JP6438119B2 - ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 - Google Patents

Description

発明の技術分野
本発明は、遺伝子アッセイ及び生化学アッセイの分野に関する。具体的には、それは、腫瘍性試料及びそれらの成分のアッセイに関する。

発明の背景
悪性神経膠腫は、成人における最も一般的な中枢神経系（ＣＮＳ）原発悪性腫瘍であり、２０１２年の米国において１４，０００件を超える死亡の原因となっている^２。世界保健機関（ＷＨＯ）は、神経膠腫を種々の亜型に分類し、それらの悪性度を示すＩ〜ＩＶの等級をそれらに付けるために使用されるいくつかの組織学的及び臨床的基準を定めた。星状細胞腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、及び神経膠芽腫（ＧＢＭ）^３を含むびまん性神経膠腫（ＷＨＯグレードＩＩ〜ＩＶ）は、それらが全ての原発性悪性脳腫瘍の８０％を占めるため、臨床的に特に重要である。これらの腫瘍は、びまん性で浸潤性であり、これは治療的な外科的切除を不可能にする。加えて、グレードＩＩ〜ＩＩＩのびまん性神経膠腫は、より高いＷＨＯグレードＩＶのＧＢＭに進行する能力も有する。ＧＢＭは、成人における最も一般的な悪性脳腫瘍であり、生存期間が最も短い（全生存期間の中央値は１２〜１５カ月である）^４。加えて、同一の組織像を有する実体間であっても、患者の転帰は実質的に異なり得る。これは、より低いグレードから進行する二次性ＧＢＭと比較して、新たに発症する原発性ＧＢＭによって最もよく示される。両方の腫瘍は組織学的に区別できないが、二次性ＧＢＭを有する患者の生存率が原発性ＧＢＭのほぼ２倍であることから^５、これらの疾患は遺伝子的及び臨床的にはっきりと異なる。

びまん性神経膠腫の正確な診断は、形態学的特徴の不均一性、侵襲性、反応性柔組織、及び曖昧さのために特に困難である。これらの診断上の困難は、これらの基準の臨床的使用の際に見られる観察者間での変動性が高いことを反映している。４人の神経病理学者によって独立して検討された２４４例の神経膠腫の研究において、合致率は５２％と低かった^６。びまん性神経膠腫の正確な診断は、患者に対する臨床的判断のために臨床的に重要である。この診断は、治療レジメンを決定し、特定の亜型は、特定の化学療法（例えば、乏突起神経膠腫治療用のプロカルバジン、ＣＣＮＵ、及びビンクリスチン）に対して治療応答の増加を示すことが知られている。加えて、組織学的亜型は、患者予後を左右する。客観的な腫瘍特異的マーカーが、より正確な診断、予後判定、及び神経膠腫患者への個人的なケアの提供のために明らかに必要である。

これらの必要性に対処するために、大規模な配列決定研究により、びまん性神経膠腫において見られる遺伝子変化の概略が明らかとなった。特にイソクエン酸脱水素酵素１及び２（ＩＤＨ１／２）^１、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のプロモーター^７、αサラセミア精神遅滞症候群Ｘ連鎖（ＡＴＲＸ）^８、９、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のｃａｐｉｃｕａ（ＣＩＣ）の相同体、ｆａｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＦＵＢＰ１）^１０において頻発する変異等の多くの変化が確認された。これらの発見は、神経膠腫の明確で客観的な分子亜型の確立を助けた。診断への関連性の観点から、ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２における変化が最も有望であり、その主な理由は、特定のゲノム遺伝子座（「ホットスポット」）における単一ヌクレオチド置換としてのそれらの頻度及びそれらの発生数である。びまん性神経膠腫において、本発明者らは、これらの変異が同時に発生するかまたは排他的に発生するかの度合いが、神経膠腫亜型を定義することを発見した。例えば、ＩＤＨ１／２変異は、５０％を超える二次性ＧＢＭにおいて発生するが、原発性ＧＢＭにおいては稀（５％未満）であり（図１）、一方ＴＥＲＴプロモーター変異は、８０％を超える原発性ＧＢＭにおいて見られ、同様に７０％を超える乏突起神経膠腫においても見られる（図２）。さらに、本発明者らは、ＴＥＲＴ／ＩＤＨ状態によって確立される神経膠腫の遺伝子学的亜型が、組織診断単独によるものよりも効果的に、神経膠腫患者を、はっきりと異なる予後を有する亜型に効果的に階層化することを発見し、これは医師に、より適切な治療に導く客観的試験を提供する（図３）。例えば、ＴＥＲＴプロモーター変異を有する神経膠腫を有する患者は、１１．５カ月の全生存期間（ＯＳ）中央値を有し、一方、ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２変異の両方を有するものは、１２５カ月のＯＳ中央値を呈した。加えて、本発明者らの研究は、組織学的分類の曖昧さを最も反映し得る「混合組織像」を呈する乏突起星状細胞腫が、星状細胞（ＴＥＲＴ^ＷＴＩＤＨ^ＭＵＴ）または乏突起膠細胞（ＴＥＲＴ^ＭＵＴＩＤＨ^ＭＵＴ）シグネチャのいずれかに遺伝学的に階層化されることを明らかにした（図３）。本発明者らは、本発明者らのこれらの変異の研究をいくつかの他の腫瘍型に拡大し、ＴＥＲＴプロモーター変異が、他の癌、中でも特に、早期診断、再発監視、及び治療応答監視が極めて重要である肝臓癌（４４．２％）、膀胱癌（６６％）、粘液性脂肪肉腫（７９．１％）、及び髄芽細胞腫（２１％）でも頻繁に起こることを発見した^７、１１。（図２）同様に、ＩＤＨ１及びＩＤＨ２変異は、軟骨肉腫（５６％）^１２、内軟骨腫（８７％）、紡錘細胞血管腫（７０％）^{１３、１４}、急性骨髄性白血病（１５％）^１５、及び肝内から生じる胆管細胞癌（２２〜２８％）^１６を含む他の型の癌でも同様に頻発することが分かっている。

これらの神経膠腫亜型の特異的かつ高再発性の変異は、ＩＤＨ１／２及びＴＥＲＴプロモーターにおけるこれらの変異を迅速に、高感度に、かつ特異的に検出することができる診断アッセイを必要とする。このようなツールは、これらの困難な診断において神経病理学者を助け、患者により正確な予後情報を提供し、医師が患者の腫瘍の固有の分子シグネチャに療法を適応させることを可能にするだろう。加えて、これらの遺伝子座のＩＤＨ１／２及びＴＥＲＴプロモーターにおいて頻発する変異を有する多くの他の前述の癌型に関して、このような診断ツールは、これらの変異の迅速かつ高感度な検出にも役立つだろう。

変異検出に対する現在の診断努力は、サンガー配列決定法に基づいており、これは時間がかかり、高価であり、さらに最も重要なことには、不十分な感度により制限される（検出限界は約２０％の突然変異遺伝子）^１７。腫瘍割合が低い試料（４０％未満の腫瘍、ヘテロ接合型変異に関しては２０％未満の突然変異遺伝子を意味する）は、感度が限定されているために変異がないと誤診されることがある（図４、５）。腫瘍割合が低い場合のこのようなシナリオは、びまん性神経膠腫及び他の悪性腫瘍に関して非常に現実的である。びまん性神経膠腫の固有の不均一性及び浸潤性質に加えて、腫瘍生検材料は最低限の腫瘍組織しか含有しないことがあり、不十分な試料採取をもたらす。壊死は、多くの癌に共通した特徴であり、使用可能な組織が限定されることもある。これらの制限は、診断及び予後に大きな影響を与え、誤った療法をもたらすことがあり、それらを臨床使用に不適切にする。

当分野では、臨床分析をより速く、より高感度に、かつより特異的にすることが継続して必要とされている。

本発明の一態様に従って、腫瘍を有するヒトの身体試料を試験するための方法が提供される。ヒトの身体試料の腫瘍ＤＮＡは、増幅プライマーのセットを用いて増幅される。各増幅プライマーは、配列番号１〜１４から選択される配列を含む。それによって、ＴＥＲＴプロモーターならびにＩＤＨ１及びＩＤＨ２配列を含む増幅産物が生成される。その後、この増幅産物が検出される。

本発明の別の態様に従って、ＴＥＲＴ／ＩＤＨ１用ヘテロ接合型キャリブレータプラスミドが提供される。プラスミドは、（ａ）ＴＥＲＴ Ｃ２２８Ｔセグメント及びＴＥＲＴ Ｃ２５０Ｔセグメント、ならびに（ｂ）ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈセグメント及びＩＤＨ１野生型セグメントを含み、ＴＥＲＴセグメントの各々は等しい量及びサイズで存在し、ＩＤＨ１セグメントの各々は等しい量及びサイズで存在する。プラスミドは、各セグメント間に制限部位を有し、これらに限定されないが他のＩＤＨ１及びＩＤＨ２変異等の他の目的とする座、ならびに他の目的とする遺伝子座の選択的な直線化及び追加を可能にする。

本発明の一態様は、（ａ）対象から少なくとも１つの腫瘍ＤＮＡを含む身体試料を得ることと、（ｂ）少なくとも１つの核酸プライマーを試料に提供することと、（ｃ）少なくとも１つのプライマーを使用する少なくとも１つのＤＮＡ鋳型の増幅のための酵素及び試薬を提供することと、（ｄ）少なくとも１つのＤＮＡ鋳型の増幅に適した条件下で試料、酵素、試薬、少なくとも１つのプライマーをインキュベートすることと、（ｅ）増幅されたヌクレオチドを検出することと、（ｆ）ＩＤＨ１／２及び／またはＴＥＲＴプロモーターにおける変異を識別することと、を含む、それらからなる、またはそれらから本質的になる、対象中のＩＤＨ１／２及び／またはＴＥＲＴプロモーターにおける変異を検出するための方法を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、表１Ａ、表１Ｂ、及び表２に含まれるプライマーならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。

他の実施形態では、酵素及び試薬は、表４に含まれるものを含む。

さらに別の実施形態では、試料は、表３に記載の条件下でインキュベートされる。

いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。

他の実施形態では、生体試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、組織、細胞、生検材料、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液、及び涙からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料は組織生検材料を含む。いくつかの実施形態では、生体試料はＣＳＦを含む。いくつかの実施形態では、生体試料は尿を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は血漿を含む。

本明細書を理解することによって当業者に明らかになるこれらの実施形態及び他の実施形態は、堅牢で、迅速で、かつ再現性のあるアッセイを当分野に提供する。
[本発明1001]
以下の段階を含む、腫瘍を有するヒトの身体試料を試験する方法：
増幅プライマーのセットを用いて前記ヒトの身体試料の腫瘍ＤＮＡを増幅する段階であって、各プライマーが、ＴＥＲＴプロモーターならびにＩＤＨ1及びＩＤＨ2配列を含む増幅産物を生成するための配列番号1〜14から選択される配列を含む、増幅する段階と、
前記増幅産物を検出する段階。
[本発明1002]
配列番号15〜21を含む増幅プライマーのセットを用いて前記身体試料中の腫瘍ＤＮＡを増幅する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記腫瘍ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記腫瘍ＤＮＡが、事前増幅に供されたゲノムＤＮＡである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記増幅のサイクルの少なくとも一部が、66℃以上で行われる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記増幅の前記サイクルの一部が、60℃以下で行われる、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記身体試料の前記腫瘍ＤＮＡの別個のアリコートが、（ａ）配列番号1〜3、（ｂ）配列番号4〜6、（ｃ）配列番号3及び6、（ｄ）配列番号7〜9、（ｅ）配列番号9及び10、（ｆ）配列番号11〜13、（ｇ）配列番号13〜14を含む、プライマーの複数のセットを用いて増幅される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記増幅が定量的ＰＣＲとして実施される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記事前増幅が、高忠実度のＤＮＡポリメラーゼを用いる、本発明1004の方法。
[本発明1010]
前記事前増幅が、66℃以上のアニーリング温度を用いる、本発明1004の方法。
[本発明1011]
前記事前増幅が、68℃以上のアニーリング温度を用いる、本発明1004の方法。
[本発明1012]
前記事前増幅が、多重反応として行われる、本発明1004の方法。
[本発明1013]
前記身体試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液、及び涙からなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記身体試料が生検試料である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記身体試料が針吸引物である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
配列番号1、2、4、5、7、8、11、及び12の前記プライマーのうちの少なくとも1つが、その3’末端にＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
配列番号1、2、4、5、7、8、11、及び12の前記プライマーの各々が、その3’末端にＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
配列番号15〜21の前記プライマーのうちの少なくとも1つが、その3’末端にＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1019]
配列番号15〜21の前記プライマーの各々が、その3’末端にＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1020]
タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも1つの5’末端に結合している、本発明1001の方法。
[本発明1021]
タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも1つの5’末端に結合している、本発明1002の方法。
[本発明1022]
（ａ）ＴＥＲＴ Ｃ228Ｔセグメント及びＴＥＲＴ Ｃ250Ｔセグメント、ならびに（ｂ）ＩＤＨ1 Ｒ132Ｈセグメント及びＩＤＨ1野生型セグメントを含む、ＴＥＲＴ／ＩＤＨ1用ヘテロ接合型キャリブレータプラスミドであって、前記ＴＥＲＴセグメントの各々が等しい量及びサイズで存在し、前記ＩＤＨ1セグメントの各々が等しい量及びサイズで存在する、ヘテロ接合型キャリブレータプラスミド。

異なる腫瘍型にわたるＩＤＨ１及びＩＤＨ２における変異。ＩＤＨ１及びＩＤＨ２変異は、びまん性神経膠腫（ＷＨＯグレードＩＩ〜ＩＩＩ）及び二次性ＧＢＭ（ＷＨＯグレードＩＶ）において頻繁に発生する。^１ 大規模な腫瘍亜型にわたるＴＥＲＴプロモーター変異の頻度。^７ びまん性神経膠腫に対するＴＥＲＴ／ＩＤＨに基づく遺伝子分類。優勢な遺伝子シグネチャには、主に組織学的乏突起神経膠腫で構成されているＴＥＲＴ^ＭＵＴＩＤＨ^ＭＵＴ、進行性星状細胞腫で構成されているＴＥＲＴ^ＷＴＩＤＨ^ＭＵＴ、原発性ＧＢＭで構成されているＴＥＲＴ^ＭＵＴＩＤＨ^ＷＴ、及びＧＢＭで構成されているＴＥＲＴ^ＷＴＩＤＨ^ＷＴが挙げられる。赤は、Ｃ２２８ＴまたはＣ２５０ＴのいずれかのＴＥＲＴプロモーター変異を示し、緑は、ＩＤＨ１のＲ１３２またはＩＤＨ２のＲ１７２のいずれかの変異を示す。 癌患者からの組織の試料採取における潜在的な課題。偽陰性は、正常組織のバックグラウンド下での低い割合の腫瘍細胞によって、または他の癌細胞のバックグラウンド下でのサブクローンの腫瘍細胞集団によって生じることがある。 特定の変異を有するゲノムＤＮＡの複数の希釈度でのサンガー配列決定クロマトグラム。２０％未満の突然変異遺伝子画分では、突然変異遺伝子に関するピークがバックグラウンドから区別できなくなり、臨床試料に対して、特に不均一性及び浸潤性のびまん性神経膠腫に対してこの手法の使用を制限する。 ＬＮＡプライマーを使用する対立遺伝子特異的ｑＰＣＲの概要を示す概略図である。 ｐＧＬ３エンハンサーベクターに基づくＴＥＲＴプロモーターＣ２２８／Ｃ２５０Ｔ及びＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈヘテロ接合型キャリブレータプラスミドを示す概略図である。ＴＥＲＴ Ｃ２２８Ｔ、Ｃ２５０Ｔ、及びＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈは、各プラスミド中に５０％の割合で存在し、３００ｂｐの各標的がｐＧＬ３エンハンサープラスミドにクローニングされている。遺伝子座は互いから３ｋｂ離れており、プライマーの交差反応を制限する。変異の再現可能な突然変異遺伝子画分を生成するために、これらのセグメントに沿って目的とする追加の遺伝子座が追加されてもよい。 ｐＧＬ３エンハンサーベクターに、互いに約３ｋｂ離れた部位にクローニングされたＴＥＲＴプロモーターＣ２２８Ｔ／Ｃ２５０Ｔ及びＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈヘテロ接合型キャリブレータプラスミドの詳細な模式図である。 種々の突然変異遺伝子画分に応じた標的変異の希釈（１０％、１％、０．１％）。これらの範囲に渡って、対立遺伝子特異的アッセイは優れた直線性を示す（Ｒ^２＞０．９９４）。 ＴＥＲＴ／ＩＤＨ対立遺伝子特異的ＬＮＡ ｑＰＣＲ試験は、０．１％の突然変異遺伝子画分（約１５の変異体コピー）を検出する。 ネステッド方式のＴＥＲＴ／ＩＤＨ対立遺伝子特異的ＬＮＡ ｑＰＣＲは、高い判別性を保ちながら、鋳型として事前に増幅されたｇＤＮＡを５０ｎｇしか使用しない。

発明の詳細な説明
本発明者らは、ＴＥＲＴプロモーター、ＩＤＨ１／２のホットスポット変異を、迅速に、特異的に、かつ高感度に検出することができる高感度な定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）基づくアッセイを開発した。このｑＰＣＲに基づく診断アッセイは、変異体ＤＮＡが０．１％の突然変異遺伝子まで低い場合等、正常ＤＮＡのバックグラウンドが高い場合も変異体ＤＮＡを検出することができる。これは、サンガー配列決定法に基づく従来の方法よりも２００倍高感度である。検出限界は、放射（ＢＥＡＭｉｎｇ）等の他の高価な時間のかかる複雑な技法と同様であるが、ｑＰＣＲアッセイは、ほんの数時間で終えることができ、単一のＰＣＲステップを必要とする。このアッセイの高感度のため、それは循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）における変異の検出を可能にする。ｃｔＤＮＡは、癌患者の血液、尿、及びＣＳＦ中でごく限られた量で発見されることが多いが、外科的介入を伴わずに患者を診断することができる「液体生検材料」として使用されることが期待されている。腫瘍再発または薬物耐性発現は、これらの体液を検査することによって監視され得る。しかしながら、本アッセイは体液の使用に限定されず、より伝統的な組織及び生検試料上でも同様に使用することができる。

この技術を適用して、ＣＳＦ、血漿、血清、尿、及び他の体液から抽出されたＤＮＡを含む、腫瘍組織ならびに「液体生検」試料から抽出されたＤＮＡ中のＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＴＥＲＴプロモーター変異におけるホットスポット変異を検出することができる。さらに、これらの変異の識別は、脳腫瘍だけではなく、肝臓癌及び膀胱癌、皮膚癌（黒色腫、扁平上皮癌、及び基底細胞癌）、急性骨髄性白血病、胆管細胞癌、軟部組織腫瘍（外軟骨腫、軟骨肉腫、紡錘細胞血管腫、粘液性脂肪肉腫、非定型的線維黄色腫、粘液性脂肪肉腫）、ならびに甲状腺癌を含む、これらの変異が頻繁に生じる多くの他の腫瘍型にも関係している。

身体試料は、腫瘍ＤＮＡを含有する身体の好都合で消費されてもよい任意の部分であり得る。これは、腫瘍組織、周辺組織、生検試料、転移性試料、リンパ液、大脳髄液、血清または血漿を含む血液、尿、唾液、粘液、ならびに涙であってもよい。腫瘍を含有する特定の器官から排出される他の体液も、試料採取され、試験されてもよい。ＤＮＡは、身体試料中で試験されてもよく、または当技術分野で既知の技法を使用して抽出されてもよい。ＤＮＡは、ＴＥＲＴプロモーター、ＩＤＨ１、及びＩＤＨ２における変異を試験するための増幅の前に事前増幅されてもよい。標的配列を分析物のより大きな割合にするために、ＤＮＡは外来配列を使い尽くしてもよい。試験されるＤＮＡは、限定されないが、ミトコンドリアＤＮＡ、増幅されたＤＮＡ、及びｃＤＮＡを含む、ゲノムＤＮＡであってもよい。

アッセイの一部として、高レベルのストリンジェンシー及び特異性を導入するために、増幅サイクルは、ＰＣＲで慣習的な、より高い温度で行われてもよい。より高い温度は、例えば、少なくとも６６℃、少なくとも６７℃、少なくとも６８℃、少なくとも６９℃、少なくとも７０℃、少なくとも７１℃、少なくとも７２℃、少なくとも７３℃、少なくとも７４℃、または少なくとも７５℃であり得る。同様に、事前増幅ステップが用いられる場合は、そのような高温で行なうことが望ましい場合がある。低温増幅サイクルが、最初の、より高温でのサイクルの後に使用されてもよい。低温サイクルは、例えば、６０度、６０℃未満、５９℃未満、５８℃未満、５７℃未満、５６℃未満、５５℃未満、５４℃未満、５３℃未満、５２℃未満、または５１℃未満で行われ得る。

特定の設定において好都合である場合、アッセイにおいて多重反応が使用されてもよい。多重設定では、２セット以上のプライマー対が同じ反応混合物中で同時に使用される。場合によっては、より少ないプライマー対を使用して、またはさらには単一のプライマー対を使用して、反応の複雑さが減少するように増幅を分けることが好ましい場合がある。以下に記載されるように、アッセイの単一反応は、例えば、野生型及び変異体特異的プライマーならびに共通プライマーを有する三つ組のプライマーを使用してもよい。これは、複数の異なるゲノムセグメントに対する、多重ではなくむしろ単一反応であると見なされ得る。

特異性を強化するために、アッセイにおいてＬＮＡ修飾ヌクレオチドが典型的にプライマーの３’末端で使用される。プライマーは、標的のゲノムセグメントに相補的ではない追加の配列も有し得る。アッセイの都合上、追加の配列またはタグが使用されてもよい。一例として、また以下で考察されるように、プライマーを使用して形成される増幅産物の配列決定を容易にするために、Ｍ１３配列がプライマーの５’末端に追加される。タグ配列は、識別及び／または定量するためのハイブリダイゼーションタグとして使用されてもよい。タグ配列は、任意の追加の機能性のために、または機能性のためではなく、使用されてもよい。標的に相補的である追加のヌクレオチドがまた、プライマーの５’末端に追加されてもよく、感度への影響は最小限である。

増幅反応の正確さをもたらすために、高忠実度のポリメラーゼが使用され得る。多くのそのようなポリメラーゼは、当技術分野で既知であり、当分野の技術者によって選択され得る。例示的なＤＮＡポリメラーゼには、ＦｉｄｅｌｉＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅａｓｙ−Ａ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）Ｅｎｈａｎｃｅｄ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＣＣＵＺＹＭＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶＥＬＯＣＩＴＹ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（商標）（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰｆｘ５０（商標）ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。

アッセイの標的である変異は、ＴＥＲＴ Ｃ２２８Ｔ及びＣ２５０Ｔと称されるが、これらの特定の変異の相補物もまた、相補的なヌクレオチドを評価するために同じ位置でアッセイされ得る。全体を通してＲ１３２及びＲ１７２に言及しているものの、ＩＤＨ１／ＩＤＨ２に関しても同様に、アッセイを相補鎖上で行なって、センス鎖で挙げられた変異の相補的なヌクレオチドを検出することができる。

上述の開示は、全体として本発明を記述する。本明細書で開示される全ての参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができ、これらは例示のみを目的として本明細書に提供され、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。

ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２ホットスポット変異のＡＳ ＬＮＡ ｑ−ＰＣＲアッセイ：
Ａ．バックグラウンド：
対立遺伝子特異的ＰＣＲは、目的とするバリエーションを含有する鋳型の選択的増幅のために使用されるＤＮＡ鋳型増幅の一形態であり、このため、ＳＮＰ遺伝子型決定のための方法である^１８。ほとんどの方法は、目的とする遺伝子型を有する標的配列により高い相補性を有する判別用プライマーに依存している。これはほとんどの場合、プライマーの３’を変異の位置に配置させて、標的バリアントまたは野生型ヌクレオチドのみに相補的であるようにさせることによって行われる。この方法では、プライマーが非標的対立遺伝子に結合し、選択的増幅をもたらす場合、ＰＣＲ効率が低減する（図６）。

この分野における大きな進歩は、ロックド核酸（ＬＮＡ）として既知である、これらの対立遺伝子特異的プライマーの３’末端における代替の核酸の使用であった。ＬＮＡは、核酸の２’−Ｏと４’−Ｃとの間にメチレン架橋を有する核酸類似体であり、リボース部分がＣ３’末端立体構造中にロックする二環式構造をとる。これは、ＬＮＡ塩基がその相補物とハイブリッド形成するときにＴ_ｍを上昇させ、その標的変異または一塩基多型に対するプライマーの特異性を大きく上昇させる（ほとんどの情報源では、ＬＮＡ対ＤＮＡで少なくとも９サイクル大きい差を測定している）^１９。このプラットフォームは、数ある用途の中でも特に、細菌種の識別^２０、嚢胞性線維症遺伝子変化^１９、ＢＲＡＦ変異^２１、ＨＢＶ薬物耐性変異^２２、ミトコンドリア変異（ＭＥＬＡＳ及びＮＡＲＰにおける）^２３に関連して、対立遺伝子判別のために用いられている。

ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２における変異を検出するために、サンガー配列決定法の代替として、ＴａｑＭａｎ ＬＮＡプローブ^２４、高解像度融解曲線分析（従来のもの^２５及びＦＲＥＴ系^２６）、ＳＮａＰｓｈｏｔ^{２７、２８、}ピロ配列決定^２９、ＣＯＬＤ ＰＣＲ ＨＲＭ^３０、及びＳａｆｅＳｅｑ^３１を含む他の手法が使用されてきたが、これらの技法は、リソースを多く消費する（ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）か、または感度に欠けるため、真の臨床診断法としては実用的ではない。

Ｂ．ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２ホットスポット変異のＡＳ ＬＮＡ ｑ−ＰＣＲアッセイ：
プライマー設計
本発明者らは、ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２の両方において最も頻発する変異の検出のための診断法として使用するためのいくつかの対立遺伝子特異的プライマー、ならびに増幅に必要とされるそれらの対立遺伝子非特異的対立プライマーを設計及び試験した（表１Ａ）。注目すべきは、これらの高性能対立遺伝子特異的（ＡＳ）プライマーを確立するために、本発明者らは、これらのプライマーの判別を改善するための種々の長さ、導入された強制ミスマッチ（３’−１及び−２位）、ならびに様々なＬＮＡの位置を有する１０を超える異なる候補となるＡＳプライマーを設計した。この判別能力を試験するために、本発明者らは、正常ＤＮＡのバックグラウンド下で１５コピーつまり０．１％までの腫瘍ＤＮＡの標準希釈法を使用し、依然として特定の産物を生成しながらｑＰＣＲ上で最も大きいΔＣｔを有するプライマーを評価した。加えて、本発明者らは、ＴＥＲＴプロモーターのこの領域を特異的に増幅し、断片化したＤＮＡソース（すなわち、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）、ｃｔＤＮＡ）を増幅することができる十分に小さい増幅産物（１６０ｂｐ未満）を生成するＰＣＲ産物をもたらすために、再び２０を超える異なる候補となる対立プライマーをバックグラウンドなしで試験した。他の対立プライマーも候補となるＡＳプライマーと連携したが、本発明者らは、ｑＰＣＲを容易にするために最も小さい増幅産物を選択した（表１、２）。最後に、本発明者らは、極めて稀なＩＤＨ１ Ｒ１３２変異（Ｒ１３２Ｃ，Ｇ，Ｓ，Ｌ）及びＩＤＨ２ Ｒ１７２変異（Ｒ１７２Ｍ，Ｗ，Ｇ）用の同様の対立遺伝子特異的プライマーも開発したが、これらは神経膠腫での用途で使用し得るものの、ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈプライマーセットが最も有用である。

（表１Ａ）最も一般的なＴＥＲＴプロモーター（Ｃ２２８Ｔ、Ｃ２５０Ｔ）、ＩＤＨ１（Ｒ１３２Ｈ）、及びＩＤＨ２（Ｒ１７２Ｋ）ホットスポット変異の検出及び定量用の高性能対立遺伝子特異的プライマー（^＊注記：＋が示す）。Ｍ１３タグ（ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ；配列番号２８）及びＣＡＧ ＧＡＡ ＡＣＡ ＧＣＴ ＡＴＧ ＡＣＣ；配列番号２９）が、配列決定を容易にするために共通プライマーの５’末端に追加された。

（表１Ｂ）稀なＩＤＨ１及びＩＤＨ２変異の検出用の高性能対立遺伝子特異的プライマー（これらのプライマーセットは、１Ａと同じ対立共通プライマーを使用することに注意されたい）。

（表２）ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２の遺伝子型決定のための対立遺伝子特異的ｑＰＣＲアッセイ用プライマーセット

^＊増幅される標的領域は、Ｍ１３配列タグが追加されるため、ＡＳ増幅産物に関して１８ｂｐ短く、非ＡＳ増幅産物に関して３６ｂｐ短いことに注意されたい

Ｃ．高性能ＰＣＲプログラム及び試薬
ＰＣＲプログラム及び試薬は、対立遺伝子特異的及び非ＡＳ様式で、ならびに２つの異なる状況（（１）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ及び（２）事前増幅されたゲノムＤＮＡのネステッドＰＣＲ）において、ＴＥＲＴプロモーター及びＩＤＨ１／２エクソン４の両方を効率的に増幅する。変異状態が迅速に必要とされ、複製物でのＰＣＲを実施するために十分な試料が存在する用途に対しては、第１のプログラムが推奨される。限られたＤＮＡが存在する、またはＤＮＡの品質が不十分である用途に対しては、第２のプログラムが推奨される。

ａ．ＴＥＲＴ／ＩＤＨ状態のためのゲノムＤＮＡの１ステップＡＳ−ＬＮＡ ｑＰＣＲ
効率的な対立遺伝子特異的ＰＣＲを可能にするＰＣＲプログラムを創出することは、特にプライマーの位置の制限のため困難である。ＴＥＲＴプロモーターは、その高いＧＣ含量（目的とする領域を通して８０％超、及びＣ２２８からＣ２５０の区間において８８％）及び反復配列（目的とする領域における４つのＧの１０回反復）のため、増幅が困難であることで有名である。野生型と突然変異遺伝子とを最大限判別するために、本発明者らが用いる増幅プログラムは、高アニーリング温度（６６℃以上）での初期段階の増幅、続いてより低いアニーリング温度（６０℃以下）での第２段階の増幅を使用する。５℃／秒の傾斜率を有する本発明者らのサーモサイクラーでは、このプログラムは、融解曲線を除いて１時間未満である（表３）。これは、さらにより迅速な検出を容易にするために、より高温（例えば、９８℃で１分間）でのより短い変性及びより短いアニーリング時間を用いて調整することができ、それは術中診断のシナリオに適用可能であり得る。本発明者らは、より高いアニーリング温度（６６℃以上）で最も有効である従来の単一アニーリング温度プログラムも使用したが、これらは感度が低い。本発明者らは、全てのプライマーセットに対して最も有効である最大限の判別のためのプログラムを以下に列記した。対立遺伝子特異的（ＡＳ）プライマーは、二重ＨＰＬＣ精製に供された特別注文のオリゴヌクレオチドとしてＥｘｉｑｏｎ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入された。非ＡＳプライマーは、標準精製された特別注文のオリゴヌクレオチドとしてＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）から購入された。

（表３）ＡＳ−ｑＰＣＲベースの遺伝子型決定のためのＰＣＲプログラム１

注記：プレートの読み取りは、ステップ５及びステップ６で生じる（ＦＡＭ）

このＰＣＲの反応条件を表４に示す。多くのＧＣに富んだキット及び他のポリメラーゼを使用したが、特にＴＥＲＴプロモーターにおいて困難があった。本発明者らのアッセイの読み出しはＳＹＢＲグリーンのシグナルであり、ＫＡＰＡ ＳＹＢＲ Ｆａｓｔ ２Ｘ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（ＫＫ４６００，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用する。プライマー濃度は様々であり、広範囲の濃度にわたって有効である。さらに、５０ｎｇを超える投与量が使用されてもよいが、反応を阻害し始める。

（表４）ＴＥＲＴ／ＩＤＨ変異検出のためにＳＹＢＲを使用する１ステップｑＰＣＲ用のＰＣＲ試薬

ｂ．ＴＥＲＴ／ＩＤＨ状態用に事前増幅されたＤＮＡのネステッドＡＳ ＬＮＡ ｑＰＣＲ
変異検出のための第２の手法は、ネステッドｑＰＣＲ手法であり、これは低品質試料（すなわち、ｃｔＤＮＡ、ＦＦＰＥ ｇＤＮＡ）、及び必要な複製物に不十分である分析物含量の少ない試料（すなわち、細針生検材料）に非常に有効である。このネステッドｑＰＣＲアッセイも、ＰＣＲ阻害として信頼性の高い定量性を有し、プライマー効率の差は、ネステッドＰＣＲ環境においてはるかに重要ではない。この手法を使用するために、目的とする遺伝子座は、高アニーリング温度（６６℃以上）で、限定されたサイクル数（２０サイクル未満）に対する高忠実度の酵素を使用して、ＴＥＲＴプロモーター、ＩＤＨ１、もしくはＩＤＨ２において、または多重様式で３つ全てにおいて、非バイアス（ＮＢ）プライマーセットを用いて増幅される（表５、６）。次いで、結果として得られるＰＣＲ産物は、精製され（カラムベースまたはビーズベースの手法のいずれかを使用する）、希釈され（通常は１：１０００）、上述の対立遺伝子特異的ＬＮＡ修飾プライマーを使用する次のラウンドの増幅のための鋳型として機能する。ネステッドＰＣＲは、それが最も高い判別を提供するため、６６℃以上のアニーリング温度で実施される（表７、８）。このネステッド手法の利益は、全てが１〜５０ｎｇのｇＤＮＡから生成される、はるかに多くの鋳型の供給があることであり、これらは、さもなければ生じ得るより多くの変異に対してスクリーニングされ得る。本発明者らは、ネステッドｑＰＣＲのための高性能ＰＣＲプログラムを以下に記載する。事前増幅反応を複数の反応に分けることは有益であり（例えば、５０μｌを５×１０μｌに分割する）、これは次いでプールされてもよい。このステップに続いて、カラムまたはビーズベースの手法を使用してＰＣＲ産物を精製することができる。

（表５）高忠実度の事前増幅のためのＰＣＲプログラム

（表６）ＴＥＲＴ／ＩＤＨ遺伝子座の高忠実度の事前増幅のためのＰＣＲ試薬

（表７）非バイアスＰＣＲ産物のネステッド対立遺伝子特異的ｑＰＣＲ用のＰＣＲプログラム

プレートの読み取りは、ステップ３で、及びＳＹＢＲ及び融解曲線を使用する場合は、ＦＡＭ／ＳＹＢＲに対してステップ５で生じる

（表８）ＬＮＡ修飾プライマーを使用する対立遺伝子特異的ｑＰＣＲ用のＰＣＲ試薬

ネステッドｑＰＣＲにおいて検出のためにプローブを使用する場合、プロトコールは、表８で言及される２つのプローブ混合物のいずれか、及びＴＥＲＴまたはＩＤＨ検出に応じて、次のプローブのいずれかを使用するべきである：
ＴＥＲＴプローブ：

ＩＤＨ１プローブ：

。ＴＥＲＴプローブは、Ｃ２２８ＴとＣ２５０Ｔとの間の共通領域内に設計される一方、ＩＤＨ１プローブは、対立遺伝子特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域に設計され、したがって全ての対立遺伝子特異的ＩＤＨ反応（Ｒ１３２Ｓ、Ｃ、Ｌ、Ｇ、及びＨ）に対して使用することができる。

Ｄ．標準物質、コピー数、及び変異％定量
ＡＳ ＴＥＲＴ及びＩＤＨ１／２プライマーセットと同時に、本発明者らは、対立遺伝子非特異的様式で、２つの変異（Ｃ２２８Ｔ及びＣ２５０Ｔ）を有するＴＥＲＴプロモーター領域、Ｒ１３２Ｈ変異を有するＩＤＨ１エクソン４を増幅するプライマー、及び高反復性ヒトｌｉｎｅ−１要素を増幅するように設計されるプライマー：

も使用する。この情報を使用して、ＷＴまたはＭＵＴ対立遺伝子を増幅する対立遺伝子特異的ＰＣＲからのＣｔ値を正規化し、突然変異遺伝子画分の定量的読取値を提供することができ、試料の相互比較が可能となる。Ｅ章で言及されるように、試料が全て同一濃度である場合は、これは必要ではない。これに加えて、検証のため、５０％変異体試料（陽性対照）、１％変異体試料（低変異陽性対照）、０％野生型試料（陰性対照）、及び鋳型を含まない対照等の試料を含む、いくつかの標準化された試料が、試験される試料とともに実行される。これらの標準物質は、既知のＴＥＲＴ／ＩＤＨ状態を有する細胞株からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離することによって生成された。一例として、本発明者らは、以下の細胞株：ＤＡＯＹ（Ｃ２２８Ｔ）、Ａ３７５（Ｃ２５０Ｔ）、ＨＣＴ１１６（野生型）、及びＨＣＴ１１６ ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈノックイン＃２（ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ）からのｇＤＮＡを使用する。標的となる遺伝子座におけるｇＤＮＡ野生型でのこれらの試料の希釈は、１％以下の必要とされる標準物質をもたらす。標準物質の別のソースは、標的変異を有するプラスミドＤＮＡであり、本発明者らは、ＴＯＰＯクローニング（Ｋ４８１０−０１、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して「１００％標準物質」として生成した。本発明者らは、目的とする変異を有する腫瘍試料からのＴＥＲＴプロモーター／ＩＤＨ１／２の一部分のＰＣＲ増幅によって生成された挿入断片を使用した。加えて、現実的な定量対照として機能させるために、本発明者らは、これらの遺伝子座を同じプラスミドに、または同様の様式で別個のプラスミドにクローニングすることによって他の標的変異に拡張され得る、ＴＥＲＴ及びＩＤＨ１の目的とする変異の両方を有する完全なヘテロ接合体プラスミドを生成した（詳細は以下を参照されたい、図７）。

各プライマーセットは、試料上で三つ組みで実行される。ＴＥＲＴ及びＩＤＨ１に対する突然変異遺伝子（すなわち、最も一般的な神経膠腫関連変異）を検出するために実行される一例は、表９の以下のプライマーセットを使用することである。野生型ＡＳプライマーセットが、より正確な定量のために非バイアス（ＮＢ）増幅産物の代用として使用されてもよい。非バイアス増幅産物用のプライマーは、特定の対立遺伝子（変異体または野生型）に対して特異性を示さず、両方の型の対立遺伝子を等しく増幅するはずである。

（表９）ＴＥＲＴプロモーターＣ２２８Ｔ、Ｃ２５０Ｔ、及びＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈを試験するためのプライマーの組み合わせ

本発明者らは、希釈が突然変異遺伝子画分及び野生型対立遺伝子画分の相対比率しか概算できないため、５０％変異／５０％ＷＴ試料として機能するヘテロ接合体キャリブレータを設計した。この標準物質は、前に言及されたネステッドＰＣＲ手法に対する標準物質として最も有効である。ヘテロ接合型キャリブレータプラスミドは、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異^３２等の単一変異用に以前に生成されていたが、本明細書で、本発明者らは、定量及びワークフローを大幅に容易にする複数の変異（ＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ及びＴＥＲＴ Ｃ２２８Ｔ／Ｃ２５０Ｔ）のための単一キャリブレータを作製した（図７）。２つの標的領域は３１００ｂｐを超えて離され、それぞれの変異は、限定されたプライマー干渉が確保されるように互いからほぼ等距離のところにある。これらの標準物質は、ＧＥＮＥＷＩＺによる合成のためにまず遺伝子を設計することによって生成され、ここで、ｐＵＣ−５７−ａｍｐＲプラスミド内のＴＥＲＴプロモーター（２２８及び２５０遺伝子座＋／−約１５０ｂｐ）の部分ならびにＩＤＨ１エクソン４（Ｒ１３２またはｃ．３９５Ｇ遺伝子座＋／−約１５０ｂｐ）の部分は、遺伝子座を互いに分離することが望まれる場合、各遺伝子断片を分けている合成された制限酵素部位と並んでいる（一部の著者は、これを標準物質としてのその性能を改善するとして言及している）。互いにほぼ等距離にあるクローニング部位を有し、「ヘテロ接合体」を構成する２つのＴＥＲＴ−ＩＤＨブロックが最大限に分離されることを確実にするように、ベクターｐＧＬ３−エンハンサー（Ｐｒｏｍｅｇａ）にこれらをクローニングし、専ら使用した。さらに本発明者らは、陰性対照として、全ての遺伝子座が野生型であり、各遺伝子座の２コピーを有する同等のプラスミドを生成した。このシステムは、目的とする他の変異、例えば、より稀なＩＤＨ１変異及びＩＤＨ２変異に拡張され得る。本発明者らは、他の遺伝子座への拡張を容易にし、選択的直線化を可能にするために、各遺伝子座の周囲に制限酵素部位を導入した。

Ｅ．データ分析
データ分析にはいくつかのオプションが存在する。最も簡単な一つの手法は、全試料を確実に同じ濃度にして、種々の変異割合に応じた標準細胞株ＤＮＡの希釈から生成される傾向線を使用し、突然変異遺伝子画分を逆算することである（図９）。以下に示されるように、傾向線は、優れた直線性を有する（Ｒ^２＞０．９９４）。

種々のＤＮＡ投入量を有する試料の使用に関して、本発明者らは、Ｃｔ値を試料のコピー数の測定値に対して正規化し（非バイアス／共通増幅産物のＣｔ値またはｈｌｉｎｅ１のＣｔ値を使用する）、突然変異遺伝子割合標準物質として陽性対照試料を使用する手法を用いた。（Ｃｔ（サイクル閾値）は、蛍光シグナルが閾値を超える（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）ために必要とされるサイクル数として定義される。このタイプの正規化計算は、さらにプライマー効率の推定も必要とする。ゲノムＤＮＡの希釈に基づいて、本発明者らは、各プライマーの組み合わせに対するプライマー効率を推定した（表１０）。

（表１０）プライマーの組み合わせ及びその効率

三つ組のＣｔ値は、各プライマーセットについて平均化され、プライマー効率値で正規化される。各試料について、ＡＳ変異体プライマーの平均Ｃｔ値は次いで、それぞれの共通（ＮＢ）プライマーセットに関する平均Ｃｔ値で正規化される。以下の（Ｐｆａｆｆｌらによる）式が使用され、式中、Ｅ_ＡＳは、ＡＳ変異体プライマーの組み合わせの効率を指し、対照は、既知の変異割合（この場合５０％）の陽性対照に関する平均Ｃｔ値を指し、試料は、評価される試料に関する平均Ｃｔ値を指す。同じ情報が分母中にあるが、適切なＮＢプライマーセット（例えば、ＴＥＲＴ共通、ＩＤＨ１共通、ｌｉｎｅ１）を参照する全てが正規化に使用される。より正確な値のために、本発明者らは、対照用のＡＳ野生型に対するＡＳ変異体を使用して式を調整することを推奨する。これは突然変異対立遺伝子画分：野生型対立遺伝子画分の比率をもたらし、突然変異対立遺伝子画分単体を得るために調整されてもよい。

これらの手法は、ｇＤＮＡの対立遺伝子特異的ｑＰＣＲ、及び事前増幅され精製されたＰＣＲ産物のネステッドｑＰＣＲの両方に有効である。ネスティングｑＰＣＲに関連して、既知の変異割合の事前増幅されたゲノムＤＮＡも使用し得るが、事前増幅されたヘテロ接合型キャリブレータプラスミドを、各標的変異の５０％を有する高度に正確な標準物質として使用し、基準としてこれに対して正規化することを、本発明者らは推奨する。

Ｆ．性能
上記プライマーセット及び条件を使用して、本発明者らは、高レベルのバックグラウンド下でのこれらのプライマーの検出の限界を試験し、１５，０００の野生型コピーのバックグラウンド下で１５の変異体ゲノムＤＮＡコピー（０．１％）まで確実に検出し、これを０％（野生型）試料と区別することができることを発見した（図１０）。ネステッドｑＰＣＲを使用して、対立遺伝子特異的ＰＣＲで高い判別性も達成することができる（図１１）。

Ｇ．ｑＰＣＲ診断の適用
臨床に関連する状況下で本発明者らのアッセイを試験するために、本発明者らは、サンガー配列決定法を使用して以前に遺伝子型決定された４３の神経膠腫試料からＤＮＡを採取し、この方法を使用してＴＥＲＴプロモーターＷＴ及びＩＤＨ１ Ｒ１３２ ＷＴを識別した。本発明者らは、本発明者らのｑＰＣＲアッセイを使用し、ＴＥＲＴプロモーターＣ２２８Ｔ変異を有する９個の試料及びＩＤＨ１ Ｒ１３２Ｈ変異を有する３個の試料、合計１２個の試料つまり全体の２８％を識別した。いずれも１０％未満の割合を有し、これらは以前、従来の方法では検出不可能であった（表１１）。加えて、このアッセイは、定量的結果を伴って約１時間以内に完了した一方で、サンガー配列決定法では、ＰＣＲの後にさらなる配列決定ステップを伴う。

（表１１）ｑＰＣＲでは検出されるが、サンガー配列決定法では検出されない（偽陰性）低レベルの変異を有するケース

参照文献
引用される各参考文献の開示は、本明細書に明示的に組み込まれる。

Claims (19)

1. 以下の段階を含む、腫瘍を有するヒトの身体試料を試験する方法：
   増幅プライマーのセットを用いて前記ヒトの身体試料の腫瘍ＤＮＡを増幅する段階であって、各プライマーが、少なくとも１つのＴＥＲＴプロモーター配列を含む増幅産物ならびに少なくとも１つのＩＤＨ１配列を含む増幅産物及び少なくとも１つのＩＤＨ２配列を含む増幅産物を生成するための：
   任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号３、６、９、１０、１３、および１４の配列；ならびに
   配列番号１、２、４、５、７、８、１１、および１２の配列；
   から選択される配列からなり、該プライマーが増幅反応で使用される際に、以下からなる対で使用され：
   配列番号１の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号３の配列；
   配列番号２の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号３の配列；
   配列番号４の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号６の配列；
   配列番号５の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号６の配列；
   配列番号７の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号９の配列；
   配列番号８の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号９の配列；
   配列番号１１の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号１３の配列；
   配列番号１２の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号１３の配列；
   任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号３の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号６の配列；
   任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号９の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号１０の配列；ならびに
   任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号１３の配列および任意で配列番号２８および２９から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号１４の配列であり、
   配列番号１、２、４、５、７、８、１１、および１２からなるプライマーが、その３’末端に修飾ＬＮＡヌクレオチドを含む、増幅する段階と、
   前記増幅産物を検出する段階。
2. 配列番号１５〜２１の配列を含む増幅プライマーのセットを用いて前記身体試料中の腫瘍ＤＮＡを増幅する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記腫瘍ＤＮＡがゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
4. 前記腫瘍ＤＮＡが、事前増幅に供されたゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
5. 前記増幅のサイクルの少なくとも一部が、６６℃以上で行われる、請求項１に記載の方法。
6. 前記増幅の前記サイクルの一部が、６０℃以下で行われる、請求項５に記載の方法。
7. 前記身体試料の前記腫瘍ＤＮＡの別個のアリコートが、（ａ）配列番号１〜３、（ｂ）配列番号４〜６、（ｃ）配列番号３及び６、（ｄ）配列番号７〜９、（ｅ）配列番号９及び１０、（ｆ）配列番号１１〜１３、および（ｇ）配列番号１３〜１４の配列を含む、プライマーの複数のセットを用いて増幅される、請求項１に記載の方法。
8. 前記増幅が定量的ＰＣＲとして実施される、請求項１に記載の方法。
9. 前記事前増幅が、高忠実度のＤＮＡポリメラーゼを用いる、請求項４に記載の方法。
10. 前記事前増幅が、６６℃以上のアニーリング温度を用いる、請求項４に記載の方法。
11. 前記事前増幅が、６８℃以上のアニーリング温度を用いる、請求項４に記載の方法。
12. 前記事前増幅が、多重反応として行われる、請求項４に記載の方法。
13. 前記身体試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液、及び涙からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
14. 前記身体試料が生検試料である、請求項１に記載の方法。
15. 前記身体試料が針吸引物である、請求項１に記載の方法。
16. 配列番号１５〜２１の配列を含む前記プライマーのうちの少なくとも１つが、その３’末端にＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
17. 配列番号１５〜２１の配列を含む前記プライマーの各々が、その３’末端にＬＮＡ修飾ヌクレオチドを含む、請求項２に記載の方法。
18. 前記タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも１つの５’末端に位置している、請求項１に記載の方法。
19. 前記タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも１つの５’末端に位置している、請求項２に記載の方法。

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