠用200μl PBS洗涤一次并且将PBS洗脱液加入到DTT洗脱液中。该洗脱液样品用于感染14ml已生长到OD600nm为0.6-0.8的大肠杆菌TG-1培养物。
在感染以及之后的5000转/分钟离心10分钟后，每一细菌沉淀重悬于500μl 2xYT培养基中，涂布于2xYT-CG琼脂平板上并于30℃温育过夜。第二天早上，将得到的克隆从平板上刮下并且通过上述的回复和扩增来制备噬菌体。
对His-Strep标记的DKK1的第二轮溶液淘选依据第一轮的方案进行，除了使用减少量的抗原(50nM和10nM)和适当改变洗涤程序的严格性。
两种不同的淘选策略应用于第三轮筛选：第二轮淘选的扩增噬菌体的产量是分开的并且接受用于两种不同筛选条件。第一半噬菌体产量用于从上述StrepTactin小珠上捕获的人His-Strep标记的DKK1的标准淘选策略(抗原量分别是10nM或1nM)。
第三轮挑选的第二种筛选变通方案是在人APP标记的DKK1上进行的。终浓度为50nM或10nM的APP标记的DKK1蛋白质与1ml预清洗的第二轮噬菌体颗粒混合，并且混合物于室温下在摇床上温育1小时。平行地，8mg预封闭的Dynabeads M-280 Streptavidin(Dynal)与40μg生物素化的小鼠抗APP抗体于室温下在摇床上温育30分钟，接着用PBST进行两步洗涤。由结合到APP标记的DKK1的噬菌体-抗体组成的预形成的复合物通过抗APP对包被的M-280 Streptavidin磁珠于室温下30分钟。噬菌体的洗脱和扩增如上进行。
可溶性Fab片段的亚克隆和表达
将挑选的HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000581
噬菌粒编码Fab的插入序列亚克隆进表达载体pMORPH
Figure BDA0000106019950000582
K9_Fab_FH，以促进快速并有效地表达可溶性Fab。为此，所选克隆的质粒DNA用限制性核酸内切酶XbaⅠ和EcoRⅠ消化，从而切除编码Fab的插入序列(ompA-VLCL和phoA-Fd)。然后将该插入序列克隆进XbaⅠ/EcoRⅠ消化的表达载体pMORPH
Figure BDA0000106019950000583
X9_Fab_FH。
Fab蛋白质从该载体中表达，并且从而携带用于检测和纯化的两个C末端标记(分别是FLAGTM和6xHis)。
大肠杆菌中HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000591
Fab抗体的微表达
为获得足够量的由上述获得的每个克隆编码的蛋白质，在将挑选的Fab亚克隆进pMORPH
Figure BDA0000106019950000592
X9_Fab_FH表达载体后筛选耐受氯霉素的单一细菌克隆。然后每个这些克隆接种到灭菌的96孔微量滴定板的孔中，每个孔含有100μl 2xYT-CG培养基每孔，并且细菌于37℃生长过夜。将每一大肠杆菌TG-1培养物的样品(5μl)转移到新鲜的、灭菌的、预填有补充了34μg/ml氯霉素和0.1％葡萄糖每孔的100μl 2xYT培养基的96孔微量滴定板中。微量滴定板于30℃在微量滴定板摇床上以400转/分钟振荡温育直至培养物稍微浑浊(约2-4小时)，OD600nm约0.5。
为以这些平板的形式表达，将补充了34μg/ml氯霉素和3mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的20μl 2xYT培养基加入到每个孔中(终浓度为0.5mM的IPTG)，微量滴定板用气体渗透带密封，并于30℃以400转/分钟振荡温育过夜。
全部细胞裂解物的制备(BEL提取物)
向表达平板的每个孔中加入含2.5mg/ml溶菌酶的40μl BEL缓冲液(2xBBS/EDTA：24.7g/l硼酸、18.7g NaCl/l、1.49g EDTA/l，pH 8.0)，并且平板于22℃在微量滴定板振荡器上(400转/分钟)温育1小时。BEL提取物用于通过FMAT的结合分析(参见实施例2)。
在50ml的塑料管中进行由大肠杆菌TG1 F细胞中的pMORPH
Figure BDA0000106019950000594
X9_Fab_FH编码的Fab片段的表达。为此，用单一克隆接种的预培养物于30℃在2xYT-CG培养基中生长过夜。第二天早上，50μl的每一预培养物用于接种到灭菌的50ml塑料管中以补充了4μg/ml氯霉素、1mM IPTG和0.1％葡萄糖的25ml 2xYT培养基中，并于30℃温育过夜。收获大肠杆菌细胞，冷冻细胞沉淀最终用Bug Buster(Novagen)裂解(disrupt)。使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen，Hilden，德国)分离Fab片段。
Figure BDA0000106019950000601
在使用补充了34μg/ml氯霉素的750ml 2xYT培养基的摇瓶培养物中进行由TG 1F细胞中的pMORPH
Figure BDA0000106019950000602
X9_Fab_FH编码的Fab片段的表达。培养物于30℃振荡直至OD600nm达到0.5。加入0.75mM IPTG诱导表达，接着于30℃温育20小时。细胞使用溶菌酶裂解，并且Fab片段由Ni-NTA层析(Qiagen，Hilden，德国)分离。蛋白质浓度通过UV-分光光度计(Krebs等人，2001)测定。
实施例2：DKK1特异性的HuCAL
Figure BDA0000106019950000603
抗体的鉴定
由上述淘选策略挑选的各个大肠杆菌克隆的BEL提取物通过微体积荧光试验技术(FM ATTM，8200Cellular Detection System analyzer，Applied Biosystems，Foster City，Calif)分析，以鉴定编码DKK1特异性Fab的克隆。FM ATTM 8100 HTS系统是共聚焦式高通量荧光筛选仪器，其自动检测活细胞或小珠的混合并读取、是非放射性试验(Miraglia，J.Biomol.Screening(1999)，4(4)193-204)。
用于从细菌裂解物中检测DKK1结合的Fab的基于微体积荧光试验技术 (FMAT)的结合分析
为从大肠杆菌裂解物(BEL提取物)中检测DKK1结合的Fab抗体，用FMAT 8200细胞检测系统(Applied Biosystems)来分析结合。为将His-Strep标记的DKK1结合到M-450Expoxy小珠(Dynal)上，将300μlM-450Epoxy小珠(1.2x108小珠)的样品转移进反应管中并用磁性颗粒分离器捕获。移除上清液并且小珠用1ml 100mM、pH 7.4的磷酸钠缓冲液洗涤四次。为包被抗原，向150μl 100mM、pH 7.4的磷酸钠缓冲液中的小珠悬浮液中加入60μg His-Strep标记的DKK1。抗原-小珠悬浮液于室温下在摇床上温育16小时。然后包被的小珠用PBS洗涤三次并且重悬于终体积为250μl的PBS中。
为每一384孔平板准备含3％BSA、0.005％Tween-20、4μl DKK1包被的小珠(1.9x106小珠)的20ml PBS和4μl Cy5TM检测抗体的混合物。45μl该溶液的样品分配到384孔FMAT黑色/透明的平底板的(AppliedBiosystems)各孔中。将含Fab的BEL提取物(5μl)加入每一孔中。FMAT平板于室温下温育过夜。第二天早上平板在8200Cellular Detection系统(Applied Biosystems)中分析。
获得阳性克隆，分析在FMAT中产生阳性的、特异性信号的克隆重链和轻链序列。据观测，鉴定显示对人DKK1强烈结合的57个独特的(非冗余)抗DKK1克隆。将这些克隆表达、纯化并测试亲和力以及进行功能性试验。
使用表面等离振子共振测定纳摩尔亲和力
使用这些克隆，在CM5芯片(Biacore，瑞典)上进行动力学的SPR分析，该芯片使用标准的EDC-NHS胺结合化学技术以10mM、pH 4.5醋酸钠中的400RU密度的重组人DKK1、小鼠DKK1(R&D System)或食蟹猴DKK1包被。相当量的人血清白蛋白(HSA)固定在参考流动池上。PBS(136mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.76mM KH2PO4 pH 7.4)用作运转缓冲液。Fab制剂以20μl/分钟流速、16-500nM的浓度梯度应用。联合相设置于60秒且解离相设置于120秒。该方法测定的对每一人类、小鼠和食蟹猴DKK1的纳摩尔级亲和力的概述于本文所示的表1中。
表1.挑选的Fab对人类、小鼠和食蟹猴各自的亲和力
表1
Figure BDA0000106019950000621
*单次测量
n.d.：未确定
实施例3：抑制DKK1的Wnt拮抗活性的抗人DKK1 Fab候选物的鉴定
使用得到的选自HuCAL GOLD
Figure BDA0000106019950000622
文库的57个不同的DKK1特异性抗体以获得纯化抗体，然后用于测试抑制人DKK1的Wnt拮抗活性的能力。这些抗体中的17个抗体候选物具有功能性活性。
使用荧光素酶报告基因试验检测每一HuCALFab的功能性活性。在表现出荧光素酶基因TCF/Lef应答的荧光素酶报告基因上游克隆12个TCF/Lef的结合位点。常规的规范Wnt蛋白质导致β联蛋白的稳定性，从而激活TCF/Lef的转录并产生荧光素酶蛋白质。DKK1蛋白质的加入阻碍Wnt活性并因此也阻碍荧光素酶基因的转录。结果，期望由各个细胞产生的荧光素酶水平与挑选的Fab阻碍DKK1作用的能力相关。
稳定的TCF/Lef应答的报告细胞系HEK293T/17-12xSTF
使用稳定的人胚胎肾细胞报告细胞系HEK293T/17-12xSTF来进行生物试验。细胞培养于含有10％FCS(PAN或BioWhittaker)和1μg/ml嘌呤霉素(BD Biosciences)的DMEM高葡萄糖培养基(Invitrogen)中，直至达到90％汇合。然后将细胞用胰蛋白酶消化、计数并稀释于不含嘌呤霉素的培养基中以达到4x105细胞/ml的浓度。随后，细胞接种到白色的、平底的96孔板中(Corning，每孔100μl细胞悬浮液)，并于37℃和5％CO2中培养过夜。第二天，准备试验培养基：将500ng/ml DKK1-APP加入到Wnt3a条件培养基(CM)中。抗DKK1 HuCAL
Figure BDA0000106019950000631
Fab(20μg/ml的终浓度)和用作阳性对照的山羊抗人DKK1抗体(R&D Systems)(1.5μg/ml的终浓度)稀释于CM中。
从试验平板的每一孔中移出60μl体积的培养基而不扰乱贴壁的细胞，并用稀释于CM中的60μl试验抗体或对照替代。细胞再培养24小时并向每孔加入100μl明亮(Bright-Glo)荧光素酶试剂。5分钟温育时间后，在光度计(GenioPro，Tecan)上读取荧光。表达的荧光素酶范围是抗体存在范围的度量。
实施例4：结合亲和力的定量分析：抑制DKK1的Wnt拮抗活性的抗人DKK1 Fab候选物的测定
亲和力测定
为进一步表征抗DKK1抗体，测定对人类、食蟹猴和小鼠DKK1的亲和力。重组DKK1蛋白质固定在CM5 Biacore芯片上并将Fab应用于不同浓度的流动相。为了可信地测定单价亲和力，仅仅将这批Fab用于Biacore测定，所述这批Fab在大小排阻层析中显示为≥90％的单体片段。
人类、小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力数据总结于表2中。发现所有17个待测Fab都具有对人DKK1的100nM以下的亲和力。另外，产生抗体的9个克隆的亲和力低于10nM。在所有测试情况下，对食蟹猴和小鼠DKK1的亲和力几乎等同于对人DKK1的那些亲和力。
表2.挑选的Fab对人类、小鼠和食蟹猴的亲和力数据
表2
Figure BDA0000106019950000641
*单次测量
n.d.：未确定
EC 50 测定
显示用于对DKK1具有最强亲和力的抗体克隆抑制达50％的有效浓度的数据本文显示于表3中。数据显示有效浓度EC50范围从39至95nM，具有58和83nM间的中值。
表3.用于对挑选的Fab抑制达50％的有效浓度
Figure BDA0000106019950000642
实施例5：通过LCDR3和HCDR2盒的平行交换的挑选的抗DKK1Fab的亲和力成熟
为优化本文描述的抗体对DKK1的亲和力，对于亲本Fab片段的集合，每一亲本Fab的轻链的LCDR3、构架4和恒定区使用BpiI和SphI来去除，并且用多样化的LCDR3连同构架4和恒定域的所用组成成分来替换。将0.5μg的结合集合载体(binder pool vector)样品结合到超过携带多样化LCDR3的3倍摩尔量插入片段。
在相似的方法中，使用XhoI和BssHII位点将HCDR2多样化，并且连接构架区保持不变。为增加克隆效率，在插入多样化HCDR2盒前用590bp填充序列来取代亲本HCDR2。
将11个不同文库的连接混合物电穿孔进入4ml大肠杆菌TOP10 F′细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，产生2x107至2x108的各个克隆。如前所述地进行文库扩增(Rauchenberger等人，2003J Biol Chem.278(40)：38.194-38205)。为了控制质量，随机挑选每一文库中的几个克隆并使用引物CFR84(VL)和OCAL_Seq_Hp(VH)进行测序(SequiServe，Vaterstetten，德国)。
挑选亲和力成熟的候选物
选出的六个挑选的成熟候选物(“亲本Fab”)表征为具有以下特征：对人DKK1的亲和力小于10nM，食蟹猴和小鼠DKK1具有显著的交叉反应，EC50小于100nM，并且优于大肠杆菌中的(中等)Fab表达水平以及Fab纯化后缺乏聚集。
在亲和力测定过程中，很显然MOR04480在高度稀释时极其不稳定。为此，MOR04480从成熟候选物的列表中删除，虽然其在所有待测Fab中具有最高亲和力(1nM)和最好EC50(7nM)。MOR04483对人DKK1具有5.5nM的高亲和力，但是显示对小鼠DKK1交叉反应，且MOR04453包含纯化后高比例的Fab聚集。因此，这两种抗体也从成熟候选物中排除。
在仔细评估所有可获得数据后，选出六个成熟候选物(MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR04461、MOR04470和MOR04516)。这些候选物的特征在本文中列于表4中。
表4.挑选的Fab的特征
表4
Figure BDA0000106019950000661
*单次测量
n.d.：未确定
#单体部分＞90％
用于亲和力成熟的挑选的Fab文库的制备
为了获得具有抗DKK1抗体的增强亲和力和抑制活性的克隆，前面实施例中所示的挑选的Fab克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR04461、MOR04470和MOR04516接受另一轮的多样化和挑选，即称为亲和力成熟的过程。
为此，使用由三核苷酸突变预建模的相应的LCDR3和HCDR2成熟盒来使CDR区多样化(Virnekas等人，1994 Nucleic Acids Res.22：5600-5607；Nagy等人，2002 Nature Medicine 8：801-807)。本文的表5显示针对亲本克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR061、MOR04470和MOR4516的LCDR3序列。
表5.针对挑选的Fab的LCDR3序列
表5
Figure BDA0000106019950000662
本文的表6显示针对亲本克隆MOR04454、MOR04455、MOR04456、MOR061、MOR04470和MOR4516的HCDR3序列。
表6.针对挑选的Fab的H-CDR3序列
表6
Figure BDA0000106019950000671
将来自表达载体pMORPH
Figure BDA0000106019950000672
X9_Fab_FH的Fab片段亚克隆进噬菌粒载体pMORPH25(参见US专利号6,753,136)中。该载体提供N端融合半胱氨酸残基和C末端半胱氨酸也融合到Fd抗体链的噬菌体蛋白质pⅢ，并因此提供各个Fab片段在噬菌体表面的二硫化物连接的展示。两种不同的策略平行应用以优化亲本Fab的亲和力和功效。
产生五个噬菌体抗体Fab文库，其中六个亲本克隆中的五个LCDR3由单独的轻链CDR3序列所用组成成分来取代。未进行MOR04454的LCDR3成熟，因为该克隆在一个CDR区具有附加的BpiⅠ限制性位点并将BpiⅠ限制酶用于文库克隆程序。
平行地，每个亲本克隆的HCDR2区由单独的重链CDR2序列所用组成成分来取代。将每个亲本Fab切除并用590bp填充片段取代。在成熟淘选期间该DNA填充片段促进单消化载体从双消化载体条带中分离并且减少高亲和力亲本Fab的背景。在后续步骤中，填充片段从每个亲本克隆的Fab编码噬菌粒中切除并用高度多样化的HCDR2成熟盒来取代。
多于2x107个成员的巨大的亲和力成熟文库通过标准的克隆程序来产生，并且将多样化的克隆转化进电感受态大肠杆菌TOP10F′细胞(Invitrogen)。如上述实施例1中描述地来制备含Fab的噬菌体。
构建四个成熟集合以促进后续的挑选过程：集合1a组成为MOR04470和MOR04516 LCDR3文库；集合1b组成为MOR04470和MOR04516HCDR2文库；集合2a组成为MOR04454、MOR04455、MOR04456和MOR04461 LCDR3文库；以及集合2b组成为MOR04454、MOR04455、MOR04456和MOR04461 HCDR2文库。
在溶液中使用减少量的His-Strep标记的DKK1和由Strep-Tactin小珠捕获的噬菌体-抗原对每个组成为进行淘。平行地，使用减少量的在Neutravidin包被的平板捕获的生物素化的DKK1将每个库应用于淘选。为增强淘选严格性并挑选出提高的解离率，在延长温育期期间进行与纯化的亲本Fab以及未标记抗原的竞争。
淘选后立即将富集的噬菌粒集合亚克隆进pMORPH_X9_FH表达载体。选出约2300个单克隆，并且以IPTG诱导Fab。
成熟淘选策略
在溶液中分别以His-Strep标记的DKK1以及以生物素化的His-Strep标记的DKK1进行两轮或三轮使用四个抗体集合的淘选程序。对于每一淘选策略，应用与纯化的亲本Fab蛋白质或与未标记的APP标记DKK1的竞争，以及低抗原浓度和大量的洗涤来增强严格性。
通过主要依据描述于实施例1的标准方案的两轮挑选来进行对未标记的His-Strep标记的DKK1的溶液淘选。但是这些程序应用减量抗原(从5nM减少至1nM)、含或不含竞争剂的洗涤程序的高严格性，以及抗体-噬菌体连同抗原的延长的温育期。
对于第一轮挑选，使用生物素化的DKK1，将Neutravidin平板的孔用300μl PBS洗涤两次。孔用1∶1稀释于PBS(封闭缓冲液)中的2xChemiBLOCKER(
Figure BDA0000106019950000681
Temecula，CA)封闭。挑选前，HuCALGOLD
Figure BDA0000106019950000682
噬菌体也用一倍体积的含0.1％Tween-20的封闭缓冲液于室温下封闭30分钟。将封闭的噬菌体制剂以100μl等分量转移至于室温下经30分钟Neutravidin包被的平板的孔中。该预吸附步骤重复一次。封闭的和预清洗的噬菌体制剂与5nM生物素化的DKK1于22℃在摇床上温育2小时。加入亲本Fab、APP-DKK1或非竞争剂并且样品于4℃在摇床上温育过夜。
于室温经20分钟在Neutravidin平板的孔中捕获抗原噬菌体复合物。在大量洗涤步骤后，通过向每孔加入200μl的10mM Tris中的20mMDTT(pH 8.0)于室温经10分钟来洗脱结合的噬菌体颗粒。将洗脱液移出并加入到OD600nm为0.6-0.8的14ml大肠杆菌TG1细胞中。孔用200μlPBS洗涤一次并且该溶液也加入到大肠杆菌TG1细胞中。噬菌体感染大肠杆菌于37℃静置进行45分钟。5000转/分钟离心10分钟后，细菌沉淀各自重悬于500μl 2xYT培养基中，涂布于2xYT-CG琼脂板上并于30℃温育过夜。通过从平板表面刮下来收获克隆并且如上所述将噬菌体颗粒回复和扩增。
如上所述地对第一轮挑选进行第二轮和第三轮挑选，只是洗涤条件更加严格并且抗原浓度分别是1和0.1nM。
基于电化学发光(Bio Veris)的结合Fab的DKK1的结合分析
为了检测大肠杆菌裂解物(BEL提取物)中亲和力增强的、DKK1特异性抗体片段，使用BioVeris M-384 SERIESWorkstation(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)。在96孔聚丙烯微量滴定板中完成进行该试验并且以补充0.5％BSA和0.02％Tween-20的PBS作为试验缓冲液。依据供应商的说明书将生物素化的人DKK1固定在M-280 Streptavidin顺磁小珠(Dynal)上。每孔加入1∶25稀释度的小珠贮备液。100μl稀释的BEL提取物样品和小珠于室温下在振荡器上温育过夜。为了检测，依据供应商(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)的说明书，使用以BV-tagTM标记的抗人(Fab)′2(Dianova)。
一组约2300个随机挑出的克隆通过上述方法分析。选择给出最高值的一组160个克隆用于溶液平衡滴定中的进一步分析。
使用溶液平衡滴定(SET)的皮摩尔亲和力的测定
对于KD测定，使用Fab的单体片段(由分析性SEC分析的至少90％单体含量；Superdex75，Amersham Pharmacia)。如由Haenel等人，2005描述地从基本上进行溶液中基于电化学发光(ECL)的亲和力测定和数据评估。Fab的恒定量以溶液中不同浓度(3n的连续稀释)的人DKK1(4nM初始浓度)平衡。加入连接顺磁小珠(M-280Streptavidin，Dynal)的生物素化的人DKK1，以及BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记的抗人类(Fab)′2(Dianova)并且将混合物温育30分钟。随后，未结合的Fab的浓度通过使用M-SERIES
Figure BDA0000106019950000701
384分析仪(BioVeris Europe)的ECL检测来定量。
为此，挑选160个单一克隆并由Ni-NTA琼脂糖以μg级进行纯化。初步的亲和力由BioVeris中的四点溶液平衡滴定(SET)来测定。从这些数据中挑选出显示亲和力的20个克隆。这些Fab以mg级进行纯化。由于在大小排阻层析中检测到的Fab的局部聚集，MOR04950从亲和力测定中排除并另行评估。使用八点SET测定和人类、小鼠和食蟹猴的DKK1，从每个Fab克隆的两个独立批次中检测最终的亲和力。
基本上如上所述，使用作为溶液中分析物的小鼠DKK1(R&D Systems)和食蟹猴DKK1而不是人DKK1来进行对小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力测定。为检测游离的Fab，使用连接顺磁小珠的生物素化的人DKK1。依据Haenel等人，2005 Anal Biochem 339.1：182-184计算亲和力。
使用上述的试验条件，在溶液中测定亲和力优化的抗DKK1 Fab的亲和力。测定针对人DKK1和针对小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力。
实施例6：亲和力优化的抗人DKK1 Fab的表征
酶联免疫吸附试验(ELISA)技术
在50％人类血清(HS)存在下测定成熟Fab的结合特异性。TBS中连续稀释的人类重组的、生物素化的DKK1于室温下经2小时包被到Neutravidin微量滴定板上，从每孔8ng DKK1至每孔125ng DKK1的浓度。抗原包被后，用1％BSA补充的TBS/0.05％Tween(TBS-T)于室温下经1小时将孔封闭。上述纯化的Fab以终浓度1μg/ml稀释于TBS/4％BSA或TBS/50％HS中，加入到包被的和封闭的孔中并且平板于室温下温育1小时。为了检测，使用抗FLAG碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体(1∶5000稀释于TBST中)和荧光底物AttoPhos(Roche)。每次温育后，微量滴定板的孔用TBST洗涤五次，只是在使用标记的第二抗体的最终温育步骤中孔洗涤三次。
在TECAN Spectrafluor平板读数器中测定荧光。测定与4％BSA中的结合活性相比在50％人类血清存在下优化的抗DKK1 Fab的结合活性。中值显示为93％，因此发现抗DKK1 Fab在人血清存在下充分结合到靶标。
使用U2OS细胞系的人类血清存在下的荧光素酶报告细胞试验
为另外测定优化的抗DKK1 Fab的结合特异性，在15％人类血清存在下使用骨肉瘤细胞系U2OS重复荧光素酶报告基因细胞试验。依据供应商的方案(ATCC，Manassas，VA，USA)培养U2OS细胞(ATCC No.HTB-96)。将细胞用胰蛋白酶消化、计数并稀释于培养基中(McCoy′s 5a/10％FCS)以达到2x105细胞/ml的浓度。对于每2x104个细胞，制备0.075μgpTA-LUC-12xSuperTopFlash和0.004μg phRL-SV40的混合物溶液。将这些混合到终体积为9.8μl的OPTI-MEM中。然后加入0.2μl FuGENE 6转染试剂(Roche，Mannheim，德国)。转染混合物简单温育并然后与预先制备的细胞混合。随后，将细胞以100μl每孔接种到白色平底的96孔细胞培养皿中并于37℃和5％CO2中培养过夜。第二天，从试验板的每孔中移出75μl培养基并替代为10μl HuCAL
Figure BDA0000106019950000711
Fab抗体稀释液(10至0.01μg/ml稀释于无血清培养基中)、15μl 70％FCS或人血清，并向每孔加入50μl含600ng/ml DKK1-APP的Wnt3a条件培养基。
对于阴性对照，加入无血清培养基以代替抗体稀释液。为获得最大量的荧光素酶信号，加入含代替抗体稀释液的10μl无血清培养基和不含DKK1-APP的50μl Wnt3a CM的对照。于37℃、5％CO2中培养24小时后，依据制造商说明使用Dual-Glo荧光素酶试验系统(Promega，Madison，WI，USA)来测定荧光。
这些数据显示获得的抗DKK1 Fab的克隆在人类血清存在下发挥作用。
通过荧光素酶报告基因细胞试验测定亲和力优化的抗DKK1 Fab的EC 50
在使用10nM DKK1的标准Wnt3a依赖性TCF/LEF荧光素酶报告基因试验中测试亲和力改进的Fab，以便获得荧光素酶表达的抑制作用。由于试验的灵敏性太低，可见无法通过该方法产生EC50值。通过所有待测Fab的陡峭的抑制曲线和相似的EC50值可见。
开发了TCF/LEF荧光素酶报告基因试验的改良版本。DKK1结合到Kremen-1和-2跨膜蛋白质并且该相互作用导致Wnt信号的强烈协同抑制作用(Mao等2002 Nature：417：664-67)。因此，Kremen cDNA与TCF/LEF荧光素酶报告基因试验共转染。得到的Wnt3a依赖性报告试验显示由Kremen共受体蛋白质的共表达介导的对DKK1灵敏性的高度增强。在该试验中，0.33nM DKK1足够诱导Wnt信号的完全抑制。使用0.33nMDKK1重复Fab滴定(以10倍浓度)，并且产生从中可计算EC50值的S形抑制曲线。
考虑到上述EC50而分析亲和力优化的抗DKK1 Fab。由该方法获得的EC50值范围从0.2nM至5.6nM。
亲和力优化的Fab的序列分析
测定所有20个Fab的重链和VL区(VH和VL)的核苷酸序列。互补决定区(CDR)的氨基酸序列列于本文表7和表8中。
表7.重链CDR的氨基酸序列
Figure BDA0000106019950000731
共有H-CDR序列SEQ ID NO：40-48源自表18A，并提供在表7中。本领域技术人员根据表18A-18C中的比对，使用标准方法和本文提供的方法，可以确定本发明的重链或轻链的其他共有CDR序列。
表8轻链CDR的氨基酸序列
Figure BDA0000106019950000741
序列分析显示，6个亲本(P)Fab中的5个产生了亲和力改善的后代。可以在HCDR2和LCDR3中优化MOR04461和MOR04470。没有获得MOR04454的优化的后代。此外，在不同的亲本抗体之间表现出高同源性，如表8中各种CDR的共有序列1和共有序列2的序列所示。使用本领域技术人员普遍已知的方法可以为表10A中显示的亲本序列提供相似的共有序列。
另外，已确定MOR04920在HCDR2区具有突变(在第73位丝氨酸残基突变为甘氨酸，依据Honegger和Pluckthun，2001 J MoI Biol309.3：657-670公布的编号方案)，因而偏离HuCAL
Figure BDA0000106019950000751
设计。
显示MOR04913具有在k轻链的构架4中的点突变(在第148位赖氨酸变为天冬酰胺)。因为不期望该位点影响抗体的结合特性，在IgG转变期间将突变回复成种系/HuCAL
Figure BDA0000106019950000752
组合物，产生抗体MOR05145。
MOR04947在LCDR2中具有潜在的糖基化位点。由于MOR04947仅仅选作备选候选物之一，因而未去除该位点。
实施例7：制备HuCAL
Figure BDA0000106019950000753
免疫球蛋白
转换成IgG形式
为表达全长免疫球蛋白(Ig)，对于人类IgG1或人类IgG4，将重(VH)和轻链(VL)的可变区片段从pMORPH
Figure BDA0000106019950000754
X9_FH_Fab表达载体中亚克隆进pMORPH
Figure BDA0000106019950000755
_h_Ig或pMORPH
Figure BDA0000106019950000756
2_h_Ig载体系列。其他载体可用于人IgG2。限制酶EcoRI、MfeI和BlpI用于将VH域片段亚克隆进pMORPH
Figure BDA0000106019950000757
_h_IgG1和pMORPH
Figure BDA0000106019950000758
_h_IgG4。限制酶MfeI和BlpI用于将VH结构域片段亚克隆进pMORPH
Figure BDA0000106019950000759
2_h_IgG1f和pMORPH
Figure BDA00001060199500007510
2_h_IgG4。使用EcoRV和Bsi WI位点将VL结构域片段亚克隆进pMORPH_h_Igκ和pMORPH
Figure BDA00001060199500007512
2_h_Igκ，而使用EcoRV和Hpa I将VL结构域片段亚克隆进pMORPH
Figure BDA00001060199500007513
_h_Igλ和pMORPH
Figure BDA00001060199500007514
2_h_Igλ2。
人类IgG的瞬时表达和纯化
用等摩尔量的IgG重链和轻链表达载体转染HEK293细胞。转染后4或5天时，收获细胞培养上清液。调节上清液的pH至8.0并且过滤灭菌后，将溶液进行标准的A蛋白柱层析(Poros 20A，PE Biosystems)。
亲本Fab转换成IgG形式
平行于亲和力成熟的开始，将MOR04454、MOR04456和MOR04470克隆进pMORPH
Figure BDA0000106019950000761
_h_IgG1和pMORPH
Figure BDA0000106019950000762
_h_IgG4表达载体。备选的构建体可用于IgG2表达载体的产生。由HEK293细胞的瞬时转染进行小范围表达并且从细胞培养上清液中纯化全长免疫球蛋白。
由大小排阻层析显示的数据表明抗体是单体形式的。Wnt3a依赖性报告基因试验中的测试证实蛋白质是有功能的。
实施例8：优化用于表达的氨基酸序列和基因的核苷酸序列
为增强哺乳动物的表达，将改变引入本文中的Fab的重链和轻链中，以进行细胞中表达的密码子选择的优化。已知的几个负的顺式作用基序减少在哺乳动物中的表达。本文的优化过程去除对表达起负作用的负的顺式作用位点(例如剪接位点或poly(A)信号)。本文的优化过程另外丰富GC含量以延长mRNA半寿期。
使用本文通过噬菌体展示筛选分离到的Fab克隆MOR04945(全长轻链亲本核苷酸序列是SEQ ID NO：98，并且全长重链亲本核苷酸序列是SEQ ID NO：102)来优化可变轻链和重链区。然后使用这些方案来优化编码这种或其他克隆的每一完整轻链和重链的核苷酸序列。
对于MOR04945的V H 和V L 链的优化过程
为优化用于在哺乳动物细胞中表达的每一VL和VH链的核苷酸序列和氨基酸序列，使密码子选择适用于哺乳动物基因的密码子偏爱。另外，在可能的情况下减少或消除GC含量非常高(＞80％)或非常低(＜30％)的区域。备选地，对于细菌、酵母或杆状病毒中表达的优化，将基于它们各自基因改变密码子的选择。
在哺乳动物表达的优化过程中，消除以下顺式作用序列基序：内在的TATA盒、Chi位点和核糖体进入位点、富含AT或富含GC的序列片段、RNA不稳定基序(ARE)序列元件、抑制RNA序列元件(INS)、cAMP响应(CRS)序列元件、重复序列和RNA二级结构、包括隐蔽位点的剪接供体和受体位点，以及分支点。除另外说明，在优化VL链的核苷酸序列过程中避免MluⅠ和HindⅢ位点的引入。除另外说明，在优化VH链的核苷酸序列过程中避免MlyⅠ和BstEⅡ位点的引入。
优化用于表达的MOR04945的V H 和V L 链的氨基酸序列
为了对上述克隆MOR04945的VH和VL链产生优化的氨基酸序列，改变密码子选择为哺乳动物的密码子选择，以使在哺乳动物细胞中具有更高和更稳定的表达速率。参见实施例5。
下表9显示了优化用于表达的可变轻链的有义(命名为“Sense”，SEQID NO：119)和反义(命名为“AS”，SEQ ID NO：120)核苷酸序列，和所获得的可变轻链氨基酸(命名为“AA”，SEQ ID NO：121)序列。
表9优化用于表达的VL链的核苷酸有义和反义序列，以及氨基酸序列
Figure BDA0000106019950000781
下表10显示了优化用于表达的可变重链的有义和反义核苷酸序列(分别是SEQ ID NO：122和123)和所获得的可变重链氨基酸(命名为AA)序列(SEQ ID NO：124)。
表10：优化用于表达的VH链的核苷酸正义(命名为“Sense”，SEQID NO：122)和反义(命名为“AS”，SEQ ID NO：123)序列，和氨基酸序列(命名为“AA”，SEQ ID NO：124)
Figure BDA0000106019950000791
优化前和优化后的图表可分别对每一亲本序列和优化的基因提供序列密码子的百分率，并分析编码VH和VL链的相关核苷酸序列的质量等级。本文所用的质量值指在期望的表达系统中用于给定氨基酸的最高频密码子设置为100，并且余下的密码子依据使用频率按比例标度。(Sharp，P.M.，Li，W.H.，Nucleic Acids Res.15(3)，1987)
另外，密码子适应指数(CAI)是描述核苷酸序列的密码子与目的生物的优选密码子选择匹配程度的数值。CAI的最大值设置为1.0，因此认为大于0.9的CAI能够高表达。优化前的VL链的CAI显示为0.73，而优化后，CAI测定为0.95。同样地，优化前的VH链的CAI显示为0.74，而优化后，在优化的结构中测定为0.98，VL链中的GC含量从MOR04945的亲本序列的51％增加到源自MOR04945的优化序列的62％。VH链中的GC含量从MOR04945的亲本序列的54％增加到MOR04945的优化衍生物的64％。
MOR04910、MOR04945、MOR04946和MOR05145的全长轻链和重链用 于表达的优化
将优化过程应用于MOR04910(SEQ ID NO：97)、MOR04945(SEQ IDNO：98)、MOR04946(SEQ ID NO：99)和MOR05145(SEQ ID NO：100)的轻链的每一亲本全长核苷酸序列以及MOR04910(SEQ ID NO：101)、MOR04945(SEQ ID NO：102)、MOR04946(SEQ ID NO：103)和MOR05145(SEQ ID NO：103)的重链的亲本全长核苷酸序列。
使用优化过程来构建与亲本克隆数相关的每一下列轻链核苷酸序列：对于克隆MOR04910，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：104；对于克隆MOR04945，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：105；对于克隆MQR04946，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：106；以及对于克隆MOR05145，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：107。另外，使用优化过程来构建与亲本克隆数相关的每一下列重链核苷酸序列：对于克隆MOR04910，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：108；对于克隆MOR04945，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：109；对于克隆MOR04946，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：110；以及对于克隆MOR05145，优化的核苷酸序列是SEQ ID NO：110。
优化的轻链核苷酸序列与下列优化的轻链氨基酸序列相关：对于克隆MOR04910，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：111；对于克隆MOR04945，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：112；对于克隆MOR04946，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：113；以及对于克隆MOR05145，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：114。优化的重链核苷酸序列与下列优化的重链氨基酸序列相关：对于克隆MOR04910，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：115；对于克隆MOR04945，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：116；对于克隆MOR04946，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：117；以及对于克隆MOR05145，优化的氨基酸序列是SEQ ID NO：117。
预期的全长轻链和重链序列的核苷酸和多肽序列的列表提供于表11中。表11提供优化的核苷酸序列和由它们编码的多肽。优化这些核苷酸序列以去除在哺乳动物表达系统中识别的潜在的剪接位点。
表11：轻链(LC)和重链(HC)序列-优化的
Figure BDA0000106019950000811
Figure BDA0000106019950000821
Figure BDA0000106019950000831
Figure BDA0000106019950000841
实施例9：生物活性试验
在报告基因试验中测定中和抗DKK1/4抗体的生物活性，使用称为SuperTopflash Krm17的遗传修饰的细胞系T/17STF_70IRES_Krm_(17)。细胞系源自人胚肾细胞HEK293并稳定转染有i)其中启动子TCF融合到萤火虫荧光素酶基因上游的报道基因构建体和ii)导致该细胞表面Krm过表达的构建体。在该细胞系中，暴露于Wnt蛋白质可刺激荧光素酶以剂量依赖性方式表达。在Wnt存在下向固定的、次最大剂量的DKK1中加入分级量的抗DKK1/4抗体，导致在16小时的温育期期间荧光素酶表达的增加。在末期，基于细胞裂解物中的酶活性来定量荧光素酶的量。荧光素酶催化底物荧光素向化学发光产物氧化虫荧光素的转变。然后用适当的光度计测定作为结果的发光型化学发光。
中和抗DKK1/4抗体试验样品的生物潜能通过与参考标准物比较其增加荧光素酶表达的能力来测定。基于蛋白质含量来归一化样品和标准品。然后依据欧洲药典1(European Pharmaco-poeia1)使用平行系试验来计算相对潜能。最终的结果表示成与参考标准相比的样品的相对潜能(以百分数)。
实施例10：相关生物靶标的体外活性
选择的前导Fab具有低纳摩尔范围的亲和力和细胞试验中的潜在活性。DKK1的生理学上的结合配偶体是LRP5/6(Kd～340pM)以及Kremen 1和2(Kd～280pM)[Mao 2001][Mao 2002]。鉴于这些高亲和力相互作用，需要另外提高亲和力以便更好地与生理学上的DKK1相互作用竞争。为增加挑选的Fab的亲和力和生物活性，通过使用导致突变的三核苷酸的盒式突变来平行优化CDR-L3和CDR-H2区[Virnekas 1994][Knappik 2000][Nagy 2002]。
亲和力成熟之后，挑选出具有低皮摩尔亲和力的、以低于1nM的EC50抑制Wnt信号发放的再激活DKK1的、并与食蟹猴、小鼠和大鼠DKK1交叉反应的FAb。然后将该FAb的可变区工程化成两个不同的人类IgG1构架。
抗DKK1/4抗体具有对人DKK1的高亲和力(2pM)，具有特别针对该亲和力抗体的结合动力学。参见图1。
图1.方法：使用具有包含CM5(S)传感器芯片(Cat#BR-1006-68)的Biacore TlOO(Biacore，Uppsala，瑞典)仪器的表面等离振子体共振来测定前导候选物和rhDKK1(重组人DKK1)(批次BTP7757)的结合亲和力和动力学。将抗人IgG1 Fc(Jackson Immuno Research，Cat#109-006-098)固定在每一流动细胞上，随后以约100RU的期望捕获来捕获前导候选物。最后，六种浓度的DKK1(范围0.195-6.25nM)以一种重复浓度在芯片上运行。将流动细胞激活用于240秒的DKK1结合，而接下来的解离达30分钟。在BIA评估1.0软件中使用动力学分析，使规范归一化的数据(减去背景的)适合与大量运输模式以1∶1结合。该试验进行三次重复，并且得到的数据是具有标准偏差的这三个试验的平均值。
实施例11：表位作图
成熟的DKK1是含两个半胱氨酸富集区(Cys-1和Cys-2)的266个氨基酸的蛋白质。Cys-2结构域负责结合LRP和Kremen蛋白质并且对于Wnt信号发放的抑制是必需且充分的[Li 2002][Brott 2002]。免疫沉淀试验(图2A、2B)证实抗DKK1/4抗体特异性结合Cys-2结构域，而不是Cys-1结构域。抗DKK1/4抗体在用变性DKK1进行的Western印迹中的活性微弱，并且在肽作图试验中未发现特异结合包括蛋白质(JTP)长度的任一重叠的15个氨基酸肽，这提示抗DKK1/4抗体很可能识别Cys-2内的非线性表位。
图2A图示全长和截短DKK1。全长(FL，含有残基1-266)、羧基端截短(ΔC，包含残基1-185)、以及氨基端截短(ΔN，包含残基1-60以及残基157-266)，在它们的C端与HA表位融合，并且克隆到巨细胞病毒(CMY)启动子控制下的哺乳动物表达载体中。图2B描述中和抗DKK1/4抗体和DKK1蛋白质的结合。来自表达包含全长的、氨基端截短的、羧基端截短的DKK1蛋白质的短暂转染的Hek293细胞的条件培养基与抗溶菌酶IgG1对照或抗DKK1/4抗体于室温下温育2小时，并且免疫复合物在G蛋白小珠上收集、由SDS-PAGE分离、转移并用抗HA抗体进行印迹。总输入量的1/10上样作为对照。
实施例11A：表位作图-N-糖基化
Wnt信号传导途径内的大量蛋白质是通过调节它们的细胞活性的酶翻译后共价修饰。包括DKK1的DKK家族成员由N-糖基化来修饰[Krupnik1999 Gene 238：301-313]。DKK1在Cys-2结构域内的第256位氨基酸具有一个理论上的N连接的糖基化位点。鉴于Cys-2结构域的高度保守特性，以及DKK1对LRP6和抗DKK1/4抗体对DKK1的潜在结合位点，我们试图确定抗DKK1/4抗体是否识别DKK1的N-糖基化形式。ELISA证实抗DKK1/4抗体识别rhDKK1的N-糖基化形式，胜过rhDKK1的特异N连接的去糖基化形式。参见表12A。而用直接针对重组蛋白质的融合表位标记区的第二抗体(抗HIS)完全等同地识别相同的蛋白质。通过使用表面等离振子体共振来定量亲和力的差异，并且发现相对于去糖基化蛋白质，抗DKK1/4抗体对糖基化的rhDKK1具有100倍高的KD，参见表12B。
表12A.结合百分比-结合到DKK1的抗DKK1/4抗体的糖基化依赖性
Figure BDA0000106019950000871
表12B.表面等离振子共振
  蛋白质   Ka(1/Ms)   Kd(1/s)   KD(M)
  WT DKK1   7.449E+6   2.319E-5   3.113E-12
  DKK1(N-去糖基化)   1.424E+6   3.071E-4   2.157E-10
通过ELISA测定抗DKK1/4抗体与野生型(WT)rhDKK1(HEK HIS表位标记的批次#BTP7757)和N连接的去糖基化的(N-DEGLY，使用酶PNGase F(Sigma，Cat#E-DEGLY)的N连接的去糖基化)rhDKK1的结合。简要地，高度结合ELISA(Nunc#442404)平板用1μg/ml WT或N-DEGLYDKK1包被。与它们分别结合N-DEGLY相比较，显示抗DKK1/4抗体和抗HIS抗体结合WT DKK1的比率。该试验以三种不同浓度进行(显示一种代表性浓度的数据)，所有浓度具有相似的结果。使用Biacore T100测定抗DKK1/4抗体与WT和N-DEGLY DKK1(HEK293批次#BTP7757)的结合亲和力和动力学。与WT DKK1相比，抗DKK1/4抗体始终具有对N-DEGLY DKK1低100倍的亲和力。
实施例12：DKK家族成员的同一性百分比
人Dickkopf家族包括四种侧向同源物(参见表13)，其中三种(DKK1、2和4)结合LRP6和Kremen蛋白质，诱导LRP5/6的内化并抑制常规Wnt信号发放[Mao 2001][Mao 2003]。DKK2也协同LRP6过表达以增强Wnt信号发放，但是LRP6和Kremen2的共表达恢复该途径的DKK2抑制作用[Mao 2003]。因此DKK2可充当激动剂和拮抗剂，这取决于细胞类型(cell context)。DKK3是最不保守的家族成员，其包括在负责LRP5/6和Kremen相互作用的Cys-2结构域内，而且由于其不结合LRP及Kremen，并且不阻碍Wnt信号而区别于其他DKK家族成员[Mao2001][Mao 2003]。
表13.跨越完整蛋白质和Cys-2结构域内的DKK家族成员的百分比同一性
表13
Figure BDA0000106019950000881
使用用于比较氨基酸同一性比率的配对序列比对的AlignX运算法则来评估DKK家族成员间的同源性。应用分别是10和0.1的空位开放罚分和空位延伸罚分。该评估包括整个蛋白质的比较，以及仅仅Cys-2结构域的比较。如上表中指出的，DKK1、2和4在整个蛋白质上有30-40％的氨基酸序列同源性。单独Cys-2结构域的比较显示DKK1和2在该区内有69％的同源性，而DKK4与DKK1和2共有约57％的相同结构域。DKK3显示与其他家族成员最低水平的同源性。Cys-2结构域内的所有成员间的同源性最大。
实施例13：抗DKK1/4抗体与人DKK家族成员的亲和力
除了结合DKK1，抗DKK1/4抗体也结合DKK4，参见表14。虽然对DKK4的亲和力比对DKK1的亲和力低大约100倍，它仍然是次纳摩级并因此很可能是生物学上和临床上相关的。值得注意的，DKK2和DKK4都没有保留预测的在DKK1的Cys-2结构域中靶向用于糖基化的天冬酰胺残基。初步的免疫沉淀试验提示抗DKK1/4抗体未特异结合DKK2。结合DKK2的抗DKK1/4抗体的结合亲和力将在DKK2成功纯化后测定。与DKK3的独特功能和结合特性相一致，抗DKK1/4抗体不结合DKK3。
表14.抗DKK1/4抗体对人DKK家族成员的亲和力
 DKK家族成员   KD
 DKK1   2.0×10-12M(±0.7)
 DKK2   ND
 DKK3   NSB
 DKK4   2.97×10-10M(±1.5)
使用Biacore T100测定抗DKK1/4抗体对人DKK家族蛋白质其他成员的结合亲和力和动力学。与以前一样，试验进行三次重复，针对显著结合抗DKK1/4抗体的蛋白质并报告为具有标准偏差的三次试验的平均值。同源性最少的家族成员DKK3，在背景水平上不具有可检测结合并因此称为NSB(无显著结合)。同样地，近期数据显示本发明的抗DKK1/4抗体也对DKK2具有无显著结合。
实施例14：抗DKK1/4抗体阻碍DKK1对LRP6的结合
DKK1通过与LRP5/6和Kremen的相互作用来介导它的Wnt拮抗剂活性，诱导内化并阻碍Wnt诱导的LRP5/6与Frizzled受体的相互作用。在图3的竞争性ELISA试验中抗DKK1/4抗体竞争性抑制DKK1与LRP6的结合。
HEK293T细胞未表达足够水平的内源性LRP5或6以使DKK1结合显现。然而，可在细胞表面检测到LRP6与表面运输侣伴蛋白质、MESD、GFP标记的DKK1的共转染，这表明DKK1/LRP6相互作用的特定性质。与抗DKK1/4抗体具有相同可变区的MOR04910特异性地阻碍该相互作用。
抗DKK1/4抗体抑制DKK1与LRP6直接结合的能力由ELISA测定。简要地，未处理平板(Fisher，Cat#12565501)用1μg/ml重组LRP6(R&DSystems Cat#l 505-LR)包被，然后将500ng/ml rhDKK1和抗DKK1/4抗体或hlgG1(抗溶菌酶MOR3207，ACEl 0915)的浓度曲线(concentrationcurve)在冰上预温育30分钟，然后将它们放置到LRP6包被的板上达2小时。洗涤平板并用抗DKK1抗体(R&D Systems AF 1096)检测DKK1结合水平。显示的是原始OD值(减去背景的)。增加浓度的抗DKK1抗体以剂量依赖方式抑制DKK1L与LRP6的直接结合，而增加浓度的hlgG1未阻碍DKK1与LRP6的结合。
MOR04910抑制DKK1/LRP6结合到细胞表面上的能力由荧光显微镜测定。HEK293T细胞是以编码LRP6和MESD的质粒转染的或短暂转染的模拟体。细胞与DKK1-GFP条件培养基连同抗溶菌酶Fab或抗DKK1FAb MOR04910于37℃温育1小时，并由荧光显微镜测定。GFP荧光反映DKK1-GFP在质膜上对超量表达的LRP6的结合。抗DKK1/4抗体在细胞表面阻碍DKK1与LRP6相互作用。
实施例14：报告基因试验-DKK1抑制的TCF/LEF基因转录的再激活
常规的Wnt信号发放在β联蛋白转移到细胞核中时终止，其中β联蛋白与导致Wnt应答基因转录增强的TCF/LEF家族的转录因子相关。报告基因试验使用驱动荧光素酶基因转录的TCF/LEF应答启动子来构建，以便于Wnt途径调节的检测。在该试验中DKK1有效地阻碍由Wnt3A条件培养基(CM)诱导的荧光素酶活性。抗DKK1/4抗体以明显的0.16nM EC50重新激活DKK1抑制的Wnt信号发放，参见图4。因为试验需要约1nM的DKK1用于完全抑制并且抗体亲和力是2pM，很可能该EC50反映试验的灵敏性和每一蛋白质的相对量而不是抗DKK1/4抗体竞争的绝对限定。
以SuperTopflash报道基因和Kremen稳定转染的293T细胞用10ng/ml rhDKK、50％Wnt3a条件培养基，以及多种量的抗DKK1/4抗体来处理。18小时后，荧光素酶活性由明亮Glo试验试剂盒(Promega)测定。
实施例15：报告基因试验-在前成骨细胞样细胞中DKK1抑制的碱性磷酸酶分泌的反转
为测定抗DKK1/4抗体是否以更加生理相关的状态阻碍DKK1功能，建立体外试验以测定多能性小鼠细胞系C3H10T1/2(10T1/2)的Wnt介导的成骨细胞分化，参见图5。成骨细胞分化后，10T1/2细胞分泌碱性磷酸酶(AP或ALP)，该现象可由DKK1抑制。抗DKK1/4抗体但不是IgG对照，在Wnt3A条件培养基存在时阻碍DKK1对10T1/2分化的抑制作用。
已报道Wnt诱导增殖和抑制许多细胞类型上的细胞凋亡和Wnt途径的激活，如由β联蛋白稳定性或核定位指示的，Wnt途径的激活常与肿瘤发展相联系。此外，在某些癌症(例如结肠癌和黑素瘤)中DKK1的减量调节，已引导某些研究者提出DKK 1对某些癌症可能是肿瘤抑制剂[Gonzalez-Sancho 2005][Kuphal 2006]。为测试DKK1对肿瘤增殖或存活是否具有影响，肿瘤细胞系用抗DKK1/4抗体处理并分析生长中的变化。未发现抗DKK1/4抗体的加入显著影响测试的肿瘤细胞系。
在体外评估抗DKK1/4抗体对若干肿瘤细胞系的存活或增殖的影响。在该试验中，抗DKK1/4抗体(100μg/ml)用肿瘤细胞系温育，3天后细胞数量由ATP(Promega，Cell Titer GIo Assay
Figure BDA0000106019950000911
)的定量来评估，ATP作为与细胞数量呈线性关系的代谢活性细胞的度量。以三种不同血清浓度(无血清，最小生长，以及完全生长)进行该试验。与未处理的和hlgG1处理的细胞相比未发现明显变化。通过ELISA分析细胞系上清液的DKK1表达。
实施例16：种间交叉反应和DKK1的中和
中和抗DKK1/4抗体的选择不是因其针对人DKK1的高亲和力和中和能力，而是基于其与其他物种的交叉反应，其中这些物种用于功效和安全研究。抗DKK1/4抗体以与对人DKK1相似的亲和力来与小鼠、大鼠和食蟹猴(cyno，Macaca fascicularis)DKK1交叉反应，见表15。此外，抗DKK1/4抗体中和所有四个种的D与KK1介导的Wnt抑制活性(表15)，暗示这些物种应该与安全和功效模式相关。
表15.种间交叉反应和DKK1的中和
Figure BDA0000106019950000921
对人类、食蟹猴、小鼠和大鼠DKK1的亲和力测定通过使用M-384SERIES
Figure BDA0000106019950000922
分析仪(BioVeris，Europe)的溶液平衡滴定(SET)来分析。对于由溶液平衡滴定(SET)测定的KD，使用IgG蛋白质的单体片段(至少90％单体含量，由分析性SEC分析的，Superdex75，Amersham Pharmacia)。在溶液中基于电化学发光(ECL)的亲和力测定和数据评估基本如描述于[Haenel et al.，2005]中地进行，应用如依据[Piehler等人，1997]修饰改进的结合安装模型。恒量的MOR4910IgG用溶液中不同浓度的(3n稀释)人DKK1(4nM初始浓度)平衡。加入连接生物素化的人DKK1的顺磁小珠(M-280Streptavidin，Dynal)和BV-tagTM(BioVeris Europe，Witney，Oxfordshire，UK)标记的山羊抗人类(Fab)′2多克隆抗体并温育30分钟。随后，经由采用M-384 SERIES分析仪(BioVeris，Europe)的ECL检测来定量未结合的IgG浓度。在溶液中使用小鼠、大鼠和食蟹猴DKK1而不是人DKK1作为分析物来基本上如上所述进行对大鼠、小鼠和食蟹猴DKK1的亲和力测定。为检测游离的IgG分子，使用连接生物素化的人DKK1的顺磁小珠。MOR4910和抗DKK1/4抗体以相同的EC50中和人DKK1(Novartis)，抗DKK1/4抗体也中和猴(Novartis)、小鼠(R&D Systems1765-DK-010)和大鼠(Novartis)的DKK1。基本如上所述(图4)使用每一种的重组DKK1而不是人DKK1作为Wnt条件培养基的抑制剂来进行对人类、大鼠、小鼠和食蟹猴DKK1的TOPFLASH报告基因试验。大鼠重组DKK1需要较高的蛋白质浓度以达到TOPFLASH试验的显著抑制。
实施例17：抗DKK1/4抗体对PC3M2AC6异种移植物的胫骨内生长的影响
前列腺肿瘤转移由于它们主要是成骨细胞的而不是溶骨细胞的，因而在骨转移中是独特的[Keller2001]。然而，甚至主要的成骨细胞性骨转移具有潜在的骨质溶解区并经常具有低骨质密度(BMD)，特别是当患者正接受雄性激素撤除治疗时[Saad 2006]。最近，证实DKK1可充当开关，由此DKK1的表达增强混合的成骨性的/溶骨性的前列腺肿瘤细胞系(C4-2B)的溶骨细胞特征。另外，DKK1的shRNA抑制作用抑制主要的溶骨性前列腺肿瘤细胞系(PC3)的溶骨活性[Hall 2005][Hall 2006]。DKK1敲除也抑制肿瘤异种移植物的胫骨内生长，导致本发明人推测溶骨活性可能对建立转移生境很重要，但随后在前列腺转移中DKK1的损失将肿瘤转变为成骨细胞表现型。
溶骨性前列腺肿瘤模型由[Kim 2003]的方法来改进。将稳定表达荧光素酶的溶骨性前列腺肿瘤细胞系(PC3M)的变体注入小鼠胫骨。肿瘤的生长由荧光素酶来监测，而骨中变化由微计算机处理X线断层摄影术(micro-CT)和组织学来监测。抗DKK1/4抗体倾向于抑制肿瘤生长，而非促进肿瘤生长。当在任一研究中抑制作用都不显著时，目前它在实施的5/5研究中一致发生，显示3倍剂量的抗DKK1/4抗体对肿瘤生长影响的代表性研究显示于图6中。具有皮下PC3M2AC6异种移植物的抗DKK1/4抗体处理的小鼠产生针对抑制作用的相似的非显著性趋势。
植入(0.2百万个细胞/动物)后第5天开始处理。以20、60和200μg/小鼠/天的剂量，每天、一周3次地静脉内注射施用抗DKK1/4抗体持续两周。以200μg/小鼠/天，每天、一周3次地静脉内注射施用对照IgG持续两周。处理后计算最终功效数据和体重变化。
使用该模型，我们发现抗DKK1/4抗体抑制肿瘤诱导的骨皮质损伤。在该模式中通过肿瘤移植物和虚拟移植对骨造成机械损伤的观测无法区分对骨小梁的影响，其造成随后重塑的编织骨中的初始增加，因此引起表观骨容量上的减少。新形成的编织骨和小梁对整体骨容量/小梁容量比率的相对影响因而不明显。然而，抗DKK1/4抗体在肿瘤和虚拟移植的胫骨中增加骨的产生，并抑制或延缓伴随重塑的骨容量的减少是明显的。使用相同的肿瘤诱导的溶骨性模式，抗DKK1/4抗体显示与唑来膦酸当量的抗溶骨活性，参见图8。抗DKK1/4抗体的骨代谢效果在20-200μg/小鼠的范围内是剂量应答的，最低有效剂量在20至60μg/小鼠之间，参见图9。综合这些数据，提示抗DKK1/4抗体对肿瘤诱导的溶骨性疾病应具有效果，但可能也对非肿瘤性骨疾病如骨质疏松症或增强骨折修复有效。
实施例18：在肿瘤和虚拟移植的胫骨中抗DKK1/4抗体维持增加的骨密度
为了评估小鼠药效学标记中的功效，分析了骨代谢的三种血清标记：骨钙蛋白(OC)、护骨蛋白(OPG)以及核因子κB配体分泌型受体活化因子(sRANKL)。由于预期的抗体作用机理，使用这些成骨细胞标记而非更典型的破骨细胞标记。然而，在与正常动物相对的患肿瘤的动物中未检测到一致的改变。如由micro-CT或IHC测定的，以任一这些标记始终未观测到骨丢失的相关性。
进行待治疗小鼠胫骨的MicroCT再建的典型实例。皮质损伤划分成从0＝无损伤至3＝严重损伤。由microCT分析来人工划分肿瘤移植的胫骨中的皮质损伤，其对于研究的组是未知的。在任一虚拟移植的胫中未观测到皮质损伤。
方法：12周龄的雌性裸鼠在左胫骨中用2x105PC-3M2AC6细胞进行胫骨内移植并且在右胫骨中进行虚拟注射。处理开始于移植后的第5天。以200μg/小鼠/天的剂量，每天、一周3次地静脉内注射施用NVP-抗-DKK1/4抗体-NX(抗DKK1/4抗体)和IgG对照持续两周。也每天、一周3次地静脉内注射施用载体(PBS)对照持续两周。在肿瘤移植后的第7、14和18天采用μ-CT VivaCT40扫描仪(SCANCO，瑞士)来扫描动物。如方法中描述地来分析小梁的骨密度(BV/TV)。星号(*)指载体和IgG对照在相同时间点上统计学显著差异(n＝12)，p＜0.05。
在图7中，为测定骨密度，胫骨的次级松质骨(spongiosa)用基于吉姆萨染色剂的Zeiss Imager Z.1和Axiovision软件进行作图。读数基于整个视野中钙化骨的百分比。每个柱形代表规定数目动物的平均值和标准偏差。在PBS、IgG和抗DKK1/4抗体处理组中，仅分析患肿瘤的动物。右胫没有虚拟注射而左胫有肿瘤。统计分析：Dunnett试验单因素方差分析。左胫或右胫与PBS组中的对应胫进行比较，p＜0.05*，p＜0.01**，p＞0.05无显著差异。
图9显示抗DKK1/4抗体的代谢骨功效是剂量依赖性的，最低有效剂量在20至60μg/小鼠3x/周之间。12周龄的雌性裸鼠在左胫骨中用2x105PC-3M2AC6细胞进行胫骨内移植并且在右胫骨中进行虚拟注射。治疗开始于移植后的第6天。以20、60和200μg/小鼠/天的剂量，每天、一周3次地静脉内注射施用NVP-抗-DKK1/4抗体-NX(抗DKK1/4抗体)持续两周。每天、一周3次地静脉内注射施用载体对照(PBS)持续两周。在肿瘤移植后的第7和20天使用μ-CT VivaCT40扫描仪(SCANCO，瑞士)来扫描动物。如方法中描述地来分析小梁的骨密度(BV/TV)。*指包括载体、IgG、仅钻孔和正常动物的所有对照在相同时间点上统计学显著差异，p＜0.05。
实施例19：生物标记情况
DKK1生物标记
已描述DKK1的RNA表达模式。Krupnik(1999)通过Northern印迹分析显示在胎盘中的表达，在心脏、脑、肺、肝、骨骼肌或胰腺中未检测到表达。Wirths(2003)显示在肝、肾和乳腺中缺乏RNA表达，尽管在肝胚细胞(hepatoblasomas)瘤和Wilms肿瘤亚种中可见RNA表达。技术人员通过RNA原位杂交检测的DKK1胃肠道表达显示在不管是正常的或恶性的胃和结肠内均未表达(Byun 2006)。
小鼠中RNA表达分析显示骨中的高DKK1表达水平，胎儿和胎盘中的中等表达，以及褐色脂肪组织、胸腺和十二指肠中的微弱表达[Li 2006]。
使用应用于当前研究中的相同的山羊抗体在骨髓瘤样本中评估DKK1蛋白质表达(Tian，2003)。本文中，在具有低级形态学的患者的骨髓瘤细胞中可见表达，在五种对照对象的骨髓活组织切片样本中未检测到DKK1蛋白质表达。
通过对一系列正常人类和猴子组织的筛选来进行治疗性抗体抗DKK1/4抗体的组织分布和物种间交叉反应研究。评估全部的组织切片和组织微阵列。阳性对照包括在相同组织体系中评估的抗DKK1的市售抗体。
DKK1_15(FITC缀合的抗DKK1/4抗体)和DKK1_8(FITC缀合的山羊抗DKK1，R&D Systems，#AF 1096，lots GBL013101和GBL14111)。
其他生物标记
由于很少了解关于DKK1的病理生理作用，相当大的努力正在并已经集中于通过生物标记研究来构建关于抗DKK1/4抗体的体内效果的知识基础，以及如何利用和进一步发展这一知识基础。关注的重点领域包括
1)在正常的和转移性的骨代谢中通过测定破骨细胞和成骨细胞活性的循环标记来理解抗DKK1/4抗体的效果。
2)在多发性骨髓瘤和其他肿瘤中用以确定和扩大靶标指示的DKK1的可比较的表达水平。
3)在重要组织如结肠、骨髓、肺、皮肤和乳腺中用以评估β联蛋白活性的基因表达水平上的效果。
初步的分子流行病学研究已证实在患有多发性骨髓瘤的患者中具有增加的DKK1血清水平并在该迹象中支持POC。
基于现有知识，表16为抗DKK1/4抗体提供建议的潜在生物标记。
表16.针对DKK1和DKK4靶标的生物标记物
实施例19：抗DKK1抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列
抗DKK1抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列全部提供于表17中，其中抗体的CDR区显示于表5和6中。
表17.抗DKK1抗体重链和轻链可变区氨基酸序列(SEQ IDNO：2-39)
Figure BDA0000106019950000981
Figure BDA0000106019950000991
Figure BDA0000106019950001001
将表17中的可变区的CDR和FR片段排列于针对重链(SEQ IDNO：2-20；VH3是SEQ ID NO：125，VH5是SEQ ID NO：126)的表18A、针对κ轻链(SEQ ID NO：21、22、23、27、28和29；VK1是SEQ ID NO：127并且VK3是SEQ ID NO：128)的表18B以及针对λ轻链(SEQ ID NO：24、25、30、31、32、33、34、35、36和37；VL2是SEQ ID NO：129并且VL1是SEQ ID NO：130)的表18C中。
Figure BDA0000106019950001011
Figure BDA0000106019950001021
实施例20：抗DKK1/4抗体治疗各种疾病
A.评估DKK1/4中和性抗体的疗效
人充质干细胞(hMSC)是MFH(恶性纤维状组织细胞增多症或组织细胞瘤)的前体，如Matushanasky等人，2007 J.Clin.Invest.117(11)：3248-3257所述。DKK1是hMSC增殖的中介，在MFH中过表达。DKK1抑制hMSC通过Wnt2/β-联蛋白经典信号传导定型分化。通过测量本发明抗体对这类在MFH中具有改变的表达的基因和基因产物的活性水平的影响，来评估抗DKK1/4中和性抗体治疗MFH和/或抑制从hMSC衍生肉瘤的能力。这类标志物包括在MFH中不能积累的核β-联蛋白；在MFH中高度过表达的Wnt2；和与其他肉瘤亚型相比缺乏的Wnt5a。通过本领域已知的技术实施对这类标志物水平和活性改变的测量。
如Matushanasky等人所述，hMSC和用SV40大T抗原永生化的hMSC，当生长在含DKK1的培养基中时，表现出肿瘤发生的集落形成，当注射到裸鼠中时，形成肿瘤。在一个实施方案中，在生长培养基中添加抗DKK1/4抗体，评估它抑制从hMSC衍生出MFH的能力。
在一个实施方案中，评估RNA和/或蛋白质水平或活性，通过例如获得样品RNA并在Wnt通路特异性微阵列中检验，如You等人，2008Dig.Dis.Sci.53：1013-1019所述。
B.用DKK1/4抗体治疗MFH
向诊断患有或有风险患MFH的对象施用有效量的本发明的抗DKK1/4抗体，并监控治疗效应。用活组织检查和CT或MRI扫描确定转移性疾病的存在。施用抗体的方法在此提供，或者可以通过本领域技术人员已知的方法施用。这类方法包括但不限于在盐水溶液中或在包括约5％右旋糖或葡萄糖的水溶液(“D5W”)中I.V.注射。患者任选的进行了前驱用药，例如用了对乙酰氨基酚(acetaminophen)和苯海拉明(diphenhydramine)。确定剂量范围(包括剂量限制毒性(dose-limited toxicity))、安全性和药物动力学(包括检测代谢物和确定排除半衰期)。通过测量DKK1和核β-联蛋白、Wnt2和/或Wnt5a的水平，确定抗体的活性。
疾病治疗还任选的包括其他疗法，包括化疗(包括异环磷酰胺(ifosfamide)和多柔比星(doxorubicin))、放疗和手术切除。此类组合疗法或治疗与DKK1/4抗体施用相比，可以是同时的、同步的、分别的或依次的。在整个疾病状态治疗的过程中，和成功治疗后，监控患者的疾病复发。
C.用DKK1/4抗体治疗IBD
向诊断患有或有风险患IBD的对象施用有效量的本发明的抗DKK1/4抗体，并监控治疗效应。通过胃肠道炎症和消化道外的表现(例如，肝脏问题、关节炎和皮肤和眼部问题)，来确定IBD的存在。施用抗体的方法在此提供，或者可以通过本领域技术人员已知的方法施用。这类方法包括但不限于在D5W或盐水溶液中的I.V.注射。患者任选的进行了前驱用药，例如用对乙酰氨基酚和苯海拉明。确定剂量范围(包括剂量限制毒性(dose-limited toxieity))、安全性和药物动力学(包括检测代谢物和确定排除半衰期)。通过测量在溃疡性结肠炎中过表达的Wnt基因(Wnt2B、Wnt3A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt9和Wnt11)，确定抗体的活性。
疾病治疗还任选的包括其他疗法，包括手术和药剂，包括免疫抑制剂和抗炎剂，包括泼尼松(prednisone)、英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade)、硫唑嘌呤(azathioprine)(Imuran)、氨甲喋呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)和美沙拉秦(mesalamine)。此类组合疗法或治疗与DKK1/4抗体施用相比，可以是同时的、同步的、分别的或依次的。在整个疾病状态治疗的过程中，监控患者，包括监控症状(腹痛、呕吐、腹泻、便血、体重减轻、关节炎、坏疽性脓皮病和原发性硬化性胆管炎)。
D.用DKK1/4抗体治疗肺癌
向诊断患有或有风险患肺癌(例如，非小细胞肺癌)的对象施用有效量的本发明的抗DKK1/4抗体，并监控治疗效应。通过胸平片、支气管镜检、CT(计算机体层摄影)扫描和/或痰细胞学检验，来确定肺癌的存在。施用抗体的方法在此提供，或者可以通过本领域技术人员已知的方法施用。这类方法包括但不限于在D5W或盐水溶液中的I.V.注射。患者任选的进行了前驱用药，例如用对乙酰氨基酚和苯海拉明。确定剂量范围(包括剂量限制毒性(dose-limited toxicity))、安全性和药物动力学(包括检测代谢物和确定排除半衰期)。通过测量在该疾病中过表达的DKK1的水平，确定抗体的活性。
疾病治疗还任选的包括其他疗法，包括手术、放疗和化疗(例如，基于铂类化合物的疗法，例如，顺铂或卡铂(carboplatin))。此类组合疗法或治疗与DKK1/4抗体施用相比，可以是同时的、同步的、分别的或依次的。在整个疾病状态治疗的过程中监控患者，包括监控症状(呼吸短促、咳嗽、咳血、胸腹痛、疲劳、胃口丧失、骨痛、声音嘶哑、发热和体重减轻)。
E.用DKK1/4抗体治疗食道鳞状细胞癌(ESCC)
向诊断患有或有风险患ESCC的对象施用有效量的本发明的抗DKK1/4抗体，并监控治疗效应。通过吞钡、钡餐、食道-胃-十二指肠镜检、CT扫描、正电子成像术和/或食道超声内窥镜来确定ESCC的存在。施用抗体的方法在此提供，或者可以通过本领域技术人员已知的方法施用。这类方法包括但不限于在D5W或盐水溶液中的I.V.注射。患者任选的进行了前驱用药，例如用对乙酰氨基酚和苯海拉明。确定剂量范围(包括剂量限制毒性(dose-limited toxicity))、安全性和药物动力学(包括检测代谢物和确定排除半衰期)。通过测量在该疾病中过表达的DKK1的水平，确定抗体的活性。
疾病治疗还任选的包括其他疗法，包括手术、激光治疗、放疗和化疗(包括氟尿嘧啶(fluorouracil)和表柔比星(epirubicin)、基于顺铂的化合物，例如卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin))。此类组合疗法或治疗与DKK1/4抗体施用相比，可以是同时的、同步的、分别的或依次的。在整个疾病状态治疗的过程中监控患者，包括监控症状(包括吞咽困难和吞咽痛、体重减轻、呕吐、咳嗽、肺炎、呕血、疼痛和贫营养)。
F.用DKK1/4抗体治疗骨髓(骨骼)转移
向诊断患有或有风险患骨髓(骨骼)转移的对象施用有效量的本发明的抗DKK1/4抗体，并监控治疗效应。通过活组织检查、X射线分析、正电子成像术、骨扫描、MRI和/或闪烁照相成像来确定骨髓(骨骼)转移的存在。施用抗体的方法在此提供，或者可以通过本领域技术人员已知的方法施用。这类方法包括但不限于在D5W或盐水溶液中的I.V.注射。患者任选的进行了前驱用药，例如用对乙酰氨基酚和苯海拉明。确定剂量范围(包括剂量限制毒性(dose-limited toxicity))、安全性和药物动力学(包括检测代谢物和确定排除半衰期)。通过测量在该疾病中过表达的DKK1的水平，确定抗体的活性。
疾病治疗还任选的包括其他疗法，包括手术、放疗和化疗(包括护骨素；RANKL(核因子-κB的受体激活剂)阻断剂；核因子-κB(NF-κB)拮抗剂；抗PTHrP(甲状旁腺素相关肽)抗体；PDGFR拮抗剂例如ST1571和甲磺酸伊马替尼(Imatinib mesylate)(格列卫(Gleevec))；ETA(内皮素受体亚型A)抑制剂，包括阿曲生坦(atrasentan)；EMD121974(西仑吉肽(cilengitide))；基质金属蛋白酶抑制剂；钐(samarium)；锶(strontium)和双磷酸盐(biphosphonate))。此类组合疗法或治疗与DKK1/4抗体施用相比，可以是同时的、同步的、分别的或依次的。在整个疾病状态治疗的过程中监控患者，包括监控症状，特别是疼痛。
G.用DKK1/4抗体治疗骨肉瘤
向诊断患有或有风险患骨肉瘤的对象施用有效量的本发明的抗DKK1/4抗体，并监控治疗效应。通过活组织检查、X射线分析、正电子成像术、骨扫描、MRI和/或闪烁照相成像来确定骨肉瘤的存在。施用抗体的方法在此提供，或者可以通过本领域技术人员已知的方法施用。这类方法包括但不限于在D5W或盐水溶液中的I.V.注射。患者任选的进行了前驱用药，例如用对乙酰氨基酚和苯海拉明。确定剂量范围(包括剂量限制毒性(dose-limited toxicity))、安全性和药物动力学(包括检测代谢物和确定排除半衰期)。通过测量在该疾病中过表达的DKK1的水平，确定抗体的活性。
疾病治疗还任选的包括其他疗法，包括手术和化疗(包括具有甲酰四氢叶酸拯救的甲氨蝶呤(methotrexate with leucovorin rescue)、顺铂、亚德利亚霉素(adriamycin)、含双磷酸盐(mesna)的异环磷酰胺(ifosfamide)、BCD、依托泊甙(etoposide)、胞壁酰三肽(muramyl tri-peptite)(MTP))。此类组合疗法或治疗与DKK1/4抗体施用相比，可以是同时的、同步的、分别的或依次的。在整个疾病状态治疗的过程中监控患者，包括监控症状(包括疼痛和组织坏死)。
实施例21
3T3-L1成纤维细胞购自ATCC(货号CL173)。细胞生长至汇合，并在含高葡萄糖(Invitrogen#11995065)的DMEM中再维持5天，所述DMEM中补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素。在分化当天，将培养基改变为补充了11μg/ml胰岛素、115μg/ml异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)和0.0975μg/ml地塞米松(dexamethasone)的分化培养基，培养3天。
Wnt3a条件培养基是从用编码Wnt3a的表达质粒转染的细胞产生的。对照的条件培养基是从用空载体转染的细胞产生的。在分化当天，向细胞添加含有11μg/ml胰岛素、115μg/ml IBMX和0.0975μg/ml地塞米松的Wnt3a条件培养基。在分化的第3和第5天，将分化培养基变为条件培养基。在分化第7天，使用细胞进行分析。
在分化当天，在分化培养基中添加各种浓度的Wnt3a、Wnt3a和DKK1，或者Wnt3a和DKK1和MOR4910。在添加至细胞之前，将Wnt3a与DKK1以及与DKK1和MOR4910按小体积组合，并在冰上孵育10分钟。在分化后第3和第5天，用含Wnt3a、DKK1和MOR4910的培养基替代培养基。在分化后第7天，使用细胞进行分析。Wnt3a重组蛋白购自R&D systems#GF145。
实施蛋白质裂解液的制备和Western印迹。使用的一抗是山羊抗GLUT4(Santa Cruz#sc-1608)、小鼠抗β肌动蛋白(Abcam#ab6276-100)、兔抗磷酸基AKT(Cell signaling#9271)、兔抗AKT(Cell signaling#9272)和抗β-联蛋白(BD Transduction Lab#610154)。
实施例22
从细胞提取总RNA，根据生产商的手册，将1微克总RNA使用Superscript III First-Strand synthesis super mix(Invitrogen#18080-400)合成cDNA。在不含核酸酶的水中1∶5稀释新合成的cDNA，至终体积100微升，并储存在-20℃直到使用。
在ABI Prism 7900HT序列检测系统上实施定量RT-PCR，并使用SDS2.0软件(Applied Biosystems)分析。每个反应使用1微升cDNA。通过内源性对照18S rRNA(Applied Biosystems#4310893E)将每个靶基因的表达归一化。从Applied Biosystems获得含有针对靶基因的特定引物和探针的Assay-on-demand 20X混合物。
表19：用于定量实时PCR的引物和探针
Figure BDA0000106019950001091
实施例23
为了验证DKK1和Wnt3a在RNA和蛋白质水平对分化的影响，分析以下对象：PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、C/EBP2(CCAAT/增强子结合蛋白2)和FABP4(脂肪酸结合蛋白2)mRNA和GLUT4(葡萄糖转运子)蛋白质表达。如图10A所示，用Wnt3a和DKK1处理逆转了Wnt3a的效应，因此，这些样品中的分化标志物的mRNA表达水平是增加的。图10B显示，相比仅用Wnt3a处理，Wnt3a和DKK1增加了GLUT4蛋白质表达。
实施例24
在根据实施例23验证了DKK1可以逆转Wnt3a对脂肪细胞分化的抑制效应后，再测试DKK1抑制性抗体MOR4910是否可以重建Wnt3a的效应。用含有10ng/ml重组Wnt3a、1μg/ml DKK1蛋白以及1μg/ml和2.5μg/ml的MOR4910的分化培养基处理细胞。监控这些细胞分化的形态学改变，分析分化标志物的mRNA表达水平和GLUT4蛋白质表达。
如实施例21所述培养细胞。在4、5、6和7天采集图像，显示在细胞分化过程中的形态学差异。如前述观察，Wnt3a对分化的抑制被1μg/mlDKK1的共处理完全逆转。通过添加2.5μg/ml MOR4910破坏了DKK1抑制Wnt3a功能的能力。其结果是，与仅用Wnt3a处理的细胞相似，用MOR4910和DKK1处理的细胞不分化。对照显示对照抗体与DKK1的组合或与Wnt3a和DKK1的组合没有效应。
实施例25
通过PPARγ、C/EBP2和FABP4mRNA和GLUT4蛋白质表达，验证MOR4910(在图11和12中标记为“BHQ880”)在RNA和蛋白质水平对分化的效应。如图11所示，MOR4910与Wnt3a和DKK1蛋白质一起降低了分化标志物的表达水平。图12显示，MOR4910与Wnt3a和DKK1蛋白质一起减少了GLUT4蛋白质表达。
如图11所示，从用Wnt3a、DKK1和MOR4910(“BHQ880”)处理的细胞中收获总RNA。通过Q-PCR确定分化标志物PPARγ、C/EBP2和AP2的表达水平。
如图12所示，制备细胞的裂解液，并用Western印迹分析GLUT4水平。栏1：在缺少任何添加的条件下，Glut 4的表达。栏2：Wnt3a阻断Glut4在3T3-L1成纤维细胞中的表达。栏3：添加DKK1和Wnt3a阻断了Wnt3a的效应，导致Glut4表达。栏4：在DKK1和Wnt3a的组合中添加IgG不影响Glut4表达。栏5：在细胞中添加DKK1和IgG导致Glut4水平超过对照。栏6和7：添加1ug/ml和2.5ug/ml BHQ880导致剂量依赖性的阻断响应Wnt3a+DKK-1的Glut4表达(与3、6和7道比较)，Glut4的条带强度逐渐减少。对于所有的栏，肌动蛋白的表达都表现出极小的变化，暗示蛋白质上样在栏(道)之间是相对一致的。
表20：概述公开的序列
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等价体
根据本发明的特定实施方案的上述详细描述，已描述了新的抗体及其免疫学片段是显而易见的。虽然本文详细的公开了特定的实施方案，但这仅出于示例的目的。特别的是，本发明人认为，可以在不脱离本发明的精神和范围的条件下，进行各种取代、改变和修饰。
Figure IDA0000106020020000011
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Claims (15)

1.治疗与DKK1和/或DKK4的存在相关的病症或病况的方法，包括向需要其的对象施用有效量的药物组合物，所述药物组合物用作药物，所述组合物包括特异性结合DKK1多肽(SEQ ID NO：1)和/或DKK4多肽(SEQ ID NO：131)中的表位的抗原结合区，其中，抗体或其功能片段结合DKK1或DKK4或两者中的至少一个表位，且所述药物是用于治疗与DKK1和/或DKK4的存在相关的病症或病况。
2.治疗与DKK1和/或DKK4的存在相关的病症或病况的方法，其中所述病症或病况选自：
i.恶性纤维状组织细胞增多症(MFH)；
ii.β地中海贫血；
iii.神经母细胞瘤；
iv.炎性肠病和肠易激惹综合征；
v.2型糖尿病；
vi.糖皮质激素或其他药物相关性糖尿病；
vii.非胰岛素依赖性糖尿病；
viii.低胰岛素血症；
ix.与色素沉着相关的病症；
x.心血管病症；
xi.胆固醇相关性病症；
xii.MGUS；
xiii.平台型骨髓瘤；和
xiv.郁积型骨髓瘤，
所述方法方法包括向需要其的对象施用药学有效量的DKK1/4抗体，所述抗体包含选自表5、6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区。
3.权利要求2的方法，其中所述方法还包括施用第二治疗剂。
4.权利要求3的方法，其中所述第二治疗剂选自抗癌剂；抗骨质疏松剂；抗生素；抗代谢剂；抗糖尿病剂；抗炎剂；抗血管发生剂；生长因子；骨合成代谢剂，体重减轻疗法，降血脂剂，和减肥药，抗高血压剂，和/或过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂，和细胞因子。
5.权利要求3的方法，其中所述第二治疗剂是除中和性抗DKK1/4组合物或其衍生物以外的药用活性剂，所述活性剂选自：
i.芳化酶抑制剂；
ii.抗雌激素物质、抗雄激素物质或促性腺激素释放因子激动剂；
iii.拓扑异构酶I抑制剂或拓扑异构酶II抑制剂；
iv.微管活性剂、烷化剂、抗肿瘤的抗代谢物或铂化合物；
v.靶向/降低蛋白质或脂质激酶活性、或者蛋白质或脂质磷酸酶活性的化合物，或进一步的抗血管发生的化合物或诱导细胞分化过程的化合物；
vi.单克隆抗体；
vii.环加氧酶抑制剂、双磷酸盐、类肝素酶抑制剂、生物反应调节剂；
viii.Ras致癌同种型抑制剂；
ix.端粒末端转移酶抑制剂；
x.蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、甲硫氨酸氨肽酶抑制剂或蛋白酶体抑制剂；
xi.用于治疗血液性恶性肿瘤的活性剂或者靶向、降低或抑制Flt-3活性的化合物；
xii.HSP90抑制剂；
xiii.抗增殖性抗体；
xiv.组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂；
xv.靶向、降低或抑制丝氨酸/苏氨酸mTOR激酶活性/功能的化合物；
xvi.促生长素抑制素受体拮抗剂；
xvii.抗白血病的化合物；
xviii.肿瘤细胞损伤方式；
xix.EDG结合剂；
xx.核糖核苷酸还原酶抑制剂；
xxi.S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶抑制剂；
xxii.VEGF或VEGFR的单克隆抗体；
xxiii.光动力学治疗；
xxiv.血管稳定类固醇；
xxv.包含皮质类固醇的植入物；
xxvi.AT1受体拮抗剂；
xxvii.ACE抑制剂；
xxviii.抗糖尿病剂；
xxix.降血脂剂；
xxx.减肥药；
xxxi.抗高血压剂；和
xxxii.过氧化物酶体增殖子-激活子受体(PPAR)的激动剂；
和任选的可药用的载体。
6.治疗恶性纤维状组织细胞增多症(MFH)的方法，包括向需要其的对象施用药学有效量的DKK1/4抗体，所述抗体包含选自表5、6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区。
7.权利要求2的方法，其中所述骨病症选自：骨折愈合、骨溶解性病损和转移、骨质减少、骨质疏松、骨密度异常、骨肉瘤和骨质溶解。
8.权利要求2的方法，其中所述癌症选自：骨髓瘤、多发性骨髓瘤、MGUS、郁积型或平台型骨髓瘤；下述的癌症或其转移：骨、乳房、结肠、黑色素细胞、肝细胞、肝细胞癌(HCC)、上皮、食道、脑、肺、前列腺或胰腺。
9.权利要求2的方法，其中所述肌肉疾病选自：肌肉创伤、萎缩、消耗、变性、修复、再生。
10.权利要求2的方法，其中所述代谢疾病选自：抗胰岛素性、非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、低胰岛素血症、糖尿病(尤其是2型糖尿病，或糖皮质激素或其它药物相关性糖尿病)、肥胖、体重减轻、持续体重减轻、神经性厌食、贪食症、恶病质、X综合征、代谢综合征、餐后高血糖症、餐后高脂血症和/或高甘油三酯血症、低血糖症、高血糖症、高尿酸血症、高胰岛素血症、高胆固醇血症、高脂血症、血脂异常、混合型血脂异常、高甘油三酯血症、胰腺炎和非酒精性脂肪肝病。
11.权利要求2的方法，其中所述心血管疾病选自：冠状动脉病、血管钙化、跛行、动脉粥样硬化、动脉硬化、急性心力衰竭、充血性心力衰竭、冠状动脉病、心肌病、心肌梗塞、心绞痛、高血压、低血压、中风、局部缺血、缺血再灌注损伤、动脉瘤、再狭窄和血管狭窄。
12.权利要求2的方法，其中所述胆固醇相关性病症选自：升高的胆固醇、与升高的胆固醇相关的病况、脂类病症、高脂血症、I型、II型、III型、IV型和V型高脂血症、继发性高甘油三酯血症、高胆固醇血症、黄瘤病和胆固醇乙酰转移酶缺陷。
13.治疗MHF的方法，包括向需要其的对象施用药学有效量的DKK1/4抗体，所述抗体包含选自表5、6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区。
14.权利要求2-13的任一项的方法，其中所述选自表5、6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区是：选自SEQ ID NO：49-52的VH CDR1，SEQID NO：53-63的VH CDR2，SEQ ID NO：64-69的VH CDR3，和SEQ ID NO：70-74的VL CDR1，SEQ ID NO：75-79的VL CDR2，SEQ ID NO：80-98的VLCDR3。
15.权利要求2-13的任一项的方法，其中所述选自表5、6、7和8的CDR1、CDR2和CDR3区包括选自以下的共有序列，对于VH CDR1 SEQID NO：40-43的共有序列，对于VH CDR2 SEQ ID NO：44-47的共有序列，对于VH CDR3 SEQ ID NO：48的共有序列，以及对于VL CDR1 SEQ IDNO：113和116的共有序列，对于VL CDR2 SEQ ID NO：114和117的共有序列，对于VL CDR3 SEQ ID NO：115和118的共有序列。
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