WO2016103727A1 - 特異的核酸配列の増幅促進方法 - Google Patents

特異的核酸配列の増幅促進方法 Download PDF

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WO2016103727A1
WO2016103727A1 PCT/JP2015/006467 JP2015006467W WO2016103727A1 WO 2016103727 A1 WO2016103727 A1 WO 2016103727A1 JP 2015006467 W JP2015006467 W JP 2015006467W WO 2016103727 A1 WO2016103727 A1 WO 2016103727A1
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nucleic acid
seq
ras
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acid region
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朋子 國富
史朗 北野
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凸版印刷株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for promoting amplification efficiency of a target gene by PCR (polymerase chain reaction) or the like for detecting a minute amount of a target gene mutation in a sample.
  • the present invention includes a kit for use in the above method and a method for detecting a mutation in the gene product of the target gene amplified by the above method.
  • ccfDNA circulating free DNA
  • the ccfDNA is DNA that is released with the contents of the cell and flows into the blood when the cell dies in the body.
  • the contents of cells released when normal cells die are usually captured and digested by phagocytic cells such as macrophages, but DNA that could not be digested flows into the blood as ccfDNA.
  • the genomic DNA derived from cancer cells that phagocytic cells could not be digested is undigested from normal cells. It flows in the bloodstream as ccfDNA along with genomic DNA.
  • cfDNA DNA derived from cells flowing into blood
  • ccfDNA DNA derived from cells flowing into blood
  • ccfDNA DNA derived from cells flowing into blood
  • ccfDNA DNA derived from cells flowing into blood
  • cancer By collecting blood regularly from subjects and tracking cancer-related gene mutations in ccfDNA derived from cancer cells, cancer can be detected at an early stage, or the effects of treatment on cancer can be confirmed. Relapse and / or recurrence of cancer can be detected early. In recent years, research and development have been actively conducted to utilize these possibilities of ccfDNA for clinical examination in the treatment of lung cancer and / or colorectal cancer.
  • molecular target drugs for cancer treatment for example, gefetinib (Iressa (registered trademark)) and panitumumab (Vectibix (registered trademark) are known.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • ATP ATP
  • EGFR autophosphorylation is blocked, signal transmission from EGFR is indirectly blocked, and apoptosis of cancer cells is induced.
  • K-RAS Non-cited literature 1: Diaz, LA Jr et al. Nature 486, 537-540 (2012)).
  • T790M of the EGFR gene is monitored as a factor predicting drug resistance after administration of gefetinib (Iressa), and in colorectal cancer, mutations such as codons 12, 13, 61 of K-RAS are caused by cetuximab ( After administration of Arbitux), it is observed as a slight variation in the blood.
  • cancer-related genes appear as signs of cancer earlier than those detected by gastrointestinal tumor markers known as CEA and CA-19-9. It has been pointed out that detecting mutations in cancer-related genes is useful for early detection of cancer.
  • the ratio of ccfDNA having a cancer-related gene mutation in the total ccfDNA in the sample is very wide, from 0.01% to 50%.
  • a highly sensitive gene analysis method is required.
  • PNA peptide nucleic acid
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • a purine ring or pyrimidine ring corresponding to a nucleobase in DNA or the like is bonded to the main chain via a methylene group and a carbonyl group in PNA.
  • PNA performs molecular recognition similar to DNA.
  • the PNA / DNA duplex forms a stronger bond than the DNA / DNA duplex.
  • DNA polymerase used in the PCR method used in genetic testing have low fidelity depending on the type and reaction conditions, and therefore differ from the desired template sequence when extended by DNA polymerase. Bases may be inserted.
  • the accuracy of DNA polymerase varies depending on the type of polymerase. For example, the mutation frequency of DNA polymerase is 5.1% for Taq polymerase and 5.1% or less for proofreading polymerases having other correction functions.
  • Non-patent Document 2 DNA polymerase with a proofreading function
  • GMP grade ones used for development in the medical and / or pharmaceutical fields are less in number than ordinary Taq polymerases.
  • Taq DNA polymerase has the above-mentioned accuracy problems, but has the advantages of being inexpensive, stable in product quality, and license-free.
  • JP 2012-135290 A International Publication No. 2012/002477 European Patent Application Publication No. 0332435
  • An object of the present invention is to improve a method for amplifying a region containing a slight amount of target gene nucleic acid mutation using artificial nucleic acids such as Taq polymerase and PNA, which are inexpensive, stable in production quality, and can be used free of licenses. And Furthermore, the present invention also reduces false positives in genetic mutation tests used for testing for cancer and the like, and dramatically increases the percentage of target mutations after nucleic acid amplification by the improved method. It is an object to provide a method.
  • the present inventors can dramatically increase the proportion of mutants that are target gene nucleic acids by inhibiting the amplification of wild-type gene nucleic acids with artificial nucleic acids. I found. Furthermore, by reducing the concentration of the four types of deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) used in the nucleic acid amplification process, that is, lower than the concentration used in the normal nucleic acid amplification process, It has been found that the amplification efficiency of the target gene nucleic acid is maintained or improved, and errors that cause false positives are reduced.
  • dATP deoxyribonucleotide triphosphate
  • the present inventor reduces the error due to DNA polymerase by clamping the nucleic acid sequence of the wild-type gene with an artificial nucleic acid in a normal nucleic acid amplification reaction, and reducing the dNTP concentration in the reaction solution, and It was clarified that the proportion of target nucleic acid can be increased dramatically.
  • the method for promoting the amplification efficiency of a nucleic acid region containing a gene mutation of a cancer-related gene according to the present invention is the following (1) to (24).
  • a method for amplifying a nucleic acid region containing a genetic mutation of K-RAS, which is a cancer-related gene (A) extracting DNA from a sample collected from a patient; (B) amplifying a nucleic acid region containing the gene mutation; including.
  • the reaction in the step of amplifying the nucleic acid region containing the gene mutation (I) a DNA polymerase without a proofreading function; (Ii) an artificially synthesized nucleic acid that binds strongly to a region of the wild-type gene in the sample corresponding to the nucleic acid region containing the genetic mutation, and (iii) dNTPs;
  • the dNTP concentration in the reaction is 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the sample in the method according to (1) is selected from the group consisting of blood, plasma, and serum,
  • the DNA extracted from the sample is circulating free DNA (ccfDNA).
  • the DNA polymerase having no calibration function is Taq DNA polymerase.
  • the amplification reaction in the step of amplifying the nucleic acid region containing the gene mutation is PCR.
  • the method described in (1) to (4) is characterized in that the artificially synthesized nucleic acid is a peptide nucleic acid (PNA).
  • PNA peptide nucleic acid
  • the method according to any one of (1) to (5) is characterized in that the region for detecting the K-RAS gene mutation is codon 12, codon 13, codon 61 or codon 146.
  • the sequence of PNA binding to the region of the wild-type K-RAS gene corresponding to the region containing the K-RAS gene mutation is as follows: (A) When binding to a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K-RAS, 5′-AGCTGGTGCGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 5) (B) When binding to a nucleic acid region containing codon 61 of K-RAS, 5′-CAGGTCAAGAGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 6) (C) When binding to a nucleic acid region containing codon 146 of K-RAS, 5′-GAAACATCAGCAAAAGACAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) It is characterized by being.
  • Primer sequences that amplify the K-RAS gene mutation are: (A) when amplifying a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K-RAS, Forward primer: 5′-AGTCACATTTTTATTTTTTATTATATAGGCCTCGCTGAAAATGA-3 ′ (SEQ ID NO: 8) Reverse primer: 5'-TCGTCCCAAAAATGATTCTGAATTTAGCTGTATCG-3 '(SEQ ID NO: 9) (B) When a nucleic acid region containing codon 61 of K-RAS is amplified, Forward primer: 5′-AGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10) Reverse primer: 5′-CCAGTCCTCATGTACTGGTCCCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11) (C) When a nucleic acid region containing the codon 146 of K-RAS is amplified, Forward primer: 5′-
  • a K-RAS gene mutation detection kit for use in the method according to claim 6 comprising: The dNTP can be adjusted to a final concentration of 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M during use.
  • a method for eliminating or reducing misreading that occurs during the amplification step of a nucleic acid region containing a gene mutation of K-RAS, which is a cancer-related gene (A) extracting DNA from a sample collected from a patient; (B) amplifying a nucleic acid region containing the gene mutation; including.
  • the reaction in the step of amplifying the nucleic acid region containing the gene mutation is as follows: (I) a DNA polymerase without a proofreading function; (Ii) an artificially synthesized nucleic acid that binds to a region of the wild-type gene in the sample corresponding to the nucleic acid region containing the genetic mutation, and (iii) dNTPs; As a reactant, The dNTP concentration in the reaction is 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • the sequence of PNA that binds to the region of the wild-type K-RAS gene corresponding to the region containing the K-RAS gene mutation is: (A) When binding to a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K-RAS, 5′-AGCTGGTGCGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 5) (B) When binding to a nucleic acid region containing codon 61 of K-RAS, 5′-CAGGTCAAGAGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 6) (C) When binding to a nucleic acid region containing codon 146 of K-RAS, 5′-GAAACATCAGCAAAAGACAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) It is characterized by being.
  • the method according to (19) or (20) is: Primer sequences that amplify the K-RAS gene mutation are: (A) when amplifying a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K-RAS, Forward primer: 5′-AGTCACATTTTTATTTTTTATTATATAGGCCTCGCTGAAAATGA-3 ′ (SEQ ID NO: 8) Reverse primer: 5'-TCGTCCCAAAAATGATTCTGAATTTAGCTGTATCG-3 '(SEQ ID NO: 9) (B) When a nucleic acid region containing codon 61 of K-RAS is amplified, Forward primer: 5′-AGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10) Reverse primer: 5′-CCAGTCCTCATGTACTGGTCCCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11) (C) When a nucleic acid region containing the codon 146 of K-RAS is amplified, Forward primer: 5′-
  • the primer and the PNA have the following sequences: (A) when amplifying a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K-RAS, Forward primer: 5′-AGTCACATTTTTATTTTTTATTATATAGGCCTCGCTGAAAATGA-3 ′ (SEQ ID NO: 8) Reverse primer: 5'-TCGTCCCAAAAATGATTCTGAATTTAGCTGTATCG-3 '(SEQ ID NO: 9) PNA: 5′-AGCTGGTGGGCGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 5) (B) When a nucleic acid region containing codon 61 of K-RAS is amplified, Forward primer: 5′-AGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCCT-3 ′ (SEQ ID NO: 10) Reverse primer: 5′-CCAGTCCTCATGTACTGGTCCCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 11) PNA: 5′-CAGGTCAAGAGGA-3 ′ (SEQ ID NO:
  • the kit according to (22 or 23) is characterized in that the DNA polymerase is Taq DNA polymerase.
  • the method for promoting amplification of a specific nucleic acid sequence reduces false positives by lowering the dNTP concentration in the amplification reaction solution to reduce errors that occur during polymerase elongation, and artificially synthesized nucleic acids such as PNA are used.
  • the ratio of the target nucleic acid amplification ratio in the amplification product can be greatly improved, and the detection of a small amount of target nucleic acid in the biological sample can be made highly efficient.
  • cancer-related gene or “oncogene” is a gene having a function indispensable for the growth of normal cells.
  • mutant gene or “mutant type” refers to a gene having a mutation in the nucleic acid sequence of the gene.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” means two or more nucleotide chains, such as DNA (deoxyribonucleic acid) and RNA (ribonucleic acid).
  • the nucleic acid molecules described herein can be RNA, DNA (eg, cDNA, genomic DNA, synthetic DNA, etc.) and the like.
  • the DNA may be double stranded or single stranded. When the DNA is single stranded, it may be sense or antisense.
  • the term “amplification” refers to amplification by means for amplifying a nucleic acid such as a target gene, such as PCR, and amplification for detecting the base sequence of a specific mutation in the amplification product obtained thereby.
  • amplification refers to amplification by means for amplifying a nucleic acid such as a target gene, such as PCR, and amplification for detecting the base sequence of a specific mutation in the amplification product obtained thereby.
  • amplification When simply described as “amplification”, it means the former, and the description as “amplification for detection” means the latter.
  • artificial nucleic acid or “artificial nucleic acid” is a peptide nucleic acid (PNA: Peptide Nucleic Acid), a cross-linked nucleic acid (BNA), a locked nucleic acid (LNA), or a locked nucleic acid (LNA).
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • BNA cross-linked nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • LNA locked nucleic acid
  • the term “clamp” or “clamping” corresponds to a nucleic acid region of a cancer-related gene having a mutated sequence to detect a cancer-related gene in amplifying a mutation in a specific cancer-related gene. This refers to specifically binding an artificially synthesized nucleic acid to the nucleic acid region of a wild-type cancer-related gene.
  • the term “clamp inhibition” refers to a wild-type cancer-related gene corresponding to a nucleic acid region of a cancer-related gene having a mutated sequence to be detected in amplifying a mutation of a specific cancer-related gene. Inhibiting wild-type amplification by specifically binding an artificially synthesized nucleic acid to a nucleic acid region of a gene.
  • enrichment refers to increasing the relative amount of a target gene, for example, a cancer-related gene having a mutation, with respect to the wild type.
  • circulating free DNA refers to DNA and / or DNA fragments contained in the bloodstream released from dead cells.
  • misreading or “error” means that a base different from the sequence of the template is inserted into the amplification product when a nucleic acid is extended by DNA polymerase in PCR amplification or the like.
  • a gene product that has been mutated by misreading is distinguished from a cancer-related gene that has the desired mutation.
  • the first invention is an invention of a method for amplifying a nucleic acid region containing a genetic mutation of K-RAS, which is a cancer-related gene, (A) extracting DNA from a sample collected from a patient; (B) amplifying a nucleic acid region containing the gene mutation; A reaction for amplifying a nucleic acid region containing a gene mutation in step (a), (I) a DNA polymerase without a proofreading function; (Ii) an artificially synthesized nucleic acid that binds strongly to a region of the wild-type gene in the sample corresponding to the nucleic acid region containing the gene mutation, and (iii) dNTP at a concentration of 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M. It is invention characterized by these.
  • the second invention is an invention of a highly sensitive K-RAS gene mutation detection kit for use in the method of the first invention.
  • This kit includes a primer and PNA, but is not limited thereto.
  • the following sets (a) to (c) can be used as the set of the primer and the PNA.
  • the third invention is an invention related to a method for detecting a nucleic acid mutation including a K-RAS gene mutation amplified in the first invention by specifying the nucleic acid sequence.
  • digital PCR can be used for detection.
  • the fourth invention is an invention of a method for amplifying a nucleic acid region containing a gene mutation of K-RAS, which is a cancer-related gene, and eliminating or reducing misreading that occurs during the amplification process.
  • the invention of this method is (A) extracting DNA from a sample collected from a patient; (B) amplifying a nucleic acid region containing the gene mutation; A reaction for amplifying a nucleic acid region containing a gene mutation in step (a), (I) a DNA polymerase without a proofreading function; (Ii) an artificially synthesized nucleic acid that binds strongly to a region of the wild-type gene in the sample corresponding to the nucleic acid region containing the gene mutation, and (iii) dNTP at a concentration of 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M. It is characterized by.
  • K-RAS which is a cancer-related gene
  • the nucleic acid mutation detected in the method for promoting amplification of a nucleic acid region containing a gene mutation of a cancer-related gene according to the present invention is a cancer-related gene.
  • Somatic mutations that occur in such cancer-related genes include all forms of mutations such as, for example, insertions, inversions, deletions, and / or point mutations.
  • the protein product of normal K-RAS gene has a function of promoting cell proliferation by transmitting a cell proliferation signal produced by the epidermal growth factor receptor (EGFR) to the nucleus during cell proliferation of normal cells.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • detection of genetic mutations in the K-RAS can be used for early detection of cancer, cancer recurrence, molecular targets Since it is important for knowing the evolution of cancer cells relative to drugs, etc., the primary object of the present invention is to detect a K-RAS gene mutation from among many cancer-related genes. .
  • K-RAS genes are somatic or germline, unlike wild-type K-RAS found in one allele (heterozygous) or both alleles (homozygous), respectively. It is a mutant K-RAS that can be found. Somatic mutations occur only in certain tissues, such as tumor tissues, and are not inherited in the germline. Germline mutations can be found in any body tissue.
  • wild-type gene or wild-type means a gene that has no mutation and contains genetic information having an original normal function.
  • the mutant K-RAS detected in the method for promoting the amplification of a nucleic acid region containing a gene mutation of a cancer-related gene according to the present invention includes codons 12, 13, 61 on exons 2 to 4 of the K-RAS gene. , And 146 with mutated K-RAS with one or more amino acid substitutions are preferred.
  • the mutant K-RAS is specifically selected from the group consisting of K-RAS proteins G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, Q61H, Q61L, Q61R, A146T, and A146V. And mutant K-RAS having one or more mutations.
  • Table 1 shows the mode of nucleic acid (gene) mutation of each mutant type.
  • the amino acid sequence of K-RAS is SEQ ID NO: 1
  • the gene sequence containing codon 12 on exon 2 of K-RAS is SEQ ID NO: 2
  • the gene sequence containing codon 61 on exon 3 of K-RAS is sequenced
  • the gene sequence containing codon 146 on exon 4 of K-RAS is shown in SEQ ID NO: 4 in No. 3.
  • a K-RAS gene that requires particularly sensitive detection from the viewpoint of medical importance
  • it is preferable to use the nucleic acid derived from the measurement it can be effectively applied to genes other than K-RAS, and is not limited to K-RAS.
  • the K-RAS gene-derived nucleic acid was obtained using the full-length or part of the genomic DNA of the K-RAS gene, the full-length or part of the mRNA of the K-RAS gene, and the full-length or part of the mRNA as a template.
  • examples thereof include cDNA, and amplification products obtained by artificially amplifying them by polymerase chain reaction (PCR).
  • the detected K-RAS gene mutation is a mutation involving one or more amino acid substitutions of codons 12, 13, 61, and 146 on exons 2 to 4 of the K-RAS gene. K-RAS is preferred.
  • collected from the patient The method of promoting the amplification of the nucleic acid region containing the gene variation of the cancer related gene which concerns on this invention
  • the genotype of K-RAS of circulating free DNA (ccfDNA) contained in a blood sample is examined.
  • the blood sample may be peripheral blood itself, serum or plasma.
  • a blood sample can be collected from a subject less invasively than tumor tissue. Therefore, the sample can be easily adjusted even for a subject who is difficult to collect a biological sample of a tumor tissue, such as a recurrent tumor patient.
  • the “(a) step of extracting DNA from a sample collected from a patient” in the present invention can collect ccfDNA from the blood of a patient by applying a generally used nucleic acid extraction method.
  • a step of collecting blood from a patient (i) a step of performing pretreatment for extracting ccfDNA from the collected blood, and (iii) from the pretreated blood
  • a step of extracting ccfDNA can be included.
  • ccfDNA is extracted from a blood sample by centrifuging blood collected from a patient, collecting the separated plasma, and collecting the ccfDNA in the collected plasma using a kit “QIAamp Circulating Nucleic” manufactured by Qiagen. It can be extracted using “Acid Kit” or the like.
  • Step B Step of amplifying nucleic acid region containing gene mutation
  • dNTP concentration is low and PNA is used.
  • PCR conditions generally used can be applied.
  • an artificial nucleic acid such as PNA functions to bind to excess wild type, inhibit wild type amplification, and enrich a trace amount of mutant in the reaction solution.
  • misleading can be reduced by using a low dNTP concentration.
  • composition of the PCR reaction solution and the PCR conditions can be determined by those skilled in the art so that a PCR amplification product can be obtained in PCR using the primer pairs described in this specification. Can be selected and set appropriately.
  • the PCR reaction cycle comprises (i) heat denaturing ccfDNA extracted from patient blood as a template, (ii) annealing primers to the template DNA, iii) It is possible to amplify the base sequence of a specific region having a gene mutation by repeating a step including a step of performing a primer extension reaction using a heat-resistant DNA polymerase.
  • the reaction cycle including the above steps (i) to (iii) of PCR can be set, for example, between 20 to 50 cycles to amplify the PCR product.
  • the number of cycles can be appropriately selected and set by a preliminary experiment or the like.
  • step (i) the double-stranded DNA is usually treated at a temperature range of 93 to 96 ° C. for 30 to 60 seconds, respectively. Release into single-stranded DNA.
  • a denaturation temperature of 93 ° C is often sufficient, but it is safer to raise the temperature to 94 ° C. Depending on the target sequence, it may be better to raise it to 95 ° C.
  • the annealing temperature should be equal to or lower than the Tm of the primer. It is. That is, the temperature should be set low enough to allow the primer and template to hybridize and high enough not to form a mismatched hybrid.
  • the Tm of an oligonucleotide used as a primer is estimated, and PCR is performed using this Tm as a reference value for the annealing temperature.
  • the standard temperature is 55 ° C. and the time is 30 seconds. If non-specific amplification other than the target sequence is observed, increase the temperature at intervals of 1 ° C to 2 ° C, for example. Conversely, if nothing is amplified, try lowering the temperature, for example, at 1 ° C to 2 ° C intervals.
  • the temperature of the step and the time required for the extension reaction depend on the concentration of the template DNA, the size of the target sequence, the reaction temperature, and the like. One minute is sufficient when the size of the target sequence is 1 Kb or less. For larger sizes, the length is increased at a rate of 1 minute per 1 Kb. Since the DNA extension rate by Taq DNA polymerase is about 60 nucleotides / second at 70 ° C., the extension time may be appropriately set taking this into consideration.
  • a hot start method in which the PCR reaction solution is completely mixed at a high temperature at the start of the reaction may be used.
  • PCR reaction conditions are described in the examples described later, but this is only an example.
  • Reaction conditions such as annealing temperature, PCR reaction reagent composition, and annealing time in the PCR reaction should be appropriately selected and set by preliminary experiments, etc., depending on the length and / or base composition of the oligonucleotide sequence used as a primer. Can do.
  • a series of operations of PCR can be performed according to the operation manual using a commercially available PCR kit or an apparatus such as a thermal cycler required for PCR.
  • the PCR reaction solution contains 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M of ccfDNA collected by the above-described step (4) of extracting DNA from the sample collected from the patient's blood as the template DNA.
  • a low concentration of dNTPmix, a forward primer, a reverse primer and an artificially synthesized nucleic acid set shown in the following (a) to (c), but not limited thereto, a buffer solution such as a MOPS buffer solution, Taq DNA Polymerases and salts such as MgCl 2 and / or NaCl can be included.
  • a cross-linked nucleic acid such as BNA or LNA having the same sequence as SEQ ID NOs: 5, 6 and 7 is used in place of PNA in a PCR amplification reaction. Can be obtained.
  • the standard concentration of each composition of the PCR reaction solution can be prepared in the following ranges, but is not limited thereto.
  • the concentration of ccfDNA used as a template can be prepared in the range of 1 to 10000 copies / ⁇ L.
  • the concentration of the forward primer and the reverse primer can be adjusted in the range of 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.2 to 2 ⁇ M.
  • the concentration and pH of the MOPS buffer solution can be adjusted in the range of 1-50 mM and pH 6.5-7.9.
  • the concentration of Taq DNA polymerase can be prepared in the range of 0.02 to 0.5 U / ⁇ L.
  • the concentration of MgCl 2 can be adjusted in the range of 1.5 to 8.5 mM.
  • the concentration of NaCl can be adjusted in the range of 10-20 mM.
  • the concentration of dNTP used in the nucleic acid amplification reaction is particularly important.
  • the concentration of dNTP is preferably a final concentration of 2.5 ⁇ M to 50 ⁇ M, more preferably 2.5 ⁇ M to 5 ⁇ M, and further preferably 2.5 ⁇ M.
  • the concentration at which false positives due to PNA can be reduced is preferably a final concentration of 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0. .1 to 2 ⁇ M.
  • the DNA polymerase used in the method for promoting amplification of a nucleic acid region containing a gene mutation of a cancer-related gene according to the present invention is preferably a DNA polymerase having no proofreading function.
  • a DNA polymerase Taq DNA Polymerase is preferable in view of the fact that the stability of the production quality is maintained and it can be used without a license, but it is not limited thereto.
  • any DNA polymerase having a function equivalent to Taq DNA Polymerase can be used in the present invention.
  • Second invention (kit invention)
  • the present invention is used to detect a K-RAS gene-derived nucleic acid in a blood sample and / or to determine the genotype of a detected K-RAS gene-derived nucleic acid.
  • the kit containing the reagent etc. which are obtained is included. By using this kit, a method for promoting amplification of a nucleic acid region containing a gene mutation of a cancer-related gene according to the present invention can be performed more simply.
  • the reagents constituting such a kit include a primer set used for PCR amplification of a mutated sequence of an oncogene, a peptide nucleic acid or a cross-linked nucleic acid that clamps a wild-type gene, dNTP, and a DNA polymerase (preferably Includes Taq DNA polymerase, and may further contain an enzyme such as ligase, a buffer solution (for example, MOPS buffer), a salt, and trehalose.
  • a primer set used for PCR amplification of a mutated sequence of an oncogene, a peptide nucleic acid or a cross-linked nucleic acid that clamps a wild-type gene, dNTP, and a DNA polymerase preferably Includes Taq DNA polymerase, and may further contain an enzyme such as ligase, a buffer solution (for example, MOPS buffer), a salt, and trehalose.
  • the sequence of the primer and the artificial nucleic acid such as PNA constituting the kit according to the present invention is not particularly limited as long as it can amplify the K-RAS mutant sequence.
  • Primers, RNA, and the like can be designed as appropriate.
  • the following sets (a) to (c) can be used.
  • kits include reagents for extracting nucleic acids from blood samples, probes that can specifically hybridize to specific genotypes of K-RAS, or primers (mutations of the K-RAS gene). Or an oligonucleotide that specifically hybridizes to the adjacent site or the like.
  • the kit may include a document or the like with specific instructions.
  • the document includes the detection of a K-RAS gene-derived nucleic acid in a blood sample, a protocol for determining the genotype thereof, and / or an EGFR inhibitor from the resulting K-RAS genotype status result
  • standard for determining the sensitivity with respect to was described may be contained.
  • kits includes, for example, one in which 1 to 50 ⁇ L of a sample can be added to a 96-well plate equipped with the reagents included in the kit, and amplification reaction can be performed by general-purpose real-time PCR. It is.
  • Another form of use is one that uses a TaqMan probe for detection. Specifically, the amplification product can be detected by adding a TaqMan probe and a reagent to a 96-well plate included in the kit.
  • the gene mutation is detected using a method for detecting a gene mutation such as a next-generation sequencer or invader method.
  • the invention according to the present application is to detect at the nucleic acid level (genomic DNA or mRNA) when determining a genotype such as K-RAS in a blood sample. Is preferred.
  • the third invention is the process described in the first invention, that is, (A) extracting DNA from a sample collected from a patient; (B) amplifying a nucleic acid region containing the gene mutation; Including (A) A reaction for amplifying a nucleic acid region containing a gene mutation in the step is: (I) a DNA polymerase without a proofreading function; (Ii) an artificially synthesized nucleic acid that binds strongly to a region of the wild-type gene in the sample corresponding to the nucleic acid region containing the gene mutation, and (iii) dNTP at a concentration of 2.5 ⁇ M to 10 ⁇ M.
  • a step of detecting a nucleic acid mutation in the nucleic acid region amplified by the above step is, (A) extracting DNA from a sample collected from a patient; (B) amplifying a nucleic acid region containing the gene mutation; Including (A) A reaction for amplifying a nucleic acid region containing
  • the amplifying step is as described in the first invention.
  • the K-RAS gene mutation detection kit of the second invention can be used in the amplification step.
  • Detection of a gene-derived nucleic acid such as K-RAS in a blood sample determination of the genotype of a detected K-RAS gene-derived nucleic acid, or identification of a mutant copy number is preferably performed by a conventional method. Specifically, for a specific region of K-RAS from ccfDNA in the blood sample, K in the amplification product amplified by the first invention using the kit according to the second invention of the present invention is used. -The presence or absence of the RAS gene and the determination of the wild type or the mutant type are preferably determined by a detection method capable of determining the nucleic acid sequence.
  • the identification of the presence of K-RAS in a blood sample or a copy number of a variant thereof is identified by detecting the nucleic acid derived from the K-RAS gene of ccfDNA contained in the blood sample using digital PCR. It is preferable to do this.
  • ddPCR droplet digital PCR
  • BioRad Non-patent Document 4: Hindson, et.al., Analytical Chemistry, 2011, vol. 83 (22), pp. 8860-8610
  • PCR ddPCR Mutation Detection Assay For detection, it is preferable to use a BioRad digital PCR kit "PrimerPCR ddPCR Mutation Detection Assay". Digital PCR conditions (temperature cycle, number of cycles, etc.) can be appropriately selected and set by a person skilled in the art through preliminary experiments or the like so that a PCR amplification product can be obtained.
  • ethylene glycol or glycerol used as a storage solution for DNA elongation enzyme or the like has a final concentration of 0.15% or less, or Triton-X has a final concentration of 0.0003% or less.
  • the surfactant is at the final concentration or more, the number of emulsions due to droplets is drastically reduced, making it difficult to detect mutations with high sensitivity.
  • the amplification reaction is performed by PCR using nucleic acids and nucleic acid fragments obtained from a blood sample, and the number of allele copies of the mutant K-RAS to be detected in the nucleic acid is determined.
  • a known mutation detection method can be performed after dilution to about 10 6 copies. According to this method, the total number of mutants present in the reaction system is increased, so that even if the number of mutations increases, the possibility that the mutant allele does not physically exist and becomes undetectable is reduced. be able to.
  • the method may be combined with the digital PCR described above.
  • a fragment containing a region encoding a mutation site in the K-RAS gene is amplified by PCR or the like using a nucleic acid in a blood sample as a template.
  • examples include a method of detecting with high sensitivity whether or not an aggregate has been formed by contacting a probe capable of specifically hybridizing with a specific RAS genotype. It is also preferred to perform emulsion PCR on the amplification product dilution prior to hybridization.
  • the probe can be, for example radioactive isotopes (3 H, 32 P, 33 P , etc.), fluorescent agent (rhodamine, fluorescein, etc.) is detectably labeled with or chromogenic agents.
  • the probe may also be an antisense oligomer such as PNA, morpholino-phosphoramidates, LNA.
  • the base length of the probe can be about 8 to about 100 nucleotides, or about 10 to about 75, alternatively about 15 to about 50, or about 20 to about 30.
  • K-RAS The presence of K-RAS in a blood sample and its genotype can also be analyzed using the Invader (registered trademark) method (Michael Olivier, Mutation Research 573: 103-110, 2005).
  • an allele probe and an invader oligo are hybridized so as to partially form a triple base with respect to double-stranded DNA or mRNA prepared by PCR or the like.
  • a part of the 5 ′ end of the allele probe is designed to have a non-complementary sequence (flap portion) with the double-stranded DNA or mRNA, but the invader oligo is completely against them. It has a complementary sequence.
  • the two allele probes are designed to be complementary to the wild type and the mutant type, respectively.
  • the target mutation is cleaved by the flap endonuclease, the fluorescently modified DNA fragment in the FRET cassette is released, and dissociates from the quencher in FRET.
  • the flap portion of the allele probe once cleaved can be re-hybridized to another FRET cassette, thereby amplifying the signal and detecting the mutation with very high sensitivity.
  • a ligase chain reaction widely used in the art can be used to amplify a fragment containing a region encoding a mutation site in the K-RAS gene (for example, Non-Patent Document 5: Wu, et.al). Genomics, 1989, vol. 4, pp. 560-569).
  • a technique known as mutation-specific PCR can also be used (see, for example, Non-Patent Document 6: Ruano and Kidd, Nucleic Acids Research, 1989, vol. 17, pp. 8392). According to the technique, a primer is used that hybridizes at its 3 'end to a particular K-RAS mutation. In the absence of a specific K-RAS mutation, no amplification product is observed.
  • Amplification Reference Mutation System for example, Patent Document 3: European Patent Application Publication No. 0332435 and Non-Patent Document 7: Newton et.al., Nucleic Acids Research, 1989, vol. 17, pp. .7 can also be used.
  • next-generation sequencer or capillary sequencer which is a detection means other than the above-mentioned digital PCR and invader method Etc. can also be used. Using these means, gene mutations such as gene deletion, insertion, and conversion can be detected.
  • a sequence analysis method based on the Sanger method is used, and the base sequence of the K-RAS gene genomic DNA or mRNA in a blood sample, or an amplification product thereof is used. There is a method of directly determining.
  • the base sequence can also be determined via PCR.
  • restriction fragment length polymorphism (RFLP) probes to the gene or surrounding marker genes can be used to score allelic alterations or insertions in the polymorphic fragment.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • Single-stranded DNA conformation polymorphism (SSCP) analysis can also be used to detect allele base change mutants (Non-Patent Document 8: Orita et.al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 1989, vol. 86, pp. 2766-2770, and Non-Patent Document 9: Genomics, 1989, vol. 5, pp. 874-879).
  • the fourth invention includes steps (a) and (b), and eliminates or reduces misreading. Is the method. These inventions can apply the same conditions as the first invention.
  • misreading during the amplification process can be eliminated or reduced.
  • the fourth invention can eliminate or reduce misreading based on the performance of the DNA polymerase during the amplification step even if a DNA polymerase having no calibration function such as Taq DNA polymerase is used.
  • the kit of the second invention can be used in the amplification step.
  • sensitivity to anticancer agents or resistance Cancer types that are expected to be acquired or cancer types that are expected to recur are particularly limited as long as they are EGFR-mediated tumors (cancers), that is, tumors that play a role of EGFR in tumorigenesis. is not.
  • tumors include brain, liver, kidney, bladder, breast, stomach, ovary, colorectal, prostate, pancreas, lung, vulva, thyroid, esophagus, liver cancer, sarcoma, glioblastoma, head and neck, leukemia And lymphoid malignancies.
  • neuroblastoma intestinal cancer (eg rectal cancer, colon cancer, familial colon polyposis cancer and hereditary non-polyposis colon cancer), esophageal cancer, lip cancer, laryngeal cancer, hypopharyngeal cancer, tongue cancer , Salivary gland cancer, stomach cancer, adenocarcinoma, medullary thyroid cancer, papillary thyroid cancer, kidney cancer, renal parenchymal cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, endometrial cancer, choriocarcinoma, pancreatic cancer, prostate cancer, Testicular cancer, breast cancer, ureteral cancer, melanoma, brain tumor (eg glioblastoma, astrocytoma, meningioma, medulloblastoma and peripheral neuroectodermal tumor), Hodgkin lymphoma, non-Hodgkin lymphoma, bar Kit lymphoma, acute lymphoblastic leukemia (ALL), chronic lympho
  • ALL
  • tumors to be used in the method according to the present invention include colon cancer, colon cancer, rectal cancer, lung cancer, liver cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, kidney cancer, esophageal cancer, head and neck cancer, uterine cancer, and cervical cancer. Although it is preferable that it is 1 type or 2 types or more selected from the group which consists of cancer, it is not restricted to this.
  • oncogene or “cancer-related inheritance” to which the method of the present invention can be applied include ALK, EGFR, H-RAS, N-RAS, K-RAS, A-RAF, B-RAF ( BRAF), C-RAF, MEK, ERK, PIK3CA, PTEN, AKT, TP53 (p53), CTNNB1 (beta-catenin), APC, KIT, JAK2, NOTCH, FLT3, RSK, ETS, ELK-1, SAP-1 Examples include, but are not limited to, cancer-related genes related to the MAPK pathway.
  • the tumor may be a primary focus (primary tumor) or a metastatic focus (metastatic tumor). It may also be a recurrent tumor. Furthermore, tumors may be present at a plurality of locations in the subject's body.
  • the method for promoting the amplification of a nucleic acid region containing a gene mutation of a cancer-related gene provides important information for determining the presence or absence of application of anticancer drug administration and / or for early recurrence diagnosis. Can be provided.
  • the method according to the present invention can provide useful information to a clinician, and based on the information obtained from the method, the clinician can determine an appropriate treatment method, which is a simple and sensitive detection method. To provide.
  • sequence of the artificially synthesized nucleic acid, forward primer, and reverse primer used in the present invention are as follows.
  • sequence numbers correspond to the sequence listing attached to the original specification of the present application.
  • sequence of artificially synthesized nucleic acid The sequence of PNA binding to the region of the wild-type K-RAS gene corresponding to the region containing the K-RAS gene mutation is as follows: (A) When binding to a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K-RAS, 5′-AGCTGGTGCGTA-3 ′ (SEQ ID NO: 5) (B) When binding to a nucleic acid region containing codon 61 of K-RAS, 5′-CAGGTCAAGAGGA-3 ′ (SEQ ID NO: 6) (C) When binding to a nucleic acid region containing codon 146 of K-RAS, 5′-GAAACATCAGCAAAAGACAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 7) The method of claim 6, wherein: (Forward primer and reverse primer sequences) Primer sequences that amplify the K-RAS gene mutation are: (A) when amplifying a nucleic acid region containing codons 12 and 13 of K
  • Example 1 In the reaction system of K-RAS (G13D mutant type), the final concentration of dNTP was changed to 50 ⁇ M, 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, and 2.5 ⁇ M, and a total of 8 conditions with and without the addition of peptide nucleic acid (PNA) PCR was performed with the reagent composition shown in Table 2.
  • PNA peptide nucleic acid
  • the artificial gene plasmid As the artificial gene plasmid, a plasmid whose concentration was measured with Pico Green was used.
  • the target insert sequence was 300 bp, and the vector length was 3.9 kb.
  • “Primer 1” and “Primer 2” listed in Table 2 are primers of “SEQ ID NO: 8” and “SEQ ID NO: 9”, respectively.
  • the “peptide nucleic acid” is a peptide nucleic acid of “SEQ ID NO: 5”.
  • a PCR reaction cycle for amplifying the base sequence of a specific region having a gene mutation includes (i) a step of heat denaturing DNA, (ii) an annealing step of a primer to a template DNA, and (iii) heat resistance. This was performed by repeating a step including a step of performing a primer extension reaction using a DNA polymerase.
  • the reaction temperature was 10 ⁇ L, and the PCR temperature control conditions were (i) step at 95 ° C. for 120 seconds, (ii) step at 95 ° C. for 5 seconds, and (iii) step at 66 ° C. for 20 seconds. I went there. 35 cycles were performed, with one cycle being the steps (ii) and (iii). Then, after processing at 97 degreeC for 120 second, it cooled and complete
  • the reaction conditions of digital PCR for identification of wild-type and mutant copy numbers are as follows: (1) Pretreatment step, (2) Amplification step, and (3) Post-treatment step (1) to (3) Consists of.
  • the pretreatment step (1) is performed at 95 ° C. for 10 minutes.
  • the amplification step (2) is a reaction cycle further comprising (i) an annealing step at 94 ° C. for 30 seconds and (ii) an amplification step at 55 ° C. for 60 seconds, the step of (i) A target nucleic acid is amplified by carrying out 40 cycles processing by making the cycle processed in the process of (ii) into 1 cycle later.
  • (3) The post-treatment step is performed at 98 ° C. for 10 minutes and then cooled to complete the reaction.
  • FIG. 3 shows the amount of K-RAS mutant product with respect to the sum of the amount of wild-type amplification and the amount of mutant product in each PCR product.
  • the proportion of the mutant type in each PCR product was greatly increased with the decrease in the concentration of dNTP only in the sample containing 0.2% mutant with the addition of PNA (FIG. 3, (1 ′) ⁇ (4 ')). These are synergistic effects due to the decrease in the amount of wild-type by decreasing the concentration of dNTP (FIG. 1) and the increase in the amount of mutant (FIG. 2). This shows that the 0.2% mutant contained in the sample could be enriched up to about 40%.

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Abstract

　核酸増幅過程中に人工核酸による阻害効率を上昇させ、擬陽性の可能性を軽減した精度の良い、目的の核酸(体細胞変異など)の富化方法の提供。本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、核酸増幅過程に使用される4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸 (ｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ, ｄＴＴＰ)、すなわちｄＮＴＰの濃度を通常の核酸増幅工程に使われる濃度よりも低濃度にすることにより、標的の富化効果が劇的に向上し、例え、擬陽性で一定の間違った割合の擬陽性が得られたとしても、核酸増幅工程後、標的核酸の割合を劇的に向上することが分かり、標的核酸の検出が容易に得られる本発明を完成させた。

Description

特異的核酸配列の増幅促進方法
　本発明は、試料中の微量の標的遺伝子の変異を検出するための、ＰＣＲ(ポリメラーゼ連鎖反応)等により標的遺伝子の増幅効率を促進する方法に関する。
　特に本発明は、前記方法に用いるためのキットと、前記方法で増幅した標的遺伝子の遺伝子産物中の変異を検出する方法を含む。
（１）血中の循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）の臨床検査における有用性
　抹消血、血漿、および血清などの生体サンプル中の微量な遺伝子変異を検出することは臨床上有用である。とりわけ、臨床検査の場においては、出生前診断またはがん患者に対する分子標的薬の治療効果予測する際に、生体サンプル中の微量な標的遺伝子の変異を高効率に増幅し、高感度に検出することが求められている。
　ヒトの血液中には微量のＤＮＡが循環遊離ＤＮＡ(ｃｃｆＤＮＡ)として存在することが知られており、ｃｃｆＤＮＡに含まれる標的遺伝子を遺伝子診断に活用する試みがなされてきた。
　ｃｃｆＤＮＡとは、体内で細胞が死ぬ際に細胞の内容物とともに放出され血中に流れ込むＤＮＡのことである。正常細胞が死んだときに放出される細胞の内容物は、通常、マクロファージなどの食細胞に捕捉され消化されるが、そのうち消化しきれなかったＤＮＡがｃｃｆＤＮＡとして血中に流れ込む。
　がん細胞のように細胞増殖速度が速い細胞が死んだときに放出される細胞の内容物についても、食細胞が消化し切れなかったがん細胞由来のゲノムＤＮＡが正常細胞由来の未消化のゲノムＤＮＡと共にｃｃｆＤＮＡとして血流を流れる。
　この他にセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）と呼ばれる、血中に流れ込んでいる細胞由来のＤＮＡがある。本願では、ｃｃｆＤＮＡ、ｃｆＤＮＡの両者を含むものとしてｃｃｆＤＮＡとして説明する。また、これら血中に微量に含まれるＤＮＡだけでなく常法で得られる、細胞核に存在する長い（大きな）ＤＮＡも対象にできることは当業者には容易に理解される。
　定期的に被験者から採血をして、がん細胞由来のｃｃｆＤＮＡ中のがん関連遺伝子の変異等を追跡することで、がんを早期に発見できたり、がんに対する治療の効果を確認できたり、がんの再燃および／または再発を早期に発見することができる。近年では、ｃｃｆＤＮＡのこれらの可能性を肺がんおよび／または大腸癌等の治療における臨床検査に活用するための研究開発が活発になされている。
　ｃｃｆＤＮＡを活用した遺伝子検査におけるさらなる試みとして、患者から経時的に採血をして、がん細胞の分子標的薬などに対する耐性獲得に関連する進化を追跡する試みがなされている。
　がん治療のための分子標的薬としては、例えば、ゲフェチニブ（イレッサ（登録商標））およびパニツムマブ（ベクチビックス（登録商標））が知られている。これらの分子標的薬は、多くのがん細胞で過剰に発現し活性化している細胞増殖および／または細胞分裂に関与するタンパク質である上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とし、ＥＧＦＲのＡＴＰの結合部位にＡＴＰと競合的に結合してＥＧＦＲの活性を阻害する。すなわち、分子標的薬がＡＴＰの結合部位に結合されるとＥＧＦＲの自己リン酸化が妨害され、ＥＧＦＲからのシグナル伝達が間接的に遮断され、がん細胞のアポトーシスが誘導される。しかし、これらの分子標的薬を数ヶ月服用すると、がん細胞が薬剤に対する耐性を獲得し、薬剤の効果が落ちることが確認されている。
　がん細胞のこれらの薬剤耐性の獲得には、Ｋ－ＲＡＳなどの遺伝子の変異が関与している（非引用文献１：Ｄｉａｚ、Ｌ．Ａ．Ｊｒ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４８６、５３７－５４０（２０１２））。
　例えば、肺がんでは、ゲフェチニブ（イレッサ）投与後の薬剤耐性を予測する因子として、ＥＧＦＲ遺伝子のＴ７９０Ｍがモニタリングされ、大腸がんでは、Ｋ－ＲＡＳのコドン１２、１３、６１などの変異が、セツキシマブ(アービタックス)投与後、血中に微量の変異として観察される。
　つまり、ｃｃｆＤＮＡ中のＫ－ＲＡＳ遺伝子の核酸変異を経時的に検出することによって、がん細胞が分子標的薬などに対する耐性を進化させているかどうかを知ることができ、その知見は治療に役立てる上でも非常に重要な手段となり得る。
　また、これらの多くのがん関連遺伝子の変異は、ＣＥＡおよびＣＡ－１９－９などとして知られる消化器系の腫瘍マーカーによる検出よりも早期のがんの兆候として現れることから、ｃｃｆＤＮＡ中のがん関連遺伝子の変異を検出することは、がんの早期発見にも有用であることが指摘されている。
　これらのがん耐性に関与する遺伝子変異は、がんのヘテロジェナイティー(不均一性)なものとして、微量に存在している可能性も示唆されているので、ｃｃｆＤＮＡだけでなく、ＦＦＰＥ(ホルマリン固定パラフィン包埋)切片などの組織サンプルにおける超高感度な遺伝子検出法が今後必要とされてくると推察できる。
　しかしながら、試料中における全ｃｃｆＤＮＡ中のがん関連遺伝子の変異を有するｃｃｆＤＮＡの割合は、０．０１％～５０％と非常に広範囲である。特に、全ｃｃｆＤＮＡ中のがん関連遺伝子の遺伝子変異を有するｃｃｆＤＮＡが血中に微量にしか存在していない場合には、非常に高感度な遺伝子解析方法が必要である。
　遺伝子解析方法としてダイレクトシークエンシングが汎用されているが、体細胞変異などの検出においては検出感度が２０％程度しかないので、臨床検査には不向きである。近年では、次世代シーケンサー（ＮＧＳ：Ｎｅｗ　Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）またはデジタルＰＣＲなどの新しい技術により、ｃｃｆＤＮＡ中の遺伝子変異を検出する報告もある。
　ＮＧＳなどによる遺伝子解析方法では、典型的なエラーレートが存在する。それらの遺伝子解析方法の検出限界(ＬＯＤ：Ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ)は、約１％程度とされており、それ以下の感度では変異を観察することができない。また、ＮＧＳで高感度に変異を検出する場合には、Ｄｅｅｐ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇをする必要があり、ＮＧＳの多項目にわたる検出能力をスポイルしてしまう。
（２）遺伝子解析におけるペプチド核酸（ＰＮＡ）の利用
　コストが安く、これらの問題を解決するひとつの方法としては、ＰＮＡなどの人工核酸をＰＣＲなどの核酸増幅過程中に添加し、特定の核酸配列を人工核酸でクランピングすることによって反応溶液中の増幅を阻害することにより、反応液中の反応に寄与する標的となる変異配列を有する核酸を富化する方法が一般的に普及している。
　ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）とは、ニールセン等によって開発された、主鎖にペプチド構造を保持した、ＤＮＡまたはＲＮＡに似た構造を持つ分子であり（非特許文献３：Ｎｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ．２５４、ｐｐ１４９７－１５００）以下のような構造を有するものをいう。すなわち、ＤＮＡとＲＮＡの主鎖を構成している糖（デオキシリボース、もしくはリボース）の代わりに、ＰＮＡではＮ－(２－アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合したものが主鎖となっている。さらに、ＤＮＡ等における核酸塩基に相当するプリン環またはピリミジン環が、ＰＮＡではメチレン基とカルボニル基を介して主鎖に結合している。ＰＮＡはＤＮＡ同様の分子認識を行う。ＰＮＡ／ＤＮＡの2重鎖はＤＮＡ／ＤＮＡの2重鎖よりも強い結合を形成する。
　このＰＮＡの特性を利用して、サンプル中の低濃度の標的分子を高感度に検出する方法が開発されている。例えば、ダイレクトシークエンス前の核酸増幅工程において、野生型の核酸配列に結合するＰＮＡを結合させる。次に、野生型以外の、変異している配列を富化する。このようにして、高感度にＫ－ＲＡＳ遺伝子変異を検出する方法(特許文献１)がある。その他、ＬＮＡまたはＰＮＡを組み合わせたリアルタイムＰＣＲ法によりがん細胞の変異遺伝子を検出する方法 (特許文献２) などがある。これらの方法は、クランプしたい配列の人工塩基を合成するだけで、簡単に目的の核酸を富化することができる。また、これらの方法は、ＮＧＳおよびデジタルＰＣＲと比較してコストが安い。
（３）遺伝子検査におけるＤＮＡポリメラーゼの正確性に係る問題点　
　一方、遺伝子検査で用いられるＰＣＲ法で使用されるＤＮＡポリメラーゼは、種類や反応条件によって、正確性（Ｆｉｌｅｄｉｔｙ）が低いものがあり、そのため、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長時に、所望の鋳型の配列とは異なる塩基が挿入されることがある。　
　ＤＮＡポリメラーゼの正確性（Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）は、ポリメラーゼの種類によって異なる。例えばＤＮＡポリメラーゼの変異の頻度は、Ｔａｑポリメラーゼにおいては５．１％、その他の修正機能を有するプルーフリーディングポリメラーゼにおいては５．１％以下である。
　すなわち、このＤＮＡポリメラーゼの低い正確性によって、ＰＣＲの増幅反応中に間違った塩基が挿入された増幅産物を生成する。この増幅産物は、次の核酸増幅工程において間違えて変異が入った塩基配列に対してはＰＮＡによりクランプできなくなる。そのため、目的とする、がん関連遺伝子の遺伝子変異とは異なる変異核酸が増幅され、それががん検査における遺伝子変異の検査において、擬陽性として検出されてしまう危険性がある。特に、０．１％以下の微量な変異を検出する際に、擬陽性の影響は顕著に現れる。これらを解決するためには、校正機能つきのＤＮＡポリメラーゼを用いることで、擬陽性が軽減することも報告されている(非特許文献２)。しかしながら、校正機能付きＤＮＡポリメラーゼは一般的に価格が高く、医療および／または医薬分野の開発に用いられるＧＭＰグレードのものは、通常のＴａｑポリメラーゼに比べて種類が少ない。一方で、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは上述のような正確性の問題はあるが、安価で、製品の品質も安定的な、しかもライセンスフリーで利用できるという長所がある。
特開２０１２-１３５２９０号公報 国際公開第２０１２/００２４７７号 欧州特許出願公開第０３３２４３５号明細書
Ｄｉａｚ、Ｌ．Ａ．Ｊｒ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ４８６、ｐｐ５３７－５４０（２０１２） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ, Ｊｕｌｙ　２００８，Ｖｏｌ. １０, Ｎｏ． ４． Ｎｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２５４、ｐｐ１４９７－１５００． Ｈｉｎｄｓｏｎ，et.al.，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，2011，vol.83（22），pp. 8604－8610 Wu，et.al.，Genomics，1989，vol.4，pp.560－569 Ruano　and　Kidd，Nucleic　Acids　Research，1989，vol.17，pp.8392 Newton　et.al.，Nucleic　Acids　Research，1989，vol.17，pp.7 Orita　et.al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences，USA，1989，vol.86，pp.2766－2770 ：Genomics，1989，vol.5，pp.874－879
　本発明では、安価で製造品質が安定しており、ライセンスフリーで使用できるＴａｑポリメラーゼとＰＮＡなどの人工核酸を用いて微量な標的遺伝子核酸の変異を含む領域を増幅させる方法を改良することを目的とする。さらに、また本発明は、前記改良された方法により、がんなどの検査に利用される遺伝子変異の検査において擬陽性を低減し、且つ核酸増幅後の標的とする変異の割合を劇的に増加する方法を提供することを課題とする。
　本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、人工核酸により野性型遺伝子核酸の増幅を阻害させることにより、標的遺伝子核酸である変異型の割合を劇的に向上させることができることを見出した。さらに、核酸増幅過程に使用される4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸 (ｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ, ｄＴＴＰ)、すなわちｄＮＴＰの濃度を通常の核酸増幅工程に使われる濃度よりも低濃度にすることで、標的遺伝子核酸の増幅効率を維持または向上させ、かつ、擬陽性の原因となるエラーを低減させることを見出した。
　すなわち、本発明者は、通常の核酸増幅反応において、人工核酸で野生型遺伝子の核酸配列をクランピングし、反応溶液中のｄＮＴＰ濃度を減少させることで、ＤＮＡポリメラーゼによるエラーを軽減させ、かつ、標的核酸の割合を劇的に増やすことができることを明らかとした。
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅効率を促進する方法は、下記（１）～（２４）である。
（１）がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する方法であって、
　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
を含む。
　前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における反応は、
　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に強力に結合する人工合成核酸と、および
　　（ｉｉｉ）ｄＮＴＰと、
を反応剤として含み、
　前記反応における前記ｄＮＴＰ濃度が２．５μＭ～１０μＭであることを特徴とする。
（２）（１）に記載の方法における前記サンプルは、血液、血漿、および血清からなる群から選択され、
　前記サンプルから抽出されるＤＮＡが循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）であることを特徴とする。
（３）（１）または（２）に記載の方法における、前記校正機能のないＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
（４）（１）～（３）に記載の方法において、前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における増幅反応はＰＣＲであることを特徴とする。
（５）（１）～（４）に記載の方法は、前記人工合成核酸がペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする。
（６）（１）～（５）に記載の方法は、前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を検出する領域が、コドン１２およびコドン１３、コドン６１またはコドン１４６であることを特徴とする。
（７）（６）に記載の方法において、
　前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む領域に対応する野生型Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の領域に結合するＰＮＡの配列は、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
であることを特徴とする。
（８）（６）または（７）に記載の方法において、
　Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を増幅するプライマーの配列は、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：　５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’　（配列番号：１３）
であることを特徴とする。
（９）（６）に記載の方法に供する高感度Ｋ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットは、
　プライマーと、
　ＰＮＡと、
　ｄＮＴＰと、
　ＤＮＡポリメラーゼと、
を含む請求項６に記載の方法に供するＫ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットであって、
　前記ｄＮＴＰは、使用時の終濃度が２．５μＭ～１０μＭに調製できるものであることを特徴とする。
（１０）（９）に記載のキット前記ＤＮＡポリメラーゼが、前記プライマーおよび前記ＰＮＡが以下の配列が、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
　ＰＮＡ：５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
　ＰＮＡ：５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’ 　（配列番号：１３）
　ＰＮＡ：５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
であることを特徴とする。
（１１）（９）または（１０）に記載のキット前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
（１２）がん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の核酸変異の検出方法が、
　（１）から（８）に記載のいずれか一項の方法に記載の工程と、
　さらに（１）から（８）に記載のいずれか一項の方法により増幅した前記核酸領域の核酸の変異を検出する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
（１３）（１２）に記載の方法が、デジタルＰＣＲを用いることを特徴とする。
（１４）がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸領域の増幅工程中に生じるミスリーディングをなくすまたは減少させる方法であって、
　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
を含む。
　また、前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における反応は、
　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に結合する人工合成核酸と、および
　　（ｉｉｉ）ｄＮＴＰと、
を反応剤として含み、
　前記反応における前記ｄＮＴＰ濃度が２．５μＭ～１０μＭであることを特徴とする。
（１５）（１４）に記載の方法が、前記サンプルが血液、血漿、および血清からなる群から選択され、
　前記サンプルから抽出されるＤＮＡが循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）であることを特徴とする。
（１６）（１４）または（１５）に記載の方法が、前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする。
（１７）（１４）～（１６）に記載の方法は、前記校正機能のないＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
（１８）（１３）～（１６）のいずれか一項に記載の方法が、前記人工合成核酸がペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする。
（１９）（１４）～（１８）のいずれか一項に記載の方法は、前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を検出する領域が、コドン１２およびコドン１３、コドン６１またはコドン１４６であることを特徴とする。
（２０）（１９）に記載の方法は、前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む領域に対応する野生型Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の領域に結合するＰＮＡの配列は、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
であることを特徴とする。
（２１）（１９）または（２０）に記載の方法は、
　Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を増幅するプライマーの配列は、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：　５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’　（配列番号：１３）
であることを特徴とする。
（２２）（１９）に記載の方法に供する高感度Ｋ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットであって
　プライマーと、
　ＰＮＡと、
　ｄＮＴＰと、
　ＤＮＡポリメラーゼと、
を含み、
　前記ｄＮＴＰは、使用時の終濃度が２．５μＭ～１０μＭに調製できるものであることを特徴とするキット。
（２３）（２２）に記載のキットは、前記プライマーおよび前記ＰＮＡが以下の配列が、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
　ＰＮＡ：５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
　ＰＮＡ：５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’ 　（配列番号：１３）
　ＰＮＡ：５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
であることを特徴とする。
（２４）（２２または２３）に記載のキットは、前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする。
　本発明に係る特異的核酸配列の増幅促進方法は、増幅反応溶液中のｄＮＴＰの濃度を低くしてポリメラーゼ伸長時に起きるエラーを軽減することで擬陽性を低減させ、かつ、ＰＮＡなどの人工合成核酸を標的核酸の増幅工程で併用することにより、増幅産物中の標的核酸の増幅割合の比率を大幅に向上させ、生体サンプル中の微量の標的核酸の検出を高効率化することを可能にする。
各条件により核酸増幅後１０の８乗倍希釈した際の、デジタルＰＣＲにより測定した野生型産物のコピー数濃度を示す図である。図中の括弧内の番号は［表２］の条件の番号に相当する。 各条件により核酸増幅後１０の８乗倍希釈した際の、デジタルＰＣＲにより測定した変異型産物のコピー数濃度を示す図である。図中の括弧内の番号は［表２］条件の番号に相当する。 各条件により核酸増幅後１０の８乗倍希釈した際の、デジタルＰＣＲにより測定した変異型産物の相対比を示す図である。図中の括弧内の番号は［表２］の条件の番号に相当する。 各ｄＮＴＰ濃度でのＰＮＡ有無による変異富化率の比較を示す図である。
（１）定義
　本発明において用語「がん関連遺伝子」、または「がん遺伝子」とは、正常細胞の生育に不可欠な機能を有する遺伝子であるが、野生型の遺伝子の塩基配列の変異等により活性が異常に亢進し細胞のがん化を促進する遺伝子のことをいい、がん原遺伝子（正常細胞の野生型遺伝子）を含む。
　本発明において用語「変異型遺伝子」または「変異型」とは、遺伝子の核酸配列中に変異を生じた遺伝子のことをいう。
　本発明において用語「核酸」または「核酸分子」とは、２つ以上のヌクレオチド鎖、例えばＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を意味する。本明細書に記載の核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成ＤＮＡ等）等であり得る。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であってもよい。ＤＮＡが一本鎖である場合には、センスまたはアンチセンスであってもよい。
　本発明において用語「増幅」とは、標的遺伝子等の核酸の増幅手段、例えばＰＣＲ等によって増幅するものと、これにより得られた増幅産物中の特定の変異の塩基配列を検出するための増幅とがある。単に「増幅」と記載されている場合は前者のことを意味し、「検出のための増幅」との記載は後者のことを意味する。
　本発明において用語「人工合成核酸」または「人工核酸」とは、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、架橋化核酸（ＢＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）またはロックド核酸（ＬＮＡ：Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）のような人工的に合成された核酸をいう。
　本発明において用語「クランプ」または「クランピング」とは、特定のがん関連遺伝子の変異を増幅するにあたり、がん関連遺伝子の検出しようとする変異配列を有するがん関連遺伝子の核酸領域に対応する野生型のがん関連遺伝子の核酸領域に、人工合成核酸を特異的に結合させることをいう。
　また、本発明において用語「クランプ阻害」とは、特定のがん関連遺伝子の変異を増幅するにあたり、検出しようとする変異配列を有するがん関連遺伝子の核酸領域に対応する野生型のがん関連遺伝子の核酸領域に、人工合成核酸を特異的に結合させることにより、野生型の増幅を阻害することをいう。
　本発明において用語「富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、標的遺伝子、例えば変異の入ったがん関連遺伝子の野生型に対する相対的な量を増加させることをいう。
　本発明において用語「循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）」とは、死んだ細胞から放出された血流中に含まれるＤＮＡおよび／またはＤＮＡ断片のことをいう。
　本発明において用語「ミスリーディング」または「エラー」とは、ＰＣＲ増幅等における、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸の伸長時に、鋳型の配列とは異なる塩基が増幅産物に挿入されることをいう。ミスリーディングにより変異が入った遺伝子産物は、目的とする変異の入ったがん関連遺伝子とは区別されるものである。
（２）本願発明の概要
本出願に係る発明は、大きく以下の４つの発明である。
　第一の発明は、がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する方法の発明であり、
　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
を含むものであり、（ａ）工程における遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する反応は、
　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に強力に結合する人工合成核酸と、および
　　（ｉｉｉ）２．５μＭ～１０μＭの濃度のｄＮＴＰと、を含むことを特徴とする発明である。
　第二の発明は、第一の発明の方法に供する高感度Ｋ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットの発明である。このキットは、プライマーとＰＮＡを含み、これに限られるものではないが、前記プライマーおよび前記ＰＮＡのセットは、以下の（ａ）～（ｃ）のセットを用いることができる。
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号８のフォワードプライマー、配列番号９のリバースプライマー、および、配列番号５の人工合成核酸のセット
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号１０のフォワードプライマー、配列番号１１のリバースプライマー、配列番号６の人工合成核酸のセット
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号１２のフォワードプライマー、配列番号１３のリバースプライマー、および、配列番号７の人工合成核酸のセット。
　第三の発明は、第一の発明で増幅したＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸の変異を、核酸配列を特定することにより検出する方法に係る発明である。検出には例えばデジタルＰＣＲを用いることができる。
　第四の発明は、がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸領域を増幅させ、増幅工程中に生じるミスリーディングをなくすまたは減少させる方法の発明である。
この方法の発明は、
　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
を含むものであり、（ａ）工程における遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する反応は、
　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に強力に結合する人工合成核酸と、および
　　（ｉｉｉ）２．５μＭ～１０μＭの濃度のｄＮＴＰと、を含むことを特徴とする。
（３）がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異について
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法において検出する核酸の変異は、がん関連遺伝子に生じる体細胞変異を含む。そのようながん関連遺伝子に生じる体細胞変異には、例えば挿入、逆位、欠失、および／または点突然変異のような全ての形態の突然変異が含まれる。
　正常なＫ－ＲＡＳ遺伝子のタンパク質産物は、正常細胞の細胞増殖において上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）が出す細胞増殖のシグナルを核に伝達して、細胞増殖を促進する機能を有する。とりわけ、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の変異は多くのがんの発生における必須の段階であるので、Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を検出することは、がんの早期発見、または、がんの再燃、分子標的薬に対するがん細胞の進化などを知る上で重要であることから、本発明においては、数多くあるがん関連遺伝子の中から特にＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を検出することを第一の目的とした。
　これらの突然変異したＫ－ＲＡＳ遺伝子は、一つの対立遺伝子（ヘテロ接合性）または双方の対立遺伝子（ホモ接合性）にそれぞれ見出される野生型Ｋ－ＲＡＳとは異なり、体細胞性または生殖系列で見出され得る変異型Ｋ－ＲＡＳである。体細胞突然変異は、ある種の組織、例えば腫瘍組織でのみ生じるものであり、生殖細胞系列で遺伝するものではない。生殖系列突然変異は、体組織の任意のもので見出すことができる。
　本発明において「野生型遺伝子」または「野生型」とは、変異を生じておらず、本来の正常な機能を有する遺伝情報を含む遺伝子のことを意味する。
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法において検出する変異型のＫ－ＲＡＳとしては、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子のエクソン２～４上のコドン１２、１３、６１、および１４６のうちの１または２以上のアミノ酸置換を伴う突然変異したＫ－ＲＡＳが好ましい。前記変異型のＫ－ＲＡＳとしては、具体的には、Ｋ－ＲＡＳタンパク質のＧ１２Ａ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｒ、Ｇ１２Ｓ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｒ、Ａ１４６Ｔ、およびＡ１４６Ｖからなる群より選択される１または２以上の変異を有する変異型Ｋ－ＲＡＳが挙げられる。
　各変異型の核酸（遺伝子）突然変異の態様を表１に示す。また、Ｋ－ＲＡＳのアミノ酸配列を配列番号１に、Ｋ－ＲＡＳのエクソン２上のコドン１２を含む遺伝子配列を配列番号２に、Ｋ－ＲＡＳのエクソン３上のコドン６１を含む遺伝子配列を配列番号３に、Ｋ－ＲＡＳのエクソン４上のコドン１４６を含む遺伝子配列を配列番号４に、それぞれ示す。
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　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法における以下の各工程では、医学的重要性の観点から、高感度な検出が特に必要とされるＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸を測定対象とすることが好ましいが、Ｋ－ＲＡＳ以外の遺伝子にも有効に適用できるものであり、Ｋ－ＲＡＳに限定されるものではない。
　本発明において、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸としては、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子のゲノムＤＮＡの全長若しくはその部分、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの全長若しくはその部分、前記ｍＲＮＡの全長若しくはその部分を鋳型として得たｃＤＮＡ、またはこれらをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等によって人工的に増幅させた増幅産物等が挙げられる。
　また、本発明において、検出するＫ－ＲＡＳ遺伝子の変異は、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子のエクソン２～４上のコドン１２、１３、６１、および１４６のうちの１または２以上のアミノ酸置換を伴う突然変異したＫ－ＲＡＳが好ましい。
（４）第一の発明（増幅する方法の発明）について
　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法の例として、血液サンプル中に含まれる循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）のＫ－ＲＡＳの遺伝子型を調べる。血液サンプルとしては、末梢血液自体であってもよく、血清または血漿であってもよい。血液サンプルは、腫瘍組織よりも低侵襲的に被験者から採取することができる。したがって、再発腫瘍患者のように、腫瘍組織の生体サンプルの採取が困難な被験者についても、サンプルの調整が容易にできる。
　本発明における「（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程」は、一般的に汎用されている核酸抽出方法を適用することで患者の血液からｃｃｆＤＮＡを採取することができる。
　例えば、本工程の一実施形態としては、（ｉ）患者から血液を採血する工程と、（ｉｉ）採取した血液をｃｃｆＤＮＡ抽出するために前処理をする工程と、（ｉｉｉ）前処理した血液からｃｃｆＤＮＡを抽出する工程を含めることができる。
　例えば、一実施形態として、血液サンプルからのｃｃｆＤＮＡの抽出は、患者から採取した血液を遠心分離して、分離された血漿を回収し、回収した血漿中のｃｃｆＤＮＡをキアゲン社のキット「ＱＩＡａｍｐ　Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ」等を用いて抽出することができる。
　（ｂ）遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程
　本発明における「（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程」における、増幅方法では、ｄＮＴＰ濃度を低濃度とし、ＰＮＡを用いること以外は、一般的に汎用されるＰＣＲ条件を適用することができる。
　本増幅工程においては、ＰＮＡなどの人工核酸は、過剰の野生型に結合して、野生型の増幅を阻害して、反応溶液中の微量の変異型を富化させる機能を果たす。また、本増幅工程においては、ｄＮＴＰ濃度を低濃度で用いることで、ミスリーディングを低減させることができる。ＰＮＡをＰＣＲ増幅の際の反応溶液に添加し、同時にｄＮＴＰ量を２．５～１０μＭと低濃度にすることにより、ミスリーディングを低減またはなくし、かつ、ＰＣＲの増幅効率を向上させることができる。したがって、その後の工程であるＫ－ＲＡＳ遺伝子の変異型の検出を容易にすることが出来る。
　ＰＣＲ反応液の組成、ＰＣＲ条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、当業者であれば、本明細書に記載のプライマーペアを用いたＰＣＲにおいてＰＣＲ増幅産物が得られるように、予備実験等により適切に選択および設定をすることができる。
　例えば、ＰＣＲの一実施形態として、ＰＣＲの反応サイクルは、（ｉ）鋳型となる患者の血液から抽出したｃｃｆＤＮＡを熱変性する工程と、（ｉｉ）プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリングする工程と、（ｉｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマーの伸長反応を行う工程とを含む工程を繰り返すことにより、遺伝子変異を有する特定の領域の塩基配列を増幅させることができる。
　ＰＣＲの上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を含む反応サイクルは、例えば、サイクル数２０～５０回の間で設定し、ＰＣＲ産物を増幅することができる。サイクル数は予備実験等により適切に選択および設定をすることができる。
　ＰＣＲの上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程は、例えば一例では、（ｉ）の工程は、２本鎖ＤＮＡを通常９３～９６℃の温度範囲で、３０～６０秒間処理することにより、それぞれ１本鎖のＤＮＡに遊離させる。変性の温度は９３℃でも十分な場合が多いが、９４℃まで上げたほうが無難である。標的配列によっては、９５℃まで上げてみるのがよい場合もある。
　（ｉｉ）の工程において、熱処理して1本鎖になった鋳型ＤＮＡとプライマーが、２本鎖を形成してプライミング反応を起こすためには、アニーリングの温度をプライマーのＴｍ以下の温度にすべきである。すなわち、プライマーと鋳型とのハイブリッドができるのに十分な低さで、しかもミスマッチのハイブリッドの形成しないような十分な高さの温度に設定すべきである。
　通常は、プライマーに用いるオリゴヌクレオチドのＴｍを推定し、このＴｍをアニーリング温度の基準値としてＰＣＲを行う。温度は５５℃、時間は３０秒間が標準である。目的とする標的配列以外の非特異的増幅が見られるときは、例えば１℃～２℃間隔で温度を上げてみる。逆に、全く何も増幅されないときは、例えば１℃～２℃間隔で温度を下げてみる。
　（ｉｉｉ）の工程の温度および伸長反応に要する時間は、鋳型ＤＮＡの濃度、標的配列のサイズ、反応温度等により左右される。標的配列のサイズが１Ｋｂ以下の場合は１分間で十分である。それ以上のサイズの場合は、１Ｋｂにつき１分間の割合で長くする。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ伸長速度は、７０℃において約６０ヌクレオチド／秒なので、このことを考慮に入れて伸長時間を適宜設定すればよい。
　さらに、ＰＣＲ反応の開始時点での非特異的反応を避け、特異的な増幅の効率を高めるために、反応開始時に高温でＰＣＲ反応液の完全な混合を行うホットスタート法を用いてもよい。
　具体的なＰＣＲの反応条件の例は後述する実施例に記載されているが、これは一例に過ぎない。ＰＣＲ反応におけるアニーリング温度、ＰＣＲ反応の試薬の組成、アニーリング時間等の反応条件は、プライマーとなるオリゴヌクレオチド配列の長さおよび／または塩基組成に応じて、予備実験等により適切に選択および設定することができる。ＰＣＲの一連の操作は、市販のＰＣＲキットまたはＰＣＲに必要なサーマルサイクラーなどの装置を利用して、その操作説明書に従って行うことができる。
　　例えば、ＰＣＲの一実施形態として、ＰＣＲ反応溶液には、患者の血液から上述した（４）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程により採取したｃｃｆＤＮＡを鋳型ＤＮＡとし、２．５μＭ～１０μＭの低濃度のｄＮＴＰｍｉｘと、これに限られるものではないが以下の（ａ）～（ｃ）に示されるフォワードプライマー、リバースプライマーと人工合成核酸のセットと、ＭＯＰＳ緩衝溶液などの緩衝溶液と、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼと、ＭｇＣｌ2および／またはＮａＣｌなどの塩を含めることができる。　
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号８のフォワードプライマー、配列番号９のリバースプライマー、および、配列番号５の人工合成核酸のセット
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号１０のフォワードプライマー、配列番号１１のリバースプライマー、配列番号６の人工合成核酸のセット
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号１２のフォワードプライマー、配列番号１３のリバースプライマー、および、配列番号７の人工合成核酸のセット。
　また、本発明の一実施形態では、上記配列番号５、６および７と同じ配列を有するＢＮＡまたはＬＮＡなどの架橋化核酸をＰＣＲの増幅反応においてＰＮＡの換わりに用いることによって、ＰＮＡと同様の効果を得ることができる。
　例えば、ＰＣＲ反応の一実施形態において、ＰＣＲ反応溶液の組成物の各々の標準的な濃度は、これに限られるものでないが以下の範囲で調製することができる。鋳型となるｃｃｆＤＮＡの濃度は１～１００００コピー数／μＬの範囲で調製することができる。フォワードプライマーおよびリバースプライマーの濃度を０．１～１０μＭ、好ましくは０．２～２μＭの範囲で調製することができる。ＭＯＰＳ緩衝溶液の濃度およびｐＨを１～５０ ｍＭおよびｐＨ６．５～７．９の範囲で調製することができる。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの濃度を０．０２～０．５Ｕ／μＬの範囲で調製することができる。ＭｇＣｌ2の濃度を１．５～８．５ｍＭの範囲で調製することができる。ＮａＣｌの濃度を１０～２０ｍＭの範囲で調製することができる。
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法において、特に核酸増幅反応で使用されるｄＮＴＰの濃度が重要である。ｄＮＴＰの濃度は、好ましくは終濃度２．５μＭ～５０μＭであり、より好ましくは２．５μＭ～５μＭであり、さらに好ましくは２．５μＭの範囲である。
　また、本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法において、ＰＮＡによる擬陽性を低減できる濃度は、好ましくは終濃度０．１～１０μＭであり、より好ましくは０．１～２μＭである。
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法で用いられるＤＮＡポリメラーゼは、校正機能をもたないＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。そのようなＤＮＡポリメラーゼとしては、製造品質の安定性が保たれていること、ライセンスフリーで使用できることを鑑みてＴａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが好ましいが、これに限定されるものではない。また、Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅと同等の機能を有するいかなるＤＮＡポリメラーゼも本発明で使用することができる。
（５）第二の発明（キットの発明）について
　本発明は、血液サンプル中のＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出、および／または、検出されたＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定に用いられる試薬等を含むキットを包含する。このキットを用いることで、本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法をより簡便に行うことができる。
　このようなキットを構成する試薬には、がん遺伝子の変異配列をＰＣＲ増幅するために用いるプライマーセットと、野生型遺伝子をクランピングするペプチド核酸または架橋化核酸と、ｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくはＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ）を含み、さらにリガーゼなどの酵素、緩衝溶液（例えば、ＭＯＰＳ緩衝液）、塩、トレハロースを含んでいても良い。
　本発明に係るキットを構成するプライマーおよびＰＮＡ等の人工核酸の配列は、Ｋ－ＲＡＳの変異配列を増幅できるものであれば特に限定されない。プライマー、ＲＮＡ等は、適宜設計することができる。好ましくは、これに限られるものではないが、以下の（ａ）～（ｃ）のセットを用いることができる。
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号８のフォワードプライマー、配列番号９のリバースプライマー、および、配列番号５の人工合成核酸のセット
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号１０のフォワードプライマー、配列番号１１のリバースプライマー、配列番号６の人工合成核酸のセット
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、配列番号１２のフォワードプライマー、配列番号１３のリバースプライマー、および、配列番号７の人工合成核酸のセット。
　キットに含まれる更なる試薬としては、血液サンプルから核酸を抽出するための試薬、Ｋ－ＲＡＳの特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブ、または、プライマー（Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の突然変異の部位またはその隣接部位に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド）等が挙げられる。
　また、当該キットには、特定の指示が記載された書面等が含まれていてもよい。その書面には、血液サンプル中のＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出、その遺伝子型の決定方法についてのプロトコル、および／または、得られたＫ－ＲＡＳの遺伝子型のステイタスの結果からのＥＧＦＲ阻害剤に対する感受性の判定するための基準についての指示が記載された書面等が含まれていてもよい。
　これらのキットの使用形態のひとつには、例えば、キットに含まれる試薬を搭載した９６ウェルプレートにサンプルを１～５０μＬ添加し、汎用されているリアルタイムＰＣＲで増幅反応を行うことができるものが含まれる。他の使用形態としては、検出にＴａｑＭａｎプローブを用いるものがある。具体的には、キットに含まれる９６ウェルプレートに、ＴａｑＭａｎプローブと試薬を添加して増幅産物の検出を行うこともできる。
　本キットを用いて増幅した増幅産物については、次世代シークエンサー、インベーダー法など、汎用される遺伝子変異を検出する方法を用いて、その遺伝子変異を検出する。
（６）第三の発明（検出方法の発明）について
　本出願に係る発明は、血液サンプル中のＫ－ＲＡＳなどの遺伝子型を決定する場合は、核酸レベル（ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ）で検出するのが好ましい。
　第三の発明は、上記第一の発明で説明した工程、すなわち、
　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
を含み、
　（ａ）工程における遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する反応は、
　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に強力に結合する人工合成核酸と、および
　　（ｉｉｉ）２．５μＭ～１０μＭの濃度のｄＮＴＰと、を含むことと、
　上記工程により増幅した前記核酸領域の核酸の変異を検出する工程と、を含むことを特徴とする発明である。
　第三の発明において、増幅する工程は、上記第一の発明の通りである。この第三の発明では、上記増幅の工程で、第二の発明のＫ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットを用いることができる。
　血液サンプル中のＫ－ＲＡＳなどの遺伝子由来核酸の検出、検出されたＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定、または、変異型のコピー数の同定は、常法により行うのが好ましい。　
　具体的には、当該血液サンプル中のｃｃｆＤＮＡからＫ－ＲＡＳの特定の領域について、本発明の上述の第二の発明に係るキットを使用して、第一の発明により増幅した増幅産物中のＫ－ＲＡＳ遺伝子の存在の有無および野生型か変異型かの決定を、核酸配列を決定できる検出方法により決定するのが好ましい。
　例えば、血液サンプル中のＫ－ＲＡＳの存在またはその変異型のコピー数の同定は、血液サンプル中に含まれているｃｃｆＤＮＡのＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸を、デジタルＰＣＲを用いて検出することによって同定するのが好ましい。特にバイオラッド社のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の技術（非特許文献４：Ｈｉｎｄｓｏｎ，et.al.，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，2011，vol.83（22），pp. 8604－8610）を利用することにより、高感度に検出することができる。
　検出にはバイオラッド社のデジタルＰＣＲ用のキット「ＰｒｉｍｅｒＰＣＲ ｄｄＰＣＲ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ」を用いるのが好ましい。デジタルＰＣＲの条件（温度サイクル、サイクルの回数等）は、当業者であればＰＣＲ増幅産物が得られるように、予備実験等により適切に選択および設定をすることができる。
　ドロップレットの数が多ければ多いほど、解析精度が高くなる。０．０１％の突然変異を検出する性能を担保するためには、一つの突然変異を検出するために１０，０００ドロップレットが必要である。そのために、ＰＣＲのマスターミックス中の界面活性剤濃度を規定することが好ましい。
　例えば、ＤＮＡ伸長酵素などの保存液として用いられるエチレングリコールまたはグリセロールは、終濃度で０．１５％以下に、またはＴｒｉｔｏｎ－Ｘは、終濃度０．０００３％以下であることが好ましい。上記界面活性剤が、前記終濃度以上になるとドロップレットによるエマルジョン数が激減し、高感度に突然変異を検出することが困難になる。
　また、血液サンプルから得られた核酸および核酸断片を用いて、ＰＣＲで、増幅反応を１５～５０サイクル行い、当該核酸中の検出すべき変異型Ｋ－ＲＡＳのアリルコピー数（ａｌｌｅｌｅ　ｃｏｐｙ　ｎｕｍｂｅｒ）の絶対量を増幅させた後、１０6コピー数程度に希釈してから、公知の突然変異検出方法を行うこともできる。当該方法によれば、反応系に存在する変異型の全体数を増加させるため、突然変異の種類が増えても、変異型のアリルが物理的に存在せずに検出不能となる可能性を下げることができる。さらに、当該方法を、前記のデジタルＰＣＲと組み合わせてもよい。
　その他の方法としては、例えば、血液サンプル中の核酸を鋳型としたＰＣＲ等により、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅した後、この増幅産物に対して、Ｋ－ＲＡＳの特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブを接触させて会合体が形成されたか否かを高感度に検出する方法が挙げられる。ハイブリダイゼーションを行う前に、前記増幅産物の希釈物に対してエマルジョンＰＣＲを行うことも好ましい。
　前記プローブは、例えば放射性同位元素（3Ｈ、32Ｐ、33Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセン等）または発色剤で検出可能に標識される。また、当該プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ－ホスホロアミデート類、ＬＮＡであってもよい。なお、当該プローブの塩基長さは、約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、または約１０から約７５、あるいは約１５から約５０、または約２０から約３０でありうる。
　血液サンプル中のＫ－ＲＡＳの存在およびその遺伝子型は、インベーダー（登録商標）法（Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｏｌｉｖｉｅｒ，　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５７３：１０３－１１０，　２００５）を使用して分析することもできる。
　インベーダー法とは、ＰＣＲなどによって調製された二本鎖ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡに対して、部分的に三重塩基を形成するように、アレルプローブとインベーダーオリゴがハイブリダイゼーションを行う。
　ここで、アレルプローブの５’末端の一部は、前記二本鎖ＤＮＡまたはｍＲＮＡと非相補的な配列（フラップ部）を有するように設計されているが、インベーダーオリゴは完全にそれらに対して相補的な配列を有している。２種のアレルプローブは、それぞれ野生型、変異型に対して相補的になるように設計されている。上記二本鎖ＤＮＡまたはｍＲＮＡに対し競合的にハイブリダイゼ－ションを行い、完全な相補でハイブリダイゼーションした際に、フラップエンドヌクレアーゼが一部三重塩基になっている部分を認識する。そして、アレルプローブのフラップ部が、同反応系に存在する自己相補型ＦＲＥＴカセットにハイブリダイゼーションする。この時に、前記の一部三重塩基になる部分ができ、目的の突然変異をフラップエンドヌクレアーゼが切断し、ＦＲＥＴカセット内の蛍光修飾されたＤＮＡ断片が遊離して、ＦＲＥＴ内の消光物質と乖離するために蛍光を発する。理論上、一度切断されたアレルプローブのフラップ部は、別のＦＲＥＴカセットに再度ハイブリダイゼーションすることができ、それによりシグナルが増幅され、非常に高感度に突然変異を検出できる。
　当該分野で汎用されているリガーゼ連鎖反応を、Ｋ－ＲＡＳ遺伝子中の変異部位をコードする領域を含む断片を増幅させるために使用することができる（例えば、非特許文献５：Wu，et.al.，Genomics，1989，vol.4，pp.560－569を参照。）。また、変異特異的ＰＣＲとして知られている技術を使用することもできる（例えば、非特許文献６：Ruano　and　Kidd，Nucleic　Acids　Research，1989，vol.17，pp.8392を参照。）。当該技術によれば、特定のＫ－ＲＡＳ突然変異にその３’末端でハイブリダイズするプライマーが使用される。特定のＫ－ＲＡＳ突然変異が存在していない場合は、増幅産物は観察されない。また、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）（例えば、特許文献３：欧州特許出願公開第０３３２４３５号明細書、および、非特許文献７：Newton　et.al.，Nucleic　Acids　Research，1989，vol.17，pp.7参照。）も使用することができる。
　血液サンプル中のＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸の検出または、検出されたＫ－ＲＡＳ遺伝子由来核酸の遺伝子型の決定には、上述のデジタルＰＣＲおよびインベーダー法以外の検出手段である次世代シーケンサーまたはキャピラリーシークエンサーなども利用することができる。これらの手段を用いて、遺伝子の欠失、挿入、変換などの遺伝子変異を検出することができる。
　その他の方法としては、具体的には、例えば、サンガー法を基礎とするシークエンス解析法を利用し、血液サンプル中のＫ－ＲＡＳ遺伝子のゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ、またはこれらの増幅産物等の塩基配列を直接決定する方法が挙げられる。また、塩基配列の決定は、ＰＣＲを介して行うこともできる。その他、遺伝子または周りのマーカー遺伝子に対する制限断片長多型（ＲＦＬＰ）プローブを、多型断片におけるアレルの改変または挿入をスコア付けするために使用することができる。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析もまた、アレルの塩基変化変異体を検出するために使用することができる（非特許文献８：Orita　et.al.，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences，USA，1989，vol.86，pp.2766－2770、および、非特許文献９：Genomics，1989，vol.5，pp.874－879）。
（７）第四の発明（ミスリーディングをなくすかまたは減少させる発明）について
　第四の発明は、上述したように、工程（ａ）と工程（ｂ）を含み、ミスリーディングをなくすかまたは減少させる方法である。これらの発明は第一の発明と同じ条件を適用することができる。
　第四の発明により、増幅工程中のミスリーディングをなくすかまたは減少させることができる。
　第四の発明は、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのような校正機能をもたないＤＮＡポリメラーゼを用いたとしても、増幅工程中のＤＮＡポリメラーゼの性能に基づくミスリーディングをなくすかまたは減少させることができる。また、本発明では、第二の発明のキットを増幅工程において用いることができる。
（８）本願発明が適用可能な病態とがん関連遺伝子について
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法において、抗がん剤に対する感受性、もしくは、耐性の獲得が予測されるがん種、あるいは再発が予測されるがん種は、ＥＧＦＲ仲介性腫瘍（癌）、すなわち、腫瘍形成にＥＧＦＲがある役割を担っている腫瘍であれば特に限定されるものではない。
　当該腫瘍には、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、甲状腺、食道、肝臓の癌、肉腫、膠芽細胞腫、頭頸部、白血病およびリンパ性悪性疾患が含まれる。より詳細には、神経芽細胞腫、腸癌（例えば、直腸癌、大腸癌、家族性大腸ポリポーシス癌および遺伝性非ポリポーシス大腸癌）、食道癌、口唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺動脈乳頭癌、腎臓癌、腎実質癌、卵巣癌、頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、尿管癌、メラノーマ、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫および末梢神経外胚葉性腫瘍）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病骨（ＡＭＬ）、慢性髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｉｏｍａ）、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫および形質細胞腫が含まれ得る。本発明に係る方法において対象となる腫瘍としては、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、および子宮頸癌からなる群より選択される１種または２種以上であることが好ましいが、これに限られるものではない。
　本発明の方法を適用できる「がん遺伝子」、または「がん関連遺伝」の具体例としては、ＡＬＫ、ＥＧＦＲ、Ｈ－ＲＡＳ、Ｎ－ＲＡＳ、Ｋ－ＲＡＳ、Ａ－ＲＡＦ、Ｂ－ＲＡＦ（ＢＲＡＦ）、Ｃ－ＲＡＦ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＡＫＴ、ＴＰ５３（ｐ５３）、ＣＴＮＮＢ１（ベータ－カテニン）、ＡＰＣ、ＫＩＴ、ＪＡＫ２、ＮＯＴＣＨ、ＦＬＴ３、ＲＳＫ、ＥＴＳ、ＥＬＫ－１、ＳＡＰ－１、ＭＡＰＫ経路に関連するがん関連遺伝子などが挙げられるが、これに限られるものではない。
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法において、抗がん剤に対する感受性、もしくは耐性の獲得が予測されるがん種、あるいは、再発が予測されるがん種は、原発巣（原発性腫瘍）であってもよく、転移巣（転移性腫瘍）であってもよい。また、再発性腫瘍であってもよい。さらに、腫瘍が、被験者の体内の複数個所に存在していてもよい。
　本発明に係るがん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の増幅を促進する方法は、抗がん剤の投与処置の適用の有無を判断する際、および／または早期再発診断に重要な情報を提供し得る。つまり、本発明に係る当該方法は、臨床医に有用な情報を提供でき、当該方法より得られた情報に基づき、臨床医らは適切な治療方法を決定することができる簡便な高感度検出方法を提供にする。
　本発明において使用される人工合成核酸の配列、フォワードプライマー、およびリバースプライマーは以下の通りである。配列番号は、本出願当初明細書に添付の配列表に対応する。
（人工合成核酸の配列）
　前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む領域に対応する野生型Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の領域に結合するＰＮＡの配列は、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域に結合させる場合は、
　５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
（フォワードプライマーおよびリバースプライマーの配列）
　Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を増幅するプライマーの配列は、
　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
　フォワードプライマー：　５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’　（配列番号：１３）
［実施例］
　以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　Ｋ－ＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ変異型）の反応系において、ｄＮＴＰの終濃度を５０μＭ、１０μＭ、５μＭ、および２．５μＭに振り、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の添加が有る場合と無い場合の合計８つの条件にてＰＣＲを表２に示す試薬組成にて実施した。鋳型には、合成した人工遺伝子プラスミドを使用し、野生型が１００％（１００％Ｗｔ）のものと、Ｇ１３Ｄ変異型が０．２％（０．２％Ｇ１３Ｄ（０．２％Ｍｔ）、９９．８％Ｗｔ）のものと、２種類で実施した。鋳型の終濃度は、ゲノムＤＮＡ １０００コピー/μＬ相当に値する５ｆｇ/μＬとした。人工遺伝子プラスミドについては、ピコグリーンで濃度測定を行ったものを用いた。標的のインサート配列は、３００ｂｐとし、ベクター長は３．９ｋｂのものを用いた。表２に記載の「プライマー１」および「プライマー２」は、それぞれ「配列番号８」および「配列番号９」のプライマーである。また、「ペプチド核酸」は「配列番号５」のペプチド核酸である。
　ＰＣＲ反応は９６ｗｅｌｌプレート上でライトサイクラー（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて実施した。　
　遺伝子変異を有する特定の領域の塩基配列を増幅させるＰＣＲの反応サイクルは、（ｉ）ＤＮＡを熱変性する工程と、（ｉｉ）プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリングする工程と、および（ｉｉｉ）耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマーの伸長反応を行う工程とを含む工程を繰り返すことにより行った。　
　反応容量１０μＬとし、ＰＣＲ温調条件は、（ｉ）の工程は９５℃、１２０秒で行い、（ｉｉ）の工程は９５℃、５秒で行い、（ｉｉｉ）の工程は６６℃、２０秒で行った。（ｉｉ）の工程および（ｉｉｉ）の工程を連続して行うことを１サイクルとして、３５サイクル行った。その後、９７℃、１２０秒での処理を行った後、冷却して反応を終了した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　さらにその増幅産物１６種類を１０8倍に蒸留水にて希釈し、それらを鋳型とし、デジタルＰＣＲを実施することで、各ＰＣＲ産物中の野性型および変異型のＰＣＲ産物量の定量を行なった。これにより、ｄＮＴＰ濃度が、Ｋ－ＲＡＳの野生型のクランプ効果、および／または変異富化率にどのように影響するかを検討した。また、ＰＮＡの有無によるエラー頻度についても確認を行った。デジタルＰＣＲは、バイオラッド社製のＱＸ－１００システムを用いた。反応組成について表３に示す。単位はマイクロリットル（μＬ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　野生型および変異型のコピー数の同定のためのデジタルＰＣＲの反応条件は、（１）前処理工程、（２）増幅工程、および（３）後処理工程の（１）～（３）の工程からなる。　
　（１）の前処理工程は９５℃、１０分間で行う。　
　（２）の増幅工程は、さらに（ｉ）９４℃、３０秒間でアニーリングする工程と、（ｉｉ）５５℃、６０秒間で増幅する工程とを含む反応サイクルであって、（ｉ）の工程の後に（ｉｉ）の工程で処理するサイクルを１サイクルとして、４０サイクル処理することで標的核酸を増幅させる。　
　（３）の後処理工程は、９８℃、１０分間で行い、その後冷却して反応を終了させる。
＜結果＞
　（１）Ｋ－ＲＡＳ野生型の産物量について（図１）
　各ＰＣＲ産物中の野性型の産物量は、（１）～（４）、（１’）～（４’）、（５）～（８）および（５’）～（８’）のいずれの条件においても、ｄＮＴＰの濃度が低くなるにつれて減少した。また、ＰＮＡ添加によるクランピング効果により、野性型の産物量が減少し、増幅が阻害されていることがわかった。阻害は、ｄＮＴＰの濃度が２．５μＭの時に最大を示すことがわかった。
　（２）Ｋ－ＲＡＳ Ｇ１３Ｄ 変異型の産物量について（図２）
　各ＰＣＲ産物中の変異型の産物量は、ＰＮＡの添加により大幅に増加した（図２、（１’）－（４’）および（５’）－（８’）を比較）。また、野生型のみが存在するサンプルにおいても変異型が検出された（図２、（１）－（４））。これは、ミスリーディングによりＧ１３Ｄが一定の割合で増幅されていることを示している。これらは先行文献(非特許文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ, ２００８、Ｖｏｌ. １０, Ｎｏ． ４)とも一致する。彼らは、この論文の中で、ＰＮＡクランプ時にＴａｑポリメラーゼによる間違った塩基が挿入され、特にアデニンが挿入されやすいことを証明している。一方、ＰＮＡなしの実験系では、野生型からＧ１３Ｄの変異型の増幅は、ｄＮＴＰ濃度が５０μＭでわずかに観察されているが、ｄＮＴＰ濃度を減らすと野生型の増幅量が低下するとともにミスリーディングによるＫ－ＲＡＳのＧ１３Ｄの変異型の増幅も検出されなくなる（図１および図２における（５）－（８））。
　野生型の産物量も変異型の産物量もｄＮＴＰの濃度が低くなると減少するが（図１、２）、変異型を含むサンプルにＰＮＡを添加した系である図２の（１‘）－（４’）の場合のみ、ｄＮＴＰの濃度が低くなるにつれ変異型の産物量の増幅効率が大幅に向上した。
　この結果は、図１および図２の増幅におよぼすｄＮＴＰの濃度変化の結果をあわせてみても、予期できない驚くべき発見であるといえる。
　（３）Ｋ－ＲＡＳ Ｇ１３Ｄ 変異型の産物中の割合について（図３）
　図３は、各条件におけるＰＣＲ産物における野生型の増幅量と変異型の産物量を合計した値に対するＫ－ＲＡＳ変異型の産物量を表したものである。
　各ＰＣＲ産物中の変異型の割合は、ＰＮＡを添加した０．２％の変異型を含むサンプルでのみ、ｄＮＴＰの濃度の減少に伴い大幅に増加した（図３、（１‘）－（４’））。これらは、ｄＮＴＰの濃度を下げたことにより野生型の量が減少したことと（図１）、変異型の量が増大したこと（図２）による相乗効果である。これにより、サンプルに含まれる０．２％の変異型を最大約４０％にまで富化出来たことを示す。
　（４）ＰＮＡ添加有無およびｄＮＴＰ濃度変化によるＫ－ＲＡＳ Ｇ１３Ｄ変異型の富化効果について（図４）
　０．２％の変異型を含むサンプルにＰＮＡ添加しＰＣＲを行うと、サンプル中の変異型のＰＣＲ産物の割合が大幅に増加することが分かる。さらに、ｄＮＴＰの濃度を下げてＰＣＲを行うと、ｄＮＴＰの濃度低下に伴い、変異型の割合が劇的に増加したことが分かる。ｄＮＴＰ濃度が５０μＭの時では、富化効果がＰＮＡありのサンプルはＰＮＡ添加なしのサンプルに比べて約１４倍であったものが、ｄＮＴＰ濃度が２．５μＭでは、富化効果がＰＮＡありのサンプルはＰＮＡ添加なしのサンプルに比べて約２０３倍まで向上した。

Claims (24)

  1. 　がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する方法であって、
    　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
    　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
    を含み、
    　前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における反応は、
    　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
    　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に結合する人工合成核酸と、および
    　　（ｉｉｉ）ｄＮＴＰと、
    を反応剤として含み、
    　前記反応における前記ｄＮＴＰ濃度が２．５μＭ～１０μＭであることを特徴とする方法。
  2. 　前記サンプルが血液、血漿、および血清からなる群から選択され、
    　前記サンプルから抽出されるＤＮＡが循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　前記校正機能のないＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記人工合成核酸がペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を検出する領域が、コドン１２およびコドン１３、コドン６１またはコドン１４６であることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む領域に対応する野生型Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の領域に結合するＰＮＡの配列は、
    　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域に結合させる場合は、
    　５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
    　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域に結合させる場合は、
    　５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
    　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域に結合させる場合は、
    　５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
    であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
  8. 　Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を増幅するプライマーの配列は、
    　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
    　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
    　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
    　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
    　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：　５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
    　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’　（配列番号：１３）
    であることを特徴とする請求項６または７に記載の方法。
  9. 　プライマーと、
    　ＰＮＡと、
    　ｄＮＴＰと、
    　ＤＮＡポリメラーゼと、
    を含む請求項６に記載の方法に供するＫ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットであって、
    　前記ｄＮＴＰは、使用時の終濃度が２．５μＭ～１０μＭに調製できるものであることを特徴とするキット。
  10. 前記プライマーおよび前記ＰＮＡが以下の配列が、
    　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
    　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
    　ＰＮＡ：５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
    　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
    　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
    　ＰＮＡ：５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
    　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
    　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’ 　（配列番号：１３）
    　ＰＮＡ：５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
    であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
  11. 　前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項９または１０に記載のキット。
  12. 　がん関連遺伝子の遺伝子変異を含む核酸領域の核酸変異の検出方法であって、
    　請求項１から８に記載のいずれか一項の方法に記載の工程と、
    　請求項１から８に記載のいずれか一項の方法により増幅した前記核酸領域の核酸の変異を検出する工程と、
    を含むことを特徴とする方法。
  13. 　デジタルＰＣＲを用いることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. 　がん関連遺伝子であるＫ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む核酸領域の増幅工程中に生じるミスリーディングをなくすまたは減少させる方法であって、
    　　（ａ）患者から採取したサンプルからＤＮＡを抽出する工程と、
    　　（ｂ）前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程と、
    を含み、
    　前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における反応は、
    　　（ｉ）校正機能のないＤＮＡポリメラーゼと、
    　　（ｉｉ）前記遺伝子変異を含む核酸領域に対応する前記サンプル中の野生型遺伝子の領域に結合する人工合成核酸と、および
    　　（ｉｉｉ）ｄＮＴＰと、
    を反応剤として含み、
    　前記反応における前記ｄＮＴＰ濃度が２．５μＭ～１０μＭであることを特徴とする方法。
  15. 　前記サンプルが血液、血漿、および血清からなる群から選択され、
    　前記サンプルから抽出されるＤＮＡが循環遊離ＤＮＡ（ｃｃｆＤＮＡ）であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 　前記遺伝子変異を含む核酸領域を増幅する工程における増幅反応がＰＣＲであることを特徴とする請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記校正機能のないＤＮＡポリメラーゼがＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項１４～１６に記載の方法。
  18. 　前記人工合成核酸がペプチド核酸（ＰＮＡ）であることを特徴とする請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 　前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を検出する領域が、コドン１２およびコドン１３、コドン６１またはコドン１４６であることを特徴とする請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 　前記Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を含む領域に対応する野生型Ｋ－ＲＡＳ遺伝子の領域に結合するＰＮＡの配列は、
    　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域に結合させる場合は、
    　５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
    　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域に結合させる場合は、
    　５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
    　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域に結合させる場合は、
    　５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
    であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
  21. 　Ｋ－ＲＡＳの遺伝子変異を増幅するプライマーの配列は、
    　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
    　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
    　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
    　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
    　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：　５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
    　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’　（配列番号：１３）
    であることを特徴とする請求項１９または２０に記載の方法。
  22. 　プライマーと、
    　ＰＮＡと、
    　ｄＮＴＰと、
    　ＤＮＡポリメラーゼと、
    を含む請求項１９に記載の方法に供する高感度Ｋ－ＲＡＳ遺伝子変異検出キットであって、
    　
    　前記ｄＮＴＰは、使用時の終濃度が２．５μＭ～１０μＭに調製できるものであることを特徴とするキット。
  23. 前記プライマーおよび前記ＰＮＡが以下の配列が、
    　（ａ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１２およびコドン１３を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＣＡＣＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡ－３’　（配列番号：８)
    　リバースプライマー：５‘－ＴＣＧＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＴＡＧＣＴＧＴＡＴＣＧ－３’　（配列番号：９)
    　ＰＮＡ：５‘－ＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ－３’　（配列番号：５)
    　（ｂ）Ｋ－ＲＡＳのコドン６１を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＣＡＡＧＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＡＣＣＴＧＴＣＴＣＴ－３’　（配列番号：１０）
    　リバースプライマー：５‘－ＣＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＧＴＡＣＴＧＧＴＣＣＣＴＣ－３’ 　（配列番号：１１）
    　ＰＮＡ：５‘－ＣＡＧＧＴＣＡＡＧＡＧＧＡ－３’　（配列番号：６)
    　（ｃ）Ｋ－ＲＡＳのコドン１４６を含む核酸領域を増幅する場合は、
    　フォワードプライマー：５‘－ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＡＡＡＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣＴＴＡ－３’　（配列番号：１２）
    　リバースプライマー：５‘－ＡＡＡＴＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＧＡＴＣＴＧＴＡ－３’ 　（配列番号：１３）
    　ＰＮＡ：５‘－ＧＡＡＡＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＡＧ－３’　（配列番号：７)
    であることを特徴とする請求項２２に記載のキット。
  24. 　前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２２または２３に記載のキット。
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