TW202328459A - 一種腫瘤檢測方法及應用 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種腫瘤檢測方法及應用，具體關於一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含評估待測樣本中標誌物基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。本發明還關於用於評估DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，及其製備方法。
Description
本發明關於生物醫學領域，具體的關於一種腫瘤檢測方法及應用。
尋找更高效的腫瘤標誌物一直是腫瘤相關研究中重要的一個方向，基於液體活檢的血漿游離DNA檢測技術對於腫瘤標誌物的發現有了更高的需求。其基本原理為：腫瘤細胞死亡後，釋放游離DNA進入血液，藉由檢測血液中的DNA突變、DNA甲基化、miRNA、組蛋白修飾等腫瘤細胞相關信息，可探測到極早期的腫瘤信號。已有研究發現DNA甲基化變化可能早於DNA突變的發生，是腫瘤早期篩查的更行之有效的檢測標誌物。
但目前早期癌症中，釋放入血的腫瘤細胞極少，並且本領域急需尋找到更多的對於胰臟腫瘤有效的檢測標誌物。因此，亟需開發一種方法和/或試劑盒，藉由檢測準確、穩定、有效的胰臟癌生物標誌物，且可以從生物樣品中數量極為有限的細胞外游離DNA高效地讀取到該表觀遺
傳學信息，更優的，該方法應可以在醫院檢驗科裡很容易地配置並可靠地應用。
本發明提供的方法可以將更多高效的甲基化標誌物，用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展，可以提高腫瘤，例如胰臟腫瘤的早篩早診效率，解決胰臟癌早診率低，臨床治療負擔重等問題。
一方面，本發明提供了一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中SIX3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。一方面，本發明提供了一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供了一種核酸，該核酸包含能夠結合SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
另一方面，本發明提供了一種製備核酸的方法，包含根據SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀
態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供了一種核酸組，該核酸組包含能夠結合SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
另一方面，本發明提供了一種製備核酸組的方法，包含根據SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。
另一方面，本發明提供了一種試劑盒，包含本發明所述的核酸和/或本發明所述的核酸組。
另一方面，本發明提供了本發明所述的核酸、本發明所述的核酸組和/或本發明所述的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。
另一方面，本發明提供了本發明所述的核酸、本發明所述的核酸組和/或本發明所述的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明提供了本發明所述的核酸、本發明所述的核酸組和/或本發明所述的試劑盒，在製備確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
另一方面，本發明提供了用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供了SIX3基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明提供了一種儲存介質，其記載可以運行本發明所述的方法的程序。
另一方面，本發明提供了一種設備，其包含本發明所述的儲存介質。
在一種實施方式中，本發明的設備還包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現本發明所述的方法。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本發明的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本發明的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本發明的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本發明所涉及發明的精神和範圍。相應地，本發明的說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
以下由特定的具體實施例說明本發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本發明的其他優點及效果。
術語定義
在本發明中，術語“SIX3”通常是指一種基因或其表達產物。例如，SIX3(Homeobox protein SIX3，Sine Oculis Homeobox Homolog 3)蛋白的UniProt登錄號可以是O95343。本發明中，SIX3可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“EMX1”通常是指一種基因或其表達產物。例如，EMX1(Homeobox protein EMX1，Empty Spiracles-Like Protein 1)蛋白的UniProt登錄號可以是Q04741。本發明中，EMX1可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“KIAA1715”通常是指一種基因或其表達產物。例如，KIAA1715(Lunapark,ER Junction Formation Factor，LNPK)蛋白的UniProt登錄號可以是Q9C0E8。本發明中，KIAA1715可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“AATF”通常是指一種基因或其表達產物。例如，AATF(Apoptosis Antagonizing Transcription Factor)蛋白的UniProt登錄號可以是Q9NY61。本發明中，AATF可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“NTRK3”通常是指一種基因或其表達產物。例如，NTRK3(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 3)蛋白的UniProt登錄號可以是Q16288。本發明中，NTRK3可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“ELMO1”通常是指一種基因或其表達產物。例如，ELMO1(Engulfment And Cell Motility 1)蛋白的UniProt登錄號可以是Q92556。本發明中，ELMO1可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“MRPL53”通常是指一種基因或其表達產物。例如，MRPL53(Mitochondrial Ribosomal Protein L53)蛋白的UniProt登錄號可以是Q96EL3。本發明中，MRPL53可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“PCCA”通常是指一種基因或其表達產物。
例如，PCCA(Propionyl-CoA Carboxylase Subunit Alpha)蛋白的UniProt登錄號可以是P05165。本發明中，PCCA可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“HDGFL3”通常是指一種基因或其表達產物。例如，HDGFL3(Hepatoma-Derived Growth Factor-Related Protein 3)蛋白的UniProt登錄號可以是Q9Y3E1。本發明中，HDGFL3可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“FER1L4”通常是指一種基因或其表達產物。例如，FER1L4(Fer-1 Like Family Member 4)蛋白的UniProt登錄
號可以是A9Z1Z3。本發明中，FER1L4可以涵蓋其未加工形式、任何的加工形式、其變體或包含其功能活性片段的物質。
在本發明中，術語“待測樣本”通常是指需要進行檢測的樣本。例如，可以檢測待測樣本上的一個或者多個基因區域是否存在有修飾狀態。
在本發明中，術語“無細胞游離核酸”或“cfDNA”通常是指樣品中的DNA，當採集時，該DNA沒有包含在細胞內。例如，無細胞游離核酸可以不是指藉由細胞或組織的體外破裂而使其不在細胞內的DNA。例如，cfDNA可以包括正常細胞和源自癌細胞的DNA兩者。例如，cfDNA可以獲自血液或血漿(“循環系統”)。例如，cfDNA可以藉由分泌或細胞死亡過程，如細胞壞死或凋亡釋放到循環系統中。
在本發明中，術語“互補核酸”通常是指與參考核苷酸序列相比具有互補的核苷酸序列。例如，互補核酸可以為視需要地具有相反方向的核酸分子。例如，該互補可以是指具有下面的互補性關聯：鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；腺嘌呤和尿嘧啶。
在本發明中，術語“DNA區域”通常是指兩個或更多個共價鍵合的天然存在的或經修飾的脫氧核糖核苷酸的序列。例如，基因的DNA區域可以是指該基因所位於的特定的脫氧核糖核苷酸的序列的位置，例如該脫氧核糖核苷酸的序列編碼該基因。例如，本發明的DNA區域包含DNA區域的全長、其互補區域，或者上述的片段。例如，本發明所提供的檢測區域的上下游至少約20kb的序列可以作為檢測的位點。例如，本發明所提供的檢測區域的上下游至少約20kb、至少約15kb、至少約10kb、至少約5kb、至少約3kb、至少約2kb、至少約1kb、或至少約0.5kb的序列可以
作為檢測的位點。例如，可以根據該微電腦設計合適的引子和探針進行樣品的甲基化檢測。
在本發明中，術語“修飾狀態”通常是指本發明中基因片段、核苷酸或其鹼基具有的修飾狀態。例如，本發明中的修飾狀態可以是指胞嘧啶的修飾狀態。例如，本發明的具有修飾狀態的基因片段可以具有改變的基因表達活性。例如，本發明的修飾狀態可以是指鹼基具有的甲基化修飾。例如，本發明的修飾狀態可以是指在基因組DNA的CpG區域的胞嘧啶5'碳位共價結合一個甲基基團，例如可以成為5-甲基胞嘧啶(5mC)。例如，修飾狀態可以是指DNA序列內存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)。
在本發明中，術語“甲基化”通常是指本發明中基因片段、核苷酸或其鹼基具有的甲基化狀態。例如，本發明中基因所在的DNA片段可以在一條鏈或多條鏈上具有甲基化。例如，本發明中基因所在的DNA片段可以在一個位點或多個位點上具有甲基化。
在本發明中，術語“轉化”通常是指將一種或多種結構轉變為另一種結構。例如，本發明的轉化可以是具有特異性。例如，不具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以變為其它結構(例如尿嘧啶)，且具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以基本不發生變化。例如，不具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以被剪切，且具有甲基化修飾的胞嘧啶經過轉化可以基本不發生變化。
在本發明中，術語“脫胺基試劑”通常是指具有移除胺基能力的物質。例如，脫胺基試劑可以將未修飾的胞嘧啶的胺基脫除。
在本發明中，術語“亞硫酸氫鹽”通常是指一種可以區分具有修飾狀態和不具有修飾狀態的DNA區域的試劑。例如，亞硫酸氫鹽可以包括亞硫酸氫鹽、或其類似物或上述的組合。例如，亞硫酸氫鹽可以使未修飾的胞嘧啶的胺基脫胺基化，以使其與修飾的胞嘧啶區分。在本發明中，術語“類似物”通常是指具有類似結構和/或功能的物質。例如亞硫酸氫鹽的類似物可以與亞硫酸氫鹽具有類似的結構。例如，亞硫酸氫鹽的類似物可以是指一種同樣可以區分具有修飾狀態和不具有修飾狀態的DNA區域的試劑。
在本發明中，術語“甲基化敏感限制酶”通常是指一種根據其識別位點的甲基化狀態而選擇性消化核酸的酶。例如，對於當識別位點未被甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點被甲基化時，可以不會發生剪切，或以顯著降低的效率剪切。對於當識別位點被甲基化時才特異剪切的限制酶來說，當識別位點未被甲基化時，可以不會發生剪切，或以顯著降低的效率剪切。例如，甲基化特異的限制酶可以識別含有CG二核苷酸(例如cgcg或cccggg)的序列。
在本發明中，術語“腫瘤”通常是指在正常生長和/或發育中呈現出至少部分失去控制的細胞和/或組織。例如，常見的腫瘤或癌細胞通常可以是失去了接觸抑制並可能是入侵性的和/或具有轉移的能力。例如，本發明的腫瘤可以是良性的，也可能是惡性的。
在本發明中，術語“進展”通常是指疾病從不太嚴重狀態到較嚴重狀態的變化。例如，腫瘤進展可以包括腫瘤的數量或嚴重性、癌細胞轉移程度、癌症生長或擴散的速度等增大。例如，腫瘤進展可以包括這種
癌症從不太嚴重狀態到較嚴重狀態的階段時期，例如從I期到II期、從II期到III期等的進展。
在本發明中，術語“形成”通常是指個體體內出現病灶。例如，當腫瘤形成時，可以將該個體確診為腫瘤患者。
在本發明中，術語“螢光PCR”通常是指一種定量或半定量的PCR技術。例如，可以是實時定量聚合酶鏈反應、定量聚合酶鏈反應或動力學聚合酶鏈反應的PCR技術。例如，可以利用PCR擴增並借助嵌入性螢光染料或序列特異性探針定量檢測起始的靶核酸量，該序列特異性探針可以含有僅與靶核酸融合才可檢出的螢光報導分子。
在本發明中，術語“PCR擴增”通常是指聚合酶鏈擴增反應。例如，本發明中的PCR擴增可以包含目前已知的用於DNA擴增的任意聚合酶鏈擴增反應。
在本發明中，術語“螢光Ct值”通常是指一種定量或半定量評估靶核酸的測量值。例如，可以是指螢光信號到達設定的域值時所經歷的擴增反應循環數。
發明詳述
一方面，本發明提供一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，可以包含確定待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的
確定結果，確認胰臟腫瘤是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為胰臟腫瘤形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為胰臟腫瘤形成的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估胰臟腫瘤的進展情況。
另一方面，本發明提供一種評估胰臟腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含確定待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。例如，根據待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定情況，評估胰臟腫瘤相關DNA區域甲基化狀態。例如，胰臟腫瘤相關DNA區域甲基化狀態可以是指該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與胰臟腫瘤的發生有關聯。
SIX3基因
例如，本發明所述DNA區域可以來源於人chr2：45029046-45171899。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫
Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中SIX3基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區
域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：45028997-45029178的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：45029106-45029328的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體
的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：1的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：5的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45029037-45029129和來源於人chr2：45029158-45029245。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45029037-45029129和來源於人chr2：45029158-45029245。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片
段的核酸：來源於人chr2：45029037-45029129和來源於人chr2：45029158-45029245。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：2所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：45028997-45029178的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：45029037-45029129的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：6所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：45029106-45029328的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：45029158-45029245的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：3與4和SEQ ID NO：7與8。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：3與4所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：45028997-45029178的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：45029037-45029129的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：7與8所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：45029106-45029328的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：45029158-45029245的DNA區域進行擴增。
EMX1基因
例如，本發明所述DNA區域可以來源於人chr2：73147574-73162020。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中EMX1基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以
下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644和來源於人chr2：73147570-73147794。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644和來源於人chr2：73147570-73147794。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，
並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：73147570-73147794的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：12的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：16
的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626和來源於人chr2：73147654-73147729。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626和來源於人chr2：73147654-73147729。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：73147571-73147626和來源於人chr2：73147654-73147729。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：13所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源
於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：17所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147570-73147794的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147654-73147729的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：14與15和SEQ ID NO：18與19。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：14與15所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：18與19所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147570-73147794的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147654-73147729的DNA區域進行擴增。
KIAA1715基因
例如，本發明所述DNA區域可以來源於人chr2：176790410-176945351。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中KIAA1715基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：176945145-176945341和來源於人chr2：176945314-176945551。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待
測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：176945145-176945341和來源於人chr2：176945314-176945551。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：176945296-176945401的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：176945145-176945341的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr2：176945314-176945551的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：28。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：20的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：24的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：28的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和
/或含量：來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：176945151-176945212和來源於人chr2：176945391-176945517。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：176945151-176945212和來源於人chr2：176945391-176945517。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：176945151-176945212和來源於人chr2：176945391-176945517。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：29。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：21所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945296-176945401的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945321-176945379的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：25所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945145-176945341的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945151-176945212的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：29所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945314-176945551的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945391-176945517的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：22與23、SEQ ID NO：26與27和SEQ ID NO：30與31。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：22與23所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945296-176945401的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945321-176945379的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：26與27所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945145-176945341的DNA區域進行擴增。例
如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945151-176945212的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：30與31所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945314-176945551的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945391-176945517的DNA區域進行擴增。
AATF基因
例如，本發明所述DNA區域可以來源於人chr17：35299944-35414171。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中AATF基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr17：35299895-35300024和來源於人chr17：35299913-35300174。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、
或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr17：35299895-35300024和來源於人chr17：35299913-35300174。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以
指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr17：35299913-35300174的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：32的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：36的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr17：35299901-35299989和來源於人chr17：35299990-35300116。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr17：35299901-35299989和來源於人chr17：35299990-35300116。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr17：35299901-35299989和來源於人chr17：35299990-35300116。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：37。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：33所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作
為探針，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：37所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299913-35300174的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299990-35300116的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：34與35和SEQ ID NO：38與39。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：34與35所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：38與39所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299913-35300174的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299990-35300116的DNA區域進行擴增。
NTRK3基因
例如，本發明所述DNA區域可以來源於人chr15：88419988-88800514。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中NTRK3基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr15：88800038-88800332和來源於人chr15：88800479-88800714。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待
測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr15：88800038-88800332和來源於人chr15：88800479-88800714。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr15：88800038-88800332的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr15：88800479-88800714的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：48。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：40的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：44的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：48的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和
/或含量：來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr15：88800183-88800259和來源於人chr15：88800507-88800580。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr15：88800183-88800259和來源於人chr15：88800507-88800580。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr15：88800183-88800259和來源於人chr15：88800507-88800580。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：49。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：41所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800361-88800450的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：45所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800038-88800332的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800183-88800259的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：49所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800479-88800714的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800507-88800580的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：42與43、SEQ ID NO：46與47和SEQ ID NO：50與51。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：42與43所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800361-88800450的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：46與47所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800038-88800332的DNA區域進行擴增。例
如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800183-88800259的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：50與51所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800479-88800714的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800507-88800580的DNA區域進行擴增。
ELMO1基因
例如，本發明所述DNA區域可以來源於人chr7：36892511-37488555。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中ELMO1基因所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：37487490-37488548、來源於人chr7：37487339-37487535、來源於人chr7：37488025-37488221和來源於人
chr7：37488377-37488698。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：37487490-37488548、來源於人chr7：37487339-37487535、來源於人chr7：37488025-37488221和來源於人chr7：37488377-37488698。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比
例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：37487339-37487535的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：37488025-37488221的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於人chr7：37488377-37488698的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：67。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：52的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：59的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：63的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：67的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：37487713-37487807、來源於人chr7：37488287-37488377、來源於人chr7：37487409-37487498、來源於人chr7：37488026-37488123和來源於人chr7：37488558-37488627。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr7：37487713-37487807、來源於人chr7：37488287-37488377、來源於人chr7：37487409-
37487498、來源於人chr7：37488026-37488123和來源於人chr7：37488558-37488627。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr7：37487713-37487807、來源於人chr7：37488287-37488377、來源於人chr7：37487409-37487498、來源於人chr7：37488026-37488123和來源於人chr7：37488558-37488627。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：68。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：53所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：56所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為
探針，可以針對來源於人chr7：37488287-37488377的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：60所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487339-37487535的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487409-37487498的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：64所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37488025-37488221的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37488026-37488123的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：68所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37488377-37488698的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37488558-37488627的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：54與55、SEQ ID NO：57與58、SEQ ID NO：61與62、SEQ ID NO：65與66和SEQ ID NO：69與70。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：54與55所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：57與58所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37488287-37488377的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：61與62所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487339-37487535的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487409-37487498的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：65與66所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37488025-37488221的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37488026-37488123的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：69與70所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，
可以針對來源於人chr7：37488377-37488698的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37488558-37488627的DNA區域進行擴增。
選自以下組中兩種或更多種的基因：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1
例如，本發明所述DNA區域可以選自以下組中兩種或更多種：來源於人chr2：73147574-73162020、來源於人chr2：74699109-74699807、來源於人chr13：100649669-101182691、來源於人chr15：83806804-83876770、來源於人chr17：35299944-35414171、來源於人chr20：34146507-34195484、和來源於人chr7：36892511-37488555。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種的基因：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態
的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr13：100649669-100649795、來源於人chr15：83952260-83952395、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr13：100649669-100649795、來源於人chr15：83952260-83952395、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關
聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的2種：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和MRPL53。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和PCCA。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和PCCA。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的3種：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和PCCA。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的4種：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA和HDGFL3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的5種：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的6種：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF和FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的7種：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4和ELMO1。
確定目標基因的DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於該目標基因亞區域的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體
的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：12、71、75、79、32、83和52。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：12的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：71的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：75的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：79的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：32的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：83的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：52的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修
飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr13：100649701-100649779、來源於人chr15：83952273-83952361、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr13：100649701-100649779、來源於人chr15：83952273-83952361、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr13：100649701-100649779、來源於人chr15：83952273-83952361、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組中兩種或更多種核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：13、72、76、80、33、84和53。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：13所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：72所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：74726602-74726722的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：74726612-74726708的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：76所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr13：100649669-100649795的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr13：100649701-100649779的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：80所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：83952260-83952395的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作
為探針，可以針對來源於人chr15：83952273-83952361的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：33所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：84所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr20：34189439-34189616的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr20：34189480-34189581的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：53所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組中兩種或更多種核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：14與15、73與74、77與78、81與82、34與35、85與86、和54與55。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：14與15所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：73與74所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：74726602-74726722的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：74726612-74726708的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：77與78所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr13：100649669-100649795的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr13：100649701-100649779的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：81與82所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：83952260-83952395的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：83952273-83952361的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：34與35所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，
可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：85與86所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr20：34189439-34189616的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr20：34189480-34189581的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：54與55所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行擴增。
選自以下組中兩種或更多種的基因：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1
例如，本發明所述DNA區域可以選自以下組中兩種或更多種：來源於人chr2：73147574-73162020、來源於人chr2：176790410-176945351、來源於人chr2：45029046：45171899、來源於人chr15：88419988-88800514、來源於人chr17：35299944-35414171、和來源於人chr7：36892511-37488555。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的
人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種的基因：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：45028997-45029178、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr17：35299895-35300024、和來源於人chr7：37487490-37488548。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA
區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：45028997-45029178、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr17：35299895-35300024、和來源於人chr7：37487490-37488548。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的2種：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和KIAA1715。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和SIX3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715和SIX3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的3種：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715和SIX3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的4種：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的5種：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的6種：EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF和ELMO1。
確定目標基因的DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於該目標基因亞區域的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：12、20、1、40、32、和52。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：12的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：20的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的
核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：1的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：40的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：32的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：52的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：45029037-45029129、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr17：35299901-35299989、和來源於人chr7：37487713-37487807。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：45029037-45029129、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr17：35299901-35299989、和來源於人chr7：37487713-37487807。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：45029037-45029129、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr17：35299901-35299989、和來源於人chr7：37487713-37487807。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組中兩種或更多種核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：13、21、2、41、33、和53。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：13所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：21所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945296-176945401的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：176945321-176945379的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：2所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：45028997-45029178的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：45029037-45029129的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：41所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800361-88800450的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：33所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：53所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組中兩種或更多種核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：14與15、
22與23、3與4、42與43、34與35、和54與55。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：14與15所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：22與23所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945296-176945401的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：176945321-176945379的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：3與4所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：45028997-45029178的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：45029037-45029129的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：42與43所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800361-88800450的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：34與35所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：54與55所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行擴增。
選自以下組中兩種或更多種的基因：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1
例如，本發明所述DNA區域可以選自以下組中兩種或更多種：來源於人chr2：73147574-73162020、來源於人chr2：74726602-74699807、來源於人chr17：35299944-35414171、來源於人chr15：88419988-88800514、來源於人chr20：34146507-34195484、和來源於人chr7：36892511-37488555。例如，本發明的基因可以藉由它們的名稱和它們的染色體坐標來描述。例如，染色體坐標可以與2009年2月發佈的人類基因組數據庫Hg19版(或稱作“Hg19坐標”)一致。例如，本發明的DNA區域可以是來源於由Hg19坐標限定的區域。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以
下組中兩種或更多種的基因：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1所在DNA區域的特定的亞區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，確認疾病是否存在。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否確診為疾病形成。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估是否有確診為疾病的風險和/或風險的高低。例如，本發明的方法可以包含，根據待測樣本中該DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量的確定結果，評估疾病的進展情況。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人
chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。例如，該DNA區域的甲基化的確認存在或相對於參考水平的數量提高，可以與疾病的發生有關聯。例如，本發明的DNA區域可以是指基因組DNA的特定區段。例如，本發明的DNA區域可以藉由基因名稱或一組染色體坐標來指定。例如，一個基因可以藉由參考其名稱獲得其序列和染色體位置，或藉由參考其染色體坐標確定其序列和染色體位置。本發明採用這些特定DNA區域甲基化狀態作為一個系列分析指標，可以在靈敏度和/或特異性方面提供顯著的改進，並且可以簡化篩查過程。例如，“靈敏度”可以指正確鑑定的陽性結果的比例，即，正確鑑定為具有所討論疾病的個體的百分數；“特異性”可以指正確鑑定的陰性結果的比例，即，正確鑑定為不具有所討論疾病的個體的百分數。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的2種：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和MRPL53。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的3種：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和AATF。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的4種：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF和NTRK3。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的5種：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3和FER1L4。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含選自以下組的基因中的6種：EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
例如，本發明的方法中，該目標基因可以包含EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4和ELMO1。
確定目標基因的DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中來源於該目標基因亞區域的DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量。
本發明的DNA區域可以包含這些分子的全部形式及其片段或變體。例如，變體可以包含相對於本發明所述的DNA區域共有至少80%、至少85%、至少90%、95%、98%、或99%序列同一性，變體可以包含一個或多個缺失、添加、置換、倒轉序列等。例如，本發明所述變體的修飾狀態可以實現相同的評估結果。本發明的DNA區域可以包含全部形式的任何其他的突變、多態性變異或等位變異。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：12、71、32、40、83、和52。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：12的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：71的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：32的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核
酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：40的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：83的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合SEQ ID NO：52的DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
另一方面，本發明提供一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，可以包含：確定待測樣本中可以選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
例如，本發明的方法可以包含：提供能夠結合可以包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人
chr2：74726612-74726708、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
例如，上述區域的一種或多種可以作為擴增區域和/或檢測區域。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組中兩種或更多種核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：13、72、33、41、84、和53。例如，該核酸可以用於檢測目標區域。例如，該核酸可以作為探針。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：13所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：72所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：74726602-74726722的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr2：74726612-74726708的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：33所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作
為探針，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：41所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr15：88800361-88800450的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：84所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr20：34189439-34189616的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr20：34189480-34189581的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：53所示的核酸或其互補核酸、或上述的片段。例如該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行檢測。例如，該核酸作為探針，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行檢測。
例如，本發明的方法可以包含：提供可以選自以下組中兩種或更多種核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：14與15、73與74、34與35、42與43、85與86、和54與55。例如，該核酸組可以用於擴增目標區域。例如，該核酸組可以作為引子組。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：14與15所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147525-73147644的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：73147571-73147626的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：73與74所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：74726602-74726722的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr2：74726612-74726708的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：34與35所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299895-35300024的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr17：35299901-35299989的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：42與43所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800238-88800514的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr15：88800361-88800450的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：85與86所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，
可以針對來源於人chr20：34189439-34189616的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr20：34189480-34189581的DNA區域進行擴增。
例如，本發明的方法可以包含：提供SEQ ID NO：54與55所示的核酸組或其互補核酸組、或上述的片段。例如該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487490-37488548的DNA區域進行擴增。例如，該核酸組作為引子組，可以針對來源於人chr7：37487713-37487807的DNA區域進行擴增。
例如，該疾病可以包含腫瘤。例如，該疾病可以包含實體瘤。例如，該疾病可以包含胰臟腫瘤等任意的腫瘤。例如，視需要地本發明的疾病可以包含胰腺癌。例如，視需要地本發明的疾病可以包含胰腺導管腺癌。例如，視需要地本發明的胰臟腫瘤可以包含胰腺導管腺癌。
例如，本發明的“互補的”和“基本上互補的”可以包括在核苷酸或核酸之間，例如在雙鏈DNA分子的兩條鏈之間，或在寡核苷酸引子和單鏈核酸上的引子結合位點之間的融合或鹼基配對或雙鏈體的形成。互補的核苷酸可以通常是A和T(或A和U)或C和G。對於兩個單鏈RNA或DNA分子，當一條鏈的核苷酸在進行最佳比對和比較並且具有適當的核苷酸插入或缺失時與另一條鏈的至少約80%(通常至少約90%至約95%，甚至約98%至約100%)成對時，可以認為它們是基本互補的。在一個方面，兩個互補的核苷酸序列能夠融合，並且可以在反向的核苷酸之間有小於25%的錯配，更可以以小於15%的錯配，可以以小於5%的錯配，或不具有錯配。例如，兩個分子可以在高嚴格條件下融合。
例如，本發明的修飾狀態可以是指該修飾狀態在DNA區域內部一個特定核苷酸或多個核苷酸處的存在、不存在和/或其含量。例如，本發明的修飾狀態可以是指特定DNA序列中每個鹼基或每個特定鹼基(例如胞嘧啶)的修飾狀態。例如，本發明的修飾狀態可以是指特定DNA序列中鹼基對組合和/或鹼基組合的修飾狀態。例如，本發明的修飾狀態可以是指特定DNA序列(包括基因所在DNA區域或其特定區域片段)中關於區域修飾密度的信息，而可以不提供該序列中何處發生修飾的精確位置信息。
例如，本發明的修飾狀態可以是指甲基化狀態或與甲基化類似的狀態。例如，具有或具有較高的甲基化的狀態可以是與特定區域的轉錄沉默相關的。例如，具有或具有較高的甲基化的狀態可以是與能夠被甲基化特異性轉化試劑(例如脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶)轉化相關的。例如，轉化可以是指被轉變為其它物質和/或被剪切或消化。
例如，該方法還可以包含獲取待測樣本中的核酸。例如，該核酸可以包含無細胞游離核酸。例如，該待測樣本可以包含組織、細胞和/或體液。例如，該待測樣本可以包含血漿。例如，本發明的檢測方法可以對任何適合的生物樣品進行。例如，待測樣本可以為生物材料的任何樣品，例如其可以源自動物，但不限於細胞材料、生物流體(例如血液)、排出物、組織活組織檢查標本、手術標本或已經導入動物身體中並且隨後取出的流體。例如，本發明的待測樣本可以包含在該樣本分離後經任何形式處理的樣本。
例如，該方法還可以包含轉化該DNA區域或其片段。例如，藉由本發明的轉化步驟，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的
該鹼基，在轉化後可以形成不同的物質。例如，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後可以改變為與該鹼基不同的其它鹼基(例如，該其它鹼基可以包含尿嘧啶)、或在轉化後被剪切。例如，該鹼基可以包含胞嘧啶。例如，該修飾狀態可以包含甲基化修飾。例如，該轉化可以包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。例如，該脫胺基試劑可以包含亞硫酸氫鹽或其類似物。例如，亞硫酸氫鈉或亞硫酸氫鉀。
例如，該方法還可以包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。例如，該擴增可以包含PCR擴增。例如，本發明的擴增可以包含已知的任意一種擴增系統。例如，本發明的擴增步驟可以是視需要地。例如，“擴增”可以是指產生所需序列的多個拷貝的過程。“多個拷貝”可以是指至少兩個拷貝。“拷貝”可以不意味著與模板序列具有完美的序列互補性或同一性。例如，拷貝可以包括核苷酸類似物如脫氧肌苷，有意的序列改變(例如藉由包含與模板可融合但不互補的序列的引子引入的序列改變)，和/或在擴增過程中可以發生序列錯誤。
例如，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法可以包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。例如，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法可以包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。例如，可以直接檢測具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。例如，可以藉由以下方式檢測：具有該修飾狀態的DNA區域或其片段可以在反應(例如擴增反應)的過程
中可以與不具有該修飾狀態的DNA區域或其片段具有不同的特性。例如，在螢光PCR方法中，具有該修飾狀態的DNA區域或其片段可以被特異性擴增，並發出螢光；不具有該修飾狀態的DNA區域或其片段可以基本不被擴增，並基本不發出螢光。例如，確定具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量的替代方法，可以包含在本發明的範圍之內。
例如，可以藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。例如，可以藉由該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。例如，當該待測樣本的螢光Ct值相對於參考螢光Ct值更低時，可以確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或可以確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的含量高於參考樣本中的修飾狀態的含量。例如，可以藉由檢測參考樣本確定該參考螢光Ct值。例如，當該待測樣本的螢光Ct值相對於參考螢光Ct值更高或基本相當時，也可以不排除該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在；當該待測樣本的螢光Ct值相對於參考螢光Ct值更高或基本相當時，可以確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的含量低於或基本等於參考樣本中的修飾狀態的含量。
例如，本發明可以藉由循環閾值(即Ct值)來表示特定DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，例如包括待測樣本的甲基化水平和參考水平。例如，Ct值可以是指在背景信號以上可以檢測到PCR產物的螢光的循環數。例如，Ct值與樣品中目標標記物的起始數量可以成負相
關關係，即Ct值越低，待測樣品中DNA區域或其片段的修飾狀態的數量越多。
例如，當待測樣品的Ct值相對於其相應的參考Ct值相同或更低可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當待測樣品的Ct值相對於其相應的參考Ct值低至少1個循環、至少2個循環、至少5個循環、至少10個循環、至少20個循環、或至少50個循環時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本的Ct值相對於其相應的參考Ct值相同或更高，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本的Ct值相對於其相應的參考Ct值高至少1個循環、至少2個循環、至少5個循環、至少10個循環、至少20個循環、或至少50個循環時，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本的Ct值相對於其相應的參考Ct值疾病相同時，可以確認為存在或不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或未形成、具有或不具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展，並同時可以給出需要進一步檢測的建議。
例如，本發明的參考水平或對照水平可以是指是正常水平或健康水平。例如，該正常水平可以是來源於無該疾病的細胞、組織或個體的樣本DNA區域的修飾狀態水平。例如，當用於腫瘤的評估，該正常水平
可以是來源於無腫瘤的細胞、組織或個體的樣本DNA區域的修飾狀態水平。例如，當用於胰臟腫瘤的評估，該正常水平可以是來源於無胰臟腫瘤的細胞、組織或個體的樣本DNA區域的修飾狀態水平。
例如，在本發明中參考水平可以是指將受試者或樣本確認為存在或不存在特定疾病的閾值水平。例如，在本發明中參考水平可以是指將受試者診斷為特定疾病的形成或具有形成風險的閾值水平。例如，在本發明中參考水平可以是指將受試者評估為特定疾病的某種進展的閾值水平。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態高於或基本等於相應參考水平時，例如此處參考水平可以是指不具有特定疾病患者的DNA區域的修飾狀態，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，本發明中的A與B“基本等於”可以是指A與B的差值為1%或更少、0.5%或更少、0.1%或更少、0.01%或更少、0.001%或更少或0.0001%或更少。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態高於相應參考水平至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當多次檢測中的至少一次、至少兩次、或至少三次的檢測中，細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態高於相應參考水平至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍、或
至少20倍時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態低於或基本等於相應參考水平時，例如此處參考水平可以是指具有特定疾病患者的DNA區域的修飾狀態，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。例如，當細胞樣本、組織樣本或來源於受試者的樣本中的DNA區域的修飾狀態低於相應參考水平至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少50%、至少100%時，可以確認為不存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
所屬技術領域具有通常知識者可以根據期望的靈敏度和特異性來選擇參考水平。例如，在本發明中各種情況下的參考水平可以是本領域人員容易確認的，如根據有限次嘗試確認合適的參考水平和/或合適的獲取參考水平的手段，例如，參考水平可以源自一個或多個參考樣品，其中參考水平獲自與檢測目的樣品的實驗平行進行的實驗。或者，也可以在數據庫中獲得參考水平，該數據庫包括來自一個或多個參考樣品或疾病參考樣品的數據、標準或水平的集合。在一些實施方式中，數據、標準或水平的集合可以被標準化或歸一化，以便可用於與來自一個或多個樣品的數據進行比較，從而用於減少不同檢測條件下產生的誤差。
例如，參考水平可以來源於數據庫，該數據庫可以是參考數據庫，例如包括來自一個或多個參考樣品的目標標記物和/或其他實驗室和臨床數據的修飾狀態水平。例如，可以藉由匯總獲自健康個體和/或非相
應疾病患者個體(即已知沒有該疾病的個體)的參考樣品的參考水平數據來建立參考數據庫。例如，可以藉由匯總獲自正在接受治療的患有相應疾病個體的參考樣品的參考水平數據來建立參考數據庫。例如，可以藉由匯總獲自疾病不同階段的個體的參考樣品的數據來建立參考數據庫。例如，例如不同階段可以是藉由本發明目標標記物的不同的修飾狀態水平來證明的。所屬技術領域具有通常知識者還可以基於各種因素，例如年齡、性別、病史、家族史、症狀等，來確定個體是否患相應疾病或具有患相應疾病的風險。
例如，本發明可以藉由循環閾值(即Ct值)來表示特定DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量，判讀方法可以為：根據各基因的甲基化水平計算得分，得分大於0則結果為陽性，即樣本對應的結果可以為惡性結節；在一個或多個實施方案中，得分小於0則結果為陰性，即胰樣本對應的結果可以為良性結節。例如，在PCR實施方案中甲基化水平可以藉由以下計算，甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%，其中，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。在測序實施方案中，甲基化水平可以藉由以下計算，甲基化水平=甲基化鹼基數/總鹼基數。
例如，本發明的方法可以包含以下步驟：獲取待測樣本中的核酸；轉化該DNA區域或其片段；確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
例如，本發明的方法可以包含以下步驟：獲取待測樣本中的核酸；轉化該DNA區域或其片段；擴增待測樣本中該DNA區域或其片段；確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
例如，本發明的方法可以包含以下步驟：獲取待測樣本中的核酸；用試劑處理從待測樣品中獲得的DNA，該試劑能夠區分該DNA中的未甲基化位點和甲基化位點，從而獲得經處理的DNA；可選地擴增待測樣本中該DNA區域或其片段；定量、半定量或定性分析待測樣本中經處理的DNA的甲基化狀態的存在和/或含量；比較測樣本中經處理的DNA的甲基化水平以及相應的參考水平，當待測樣本中的DNA區域的甲基化狀態高於或基本等於相應參考水平時，可以確認為存在特定疾病、診斷為特定疾病的形成或具有形成風險或者評估為特定疾病的某種進展。
另一方面，本發明提供一種核酸，該核酸可以包含能夠結合SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。例如，該核酸可以是本發明的任一種探針。另一方面，本發明提供一種製備核酸的方法，可以包含根據SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。例如，製備核酸的方法可以是本領域已知的任意合適的方法。
另一方面，本發明提供一種核酸組，該核酸組可以包含能夠結合SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。例如，該核酸組可以是本發明的任一種引子組。另一方面，本發明提供一種製備核酸組的方法，可以包含根據SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來
的區域、或上述的片段的核酸組。例如，製備核酸組中的核酸的方法可以是本領域已知的任意合適的方法。例如，可以使用單個探針或引子評估靶多核苷酸的甲基化狀態，該單個探針或引子被配置成與該靶多核苷酸融合。例如，可以使用多個探針或引子評估靶多核苷酸的甲基化狀態，該多個探針或引子被配置成與該靶多核苷酸融合。
另一方面，本發明提供一種試劑盒，可以包含本發明的核酸和/或本發明的核酸組。例如，本發明的試劑盒可以可選地包含相應用途的參考樣本或提供相應用途的參考水平。
另一方面，本發明所述各探針還可以含有可檢測物。在一個或多個實施方案中，該可檢測物可以是5’端螢光報告基團和3’端標記淬滅基團。在一個或多個實施方案中，該螢光報告基因可以選自Cy5、Texas Red、FAM和VIC。
另一方面，本發明所述試劑盒還可以包括經轉化的陽性標準品，其中未甲基化的胞嘧啶轉化為不與鳥嘌呤結合的鹼基。在一個或多個實施方案中，該陽性標準品可以是完全甲基化的。
另一方面，本發明所述試劑盒還可以包括選自以下一種或多種的物質：PCR緩衝液、聚合酶、dNTP、限制性內切酶、酶切緩衝液、螢光染料、螢光淬滅劑、螢光報告劑、外切核酸酶、鹼性磷酸酶、內標、對照物、KCl、MgCl2和(NH4)2SO4。
另一方面，本發明檢測DNA甲基化的試劑可以是選自以下方法的一個或多個中所用的試劑：基於重亞硫酸鹽轉化的PCR(例如甲基化特異性PCR)、DNA測序(如亞硫酸氫鹽測序、全基因組甲基化測序、
簡化甲基化測序)、甲基化敏感的限制性內切酶分析法、螢光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線法、基於芯片的甲基化圖譜分析、和質譜(例如飛行質譜)。例如，該試劑可以選自以下一種或多種：重亞硫酸鹽及其衍生物、螢光染料、螢光淬滅劑、螢光報告劑、內標、和對照物。
診斷方法、製備用途
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備可以進行疾病檢測產品中的應用。
另一方面，本發明提供一種疾病檢測方法，可以包括提供本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，其可以用於進行疾病檢測。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備可以確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明提供一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，可以包括提供本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，其可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，在製備可以確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
另一方面，本發明提供一種確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的方法，可以包括提供本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒。
另一方面，本發明提供如本發明的核酸、如本發明的核酸組和/或本發明的試劑盒，其可以用於確定該DNA區域或其片段的修飾狀態。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備可以用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含SIX3基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，可以包括提供確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，該用於確定的DNA區域包含SIX3基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，其可以用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展，該用於確定的DNA區域包含SIX3基因所在DNA區域或其片段。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形
成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用，該DNA區域可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
另一方面，本發明提供確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，可以包括提供確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，該DNA區域可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
另一方面，本發明提供用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，其可以用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展，該DNA區域可以包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
另一方面，本發明提供SIX3基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合。
另一方面，本發明提供SIX3基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備可以用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用。
另一方面，本發明提供確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含提供SIX3基因所
在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合。
另一方面，本發明提供SIX3基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，其可以用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展。
另一方面，本發明提供選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
另一方面，本發明提供選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
另一方面，本發明提供可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含提供選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
另一方面，本發明提供選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組
合，其可以用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328。
例如，本發明的核酸可以是指分離的核酸。例如，分離的多核苷酸可以是DNA分子、RNA分子或其組合。例如，DNA分子可以是基因組DNA分子或其片段。
技術方案1
1.一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
2.一種評估胰臟腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
3.如技術方案1或2所述的方法，其中，該DNA區域來源於人chr2：45029046-45171899；人chr2：73147574-73162020；人chr2：176790410-176945351；人chr17：35299944-35414171；人chr15：88419988-88800514；或人chr7：36892511-37488555。
4.如技術方案1至3中任一項所述的方法，其中，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
5.如技術方案4所述的方法，其中，該核酸包含無細胞游離核酸。
6.如技術方案1至5中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
7.如技術方案1至6中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含血漿。
8.如技術方案1至7中任一項所述的方法，其中，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
9.如技術方案8所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
10.如技術方案1至9中任一項所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
11.如技術方案9或10所述的方法，其中，該鹼基包含胞嘧啶。
12.如技術方案1至11中任一項所述的方法，其中，該修飾狀態包含甲基化修飾。
13.如技術方案10至12中任一項所述的方法，其中，該其它鹼基包含尿嘧啶。
14.如技術方案8至13中任一項所述的方法，其中，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
15.如技術方案14所述的方法，其中，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
16.如技術方案1至15中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
17.如技術方案1至16中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
18.如技術方案1至17中任一項所述的方法，其中，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
19.如技術方案1至18中任一項所述的方法，其中，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。
20.如技術方案1至19中任一項所述的方法，其中，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
21.如技術方案20所述的方法，其中，該擴增包含PCR擴增。
22.一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328；來源於人chr2：73147525-73147644和來源於人chr2：73147570-73147794；來源
於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：176945145-176945341和來源於人chr2：176945314-176945551；來源於人chr17：35299895-35300024和來源於人chr17：35299913-35300174；來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr15：88800038-88800332和來源於人chr15：88800479-88800714；或來源於人chr7：37487490-37488548、來源於人chr7：37487339-37487535、來源於人chr7：37488025-37488221和來源於人chr7：37488377-37488698。
23.一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328；來源於人chr2：73147525-73147644和來源於人chr2：73147570-73147794；來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：176945145-176945341和來源於人chr2：176945314-176945551；來源於人chr17：35299895-35300024和來源於人chr17：35299913-35300174；來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr15：88800038-88800332和來源於人chr15：88800479-88800714；或來源於人chr7：37487490-37488548、來源於人chr7：37487339-37487535、來源於人chr7：37488025-37488221和來源於人chr7：37488377-37488698。
24.如技術方案22或23所述的方法，其中，包含提供能夠結合包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：
12和SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：48；或SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：67。
25.如技術方案22至24中任一項所述的方法，其中，包含提供能夠結合包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：45029037-45029129和來源於人chr2：45029158-45029245；來源於人chr2：73147571-73147626和來源於人chr2：73147654-73147729；來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：176945151-176945212和來源於人chr2：176945391-176945517；來源於人chr17：35299901-35299989和來源於人chr17：35299990-35300116；來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr15：88800183-88800259和來源於人chr15：88800507-88800580；或來源於人chr7：37487713-37487807、來源於人chr7：37488287-37488377、來源於人chr7：37487409-37487498、來源於人chr7：37488026-37488123和來源於人chr7：37488558-37488627。
26.如技術方案22至25中任一項所述的方法，其中，包含提供選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：49；或SEQ ID NO：
53、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：68。
27.如技術方案22至26中任一項所述的方法，其中，包含提供選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：3與4和SEQ ID NO：7與8；SEQ ID NO：14與15和SEQ ID NO：18與19；SEQ ID NO：22與23、SEQ ID NO：26與27和SEQ ID NO：30與31；SEQ ID NO：34與35和SEQ ID NO：38與39；SEQ ID NO：42與43、SEQ ID NO：46與47和SEQ ID NO：50與51；或SEQ ID NO：54與55、SEQ ID NO：57與58、SEQ ID NO：61與62、SEQ ID NO：65與66和SEQ ID NO：69與70。
28.如技術方案22至27中任一項所述的方法，其中，該疾病包含腫瘤。
29.如技術方案22至28中任一項所述的方法，其中，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
30.如技術方案29所述的方法，其中，該核酸包含無細胞游離核酸。
31.如技術方案22至30中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
32.如技術方案22至31中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含血漿。
33.如技術方案22至32中任一項所述的方法，其中，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
34.如技術方案33所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
35.如技術方案22至34中任一項所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
36.如技術方案34或35所述的方法，其中，該鹼基包含胞嘧啶。
37.如技術方案22至36中任一項所述的方法，其中，該修飾狀態包含甲基化修飾。
38.如技術方案35至37中任一項所述的方法，其中，該其它鹼基包含尿嘧啶。
39.如技術方案33至38中任一項所述的方法，其中，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
40.如技術方案39所述的方法，其中，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
41.如技術方案22至40中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
42.如技術方案22至41中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
43.如技術方案22至42中任一項所述的方法，其中，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
44.如技術方案22至43中任一項所述的方法，其中，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。
45.如技術方案22至44中任一項所述的方法，其中，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
46.如技術方案45所述的方法，其中，該擴增包含PCR擴增。
47.一種核酸，該核酸包含能夠結合SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
48.一種製備核酸的方法，包含根據SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
49.一種核酸組，該核酸組包含能夠結合SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
50.一種製備核酸組的方法，包含根據SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。
51.一種試劑盒，包含如技術方案47所述的核酸和/或技術方案49所述的核酸組。
52.一種如技術方案47所述的核酸、如技術方案49所述的核酸組和/或技術方案51所述的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。
53.一種如技術方案47所述的核酸、如技術方案49所述的核酸組和/或技術方案51所述的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
54.一種如技術方案47所述的核酸、如技術方案49所述的核酸組和/或技術方案51所述的試劑盒，在製備確定所述DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
55.一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域或其片段。
56.一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾
病的進展的物質中的應用，該DNA區域包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328；來源於人chr2：73147525-73147644和來源於人chr2：73147570-73147794；來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：176945145-176945341和來源於人chr2：176945314-176945551；來源於人chr17：35299895-35300024和來源於人chr17：35299913-35300174；來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr15：88800038-88800332和來源於人chr15：88800479-88800714；或來源於人chr7：37487490-37488548、來源於人chr7：37487339-37487535、來源於人chr7：37488025-37488221和來源於人chr7：37488377-37488698。
57.一種SIX3、EMX1、KIAA1715、AATF、NTRK3、和/或ELMO1基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用。
58.一種選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用：來源於人chr2：45028997-45029178和來源於人chr2：45029106-45029328；來源於人chr2：73147525-73147644和來源於人chr2：73147570-73147794；來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：176945145-176945341和來源於人chr2：176945314-176945551；
來源於人chr17：35299895-35300024和來源於人chr17：35299913-35300174；來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr15：88800038-88800332和來源於人chr15：88800479-88800714；或來源於人chr7：37487490-37488548、來源於人chr7：37487339-37487535、來源於人chr7：37488025-37488221和來源於人chr7：37488377-37488698。
59.一種儲存介質，其記載可以運行如技術方案1至46中任一項所述的方法的程序。
60.一種設備，其包含技術方案59所述的儲存介質。
61.如技術方案60所述的設備，還包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現如技術方案1至46中任一項所述的方法。
技術方案2
1.一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
2.一種評估胰臟腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、
FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
3.如技術方案1或2所述的方法，其中，該DNA區域選自以下組中兩種或更多種：來源於人chr2：73147574-73162020、來源於人chr2：74699109-74699807、來源於人chr13：100649669-101182691、來源於人chr15：83806804-83876770、來源於人chr17：35299944-35414171、來源於人chr20：34146507-34195484、和來源於人chr7：36892511-37488555、來源於人chr2：73147574-73162020、來源於人chr2：176790410-176945351、來源於人chr2：45029046：45171899、來源於人chr15：88419988-88800514、來源於人chr17：35299944-35414171、和來源於人chr7：36892511-37488555或來源於人chr2：73147574-73162020、來源於人chr2：74726602-74699807、來源於人chr17：35299944-35414171、來源於人chr15：88419988-88800514、來源於人chr20：34146507-34195484、和來源於人chr7：36892511-37488555。
4.如技術方案1至3中任一項所述的方法，其中，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
5.如技術方案4所述的方法，其中，該核酸包含無細胞游離核酸。
6.如技術方案1至5中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
7.如技術方案1至6中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含血漿。
8.如技術方案1至7中任一項所述的方法，其中，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
9.如技術方案8所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
10.如技術方案1至9中任一項所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
11.如技術方案9或10所述的方法，其中，該鹼基包含胞嘧啶。
12.如技術方案1至11中任一項所述的方法，其中，該修飾狀態包含甲基化修飾。
13.如技術方案10至12中任一項所述的方法，其中，該其它鹼基包含尿嘧啶。
14.技術方案8至13中任一項所述的方法，其中，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
15.如技術方案14所述的方法，其中，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
16.如技術方案1至15中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
17.如技術方案1至16中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
18.如技術方案1至17中任一項所述的方法，其中，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
19.如技術方案1至18中任一項所述的方法，其中，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。
20.如技術方案1至19中任一項所述的方法，其中，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
21.如技術方案20所述的方法，其中，該擴增包含PCR擴增。
22.一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr13：100649669-100649795、來源於人chr15：83952260-83952395、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548；來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：176945296-176945401、
來源於人chr2：45028997-45029178、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr17：35299895-35300024、和來源於人chr7：37487490-37488548；或來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。
23.一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr13：100649669-100649795、來源於人chr15：83952260-83952395、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548；來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：45028997-45029178、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr17：35299895-35300024、和來源於人chr7：37487490-37488548；或來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。
24.如技術方案22或23所述的方法，包含提供能夠結合包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：12、71、75、79、32、83和
52；SEQ ID NO：12、20、1、40、32、和52；或SEQ ID NO：12、71、32、40、83、和52。
25.如技術方案22至24中任一項所述的方法，其中，包含提供能夠結合包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr13：100649701-100649779、來源於人chr15：83952273-83952361、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807；來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：176945321-176945379、來源於人chr2：45029037-45029129、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr17：35299901-35299989、和來源於人chr7：37487713-37487807；或來源於人chr2：73147571-73147626、來源於人chr2：74726612-74726708、來源於人chr17：35299901-35299989、來源於人chr15：88800361-88800450、來源於人chr20：34189480-34189581、和來源於人chr7：37487713-37487807。
26.如技術方案22至25中任一項所述的方法，其中，包含提供選自以下組中兩種或更多種核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：13、72、76、80、33、84和53；SEQ ID NO：13、21、2、41、33、和53；或SEQ ID NO：13、72、33、41、84、和53。
27.如技術方案22至26中任一項所述的方法，其中，包含提供選自以下組中兩種或更多種核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：
SEQ ID NO：14與15、73與74、77與78、81與82、34與35、85與86、和54與55；SEQ ID NO：14與15、22與23、3與4、42與43、34與35、和54與55；或SEQ ID NO：14與15、73與74、34與35、42與43、85與86、和54與55。
28.如技術方案22至27中任一項所述的方法，其中，該疾病包含腫瘤。
29.如技術方案22至28中任一項所述的方法，其中，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
30.如技術方案29所述的方法，其中，該核酸包含無細胞游離核酸。
31.如技術方案22至30中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
32.如技術方案22至31中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含血漿。
33.如技術方案22至32中任一項所述的方法，其中，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
34.如技術方案33所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
35.如技術方案22至34中任一項所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
36.如技術方案34或35所述的方法，其中，該鹼基包含胞嘧啶。
37.如技術方案22至36中任一項所述的方法，其中，該修飾狀態包含甲基化修飾。
38.如技術方案35至37中任一項所述的方法，其中，該其它鹼基包含尿嘧啶。
39.如技術方案33至38中任一項所述的方法，其中，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
40.如技術方案39所述的方法，其中，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
41.如技術方案22至40中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
42.如技術方案22至41中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
43.如技術方案22至42中任一項所述的方法，其中，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
44.如技術方案22至43中任一項所述的方法，其中，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相
對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。
45.如技術方案22至44中任一項所述的方法，其中，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
46.如技術方案45所述的方法，其中，該擴增包含PCR擴增。
47.一種核酸，該核酸包含能夠結合選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
48.一種製備核酸的方法，包含根據選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
49.一種核酸組，該核酸組包含能夠結合選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、
和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
50.一種製備核酸組的方法，包含根據選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
51.一種試劑盒，包含如技術方案47所述的核酸和/或技術方案49所述的核酸組。
52.一種如技術方案47所述的核酸、如技術方案49所述的核酸組和/或技術方案51所述的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。
53.一種如技術方案47所述的核酸、如技術方案49所述的核酸組和/或技術方案51所述的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
54.一種如技術方案47所述的核酸、如技術方案49所述的核酸組和/或技術方案51所述的試劑盒，在製備確定該DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
55.一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用，該用於確定的DNA區域包含選
自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域或其片段：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
56.一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用，該DNA區域包含選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr13：100649669-100649795、來源於人chr15：83952260-83952395、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548；來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：45028997-45029178、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr17：35299895-35300024、和來源於人chr7：37487490-37488548；或來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。
57.一種選自以下組中兩種或更多種基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫
瘤的進展的物質中的應用：EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1；EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1；或EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1。
58.一種選自以下組中兩種或更多種DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用：來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr13：100649669-100649795、來源於人chr15：83952260-83952395、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548；來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：176945296-176945401、來源於人chr2：45028997-45029178、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr17：35299895-35300024、和來源於人chr7：37487490-37488548；或來源於人chr2：73147525-73147644、來源於人chr2：74726602-74726722、來源於人chr17：35299895-35300024、來源於人chr15：88800238-88800514、來源於人chr20：34189439-34189616、和來源於人chr7：37487490-37488548。
59.一種儲存介質，其記載可以運行如技術方案1至46中任一項所述的方法的程序。
60.一種設備，其包含如技術方案59所述的儲存介質。
61.如技術方案60所述的設備，還包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現如技術方案1-46中任一項所述的方法。
另一方面，本發明提供一種儲存介質，其記載可以運行本發明的方法的程序。
另一方面，本發明提供一種設備，其可以包含本發明的儲存介質。另一方面，本發明提供了一種非易失性計算機可讀存儲介質，其上存儲有計算機程序，該程序被處理器執行以實現本發明所述的任一種或多種的方法。例如，該非易失性計算機可讀存儲介質可以包括軟盤、柔性盤、硬盤、固態存儲(SSS)(例如固態驅動(SSD))、固態卡(SSC)、固態模塊(SSM))、企業級閃存驅動、磁帶或任何其他非臨時性磁介質等。非易失性計算機可讀存儲介質還可以包括打孔卡、紙帶、光標片(或任何其他具有孔型圖案或其他光學可識別標記的物理介質)、壓縮盤只讀存儲器(CD-ROM)、可重寫式光盤(CD-RW)、數字通用光盤(DVD)、藍光光盤(BD)和/或任何其他非臨時性光學介質。
例如，本發明的設備還可以包含耦接至該儲存介質的處理器，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現本發明的方法。例如，該設備可以實現各種機制以便確保在數據庫系統上執行的本發明所述的方法產生正確的結果。在本發明中，該設備可以使用磁盤作為永久性數據存儲器。在本發明中，該設備可以為多個數據庫客戶端提供數據庫存儲和處理服務。該設備可以跨多個共享存儲設備存儲數據庫數據，和/
或可以利用具有多個執行節點的一個或更多個執行平臺。該設備可以被組織成使得存儲和計算資源可以被有效地無限擴展。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本發明的產品、製備方法和用途等，而不用於限制本發明的範圍。
實施例
實施例1 比較胰腺導管腺癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於胰臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於胰腺導管腺癌患者的癌組織和癌旁組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品30個，癌組織各30個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測cfDNA的濃度。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit，Thermo，貨號：MECOV50)處理，以獲得轉化的DNA。
在PCR反應體系中，每個引子的終濃度為100nM，每個檢測探針的終濃度為100nM。例如，PCR反應體系可以包含10μL至12.50μL的2x PCR反應液，正向引子、反向引子各0.12μL，探針0.04μL，樣本DNA(約10ng)6μL，加水補齊總體積約為20μL。
其中引子序列見表1(例如SEQ ID NO：3與4)，探針序列見表2(例如SEQ ID NO：2)。例如，PCR反應條件可以如下：95℃ 5分鐘；95℃ 20秒，60℃ 45秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，甲基化水平=2-△Ct待檢樣品/2-△Ct陽性標準品×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白細胞樣品，也代表甲基化信號強。白細胞大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測胰腺癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表5所示。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
實施例2 比較胰腺導管腺癌患者、胰臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取100個胰臟未見異常健康對照血漿、100個胰腺導管腺癌患者血漿進行檢測：使用商業化QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
採用以上PCR反應體系進行螢光PCR檢測。使用如表1所示的引子(SEQ ID NO：3與4)、表2所示的檢測探針序列(例如SEQ ID NO：2)，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測胰腺導管腺癌。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
實施例3 比較胰腺導管腺癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於胰臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於胰腺導管腺癌患者的癌組織和癌旁組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品30個，癌組織各30個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測cfDNA的濃度。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit，Thermo，貨號：MECOV50)處理，以獲得轉化的DNA。
在PCR反應體系中，每個引子的終濃度為100nM，每個檢測探針的終濃度為100nM。例如，PCR反應體系可以包含10μL至12.50μL
的2x PCR反應液，正向引子、反向引子各0.12μL，探針0.04μL，樣本DNA(約10ng)6μL，加水補齊總體積約為20μL。
其中引子序列見表8(例如SEQ ID NO：14與15)，探針序列見表9(例如SEQ ID NO：13)。例如，PCR反應條件可以如下：95℃ 5分鐘；95℃ 20秒，60℃ 45秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，甲基化水平=2-△Ct待檢樣品/2-△Ct陽性標準品×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白細胞樣品，也代表甲基化信號強。白細胞大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測胰腺癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表12所示：
結果顯示，本發明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
實施例4 比較胰腺導管腺癌患者、胰臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取100個胰臟未見異常健康對照血漿、100個胰腺導管腺癌患者血漿進行檢測：使用商業化QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
採用以上PCR反應體系進行螢光PCR檢測。使用如表8所示的引子(SEQ ID NO：14與15)、表9所示的檢測探針序列(例如SEQ ID NO：13)，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測胰腺導管腺癌。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
實施例5 比較胰腺導管腺癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於胰臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於胰腺導管腺癌患者的癌組織和癌旁組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品30個，癌組織各30個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測cfDNA的濃度。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit，Thermo，貨號：MECOV50)處理，以獲得轉化的DNA。
在PCR反應體系中，每個引子的終濃度為100nM，每個檢測探針的終濃度為100nM。例如，PCR反應體系可以包含10μL至12.50μL
的2x PCR反應液，正向引子、反向引子各0.12μL，探針0.04μL，樣本DNA(約10ng)6μL，加水補齊總體積約為20μL。
其中引子序列見表15(例如SEQ ID NO：22與23)，探針序列見表16(例如SEQ ID NO：21)。例如，PCR反應條件可以如下：95℃ 5分鐘；95℃ 20秒，60℃ 45秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，甲基化水平=2-△Ct待檢樣品/2-△Ct陽性標準品×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白細胞樣品，也代表甲基化信號強。白細胞大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測胰腺癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表19所示：
結果顯示，本發明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
實施例6 比較胰腺導管腺癌患者、胰臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取100個胰臟未見異常健康對照血漿、100個胰腺導管腺癌患者血漿進行檢測：使用商業化QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
採用以上PCR反應體系進行螢光PCR檢測。使用如表15所示的引子(SEQ ID NO：22與23)、表16所示的檢測探針序列(例如SEQ ID NO：21)，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同
基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測胰腺導管腺癌。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
實施例7 比較胰腺導管腺癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於胰臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於胰腺導管腺癌患者的癌組織和癌旁組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品30個，癌組織各30個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE
Tissue Kit提取組織DNA。使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測cfDNA的濃度。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit，Thermo，貨號：MECOV50)處理，以獲得轉化的DNA。
在PCR反應體系中，每個引子的終濃度為100nM，每個檢測探針的終濃度為100nM。例如，PCR反應體系可以包含10μL至12.50μL的2x PCR反應液，正向引子、反向引子各0.12μL，探針0.04μL，樣本DNA(約10ng)6μL，加水補齊總體積約為20μL。
其中引子序列見表22(例如SEQ ID NO：34與35)，探針序列見表23(例如SEQ ID NO：33)。例如，PCR反應條件可以如下：95℃ 5分鐘；95℃ 20秒，60℃ 45秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，甲基化水平=2-△Ct待檢樣品/2-△Ct陽性標準品×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白細胞樣品，也代表甲基化信號強。白細胞大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測胰腺癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表26所示：
結果顯示，本發明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
實施例8 比較胰腺導管腺癌患者、胰臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取100個胰臟未見異常健康對照血漿、100個胰腺導管腺癌患者血漿進行檢測：使用商業化QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
採用以上PCR反應體系進行螢光PCR檢測。使用如表22所示的引子(SEQ ID NO：34與35)、表23所示的檢測探針序列(例如SEQ ID NO：33)，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同
基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測胰腺導管腺癌。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
實施例9 比較胰腺導管腺癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於胰臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於胰腺導管腺癌患者的癌組織和癌旁組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品30個，癌組織各30個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測cfDNA的濃度。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit，Thermo，貨號：MECOV50)處理，以獲得轉化的DNA。
在PCR反應體系中，每個引子的終濃度為100nM，每個檢測探針的終濃度為100nM。例如，PCR反應體系可以包含10μL至12.50μL的2x PCR反應液，正向引子、反向引子各0.12μL，探針0.04μL，樣本DNA(約10ng)6μL，加水補齊總體積約為20μL。
其中引子序列見表29(例如SEQ ID NO：42與43)，探針序列見表30(例如SEQ ID NO：41)。例如，PCR反應條件可以如下：95℃ 5分鐘；95℃ 20秒，60℃ 45秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，甲基化水平=2-△Ct待檢樣品/2-△Ct陽性標準品×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白細胞樣品，也代表甲基化信號強。白細胞大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測胰腺癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表33所示：
結果顯示，本發明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
實施例10 比較胰腺導管腺癌患者、胰臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取100個胰臟未見異常健康對照血漿、100個胰腺導管腺癌患者血漿進行檢測：使用商業化QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
採用以上PCR反應體系進行螢光PCR檢測。使用如表29所示的引子(SEQ ID NO：42與43)、表30所示的檢測探針序列(例如SEQ ID NO：41)，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。
螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同
基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測胰腺導管腺癌。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
實施例11 比較胰腺導管腺癌、癌旁組織及白細胞DNA樣本甲基化豐度
分別從來源於胰臟未見異常的健康人群的白細胞、來源於胰腺導管腺癌患者的癌組織和癌旁組織中獲得DNA樣品(其中白細胞樣品30個，癌組織各30個)，選擇白細胞DNA作為參考樣本是因為血漿游離DNA大多數來源於白細胞破裂後釋放的DNA，其本底背景可以是血漿游離DNA該檢測位點的一個基礎背景信號。按照說明書的要求，用Qiagen QIAamp DNA Mini Kit提取白細胞DNA，用Qiagen QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取組織DNA。使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測cfDNA的濃度。
將上述步驟中獲得的DNA取20ng樣品用亞硫酸氫鹽試劑(MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit，Thermo，貨號：MECOV50)處理，以獲得轉化的DNA。在PCR反應體系中，每個引子的終濃度為100nM，每個檢測探針的終濃度為100nM。例如，PCR反應體系可以包含10μL至12.50μL的2x PCR反應液，正向引子、反向引子各0.12μL，探針0.04μL，樣本DNA(約10ng)6μL，加水補齊總體積約為20μL。
其中引子序列見表36(例如SEQ ID NO：54與55)，探針序列見表37(例如SEQ ID NO：53)。例如，PCR反應條件可以如下：95℃ 5分鐘；95℃ 20秒，60℃ 45秒(採集螢光)，進行50個循環。使用ABI 7500 Real-Time PCR System在相應的螢光通道檢測不同的螢光。計算並比較從白細胞、癌旁組織和癌組織獲得的樣品Ct值，甲基化水平=2-△Ct待檢樣品/2-△Ct陽性標準品×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，癌組織中甲基化信號檢出率可以遠高於白細胞樣品，也代表甲基化信號強。白細胞大多數樣本不能檢出靶點甲基化信號。這些靶點都可以具備用於血液檢測胰腺癌的潛能。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。在大於90%特異性的情況下，檢測位點的檢測靈敏度統計如表40所示：
結果顯示，本發明所選目標標記物對腫瘤組織具有較高的靈敏度。
實施例12 比較胰腺導管腺癌患者、胰臟未見異常人群血漿樣本甲基化信號
選取100個胰臟未見異常健康對照血漿、100個胰腺導管腺癌患者血漿進行檢測：使用商業化QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)抽提上述血漿樣本中的細胞外游離DNA。使用商業化亞硫酸氫鹽轉化試劑MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit對抽提出的細胞外游離DNA進行亞硫酸鹽轉化處理，得到轉化後的DNA。
採用以上PCR反應體系進行螢光PCR檢測。使用如表36所示的引子(SEQ ID NO：54與55)、表37所示的檢測探針序列(例如SEQ ID NO：53)，並且同時對內參基因ACTB進行檢測，作為對照。引子終濃度為500nM，探針終濃度為200nM。PCR反應體系包含：10μL的預
擴增稀釋產物，包含檢測位點的引子和探針預混液2.5μL；PCR試劑(Luna®Universal Probe qPCR Master Mix(NEB)12.5μL。螢光PCR反應體系與上述實施例相同。PCR反應條件如下：95℃ 5分鐘；95℃ 15秒，56℃ 40秒(採集螢光)，50個循環。針對不同基因探針修飾螢光，選擇相應檢測螢光通道。甲基化水平=2^(-△Ct待檢樣品)/2^(-△Ct陽性標準品)×100%。△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。
結果顯示，本發明的靶點都可以具備用於血液檢測胰腺導管腺癌。證明所選目標標記物對腫瘤組織具有可行性和特異性。
實施例13 EMX1、MRPL53、PCCA、HDGFL3、AATF、FER1L4、和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表43，探針序列見表44。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=6.42524+EMX1甲基化水平×0.04589+MRPL53甲基化水平×0.23103-PCCA甲基化水平×0.02074+HDGFL3甲基化水平×0.02265+AATF甲基化水平×0.05333+FER1L4甲基化水平×0.02855+ELMO1甲基化水平×0.06488。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到82%，靈敏度為76%，AUC為0.832。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例14 EMX1、KIAA1715、SIX3、NTRK3、AATF、和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表45，探針序列見表46。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=4.853678+EMX1甲基化水平×0.046558+KIAA1715甲基化水平×0.005535+SIX3甲基化水平×0.001106+NTRK3甲基化水平×0.015994+AATF甲基化水平×
0.053427+ELMO1甲基化水平×0.050806。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到80%，靈敏度為72%，AUC為0.802。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例15 EMX1、MRPL53、AATF、NTRK3、FER1L4、和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表47，探針序列見表48。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=6.66045+EMX1甲基化水平×0.04529+MRPL53甲基化水平×0.25403+AATF甲基化水平×0.05136+NTRK3甲基化水平×0.0196+FER1L4甲基化水平×0.01906+ELMO1甲基化水平×0.06498。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到84%，靈敏度為72%，AUC為0.827。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例16 EMX1和MRPL53聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表49，探針序列見表50。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=2.88681+EMX1甲基化水平×0.06605+MRPL53甲基化水平×0.22858
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到82%，靈敏度為62%，AUC為0.750。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例17 EMX1、MRPL53、PCCA和AATF聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的
胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表51，探針序列見表52。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=4.04520+EMX1甲基化水平×0.05074+MRPL53甲基化水平×0.22680-PCCA甲基化水平×0.01051+AATF甲基化水平×0.06641。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到82%，靈敏度為70%，AUC為0.811。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例18 EMX1、MRPL53、PCCA、AATF、FER1L4、和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表53，探針序列見表54。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=5.83434+EMX1甲基化水平×0.04209+MRPL53甲基化水平×0.27712-PCCA甲基化水平×0.01840+HDGFL3甲基化水平×0.01612+AATF甲基化水平×0.05594+ELMO1甲基化水平×0.05887。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到90%，靈敏度為64%，AUC為0.828。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例19 EMX1、AATF、和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表55，探針序列見表56。
多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=4.38531+EMX1甲基化水平×0.04716+AATF甲基化水平×0.05849+ELMO1甲基化水平×0.05275。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到84%，靈敏度為67%，AUC為0.802。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例20 EMX1、KIAA1715、NTRK3、AATF、和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表57，探針序列見表58。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=4.844144+EMX1甲基化水平×0.046670+KIAA1715甲基化水平×0.005509+NTRK3甲基化水平×0.016181+AATF甲基化水平×0.053722+ELMO1甲基化水平×0.050653。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到84%，靈敏度為70%，AUC為0.801。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例21 EMX1、MRPL53和AATF聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的
胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表59，探針序列見表60。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=4.11502+EMX1甲基化水平×0.04887+MRPL53甲基化水平×0.23457+AATF甲基化水平×0.06499。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到84%，靈敏度為66%，AUC為0.806。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
實施例22 EMX1、MRPL53、AATF和ELMO1聯合用於胰腺癌預測
本發明對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿cfDNA進行甲基化特異的PCR，發現本發明的基因組合的DNA甲基化水平可以用於區分胰腺癌和正常人群血漿。
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，貨號：51304)對115例胰腺癌患者和85例健康對照的血漿進行cfDNA抽提；使用QubitTM dsDNA HS Assay Kit(Thermo，貨號：Q32854)檢測DNA的濃度；使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質檢。
使用MethylCodeTM Bisulfite Conversion Kit(Thermo，貨號：MECOV50)對步驟1得到的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞嘧啶(cytosine,C)經過轉化變為尿嘧啶(uracil,U)；甲基化的胞嘧啶轉化後不發生改變。
其中引子序列見表61，探針序列見表62。
採用多重甲基化特異的PCR法(Multiplex MSP)，PCR混合物包括PCR反應液、引子混合物、探針混合物，進行單個樣本的配製。引子混合物包含本發明的基因組合和內參基因的各一對引子。
PCR反應體系如下：5.00μL的樣本cfDNA/陽性對照/陰性對照，3.40μL的多重引子混合物(100μM)，4.10μL的水，12.5μL的2x PCR反應液。
設置PCR程序為94℃預變性2min；94℃變性30s，60℃退火延伸1min，45個循環。60℃退火延伸階段收集螢光信號。
甲基化水平(methylation level)=Ct內參基因--Ct目的基因。
對本發明的基因組合的甲基化水平進行二元Logistic回歸分析，擬合方程。例如示例性的公式得分大於0，則判定結果為陽性，即為惡性結節。
示例性的擬合方程可以為得分(Score)=5.82377+EMX1甲基化水平×0.04276+MRPL53甲基化水平×0.27647+AATF甲基化水平×0.05715+ELMO1甲基化水平×0.06126。
本發明的基因組合經過ROC分析，特異性達到84%，靈敏度為70%，AUC為0.823。
結果顯示，本發明檢測位點組合在對照血漿和胰腺導管腺癌血漿DNA甲基化信號對比。證明所選目標標記物對腫瘤檢測具有較高的靈敏度。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本發明所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其均等方案的範圍內。
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Claims (61)
- 一種確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的方法，包含確定待測樣本中SIX3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
- 一種評估胰臟腫瘤相關DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中SIX3基因所在DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或含量。
- 如請求項1或2所述的方法，其中，該DNA區域來源於人chr2：45029046-45171899。
- 如請求項1至3中任一項所述的方法，其中，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
- 如請求項4所述的方法，其中，該核酸包含無細胞游離核酸。
- 如請求項1至5中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
- 如請求項1至6中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含血漿。
- 如請求項1至7中任一項所述的方法，其中，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
- 如請求項8所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
- 如請求項1至9中任一項所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
- 如請求項9或10所述的方法，其中，該鹼基包含胞嘧啶。
- 如請求項1至11中任一項所述的方法，其中，該修飾狀態包含甲基化修飾。
- 如請求項10至12中任一項所述的方法，其中，該其它鹼基包含尿嘧啶。
- 如請求項8至13中任一項所述的方法，其中，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
- 如請求項14所述的方法，其中，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
- 如請求項1至15中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
- 如請求項1至16中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
- 如請求項1至17中任一項所述的方法，其中，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
- 如請求項1至18中任一項所述的方法，其中，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。
- 如請求項1至19中任一項所述的方法，其中，該方法還包含在確定該DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中該DNA區域或其片段。
- 如請求項20所述的方法，其中，該擴增包含PCR擴增。
- 一種確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的方法，包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45028997至45029178和來源於人chr2：45029106至45029328。
- 一種確定DNA區域甲基化狀態的方法，包含確定待測樣本中選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段的修飾狀態的存在和/或含量：來源於人chr2：45028997至45029178和來源於人chr2：45029106至45029328。
- 如請求項22或23所述的方法，其中，包含提供能夠結合包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5。
- 如請求項22至24中任一項所述的方法，其中，包含提供能夠結合包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的 區域、或上述的片段的核酸：來源於人chr2：45029037至45029129和來源於人chr2：45029158至45029245。
- 如請求項22至25中任一項所述的方法，其中，包含提供選自以下組核酸或其互補核酸、或上述的片段：SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6。
- 如請求項22至26中任一項所述的方法，其中，包含提供選自以下組核酸組或其互補核酸組、或上述的片段：SEQ ID NO：3與4和SEQ ID NO：7與8。
- 如請求項22至27中任一項所述的方法，其中，該疾病包含腫瘤。
- 如請求項22至28中任一項所述的方法，其中，該方法還包含獲取待測樣本中的核酸。
- 如請求項29所述的方法，其中，該核酸包含無細胞游離核酸。
- 如請求項22至30中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含組織、細胞和/或體液。
- 如請求項22至31中任一項所述的方法，其中，該待測樣本包含血漿。
- 如請求項22至32中任一項所述的方法，其中，該方法還包含轉化該DNA區域或其片段。
- 如請求項33所述的方法，其中，具有該修飾狀態的鹼基以及不具有該修飾狀態的該鹼基，在轉化後形成不同的物質。
- 如請求項22至34中任一項所述的方法，其中，具有所述修飾狀態的鹼基在轉化後基本不發生改變，且不具有該修飾狀態的該鹼基在轉化後改變為與該鹼基不同的其它鹼基、或在轉化後被剪切。
- 如請求項34或35所述的方法，其中，該鹼基包含胞嘧啶。
- 如請求項22至36中任一項所述的方法，其中，該修飾狀態包含甲基化修飾。
- 如請求項35至37中任一項所述的方法，其中，該其它鹼基包含尿嘧啶。
- 如請求項33至38中任一項所述的方法，其中，該轉化包含藉由脫胺基試劑和/或甲基化敏感限制酶轉化。
- 如請求項39所述的方法，其中，該脫胺基試劑包含亞硫酸氫鹽或其類似物。
- 如請求項22至40中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確認具有該修飾狀態的鹼基在該轉化後形成的物質的存在和/或含量。
- 如請求項22至41中任一項所述的方法，其中，該確定修飾狀態的存在和/或含量的方法包含，確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
- 如請求項22至42中任一項所述的方法，其中，藉由該螢光PCR方法檢測的螢光Ct值確定具有該修飾狀態的DNA區域或其片段的存在和/或含量。
- 如請求項22至43中任一項所述的方法，其中，藉由確認該DNA區域或其片段的修飾狀態的存在和/或該DNA區域或其片段相對於參考水平具有更高的修飾狀態的含量，確定胰臟腫瘤的存在、或者有胰臟腫瘤形成或形成的風險。
- 如請求項22至44中任一項所述的方法，其中，該方法還包含在確定所述DNA區域或其片段的修飾的存在和/或含量之前，擴增待測樣本中所述DNA區域或其片段。
- 如請求項45所述的方法，其中，該擴增包含PCR擴增。
- 一種核酸，其中，該核酸包含能夠結合SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
- 一種製備核酸的方法，包含根據SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠結合該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸。
- 一種核酸組，其中，該核酸組包含能夠結合SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的序列。
- 一種製備核酸組的方法，包含根據SIX3基因所在DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的修飾狀態，設計能夠擴增該DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸組。
- 一種試劑盒，包含如請求項47所述的核酸和/或請求項49所述的核酸組。
- 一種如請求項47所述的核酸、如請求項49所述的核酸組和/或請求項51所述的試劑盒，在製備疾病檢測產品中的應用。
- 一種如請求項47所述的核酸、如請求項49所述的核酸組和/或請求項51所述的試劑盒，在製備確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用。
- 一種如請求項47所述的核酸、如請求項49所述的核酸組和/或請求項51所述的試劑盒，在製備確定所述DNA區域或其片段的修飾狀態的物質中的應用。
- 一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認胰臟腫瘤的存在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用，其中，該用於確定的DNA區域包含SIX3基因所在DNA區域或其片段。
- 一種用於確定DNA區域修飾狀態的核酸、核酸組和/或試劑盒，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用其中，該DNA區域包含選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的片段：來源於人chr2：45028997至45029178和來源於人chr2：45029106至45029328。
- 一種SIX3基因所在DNA區域、或其轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認胰臟腫瘤的存 在、評估胰臟腫瘤形成或形成風險和/或評估胰臟腫瘤的進展的物質中的應用。
- 一種選自以下組DNA區域、或其互補區域、或上述的轉化而來的區域、或上述的片段的核酸，以及上述核酸的組合，在製備用於確認疾病的存在、評估疾病形成或形成風險和/或評估疾病的進展的物質中的應用：來源於人chr2：45028997至45029178和來源於人chr2：45029106至45029328。
- 一種儲存介質，其記載可以運行如請求項1至46中任一項所述的方法的程序。
- 一種設備，其包含如請求項59所述的儲存介質。
- 如請求項60所述的設備，其中，還包含耦接至該儲存介質的處理器其中，該處理器被配置為基於存儲在該儲存介質中的程序執行以實現如請求項1至46中任一項所述的方法。
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