JP6453781B2

JP6453781B2 - ヒトｐｉ３ｋｃａ（ｐｉｋ３ｃａ）遺伝子変異検出のための方法及び組成物

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Publication number: JP6453781B2
Application number: JP2015562104A
Authority: JP
Inventors: ツァンアリソン
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
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Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2019-01-16
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Description

本発明は、癌治療のための癌診断及びコンパニオン診断薬に関する。特に、本発明は、癌の診断、予後、並びに治療の効果的な予測に有用な変異の検出のための方法及び組成物に関する。

フォスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋｓ）は、細胞増殖を制御するシグナル経路、生存、接着及び運動性を調整する細胞内脂質キナーゼである（ＶｉｖａｎｃｏａｎｄＳａｗｙｅｒｓ，（２００２）Ｔｈｅｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ＫｉｎａｓｅＡＫＴｐａｔｈｗａｙｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒ，ＮａｔｕｒｅＲｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ２：４８９）。ＰＩ３ＫＣＡ（ＰＩＫ３ＣＡ）はＰＩ３Ｋ遺伝子ファミリーのメンバーであり、キナーゼｐ１１０αの触媒サブユニットをコードしている。この遺伝子は、調べられた全てのＰＩ３Ｋ遺伝子の中で、腫瘍に関連している固有の遺伝子であり、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子だけが、複数の癌において変異を有することが認められた。ある研究では、ＰＩ３ＫＣ遺伝子の体細胞突然変異が、３２％の結腸癌、２７％のグリオブラストーマ、２５％の胃癌、８％の乳癌、そして４％の肺癌で見出された（Ｓａｍｕｅｌｓｅｔａｌ．（２００４）ＨｉｇｈｆｒｅｑｕｅｎｃｙｏｆｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＰＩ３ＫＣＡｇｅｎｅｉｎｈｕｍａｎｃａｎｃｅｒｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０４：５５４）。後の研究で、子宮癌（２４％）、卵巣癌（１０％）、そして子宮頸癌（１０％）における突然変異も報告されている（ＢｒａｎａａｎｄＳｕｉ，（２０１２）Ｃｌｉｎｉｃａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ＢＭＣＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１２，１０：１６１）。

ＰＩ３Ｋは、Ａｋｔタンパク質の特異的な活性化によって、細胞内Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路に働きかける。遺伝学的アプローチにより、変異型ＰＩ３ＫＣＡによるこの経路の恒常的活性化が、ＥＧＦＲ標的療法に対して耐性化することに貢献していることが明らかにされた（Ｂｅｒｎｓｅｔａｌ．（２００７）ＡｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｔｈｅＰＩ３Ｋｐａｔｈｗａｙａｓａｍａｊｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｏｆｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ１２：３９５）。時を同じくして、無変化（非変異型）のＰＩ３ＫＣＡの活性が、特異的な阻害剤によって抑制され、これにより、経路上で調整不全となっている上流因子（例えば、ＥＧＦＲ）の影響を乗り越えることが証明され、近年、ＰＩ３ＫＣＡ（ｐ１１０α）それ自体を標的とする治療薬が開発されている（Ｗｅｉｃｋｈａｒｄｔら（２０１０）が総説を開示している。ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＯｖｅｒｃｏｍｉｎｇＩｎｈｅｒｅｎｔａｎｄＡｃｑｕｉｒｅｄＲｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＥＧＦＲＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓｂｙＴａｒｇｅｔｉｎｇＤｏｗｎｓｔｒｅａｍＥｆｆｅｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅＲＡＳ／ＰＩ３ＫＰａｔｈｗａｙ，ＣｕｒｒｅｎｔＣａｎｃｅｒＤｒｕｇＴａｒｇｅｔｓ，１０：８２４；ａｎｄＢｒａｎａａｎｄＳｕｉ，（２０１２）Ｃｌｉｎｉｃａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ３−ｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ＢＭＣＭｅｄｉｃｉｎｅ２０１２，１０：１６１）。

まとめると、これらの研究は、標的の癌の治療を探している患者に、個別化医療を届けるために、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子における体細胞突然変異を検出する方法及びツールの必要性を証明している。

これまでのところ、ＰＩ３ＫＣＡにおける３０の体細胞突然変異が同定されている（米国特許番号８，０２６，０５３）。突然変異の大部分は、エクソン９及びエクソン２０に密集している。しかしながら、臨床的に有意な突然変異の多くは、エクソン１、４及び７において報告されている。診断検査は、できるだけこれらの突然変異の多くを標的とすべきである。さらに、検査の結果は患者の癌治療の方針を決定するので、正確な識別（高い特異性）が必要とされている。

本発明は、ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子における変異Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋのそれぞれを検出するためのオリゴヌクレオチドを含むものであって、配列番号：２，１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９の１つと少なくとも９０％同一、かつ、該配列の３’末端ヌクレオチドを有する。

他の実施態様において、本発明は、ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中の１又は２以上の変異Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋの存在についてサンプルをアッセイする方法であって、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８、２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、該オリゴヌクレオチドと同一の３−末端ヌクレオチドを有するそれぞれの変異に対する１つの対立遺伝子特異的ヌクレオチドオリゴヌクレオチドと、該サンプルとを接触することを含む。本実施形態の変形において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８からなる群から選択される。

さらに他の実施形態において、本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中の１又は２以上の変異Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋを検出するオリゴヌクレオチドのセットであって、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９と少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、同一の３−末端ヌクレオチドを有する２又は３以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせを含む。本実施形態の変形において、ヌクレオチドは、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される。

さらに他の実施形態において、本発明は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中の１又は２以上の変異Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋを検出するための反応混合物であって、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８、２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、同一の３−末端ヌクレオチドを有する、それぞれの突然変異に対する１つの対立遺伝子特異的ヌクレオチドを含む。本実施形態の変形において、反応混合物は、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８を含む。

さらに他の実施形態において、本発明は、患者サンプルにおけるＰＩＫ３ＣＡ遺伝子中の１又は２以上の変異Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋを検出することによって、患者の癌を評価するための方法であって、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８、２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有する、及び同一の３−末端ヌクレオチドを有するそれぞれの突然変異に対する１つの対立遺伝子特異的ヌクレオチドを使用する。

発明の詳細な説明
定義
本開示するところの理解を促進するために、以下、ここで使用される用語の定義を提供する。

用語「Ｘ[ｎ]Ｙ」とは、アミノ酸配列中の位置[ｎ]において、アミノ酸Ｘがアミノ酸Ｙへ置換したミスセンス変異を意味している。例えば、用語「Ｈ１０４７Ｒ」とは、位置１０４７のヒスチジンがアルギニンへ置換された変異を意味している。

用語「対立遺伝子特異的プライマー」又は「ＡＳプライマー」とは、標的配列の１又は２以上の変異体にハイブリダイズするプライマーを意味するが、標的配列の多数の変異体から変異体の１つを区別することが可能であり、該プライマーは、最適な条件下で核酸ポリメラーゼによって効率的に伸長する。標的配列の他の変異体を用いた場合、伸長効果が低いか、又は非効率となる。

用語「共通プライマー」とは、対立遺伝子特異的プライマーを含むプライマーのペアにおける第二プライマーを意味する。共通プライマーは、対立遺伝子特異的ではなく、つまり、対立遺伝子特異的プライマーが区別する標的配列の変異体を区別しない。

癌に関連した用語「評価」とは、癌の状態や条件を推測することを意味するだけでなく、診断手順又は治療の必要性を決定すること、治療の潜在的な効果を評価すること、被験者の癌を観察すること、又は、癌の治療若しくは診断に関連した他の工程若しくは手順をも意味する。

用語「相補的」又は「相補性」とは、ワトソン−クリック塩基ペア法則に関連したポリヌクレオチドの逆並行鎖に関して使用される。用語「完全相補的」又は「１００％相補的」とは、逆並行鎖間の全ての塩基が、ワトソン−クリックペアの相補配列であることを意味しており、つまり、ポリヌクレオチド二本鎖の二つの塩基間でミスマッチが無いことを意味している。しかしながら、完全相補性でなくても、二本鎖は逆並行鎖間で形成される。用語「部分的相補性」又は「不完全相補性」とは、１００％完全に満たない逆並行ポリヌクレオチド鎖間の塩基のアライメントを意味する（例えば、ポリヌクレオチド二本鎖において少なくとも１つのミスマッチ又はマッチしない塩基が存在すること）。完全相補鎖の二本鎖よりも、部分的相補鎖の二重鎖は一般的に安定性が低い。

用語「サンプル」とは、核酸を含む、又は、含むと推定された組成物を意味する。これは、組織のサンプル、又は個人から単離された液体を含み、例えば、皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血液細胞、臓器及び腫瘍であり、個人から採取した細胞で樹立したin vitro培養のサンプルも含み、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）及びそれから単離した核酸を含む。体細胞突然変異を検出するために、サンプルは、一般的に、固形癌（初期又は転移性）の断片、又は、体内、例えば、循環している血液等の別の場所で見出された腫瘍由来細胞を含む。

用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」とは、互換的に使用される。「オリゴヌクレオチド」は、時折、より短いポリヌクレオチドを記述するために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、所望のヌクレオチド配列の領域に一致する少なくとも６ヌクレオチド、例えば、少なくとも約１０−１２ヌクレオチド、又は少なくとも約１５−３０ヌクレオチドで構成されてもよい。

用語「主要配列（ｐｒｉｍａｒｙｓｅｑｕｅｎｃｅ)」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチドの配列を意味する。窒素性塩基修飾、糖修飾、又は他の骨格修飾のようなヌクレオチド修飾は主要配列の一部ではない。オリゴヌクレオチドに結合させる発色団のような標識もまた、主要配列の一部ではない。このように、２つのオリゴヌクレオチドは同じ主要配列を共有することができるが、修飾や標識に関しては異なる。

用語「プライマー」とは、標的核酸における配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味し、合成に最適な条件下で核酸の相補鎖に沿った合成の開始部位として働くことが出来る。本明細書で使用される用語「プローブ」とは、標的配列とハイブリダイズし、一般には検出可能な標識がなされたオリゴヌクレオチドを意味する。プローブは、核酸ポリメラーゼで伸長できなくするような３’末端の修飾や、１又は２以上の発色団のような、修飾を有することが可能である。同一配列のオリゴヌクレオチドは、あるアッセイではプライマーとして働いてもよく、他のアッセイではプローブとして働いてもよい。

用語「修飾ヌクレオチド」とは、修飾された塩基、糖、リン酸基を含む核酸ポリマーの単位を意味し、又は、その構造では非天然成分を取り込んだ核酸ポリマーの単位を意味する。非天然核酸の例としては、修飾された窒素性塩基、例えば、アルキル化、又はワトソン−クリックペアリングに関与する従来の窒素性塩基には存在しない他の置換基、を含む。説明される又は説明されていない方法によって、修飾ヌクレオチドは、メチル基、エチル基、ベンジル基、又はブチル−ベンジル基と置換した塩基を含んでいる。

本明細書で使用される、用語「標的配列」、「標的核酸」又は「標的」とは、増幅される、検出される、又はその両方の核酸配列の部分を意味する。

用語「ハイブリダイズされた」及び「ハイブリダイゼーション」とは、２つの核酸間で塩基ペア相互作用がおこり、その結果、二本鎖を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションするために、全長にわたって２つの核酸が１００％相補性を有することは必要としない。

本発明は、患者のサンプル中のＰＩ３ＫＣＡ遺伝子中の１又は２以上の変異の存在を、迅速及び正確に決定するための方法及び組成物を含む。本発明は、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋから選択される変異の検出を可能とするだけでなく、上で挙げた変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の同時クエリも可能とする。

多重化に対して感受性があり、受け入れられる１つの技術としては、米国特許番号６，６２７，４０２に記載された対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ＡＳ−ＰＣＲ）が挙げられる。当該技術は、配列の野生型変異体を有する核酸配列中の変異又は遺伝子多型を検出する。成功した対立遺伝子特異的ＰＣＲでは、標的核酸の所望の変異体が増幅され、一方で他の変異体は増幅されず、少なくとも検出レベルに達しない。

対立遺伝子特異的ＰＣＲの識別の１つの方法は、２つの対立遺伝子を含む増幅反応中のＣ_t値（ΔＣ_t）の違いである。核酸増幅アッセイの文脈において、「成長曲線」又は「増幅曲線」によって特徴づけられるそれぞれの増幅反応は関数グラフであり、そこで、独立変数は増幅サイクルの数であり、従属変数は、発光体によって発光する蛍光のような、それぞれの増幅サイクルで測定される増幅依存的測定可能パラメータである。一般的に、増幅依存的測定可能パラメータとは、ハイブリダイゼーションした時、又は核酸ポリメラーゼのヌクレアーゼ化活性によるプローブの加水分解時のプローブによって発光する蛍光量であって、以下を参照する。Ｈｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：７２７６−７２８０及び米国特許番号５，２１０，０１５。成長曲線は「閾値」（又はＣ_t値）によって特徴づけられるものであって、それは、測定可能パラメータの予め決定されたマグニチュードが得られたサイクル数である。低いＣ_t値は、より迅速な増幅を意味し、一方で高いＣ_t値は遅い増幅を意味する。対立遺伝子特異的反応の文脈において、２つのテンプレートのＣ_t値の違いは、反応における対立遺伝子識別を表している。

対立遺伝子特異的ＰＣＲにおいて、配列の特異的変異体が存在するときはプライマー伸長のみが（又は優先的に）起こり、そして他の変異体が存在するときはプライマー伸長が起こらない（又は、起こる効率が低い、つまり、実質的ΔＣｔである）ように、少なくとも１つのプライマーは対立遺伝子特異的である。成功する対立遺伝子特異的プライマーのデザインは、予測できない技術である。既知の配列に対するプライマーをデザインすることは定型である一方、非常に類似した配列を識別できるプライマーをデザインする慣習的な方法は存在しない。同一反応混合物中に１又は２以上の多型部位を標的とする１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーが存在するとき、識別は特にチャレンジングである。

一般的に、プライマー中のおける識別するヌクレオチド、つまり、標的配列のたった１つの変異体と一致するヌクレオチドは、３’末端のヌクレオチドである。しかしながら、プライマーの３’末端は、特異性の決定因子の多くの１つにすぎない。例えば、追加的なミスマッチもまた識別に影響を与えうる（米国特許出願公開番号ＵＳ２０１０００９９１１０参照）。他のアプローチは、プライマーと標的配列の間の塩基ペアリングを変える非天然型又は修飾ヌクレオチドを含むことである（米国特許番号６，００１，６１１）。プライマーの減少した伸長反応速度やこのようなプライマーの特異性は、ミスマッチの全長配列コンテクストを含む多くの因子や、反応中に存在する他の核酸によって影響される。それぞれの追加的なミスマッチのみならず、それぞれの追加的な非天然型ヌクレオチド単独、またはその組み合わせにおけるこれらの外部因子の効果は予測不可能である。出願人らは、プライマーの様々な変異体を試験し、驚くべきことに、近縁の標的配列間において、ある変異体は、識別する能力に関して劇的に異なることを見出した。

プライマーの伸長の成功のためには、プライマーの３’末端における相補性が、プライマーの５’末における相補性よりも、より重要である（Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．Ｅｄｓ．ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，（１９９０）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ１，ｐｐ．９−１１）。それゆえ、本発明は、表１〜１３に開示されたプライマーだけでなく、５’末変異体を有するその同等物も包含するものである。

一実施形態において、本発明は、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋから選択されるＰＩ３ＫＣＡ変異の検出、並びに、上述の変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の同時クエリのためのオリゴヌクレオチドを含む。一実施形態において、本発明は、ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子における変異を特異的に検出するために、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９（表１〜１３）から選択されるオリゴヌクレオチド、並びに、該オリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一かつ、該ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを有する変異体、を含む。表１〜１３で記載されるように、与えられたヌクレオチドと９０％同一性を共有するオリゴヌクレオチドは、該ヌクレオチドと１、２又は３つのミスマッチを有することを含む。表１〜１３でさらに記載されるように、与えられたオリゴヌクレオチドと９０％同一性を共有するオリゴヌクレオチドもまた、１又は２以上の非天然型ヌクレオチドを有することを含む。表１〜１３でさらに記載されるように、ミスマッチ及び非天然型ヌクレオチドは、一般的にはオリゴヌクレオチドの３’末端部分、特に最後から２番目の５ヌクレオチド内で生じる。しかしながら、与えられたヌクレオチドと９０％同一性を共有するオリゴヌクレオチドの中には、オリゴヌクレオチドの他の部位、例えばオリゴヌクレオチドの５’部位、の１、２又は３つのミスマッチを有するものも含んでいる。以下の実施例で証明するように、本発明のオリゴヌクレオチドは、公式 ΔＣ_t＝Ｃ_t（野生型）−Ｃ_t（変異体）を用いることで決定された実質的にポジティブΔＣｔによって特徴づけられ、それは、野生型の鋳型の増幅は、変異体の鋳型の増幅よりもより遅く検出可能であることを示唆している。

表の説明
下線を引いたヌクレオチドは野生型及び変異型の配列の両方とミスマッチである。以下の略語は、修飾塩基ヌクレオチドとして使用された：Ａ^*及びＣ^*は、それぞれＮ６−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル−デオキシアデニン、Ｎ４−ｔｅｒｔ−ブチル−ベンジル−デオキシシトシンである。Ｃ^は、Ｎ４−エチル−デオキシシトシン、Ｃ^#はＮ４−メチル−デオキシシトシンである。

本発明の一実施形態は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のコドン１０４２と１０５０の間の１又は２以上のヌクレオチド位置における変異を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドは配列番号：２、１８、３９、２０８、２１９からなる群から選択される配列の１又は２以上と少なくとも９０％同一であり、かつ、該配列の３’末端ヌクレオチドを有する。該オリゴヌクレオチドは、３’末端のヌクレオチド及び／又は３’末端の最後から２番目の５ヌクレオチドにおいて少なくとも１つのミスマッチを有することを除いて、該１つの配列と３又はそれ以下のミスマッチを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、３’末端の最後の５ヌクレオチドにおいて少なくとも１つの修飾ヌクレオチドをさらに含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、Ｍ１０４３Ｉ、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ及び／又はＨ１０４９Ｒの１又は２以上の変異を検出するために、とりわけ最適である。

本発明の他の実施形態は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＮ３４５Ｋ変異を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号：６１と少なくとも９０％同一であり、かつ、配列番号：６１の３’末端ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチド及び／又は３’末端の最後から２番目の５ヌクレオチドにおいて少なくとも１つのミスマッチを有することを除いて、配列番号：６１と３又はそれ以下のミスマッチを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、３’末端の最後の５ヌクレオチドにおいて少なくとも１つ修飾されたヌクレオチドをさらに含んでもよい。

本発明の別の実施形態は、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のコドン５４１及び５４７の間の１又は２以上のヌクレオチド位置における変異を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号：８４、９９、１２６、１４８、１６８及び１９７からなる群から選択される１又は２以上の配列と少なくとも９０％同一であり、かつ、該配列の３’末端ヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチド及び／又は３’末端の最後から２番目の５ヌクレオチドにおいて、少なくとも１つのミスマッチを除き、該配列の１つと３又はそれ以下のミスマッチを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは３’末端の最後の４ヌクレオチドにおいて、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドをさらに含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｑ５４６Ｋ、Ｑ５４６Ｌ及び／又はＱ５４６Ｅの１又は２以上の変異を検出するために、とりわけ最適である。

他の実施形態において、本発明は、ヒトＰＩ３ＫＣＡ（ＰＩＫ３ＣＡ）遺伝子におけるＨ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋから選択される変異を検出する診断、並びに、上述の変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又は１３の同時クエリの方法であって、配列番号：２、１８、３９、６１、８４，９９、１２６、１４８、１６８、１８５、１９７、２０８、２１９又は該オリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一かつ該ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを有する変異体から選択されるオリゴヌクレオチドを利用する方法である。本発明の変形において、方法は、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチドを使用することを含む。方法は、対応する下流プライマー及び検出プローブの存在下、核酸を含むテストサンプルと、１又は２以上のオリゴヌクレオチドを接触させることを含む。有利には、近接した位置の変異の検出は、単一反応で実施することができる。いくつかの実施形態においては、単一反応は、２又は３以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、例えば、配列番号：８、２１及び４６等を含み、単一下流プライマー及び検出プローブと共に１つの反応混合物で併用できる。同様に、単一反応は、単一下流プライマー及び単一検出プローブと共に１つの反応混合物中で併用可能である配列番号：９３、１１３、１４１、１６６、１７０及び１９９の２又は３以上を含んでいてもよい。方法は、ＰＩ３ＫＣＡ変異がサンプル中に存在するときにだけ、１又は２以上の対立遺伝子特異的プライマーが効率的に伸長されるように、対応する下流プライマー（つまり、指数関数的に増幅するように標的核酸の反対鎖にハイブリダイズすることができるプライマー）の存在下、１又は２以上のオリゴヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸及び核酸ポリメラーゼと、核酸を含むテストサンプルとを接触させ、そして、プライマー伸長の有無を検出して直接的、又は間接的にＰＩ３ＫＣＡ変異の有無を検出することを含む。

特別の実施形態において、プライマー伸長の存在はプローブによって検出される。プローブは、放射性、又は発色団（蛍光体）標識、例えば、ＦＡＭ，ＪＡ２７０、ＣＹ５ファミリー色素、又はＨＥＸ色素を含む標識でラベルされてもよい。蛍光体標識プローブを利用する検出の１つの例としては、変異はリアルタイムポリメラーゼチェーン反応（ｒｔ−ＰＣＲ）によって検出されてもよく、プローブがハイブリダイゼーションした結果、プローブの酵素消化がおこり、その結果として蛍光を検出する（ＴａｑＭａｎ^TM プローブ法、Ｈｏｌｌａｎｄｅｔａｌ．（１９９１）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ８８：７２７６−７２８０）等である。あるいは、伸長産物及び増幅産物の存在を、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄＲｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．Ｗ．（２００１）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄｅｄ．ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ５ａｎｄ９に記載されているように、電気泳動した後に染色、又は、ブロッティングしてハイブリダイゼーションすることによって検出してもよい。

他の実施形態において、本発明は、変異ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子を備える可能性のある腫瘍細胞を有する患者を治療する方法である。方法は、患者由来のサンプルと、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００（９９）、１２７（１２６）、１４８、１７０（１６８）、１８５、１９７、２０８、２１９又は該オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％同一かつ該ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを有する変異体から選択される、１又は２以上のオリゴヌクレオチドとを、対応する二次プライマー、又は複数のプライマーの存在の下で接触させて、対立遺伝子特異的増幅を誘導し、プライマー伸長の有無を検出することでＰＩ３ＫＣＡ変異の有無を検出すること、並びに、少なくとも１つの変異が見つけられた場合、又は見つけられなかった場合、該患者に適切な治療投薬計画を受けさせること、を含んでいる。いくつかの実施形態において、治療は、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子がコードするタンパク質（ｐ１１０−アルファタンパク質）の阻害剤を投与することを含む。他の実施形態において、治療は、ＰＩ３ＫＣＡ変異が検出されなかった場合は、経路の上流タンパク質、例えば、ＥＧＦＲ等の阻害剤を投与することを含み、変異が検出された場合は代わりとなる治療を実施することを含んでいる。本実施形態の変形において、方法は、患者由来のサンプルと、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチドとを接触することを含む。

さらに別の実施形態において、本発明は、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子の変異、特に、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋから選択される変異の検出、並びに、上述の変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の同時クエリのための試薬を含むキットである。試薬は、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００（９９）、１２７（１２６）、１４８、１７０（１６８）、１８５、１９７、２０８、２１９、又は該オリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一、かつ、該オリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを有する変異体から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチド、１又は２以上の対応する二次プライマー、及び付加的な１又は２以上のプローブとを含む。本実施形態の変形において、試薬は、配列番号：１１、３２、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチドを含む。キットは、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及びポリメラーゼの作用に必要な緩衝液等、増幅の遂行や検出アッセイに必要な試薬をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、プローブは検出可能であるように標識される。このような実施形態において、キットは、標識するための、及び、標識を検出するための試薬を含んでもよい。

さらに他の実施形態において、本発明は、ＰＩ３ＫＣ遺伝子の変異、特にＨ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋから選択される変異の検出、並びに、上述の変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の同時クエリのための反応混合物である。混合物は、配列番号：２、１８、３９、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８、２１９、又は該オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％同一かつ該ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを有する変異体から選択される、１又は２以上のオリゴヌクレオチド、１又は２以上の対応する二次プライマー、及び追加的に１又は２以上のプローブを含む。本実施形態の変形において、反応混合物は、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される１又は２以上のオリゴヌクレオチドを含む。反応混合物は、ヌクレオシド三リン酸、核酸ポリメラーゼ、及びポリメラーゼの作用に必要な緩衝液等の試薬をさらに含んでもよい。

さらに別の実施形態において、本発明は、患者サンプルにおいて、ＰＩ３ＫＣＡ遺伝子の変異、特に、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｈ１０４７Ｙ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋから選択される変異の検出、並びに、上述の変異の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の同時クエリによって、患者の癌を評価する方法であって、それぞれの変異に対し、配列番号：２、１８、３９、６１、８４，９９、１２６、１４８、１６８、１８５、１９７、２０８、２１９、又は該オリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一かつ該ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドを有する変異体、から選択されるオリゴヌクレオチドを使用する方法である。本実施形態の変形において、オリゴヌクレオチドは、配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される。

代表的な反応条件
以下の実施例全てにおいて、以下の反応条件を使用した。それぞれの反応では、１０⁴コピーの変異体鋳型又は野生型ＤＮＡ鋳型、０．１μＭの選択プライマー及び共通プライマー、検出プローブ、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ及び最適なＤＮＡポリメラーゼ緩衝液を含む。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０機器（ロッシュモレキュラーダイアグノスティクス、インディアナポリス、Ｉｎｄ.）におけるサーマルサイクリングプロファイルに従って、反応を実施した。：５０℃にて５分の反応後、９５℃（１０秒）→６２℃（３０秒）を２サイクル、９３℃（１０秒）→６２℃（３０秒）を６５サイクル。蛍光データは、６２℃のそれぞれの工程の初めに収集した。それぞれの反応のＣ_t値はΔＣ_t値を計算するために使用した。平均Ｃ_t及び標準偏差はそれぞれの例で示している。

実施例１
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＨ１０４７Ｌ変異検出のためのプライマーの性能

実施例２
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＨ１０４７Ｒ変異検出のためのプライマーの性能

実施例３
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＨ１０４７Ｙ変異検出のためのプライマーの性能

実施例１
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＮ３４５Ｋ変異検出のためのプライマーの性能

実施例５
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＥ５４２Ｋ変異検出のためのプライマーの性能

実施例６
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＥ５４５Ａ変異検出のためのプライマーの性能

実施例７
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＥ５４５Ｇ変異検出のためのプライマーの性能

実施例８
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＥ５４５Ｋ変異検出のためのプライマーの性能

実施例９
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＱ５４６Ｋ変異検出のためのプライマーの性能

実施例１０
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＱ５４６Ｅ変異検出のためのプライマーの性能

実施例１１
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＱ５４６Ｌ変異検出のためのプライマーの性能

実施例１２
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＧ１０４９Ｒ変異検出のためのプライマーの性能

実施例１３
ヒトＰＩ３ＫＣＡ遺伝子におけるＭ１０４３Ｉ変異検出のためのプライマーの性能

本発明は、特定の実施例に関して詳細に記述されているが、当業者にとって、本発明の範囲内で様々な改変ができることは明らかである。このように、本発明の範囲は、本明細書に記載される例によって限定されず、しかし、以下で挙げられたクレームによって限定される。

Claims

配列番号：３９の配列と少なくとも９０％同一、かつ、前記配列の３’末端ヌクレオチドを有する、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子におけるＨ１０４７Ｙ変異を検出するためのオリゴヌクレオチドであって、前記オリゴヌクレオチドが３’末端ヌクレオチドを除いて３個以下のミスマッチを含み、ここで、少なくとも１つのミスマッチが、３’末端の最後から２番目の５ヌクレオチド内に含まれる、又は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、３’末端の最後の５ヌクレオチド内に含まれる、オリゴヌクレオチド。
ヒトＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＨ１０４７Ｙ変異の存在についてサンプルをアッセイする方法であって、配列番号：３９を含むオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、前記ヌクレオチドと同一の３’末端ヌクレオチドを有する１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドと、前記サンプルとを接触させることを含む方法であって、
ここで、前記オリゴヌクレオチドが、３’末端ヌクレオチドを除いて３個以下のミスマッチを含み、少なくとも１つのミスマッチが、３’末端の最後から２番目の５ヌクレオチド内に含まれる、又は少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、３’末端の最後の５ヌクレオチド内に含まれる、方法。
オリゴヌクレオチドが、配列番号：４６である、請求項２に記載の方法。
配列番号：２、１８、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、前記オリゴヌクレオチドと同一の３’末端ヌクレオチドを有し、Ｈ１０４７Ｙ以外の各変異に対する、少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２又は３に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：８、２１、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８から選択される、請求項４に記載の方法。
２又は３以上のオリゴヌクレオチドの組み合わせを含む、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＨ１０４７Ｙ変異と、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋの１又は２以上の変異とを検出するためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
ここで、１つのオリゴヌクレオチドが、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと同一であり、Ｈ１０４７Ｙ以外の各変異に対する少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号：２、１８、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、前記配列と同一の３’末端ヌクレオチドを有する、オリゴヌクレオチドのセット。
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：４６であり、及び／又は、前記対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号：８、２１、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８からなる群から選択される、請求項６に記載のセット。
配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８を含む、請求項６に記載のセット。
ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＨ１０４７Ｙ変異と、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋの１又は２以上の変異とを検出するための反応混合物であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと同一の１つのオリゴヌクレオチドと、配列番号：２、１８、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、前記配列と同一の３’末端ヌクレオチドを有する、Ｈ１０４７Ｙ以外の各変異に対する少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとを含む、反応混合物。
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：４６であり、及び／又は、前記対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号：８、２１、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８からなる群から選択される、請求項９に記載の反応混合物。
配列番号：８、２１、４６、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８を含む、請求項９に記載の反応混合物。
患者のサンプルにおいて、ＰＩＫ３ＣＡ遺伝子のＨ１０４７Ｙ変異と、Ｈ１０４７Ｌ、Ｈ１０４７Ｒ、Ｎ３４５Ｋ、Ｅ５４２Ｋ、Ｅ５４５Ａ、Ｅ５４５Ｇ、Ｅ５４５Ｋ、Ｇ１０４９Ｒ、Ｍ１０４３Ｉ、Ｑ５４６Ｅ、Ｑ５４６Ｌ及びＱ５４６Ｋの１又は２以上の変異とを検出することによって前記患者の癌を評価する方法であって、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと同一の１つのオリゴヌクレオチドと、配列番号：２、１８、６１、８４、１００、１２７、１４８、１７０、１８５、１９７、２０８及び２１９からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドと少なくとも９０％同一性を共有し、かつ、前記配列と同一の３’末端ヌクレオチドを有する、Ｈ１０４７Ｙ以外の各変異に対する１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとを、前記サンプルに接触させることを含む、方法。
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号：４６であり、及び／又は、前記対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドが、配列番号：８、２１、７８、９３、１１３、１４１、１６６、１７０、１９４、１９９、２１７及び２２８からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。