CN109825590A - 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物 - Google Patents
肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109825590A CN109825590A CN201910256744.2A CN201910256744A CN109825590A CN 109825590 A CN109825590 A CN 109825590A CN 201910256744 A CN201910256744 A CN 201910256744A CN 109825590 A CN109825590 A CN 109825590A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- seq
- detection
- single base
- mutation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物，该方法包含：步骤1，设计扩增引物，对目的片段进行PCR扩增，获得含有单碱基突变检测位点的第一PCR产物及含有MSI检测位点的第二PCR产物；步骤2，对PCR产物进行纯化；步骤3，设计用于单碱基延伸反应的第一引物和第二引物；第一引物针对单碱基突变位点进行设计；第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端的碱基互补，并且对第二引物的3’端进行修饰，以阻止第二引物的延伸；步骤4，对第一引物及所述第二PCR产物进行单碱基延伸；步骤5，对单碱基延伸反应产物进行纯化；步骤6，对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤驱动基因变异检测技术领域，具体涉及一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物。
背景技术
肿瘤是一种高发病率和高死亡率的疾病，严重危害公众健康。随着对肿瘤发病机制的研究，更多的研究焦点集中在肿瘤驱动基因BRAF、KRAS、NRAS、PIK3CA及微卫星不稳定(microsatellite instablility,MSI)。
RAS基因变异主要为点突变，突变位置以第2、3、4外显子多见，这些密码子编码的氨基酸是Ras蛋白和GTP酶活化蛋白(GAP)的作用位点，突变将会导致Ras-GTP处于持续激活状态，从而引起细胞恶性增殖和转移。其中NRAS突变多发生在第2、3外显子，KRAS突变多发生在第2、3、4外显子。KRAS基因突变与NSCLC对厄洛替尼、吉非替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关，KRAS基因突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。因此检测KRAS基因的突变可作为EGFR靶向治疗耐药性产生的重要预测指标。
BRAF：V600E突变能模拟T598和S601两个位点的磷酸化过程，从而持续激活BRAF蛋白，BRAF蛋白激活后导致MEK/ERK的激活，其通过转录物或非转录物的方式影响肿瘤进展。目前己经发现，在多种人类恶性肿瘤中均存在BRAF基因的突变，如甲状腺乳头状癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌、卵巢癌、肺癌、肝癌、膜腺癌等。因此，及时检测BRAF基因突变情况，对早期筛查肿瘤病人以及对肿瘤病人的个体化治疗、预后将具有重要的指导意义。
PIK3CA的突变约4/5发生在螺旋区(exon9)和激酶区(exon20)这两个热点区域。其突变不仅可以减少细胞的凋亡还可以促进肿瘤的浸润、提高其下游激酶PI3Ks的活性。关于PIK3CA突变这两个热点区的研究发现，激酶区和螺旋区的突变可能通过不同的机制引起酶功能性的改变。不同区域的突变，分别通过与PI3Ks的调节亚单位p85和RAS—GTP相互作用的不同机制导致PI3Ks活化。
临床研究表明，KRAS/NRAS/BRAF/PIK3CA基因突变的转移性结直肠患者对西妥昔、帕尼单抗等EGFR靶向治疗药物产生耐药，根据检测结果决定是否使用EGFR靶向药物作为临床治疗措施。目前针对这四个基因突变的检测方法主要是以ARMS-PCR为主“Molecularspectrum of KRAS,NRAS,BRAF and PIK3CA mutations in Chinese colorectal cancerpatients:analysis of 1,110cases Scientific Reports volume 5,Article number:18678(2015)”。突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system,ARMS)是肿瘤个性化分子检测的重要技术。
肿瘤驱动基因发生单碱基突变时，可采用SNapShot技术对其单碱基突变位点进行检测。SNapShot法是一种新兴的SNP检测技术，该技术由美国应用生物公司(ABI)开发，是基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，其原理是先根据基因序列，设计特异性的扩增引物及延伸引物，在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧邻多态位点5’端的不同长度的延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经过测序仪检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)，即单核苷酸多态性，是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传的变异中最常见的一种，并作为第三代遗传标志。人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关，因此被广泛用于群体遗传学研究和疾病相关基因研究。
微卫星是广泛分布于人类基因组中单个、两个、三个甚至更多个串联重复的核苷酸序列。微卫星不稳定性(MSI)的产生是由于DNA错配修复系统(mismatch repair,MMR)缺陷导致的微卫星序列丢失或增加，出现新的微卫星等位基因，它与MMR基因的异常相关。临床研究表明：微卫星高不稳定性(MSI-H)的Ⅱ期结直肠癌患者预后较好，但不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗中获益；MSI检测有助于辅助诊断遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditarynon-polyposiscolorectal cancer,HNPCC)，或称为林奇综合征。微卫星位点的重复单位的数目不同，从而使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。大量研究表明，MSI与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等发生密切相关。建立MSI检测体系以寻找高度灵敏性及特异性的MSI相关位点已成为近年来研究MSI检测领域的热点。
现有技术有的主要偏重单核苷酸重复位点，如微卫星不稳定性多重检测体系及试剂盒(CN201410377852.2)和一种人类微卫星不稳定性MSI检测扩增引物组合物及试剂盒(CN201710059634.8)，也有基于二代测序平台的结肠癌微卫星不稳定性检测试剂盒(CN201510800155.8)，这些技术仅能检测MSI位点。而现有ARMS-PCR基因检测技术也只能检测单碱基突变等基因突变。
现有基因检测产品仅针对基因突变或MSI，检测项目单一，而对于肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性同时检测只能通过NGS检测方法得以实现，检测周期长，成本较高。因此，开发一种基因单碱基突变和MSI共同检测技术，将有助于弥补现有技术的不足，完善肿瘤基因检测水平，提供更加精准、多元化的基因检测服务。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物，能够对肿瘤驱动基因单碱基突变和微卫星不稳定性进行联合检测。
为了达到上述目的，本发明提供了一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法，其包含以下步骤：
步骤1，设计扩增引物，利用该扩增引物对目的片段进行PCR扩增，获得含有单碱基突变检测位点的第一PCR产物及含有MSI检测位点的第二PCR产物；
步骤2，对步骤1获得的第一PCR产物及第二PCR产物进行纯化；
步骤3，设计用于单碱基延伸反应的第一引物和第二引物；第一引物针对单碱基突变检测位点进行设计，第一引物的3’端靠近相应的单碱基突变检测位点；第二引物用于使第二PCR产物延伸一个碱基，而第二引物本身不延伸，其中，第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端的碱基互补，并且对第二引物的3’端进行修饰，以阻止第二引物的延伸；
步骤4，进行单碱基延伸反应，获得单碱基延伸反应产物，其包含：
步骤4.1，将纯化后的第一PCR产物和所述第一引物加入反应体系中，该反应体系中含有不同荧光标记的ddNTP，使得所述第一引物的3’端延长一个与单碱基突变检测位点匹配并带荧光的碱基；
步骤4.2，将纯化后的第二PCR产物和所述第二引物加入反应体系中，该反应体系中含有不同荧光标记的ddNTP，使得所述第二PCR产物的3’端延长一个带荧光的碱基；
步骤5，对所述单碱基延伸反应产物进行纯化；
步骤6，对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测。
较佳地，上述步骤3中，所述第二引物的3’端以C3-Spacer(间臂)修饰。C3-Spacer修饰基团用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用，从而阻止引物延伸。
较佳地，步骤6中，采用毛细管电泳荧光分析技术对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测，即可以在同一个检测孔中同时判读出单碱基突变与MSI状态的结果。
较佳地，各条第一引物之间，以及第一引物与所述第二PCR产物之间的序列长度互不相同，使最终的结果图谱上的峰图可以间隔合理地排列，以利于联合检测结果的判断。
上述肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法也能够在单核苷酸多态性(SNP)联合微卫星不稳定同步检测中进行应用。
本发明还提供了一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒，该试剂盒采用上述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法对肿瘤驱动基因的变异进行联合检测；所述的试剂盒包含以下10组引物：
(1)针对KRAS基因的扩增引物SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2和第一引物SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5；
(2)针对BRAF基因的扩增引物SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：7和第一引物SEQ ID NO：8或第一引物SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9针对同一位点，使用时只加入其中一条；
(3)针对NRAS基因的扩增引物SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：13和第一引物SEQ IDNO：14至SEQ ID NO：16；
(4)针对PIK3CA基因的扩增引物SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20和第一引物SEQ IDNO：21至SEQ ID NO：23；
(5)针对MSI检测位点BAT-25的扩增引物SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：25和第二引物SEQ ID NO：26；
(6)针对MSI检测位点D5S346的扩增引物SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：28和第二引物SEQ ID NO：29；
(7)针对MSI检测位点D17S250的扩增引物SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：31和第二引物SEQ ID NO：32；
(8)针对MSI检测位点BAT-26的扩增引物SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：34和第二引物SEQ ID NO：35；
(9)针对MSI检测位点D2S123的扩增引物SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：37和第二引物SEQ ID NO：38；
(10)针对MSI内参位点PentaC的扩增引物SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：40和第二引物SEQ ID NO：41；
其中，所述第二引物的3’端以C3-Spacer修饰。
引物序列具体如表1所示。
表1.引物序列
上述引物的检测位点如表2和表3所示。
表2.肿瘤驱动基因单碱基突变检测位点
KRAS基因中，SEQ ID NO：3针对c.35G>A、c.35G>C及c.35G>T检测位点；SEQ ID NO：4针对c.38G>A检测位点；SEQ ID NO：5针对c.34G>A、c.34G>C及c.34G>T检测位点。各检测位点使用同一组扩增引物。
NRAS基因中，使用SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11以及SEQ ID NO：15针对c.35G>C、c.35G>A、c.35G>T检测位点进行扩增和单碱基延伸，使用SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：14针对c.181C>A检测位点进行扩增和单碱基延伸；使用SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13以及SEQ ID NO：16针对c.182A>G检测位点进行扩增和单碱基延伸。
PIK3CA基因中，使用SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18以及SEQ ID NO：21针对c.3140A>T、c.3140A>G检测位点进行扩增和单碱基延伸；使用SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20以及SEQID NO：22针对c.1624G>A检测位点进行扩增和单碱基延伸；使用SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20以及SEQ ID NO：23针对c.1633G>A、c.1633G>C检测位点进行扩增和单碱基延伸。
表3.MSI检测位点
| MSI位点名称 | 重复序列信息 |
| BAT-25 | agttttgtgttttgtttttttgatttttttttttttttttttttttttga |
| BAT-26 | ggtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggttaaaaatg |
| D2S123 | gatacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacacatattt |
| D5S346 | ttactctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtaaat |
| D17S250 | catttgaaagtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtttg |
| Penta C | agttttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgttttgtttttctg |
上述肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒的使用方法中，采用扩增引物对目的片段进行PCR扩增的体系为：
采用扩增引物对目的片段进行PCR扩增的反应程序为：50℃，2分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃10秒，55-60℃10-20秒，72℃40-70秒，35-45个循环；
采用第一引物或第二引物进行单碱基延伸反应的程序为：50℃，2分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃10秒，56-62℃10-20秒，72℃10-20秒，20-30个循环。
较佳地，本发明的肿瘤驱动基因单碱基突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒还包含：Mg2+、dNTPs、Taq酶、UNG酶、用于PCR纯化的ExoSAP-IT及用于去除ddNTPs的SAP。
本发明还另外提供了用于肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的引物，引物为表1所示的10组引物中的任意一组或两组以上。可采用表1所示的引物并结合针对其他基因或位点设计的引物对肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性进行联合检测。
有益效果：
(1)本发明的方法创新性地把SnapShot技术用于肿瘤的体细胞突变检测，能够同时检测MSI，检测灵敏度高。
(2)本发明实现了肿瘤驱动基因单碱基突变和微卫星不稳定性的联合检测，并且两种检测类型的位点能够利用同一种检测试剂以及同一种反应体系和反应条件，大大提高了实验的方便性。
(3)用于单碱基延伸反应的第一引物和第二引物混合使用时，同一样本可以在同一反应体系中同时检测肿瘤驱动基因单碱基突变和微卫星不稳定性，提高了样本的利用率。
附图说明
图1为本发明的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测方法的原理示意图。
图2为实施例1的检测结果。
图3为实施例2的检测结果。
图4为实施例3的检测结果。
图5为实施例4的检测结果。
图6为实施例5的检测结果。
图7为灵敏度分析实验中实施例6的检测结果。
图8为灵敏度分析实验中实施例7的检测结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，以下涉及的科学术语与本领域普通技术人员所理解的具有相同的含义。
如图1所示，为本发明的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测方法的原理示意图。本发明的方法充分利用了单碱基延伸技术，并结合PCR技术及毛细管电泳荧光分析技术，设计出一种肿瘤基因点突变(单碱基突变)和微卫星不稳定性(MSI)联合检测的方法。
本发明的方法步骤如下：
步骤1，设计扩增引物，对含有单碱基突变检测位点(即点突变检测位点)的目的片段及含有MSI检测位点的目的片段进行PCR扩增，获得含有所述单碱基突变检测位点的第一PCR产物及含有所述MSI检测位点的第二PCR产物。
步骤2，对步骤1获得的第一PCR产物及第二PCR产物进行纯化，以去除剩余的扩增引物和dNTPs，并获得纯化后的第一PCR产物及第二PCR产物；去除剩余的扩增引物和dNTPs可避免对后续反应产生影响。
步骤3，设计用于单碱基延伸反应的若干条第一引物和若干条第二引物；第一引物以所述第一PCR产物为模板，针对单碱基突变检测位点进行设计，并且各条第一引物的3’端分别靠近相应的单碱基突变检测位点；第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端的碱基互补，并且对第二引物的3’端以C3-Spacer(间臂)修饰，以阻止第二引物的延伸；其中，任意第一引物之间及第一引物与所述第二PCR产物之间的序列长度不相同。
步骤4，对第一引物及所述第二PCR产物进行单碱基延伸反应，获得单碱基延伸反应产物；延伸反应的体系中含有四种不同荧光标记的ddNTP；所述第一引物延伸后，其3’端延长一个与单碱基突变检测位点互补的碱基，该碱基带有荧光；所述第二PCR产物延伸后，其3’端延长一个碱基，使得所述第二PCR产物在联合检测时带有荧光。
步骤5，单碱基延伸反应后，对所述单碱基延伸反应产物进行纯化，以除去多余的含有荧光标记的ddNTPs。
步骤6，利用荧光检测系统，对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测，肿瘤驱动基因的单碱基突变位点根据目的峰图所在位置的峰图颜色判断是否发生突变；MSI位点根据目的峰图是否发生位移来判断是否发生微卫星不稳定性变化。
关于单碱基延伸的方法，美国应用生物公司(ABI)开发的SNapShot法是一种简单有效的技术。通过在一个含有测序酶、四种荧光标记ddNTP、紧邻多态位点5’端的不同长度的延伸引物和PCR产物模板的反应体系中，引物延伸一个碱基即终止，经过测序仪(毛细管电泳)检测后，根据峰的移动位置确定该延伸产物对应的SNP位点，根据峰的颜色可得知掺入的碱基种类，从而确定该样本的基因型。MSI则可通过毛细管电泳，根据目的峰图是否发生位移来判断是否发生微卫星不稳定性变化。本发明设计的第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端互补，并在第二引物的3’端以C3-Spacer修饰，以阻止第二引物的延伸，第二PCR产物相当于延伸引物，第二引物相当于模版，延伸反应过程中只将第二PCR产物延伸一个碱基。因单碱基延伸反应体系中含有四种不同荧光标记的ddNTP，第二PCR产物延伸一个碱基后，会带有荧光。
通过上述方法，本发明将单碱基延伸技术用于检测肿瘤组织驱动基因的单碱基突变，并实现了肿瘤驱动基因点突变和微卫星不稳定性的联合检测，并且两种检测能够利用同一种检测试剂，甚至同一种反应体系和反应条件，大大提高了实验的方便性。
本发明提供的一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒，基于单碱基延伸技术和毛细管电泳技术平台，能够高特异性地联合检测KRAS基因突变、BRAF基因突变、NRAS基因突变、PIK3CA基因突变、微卫星不稳定性(MSI)。试剂盒能够以组织DNA为检测样本，通过检测人类基因组DNA变异类型，可以在治疗过程中连续、动态监测患者的遗传信息变化情况，用于指导患者的治疗。试剂盒具体成分如表4所示。针对各基因单碱基突变检测位点或MSI检测位点的引物具体如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：41所示。
试剂盒中，为实现方便，PCR反应所需试剂及引物预先混合为溶液。KRAS基因及PIK3CA基因的扩增引物混合于同一管中，BRAF基因及NRAS基因的扩增引物混合于同一管中。针对MSI位点(BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、D17S250及Penta C)的扩增引物混合于同一管中。针对KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因的第一引物及针对6个MSI位点的第二引物全部混合于同一管中。引物也可以单独分开使用，根据具体检测位点添加到不同的反应管中。
试剂盒提供的SNaPshot多重混合液包含 DNA聚合酶和四种不同荧光标记的ddNTP。ExoSAP-IT试剂含有外切酶和虾碱性磷酸酶(Shrimp AlkalinePhosphatase,SAP)，用于从PCR产物中去除剩余的dNTPs和引物。
表4.试剂盒组成
以下实施例采用本发明提供的检测方法及引物，选用临床组织样本进行检测，样本已通过一代测序/NGS/qPCR等方法鉴定是突变阳性还是野生型组织样本，步骤如下：
(1)阳性和野生型组织样本DNA的提取：采用上海桐树生物科技有限公司的核酸提取试剂盒FD-50(50次/盒)，商品号：150091，进行DNA提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。提取的核酸稀释到5ng/μL。
(2)构建PCR富集体系，将提取并稀释后的阳性临床样本和野生型临床样本分别取2μl进行PCR富集。PCR富集体系及程序如表5.1和表5.2所示所示：
表5.1 PCR富集体系
| 缓冲液 | 1x |
| Mg<sup>2+</sup> | 200-500μM |
| dNTPs | 10-30μM |
| Taq酶 | 1-3U |
| UNG酶 | 0.1-0.5U |
| 各条扩增引物 | 0.2-1.0μM |
| 样本DNA | 2μl |
| 补纯化水至 | 25μl |
表5.2 PCR富集程序
(3)PCR富集完毕，待冷却至室温，然后将其震荡混匀并快速离心。取5μl PCR富集产物进行PCR产物纯化。PCR纯化体系及程序如表6.1和表6.2所示：
表6.1 PCR纯化体系
| ExoSAP-IT | 2μl |
| PCR富集产物 | 5μl |
表6.2 PCR纯化程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 15分钟 | 1 |
| 80℃ | 15分钟 | 1 |
(4)PCR纯化完毕，待冷却至室温，然后将其震荡混匀并快速离心。取3μl PCR纯化产物进行单碱基延伸。单碱基延伸体系及程序如表7.1和表7.2所示：
表7.1单碱基延伸体系
| SNAPSHOT MULTIPLEX | 5μl |
| 各条第一引物或第二引物 | 0.05-1.0μM |
| PCR纯化产物 | 3μl |
| 补纯化水至 | 10μl |
表7.2单碱基延伸程序
(5)单碱基延伸完毕，待冷却至室温，然后将其震荡混匀并快速离心。将10μl单碱基延伸产物全部用于去除ddNTPs处理步骤，去除ddNTPs的体系及程序如表8.1和表8.2所示：
表8.1去除ddNTPs的体系
表8.2去除ddNTPs的程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 37℃ | 60分钟 | 1 |
| 65℃ | 15分钟 | 1 |
(6)毛细管电泳仪上机前处理：将HiDi和LIZ600按照35:1进行混合，震荡混匀并快速离心，备用。取1μl上一步经过去除ddNTPs处理的产物，按照上机前处理体系及程序进行处理，上机前处理体系及程序如表9.1和表9.2所示：
表9.1上机前处理体系
| 名称 | 终浓度 |
| HiDi：LIZ600(35:1) | 9ul |
| 去除了ddNTPs的纯化产物 | 1ul |
表9.2上机前处理程序
| 温度 | 时间 | 循环数 |
| 95℃ | 5分钟 | 1 |
| 1℃ | 5-20分钟 | 1 |
(7)将上一步处理完成的样品加入仪器配套的96孔板，放入毛细管电泳仪，进行上机。
结果判读：通过Genemapper软件进行数据处理，根据毛细管电泳仪显示的荧光峰图判断检测结果；利用针对单碱基突变位点的第一引物的大小不同将不同位点分散在不同区域，根据A、T、C、G四种碱基的荧光峰图颜色不同来判断同一位点是否发生碱基突变以及突变碱基类型，此外，根据五指峰/三角峰是否发生位移来判断微卫星不稳定性。
实施例1
图2为实施例1的检测结果。样本名称为17-1894，已知该样本为KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因野生型(WT)。对其同时检测KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因的单碱基突变位点，具体检测位点如图2所示。采用本发明提供的检测方法及引物，各检测位点的检测结果也均为野生型。
实施例2
图3为H23细胞株样本的检测结果，H23细胞株样本已知为KRAS(c.34G>T)突变类型，对其同时检测KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因的单碱基突变位点，具体检测位点请参阅图2。采用本发明提供的检测方法及引物，检测结果也是KRAS c.34G>T突变。
实施例3
图4为16-2823样本的检测结果。16-2823样本已知为BRAF(c.1799T>A)突变类型，对其同时检测KRAS、BRAF、NRAS、PIK3CA基因位点，具体检测位点请参阅图2。采用本发明提供的检测方法及引物，检测结果也是BRAF c.1799T>A突变。
实施例4
图5为17-1468样本的检测结果。已知该样本为基因野生型(WT)。对该样本MSI的D17S250位点进行检测。采用本发明提供的检测方法及引物，检测结果也是野生型。
实施例5
图6也是17-1468样本的检测结果。已知该样本D5S346位点为阳性。采用本发明提供的检测方法及引物，对其同时检测KRAS、NRAS基因的单碱基突变位点，以及BAT-25、BAT-26、D2S123、D5S346、Penta C位点。检测结果表明KRAS、NRAS基因的单碱基突变位点为野生型，MSI(D5S346位点)阳性。图中还检测了其他单碱基突变位点，具体信息说明书中未给出。
检测结果表明，本发明的检测方法可以对肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性进行联合检测。
灵敏度分析：
实施例6
取同一份野生型组织样本(样本名称为17-1468)对突变阳性样本(样本名称为16-2823)进行不同梯度的稀释，每次取2μL稀释样本进行PCR富集及后续检测。图7的检测结果表明，16-2823样本(已知BRAF c.1799T>A突变频率为29％)，用野生型样本将其稀释10倍(突变频率为2.9％)，仍然能检测出BRAF突变。
实施例7
17-1410样本(已知KRAS c.35G>A突变频率为54％)，用野生型样本(样本名称为17-1468)进行梯度稀释，最终稀释至2.7％突变频率仍能检测出KRAS突变。图8的检测结果表明，本方法的检测灵敏度可达到2.7％。
综上所述，本发明的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的新技术，充分利用了单碱基延伸技术和传统MSI检测方法，打破了传统的单碱基延伸技术只能检测基因突变的思路，将其应用于检测微卫星不稳定性(MSI)检测，从而达到一个样本可以同时检测基因突变和微卫星不稳定性的目的，方法新颖，检测结果清晰，可以明确体现碱基突变类型，检测结果准确可靠，操作流程简单快速，检测成本较低，是一种理想的基因单碱基突变和MSI联合检测技术，并且检测灵敏度高。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 常州桐树生物科技有限公司
<120> 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aggcctgctg aaaatgactg aatatt 26
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctgaattag ctgtatcgtc aagg 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaggcactc ttgcctacgc ta 22
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atagaaacgt caaggcactc ttgcctagg 29
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatatgactg aatataaact tgtggtagtt ggacct 36
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cttcaagaag acctcacagc aaaaatagg 29
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acaaaatgga tcgagacaac tgttc 25
<210> 8
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaac agtaaaaata cgtgattttg gtctagcttc 60
ag 62
<210> 9
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaata tgtgactcca tagaaaatct atctcctcct 60
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggtgtgaaa tggctgagta caatctg 27
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caaagtggtg ctggattagc tggtt 25
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggttattgat ggtgaaacct gtatgtag 28
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctccgcctg tcctcatgta atg 23
<210> 14
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaataaataa actgttgcac atacaggata 60
cagctcga 68
<210> 15
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaacaataac aataactggt 60
gatcgttgga gctg 74
<210> 16
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacaa taatggtctc 60
tcgtggcact gtactgtact 80
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtaaaattta ttgataatgt agttgctttc tc 32
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atctccattt cagcacatac ctgtgac 27
<210> 19
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ttagataaag ctgagcaaga ggcttcg 27
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggaatccaga gagagctttc atatt 25
<210> 21
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gactgactga ctgactaatt ccatgaaaca gatgaatgat cctc 44
<210> 22
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gactgactga ctgactgact gactagcaaa ttctacacgt gatccgctct ct 52
<210> 23
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gactgactga ctgactgact gactgactga cttgactcca tagaaattct tactcctggt 60
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
caccgctttc ctcgcctcca a 21
<210> 25
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tctaactatg gctctaaatt gctctgat 28
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tttctaacta tggctctaaa ttgctctgat 30
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcagggaatt gagagttaca ggtaact 27
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
atgaatacca ggatagcttt ataatgcag 29
<210> 29
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aaatgaatac caggatagct ttataaagca g 31
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggattacagg catgagccac tca 23
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcgaagaatc aaatagacaa taatattatg t 31
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
ggggattaca ggcatgagcc actca 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cagagccctt aacctttatc agc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
cagcttcttc agtatatgtc aat 23
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
cccagcttct tcagtatatg tcaat 25
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tctggccaga gaaattagac acagtgata 29
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tagccttagg agctcttatg aattg 25
<210> 38
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aatctggcca gagaaattag acacagtgat a 31
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgaacacact ttgcacctgt ca 22
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atctgacccg gaaccagca 19
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tttgaacaca cattgcacct gtca 24
Claims (9)
1.一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤1，设计扩增引物，利用该扩增引物对目的片段进行PCR扩增，获得含有单碱基突变检测位点的第一PCR产物及含有MSI检测位点的第二PCR产物；
步骤2，对步骤1获得的第一PCR产物及第二PCR产物进行纯化；
步骤3，设计用于单碱基延伸反应的第一引物和第二引物；第一引物针对所述单碱基突变检测位点进行设计，第一引物的3’端靠近相应的单碱基突变检测位点；第二引物用于使第二PCR产物延伸一个碱基，而第二引物本身不延伸，其中，第二引物3’端的若干个连续碱基与所述第二PCR产物3’端的碱基互补，并且对第二引物的3’端进行修饰，以阻止第二引物的延伸；
步骤4，进行单碱基延伸反应，获得单碱基延伸反应产物，其包含：
步骤4.1，将纯化后的第一PCR产物和所述第一引物加入反应体系中，该反应体系中含有不同荧光标记的ddNTP，使得所述第一引物的3’端延长一个与单碱基突变检测位点匹配并带荧光的碱基；
步骤4.2，将纯化后的第二PCR产物和所述第二引物加入反应体系中，该反应体系中含有不同荧光标记的ddNTP，使得所述第二PCR产物的3’端延长一个带荧光的碱基；
步骤5，对所述单碱基延伸反应产物进行纯化；
步骤6，对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测。
2.根据权利要求1所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法，其特征在于，步骤3中，所述第二引物的3’端以C3-Spacer修饰。
3.根据权利要求1所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法，其特征在于，步骤6中，采用毛细管电泳荧光分析技术对纯化后的单碱基延伸反应产物进行联合检测。
4.根据权利要求1所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法，其特征在于，所述第一引物之间，以及第一引物与所述第二PCR产物之间的序列长度互不相同。
5.一种肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒采用权利要求1-4任一项所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法进行联合检测；所述的试剂盒包含以下10组引物：
(1)针对KRAS基因的扩增引物SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：2和第一引物SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：5；
(2)针对BRAF基因的扩增引物SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：7和第一引物SEQ ID NO：8或第一引物SEQ ID NO：9；
(3)针对NRAS基因的扩增引物SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：13和第一引物SEQ ID NO：14至SEQ ID NO：16；
(4)针对PIK3CA基因的扩增引物SEQ ID NO：17至SEQ ID NO：20和第一引物SEQ ID NO：21至SEQ ID NO：23；
(5)针对MSI检测位点BAT-25的扩增引物SEQ ID NO：24至SEQ ID NO：25和第二引物SEQID NO：26；
(6)针对MSI检测位点D5S346的扩增引物SEQ ID NO：27至SEQ ID NO：28和第二引物SEQID NO：29；
(7)针对MSI检测位点D17S250的扩增引物SEQ ID NO：30至SEQ ID NO：31和第二引物SEQ ID NO：32；
(8)针对MSI检测位点BAT-26的扩增引物SEQ ID NO：33至SEQ ID NO：34和第二引物SEQID NO：35；
(9)针对MSI检测位点D2S123的扩增引物SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：37和第二引物SEQID NO：38；
(10)针对MSI内参位点PentaC的扩增引物SEQ ID NO：39至SEQ ID NO：40和第二引物SEQ ID NO：41。
6.根据权利要求5所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒，其特征在于，采用试剂盒中的扩增引物对目的片段进行PCR扩增的反应体系为：
采用试剂盒中的扩增引物对目的片段进行PCR扩增的反应程序为：50℃，2分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃10秒，55-60℃10-20秒，72℃40-70秒，35-45个循环。
7.根据权利要求5所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒，其特征在于，采用试剂盒中第一引物或第二引物进行单碱基延伸反应的程序为：50℃，2分钟，1个循环；95℃，2分钟，1个循环；95℃10秒，56-62℃10-20秒，72℃10-20秒，20-30个循环。
8.根据权利要求5所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包含：Mg2+、dNTPs、Taq酶、UNG酶、用于PCR纯化的ExoSAP-IT及用于去除ddNTPs的SAP。
9.用于肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的引物，其特征在于，所述引物选自权利要求5所述的肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测试剂盒所包含的10组引物中的任意一组或两组以上。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910256744.2A CN109825590B (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910256744.2A CN109825590B (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109825590A true CN109825590A (zh) | 2019-05-31 |
| CN109825590B CN109825590B (zh) | 2022-08-05 |
Family
ID=66874653
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910256744.2A Active CN109825590B (zh) | 2019-04-01 | 2019-04-01 | 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109825590B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110408701A (zh) * | 2019-07-27 | 2019-11-05 | 苏州丽纳芯生物科技有限公司 | 一种结肠癌K-ras癌基因突变检测系统 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013070660A (ja) * | 2011-09-27 | 2013-04-22 | National Center For Global Health & Medicine | Ｃ型肝炎患者の経過予測方法 |
| CN103305625A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-09-18 | 广东省人民医院 | 检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用 |
| CN107217103A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-09-29 | 常州桐树生物科技有限公司 | 检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒 |
-
2019
- 2019-04-01 CN CN201910256744.2A patent/CN109825590B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013070660A (ja) * | 2011-09-27 | 2013-04-22 | National Center For Global Health & Medicine | Ｃ型肝炎患者の経過予測方法 |
| CN103305625A (zh) * | 2013-07-08 | 2013-09-18 | 广东省人民医院 | 检测非小细胞肺癌驱动基因突变谱的方法及试剂盒与应用 |
| CN107217103A (zh) * | 2017-07-14 | 2017-09-29 | 常州桐树生物科技有限公司 | 检测微卫星不稳定性的多重荧光pcr扩增试剂及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PEDRO PINTO等: "Comparison of methodologies for KRAS mutation detection in metastatic colorectal cancer", 《CANCER GENETICS》 * |
| 李文琪等: "ＲAS /ＲAF 突变与MSI状态在结直肠癌治疗中的研究进展", 《实用肿瘤学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110408701A (zh) * | 2019-07-27 | 2019-11-05 | 苏州丽纳芯生物科技有限公司 | 一种结肠癌K-ras癌基因突变检测系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109825590B (zh) | 2022-08-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10787712B2 (en) | Consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers | |
| US20230119938A1 (en) | Methods of Preparing Dual-Indexed DNA Libraries for Bisulfite Conversion Sequencing | |
| US20090123928A1 (en) | Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers | |
| WO2013172933A1 (en) | Ethnic gene profile of genes involved in angiogenesis may predict regional bevacizumab efficacy difference in gastric cancer | |
| WO2010123625A1 (en) | Cd133 polymorphisms predict clinical outcome in patients with cancer | |
| CN110541033A (zh) | Egfr基因突变检测用组合物及检测方法 | |
| JP7337391B2 (ja) | 癌を性質決定する組成物および方法 | |
| CN109825590A (zh) | 肿瘤驱动基因突变和微卫星不稳定性联合检测的方法、试剂盒和引物 | |
| CN111349691A (zh) | Egfr基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法 | |
| CN111566229A (zh) | 乳腺癌分子分型及远处转移风险基因群及诊断产品和应用 | |
| CN111607646A (zh) | 一种用于检测braf基因突变的核苷酸序列组及其应用 | |
| CN110819713B (zh) | Snp标志物在胰腺癌预后中的应用 | |
| KR101795920B1 (ko) | 폐암 환자의 생존 예측용 ｓｌｃ５ａ１０ 다형성 마커 및 이를 이용한 폐암 생존 예후의 예측 방법 | |
| WO2024047250A1 (en) | Sensitive and specific determination of dna methylation profiles | |
| Domingo Sabugo | Establishing methods for analysis of DNA methylation in breast cancer and cell-free circulating DNA | |
| KR101860997B1 (ko) | 폐암 환자의 생존 예측용 ｅｇｆｒ 다형성 마커 및 이를 이용한 폐암 생존 예후의 예측 방법 | |
| Hesse et al. | Clinical Next-Generation Sequencing for Somatic Mutation Detection–Advances and Commercialization Strategies | |
| KR20220085748A (ko) | 유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 | |
| Nouspikel | Digging deep or spreading wide?—a comparison of polymerase chain reaction and sequencing approaches in the analysis of circulating tumor DNA | |
| WO2023097197A2 (en) | Compositions and methods for assessing the efficacy of polynucleotide delivery and cancer therapy | |
| CN115232873A (zh) | 用于泛癌种化疗用药指导的检测组合物、试剂盒及其应用 | |
| TW202328459A (zh) | 一種腫瘤檢測方法及應用 | |
| WO2011084757A1 (en) | Germline polymorphisms in the sparc gene associated with clinical outcome in gastric cancer | |
| CN111139295A (zh) | 一种与非综合征型多生牙诊断相关的snp标志物及其应用 | |
| RU2020128083A (ru) | Способы выявления и мониторинга рака путем персонализированного выявления циркулирующей опухолевой днк |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |