JPH11506609A

JPH11506609A - 生体液中の遺伝子配列の検出

Info

Publication number: JPH11506609A
Application number: JP9501000A
Authority: JP
Inventors: ディー．ソレンソン，ジョージ
Original assignee: トラスティーズオブダートマスカレッジ
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-03
Publication date: 1999-06-15
Also published as: US6020124A; EP0832285A1; WO1996040995A1; CA2220646A1

Abstract

(57)【要約】生体液中の遺伝子配列、例えば突然変異した遺伝子および癌遺伝子を検出する方法を提供する。体液試料（例えば血漿、血清、尿など）を入手し、除タンパク質し、試料中に存在するＤＮＡを抽出する。次いで、増幅手順、例えばＰＣＲまたはＬＣＲを用いて変異遺伝子配列を増幅して、ＤＮＡを増幅する。一実施態様では、増幅手順の前または間に、ＤＮＡをペプチド核酸と接触させる。

Description

【発明の詳細な説明】生体液中の遺伝子配列の検出［政府の援助］本発明へと導く研究は、ＮＩＨ助成金第CA47248 号および第CA58625 号による政府の資金提供によって援助された。［発明の背景］可溶性ＤＮＡは、健康な個体の血液中に約５〜10ng／mlの濃度で存在することが公知である。可溶性ＤＮＡは、自己免疫病、特に全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）や、その他のウイルス性肝炎、癌および肺動脈塞栓症などの疾病を有する個体の血中では、高いレベルで存在すると考えられる。循環する可溶性ＤＮＡが、血中に出現することが特に多い特定の種類のＤＮＡを表すのか否かは、不明である。しかし、研究は、このＤＮＡが、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖および一本鎖ＤＮＡの混合物として振舞うこと、そして一本鎖領域を有する未変性ＤＮＡで構成されているらしいことを示している［R.H．Dennin（1979）Klin．Wochenschr．57: 451-456; C.R．Steinman（1948）J．Clin．Invest．73:832-841; G.J．Fournie et al.（1986）Analytical Biochem．158:250-256］。ＳＬＥの患者では、循環ＤＮＡが、正常なヒトゲノムＤＮＡと比較したときに、ヒト反復ＤＮＡ（Alu）含有断片について富裕化されているという証拠もある。癌の患者では、血中の循環可溶性ＤＮＡのレベルが顕著に上昇している。上昇したＤＮＡレベルの出現率が高いと思われる癌の種類は、膵臓癌、乳癌、結腸直腸癌および肺癌を包含する。これらの形態の癌では、血中の循環可溶性ＤＮＡが 50ng／mlを超えるのを常とし、一般に、平均値は150 ng／mlより多い［Leon et al.（1977）Can．Res.，37:646-650; Shapiro et al.（1983）Cancer，51:2116- 2120］。突然変異した癌遺伝子が実験的腫瘍やヒトの腫瘍で記載されている。ある種の突然変異した癌遺伝子が特定の種類の腫瘍に関連している場合もある。これらの例は、膵臓、結腸および肺の腺癌であって、第12コドンの第１または２位に突然変異があるKirsten ras （K-ras）遺伝子の、それぞれ約75％、50％および35％の出現率を有する。最も頻度の高い突然変異は、グリシンからバリンへ（ＧＧＴからＧＴＴへ）、グリシンからシステインへ（ＧＧＴからＴＧＴへ）、およびグリシンからアスパラギン酸へ（ＧＧＴからＧＡＴへ）の変化である。第12コドンのその他の、しかしより一般的でない突然変異は、ＡＧＴおよびＣＧＴへの変異を包含する。そのような患者の体細胞のK-ras 遺伝子に、は突然変異がない。生体液、例えば血漿の僅かな試料中の変異癌遺伝子その他の遺伝子の配列が検出できることは、有用な診断手段を与えると思われる。血漿中の変異K-ras 遺伝子配列の存在は、患者における変異癌遺伝子を有する腫瘍の存在を示すと思われる。おそらく、変異K-ras 遺伝子の公知の発生源は他に存在しないことから、これは、特異的な主要マーカーになると思われる。したがって、この評価は、診断を示唆および／または確認するのに役立つことがある。血漿中の変異K-ras 遺伝子の配列の量は、腫瘍の大きさ、腫瘍の成長速度および／または腫瘍の衰退に関係し得る。したがって、変異K-ras 配列の系統的定量は、腫瘍体での変化を決定するのに役立つと言える。ヒトの殆どの癌は、突然変異した癌遺伝子を有することから、変異配列についての血漿ＤＮＡの評価には、非常に広い適用可能性および有用性があると言える。［発明の要約］本発明は、血液中に存在する遺伝子配列（例えば癌遺伝子の配列）を認識し、生体液、例えば血漿や血清中の、変異癌遺伝子その他の遺伝子からのそれのような、遺伝子配列を検出かつ定量する方法を提供する。この方法は、血中の循環可溶性ＤＮＡのレベルを上昇させる傾向がある、一定の癌その他の疾病を探知するための診断手法として用いることができる。その上、この方法は、一定の癌の患者のための治療方式の進捗を評価するのに役立つ。本発明の方法は、生体液（例えば、尿、血漿もしくは血清、喀痰、結腸流出液、内視鏡による逆行性胆管膵臓造影に起因する体液、脳脊髄液、骨髄またはリンパ液）の試料を入手し、次いで、除タンパクし、ＤＮＡを抽出する最初の段階を含む。ＤＮＡの抽出の後、その中の変異対立遺伝子を、本発明の方法の実施態様を用いて検出することができる。一実施態様では、抽出したＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のような手法を用い、試料中に存在する変異遺伝子配列から正常な遺伝子配列を識別する対立遺伝子特異的な方式で増幅する。この増幅段階には、変異対立遺伝子が検出できるＤＮＡの総量を増加させるよう野生型および／または突然変異ＤＮＡを増幅する、一般的な増幅段階を先行させることができる。もう一つの実施態様では、抽出したＤＮＡを、該ＤＮＡのセグメント、例えば野生型センス鎖のセグメントに相補的であるペプチド核酸（ＰＮＡ）と接触させる。ペプチド核酸は、該ＤＮＡと結合し（本明細書では「鎖置換」と呼ぶ）、それによって、配列、例えば野生型配列のその後の増幅に干渉する。加えて、ＰＮＡは、本明細書に記載の方法のいかなる一段階またはそれ以上の段階でも該ＤＮＡと接触させる（すなわち温置する）ことができる。例えば、ＰＮＡは、該ＤＮＡを最初に抽出した後、および／またはＤＮＡの増幅、例えば一般的増幅もしくは対立遺伝子特異的増幅の際に、該ＤＮＡと温置できる。更に、本方法の実施態様のいずれからの段階も、一つの方法へと合併することができる。ＰＮＡの上記の使用の効果は、誤対合、および野生型ＤＮＡ配列からの伸長に由来する偽陽性の数の実質的減少である。突然変異の場所が既知である場合、４対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて対立遺伝子特異的なＰＣＲ増幅を実施する。４プライマー対は、第一鎖での突然変異の部位に隣接する遺伝子配列に相補的な、対立遺伝子特異的な第一プライマー４個のセットを包含する。これら４個のプライマーは、互いに独自であり、野生型ヌクレオチドに、またはこの既知の位置で生じ得る３種類の可能な突然変異の一つに相補的である、3'ヌクレオチドでのみ異なるにすぎない。４プライマー対は、４個の独自な第一鎖プライマーのそれぞれと併用されるただ１個の一般的なプライマーも含む。一般的プライマーは、第一プライマーの位置から多少隔たった、該ＤＮＡの第二鎖のセグメントに相補的である。この増幅手順は、突然変異を含む既知の塩基対断片を増幅する。したがって、この手法は、10⁵倍も過剰な正常ＤＮＡのバックグラウンドで、僅か数個にすぎない突然変異ＤＮＡ配列を検出できるため、高レベルの感度を示すという利点がある。この方法は、正常ＤＮＡが20倍を超えて過剰であるならば変異を検出しないことになる、対立遺伝子特異的な放射性標識したプローブとのＰＣＲ生成物のハイブリッド形成によって点突然変異を検出する方法より、はるかに高い感度を有すると考えられる。上記実施態様は、突然変異がＤＮＡの既知の場所に存在する場合に役立つ。突然変異が２ケ所の可能な位置の一つに存在することが既知であるもう一つの実施態様では、８対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてよい。第一の４プライマー対のセット（すなわち、それぞれが一般的プライマーと対を形成する４個の独自な対立遺伝子特異的プライマー）は、上記のとおりである。第二の４プライマー対のセットは、センス鎖上の可能な第二の突然変異の部位に隣接する遺伝子配列に相補的な４個の対立遺伝子特異的プライマーを含む。これら４個のプライマーは、互いに独自であり、野生型ヌクレオチドに、またはこの第二の既知の位置に生じ得る３種類の可能な突然変異の一つに相補的である、3'ヌクレオチドで異なる。これらの対立遺伝子特異的プライマーは、それぞれ、この突然変異の場所から隔たった他方の鎖に相補的なもう一つの一般的プライマーと対合する。上記のＰＣＲの手法は、3'エキソヌクレアーゼ活性と、そのため校正できる能力とを欠くＤＮＡポリメラーゼを利用するのが好ましい。好適なＤＮＡポリメラーゼは、Thermus aquaticus のＤＮＡポリメラーゼである。増幅手順の際は、通常、ＤＮＡサーマルサイクラー内で約30サイクルの増幅を実施するのが充分である。５分の最初の変性期の後、各増幅サイクルは、95℃で約１分の変性期、58℃で約２分間のプライマーアニーリング、および72℃で約１分間の伸長を包含する。好適実施態様では、ＤＮＡサーマルサイクラー内での約30サイクルの増幅を実施する。94℃で５分の最初の変性期の後、各増幅サイクルは、94℃で約１分の追加の変性期、75℃で約30秒間のＰＮＡアニーリング、65℃で約１分間のプライマーアニーリング、および70℃で約１分間の伸長を包含する。増幅に続いて、ＰＣＲからの増幅されたＤＮＡのアリコートを、臭化エチジウム染色を用いたアガロースゲルによる電気泳動のような手法によって、分析することができる。標識したプライマーを用い、次いで、フィルム上の放射能または化学発光の検出により増幅産物を特定することによって、感度の向上を達成し得る。標識されたプライマーは、初めの標本中の標的配列の量を決定するのに用いられる増幅産物の定量も可能にすることがある。本明細書で用いられる限りで、対立遺伝子特異的増幅は、変異対立遺伝子に特異的であるプライマーを用い、そのため該プライマーの3'末端と標的遺伝子配列との間に100 ％の相補性が存在する配列の増幅が生じるのを可能にする、本発明の方法の特徴を記載する。したがって、対立遺伝子特異的増幅は、変異対立遺伝子がない限り増幅を許さないことが好都合である。これは、極めて鋭敏な検出手法を与える。［図面の簡単な説明］図１Ａ〜１Ｂは、K-ras の既知のただ１ケ所に突然変異が存在する、変異K-ra s 遺伝子の検出のための増幅方針の模式的表示である。図２Ａ〜２Ｂは、K-ras の可能な２ケ所のうち二番目に突然変異が存在する、変異K-ras 遺伝子の検出のための増幅方針の模式的表示である。図３は、事前のＰＮＡの鎖置換なし、かつＤＮＡの一般的増幅にＰＮＡを用いない、200 ngの野生型ＤＮＡの対立遺伝子特異的増幅を示すアガロースゲルの写真である。図４は、事前のＰＮＡ鎖置換なし、かつＤＮＡの一般的増幅にＰＮＡを用いない、10ngの野生型ＤＮＡと、10ngおよび100 ngの変異ＤＮＡとの対立遺伝子特異的増幅を示すアガロースゲルの写真である。図５は、ＰＮＡの鎖置換があり、ＤＮＡの一般的増幅にＰＮＡを用いるか、または用いない、野生型ＤＮＡ、変異ＤＮＡ、ならびに野生型および変異ＤＮＡの混合物の増幅を示すアガロースゲルの写真である。図６は、ＰＮＡの鎖置換があり、かつＤＮＡの一般的増幅にＰＮＡを用いる、野生型ＤＮＡ、ならびに野生型および変異ＤＮＡ混合物の対立遺伝子特異的増幅を示すアガロースゲルの写真である。図７は、ＰＮＡの鎖置換があり、かつＤＮＡの一般的増幅にＰＮＡを用いる、野生型ＤＮＡ、ならびに野生型および変異ＤＮＡ混合物の対立遺伝子特異的増幅を示すアガロースゲルの写真である。［発明の詳細な説明］変異ＤＮＡ、例えば特定の単一コピー遺伝子の検出は、診断の目的、および／または疾病の程度の評価に役立つ。正常な血漿は、１mlあたり約10ngの可溶性ＤＮＡを含有すると考えられる。血漿中の可溶性ＤＮＡの濃度は、癌その他の何らかの疾病の個体で顕著に上昇することが公知である。したがって、医学的状態を示す公知の突然変異した遺伝子配列、例えばK-ras 遺伝子配列の存在を検出できることが、非常に望ましい。本発明は、生体液中のそのような変異対立遺伝子の検出を、10⁵倍も過剰な正常ＤＮＡのバックグラウンドに対してさえ可能にする、非常に鋭敏な診断方法を提供する。この方法は、一般的には、可溶性ＤＮＡを含有する生体液の試料を得る段階と、ＤＮＡを除タンパク質し、抽出し、変性させる段階と、その後、該変異対立遺伝子に特異的なプライマーのうち１セットのプライマーを用いて、対立遺伝子特異的な方式でＤＮＡを増幅する段階とを含む。この対立遺伝子特異的増幅の手法によって、変異対立遺伝子のみ増幅されるにすぎない。増幅に続いて、様々な手法を用いて、増幅されたＤＮＡの存在を検出し、増幅されたＤＮＡを定量することができる。増幅ＤＮＡの存在は、変異遺伝子の存在を表し、存在する増幅遺伝子の量は、疾病の程度の指標を提供することができる。この手法は、その既知の位置で突然変異した単一コピーの遺伝子からの配列を生体液中で特定するのに適用できる。可溶性ＤＮＡを有する生体液（例えば、血漿、血清、尿、喀痰、結腸流出液、内視鏡による逆行性胆管膵臓造影に起因する体液、脳脊髄液、骨髄およびリンパ液）の試料を採集し、ＤＮＡを除タンパク質かつ抽出するよう処理する。その後、突然変異を有する遺伝子を、本発明の方法の実施態様を用いて対立遺伝子特異的な方式で増幅する。体液試料からのＤＮＡの除タンパク質の際は、タンパク質の急速な除去、およびいかなるＤＮアーゼもの事実上同時の失活が重要であると考えられる。本発明の一実施態様では、試料のアリコートに等量の20％NaClを加え、次いで、混合物を約３〜４分間煮沸する。その後、標準的手法を用いて、ＤＮＡの抽出および単離を完了することができる。好適な抽出法は、遠心分離のような手法によって体液試料中のＤＮＡの量を濃縮することを含む。本発明の好適実施態様では、例えばQiagenのQIAamp Bloodというキットを用い、実施例４に記載の方法を用いて、生体液の試料からＤＮＡを単離する。 20％NaCl溶液を用い、その後煮沸することは、タンパク質を急速に除去し、同時に、存在するいかなるＤＮアーゼも不活性化すると考えられる。血漿中に存在するＤＮアーゼは、ヌクレオソームの形態で存在すると考えられ、そのため、血液中ではＤＮアーゼから保護されていると考えられる。しかし、ＤＮＡは、一旦抽出されたならば、ＤＮアーゼに作用され易くなる。そのため、除タンパク質と同時にＤＮアーゼを不活性化して、ＤＮアーゼが、増幅に利用できるＤＮＡの量を減らすことによって増幅法を阻害するのを防ぐことが重要である。20％NaCl溶液が現在のところ好適とされるが、NaClのその他の濃度、および他の塩類を用いることもできる。利用できるＤＮＡにＤＮアーゼが影響するのを防ぎつつ、ＤＮＡを抽出するには、他の手法を用いてもよい。血漿ＤＮＡは、ヌクレオソーム（主としてヒストンとＤＮＡ）の形態で存在すると考えられるため、ヒストンその他のヌクレオソームタンパク質に対する抗体を用いて、血漿ＤＮＡを単離することもできる。もう一つの方策は、ヌクレオソームと結合する抗ヒストン抗体を付着させた固体支持体上を、血漿（または血清）を通すことである得ると思われる。洗浄の後、ヌクレオソームは、富裕化または精製された分画として、抗体から溶離させることができる。その後、上記または他の慣用の方法を用いて、ＤＮＡを抽出できる。本発明の一実施態様では、抽出したＤＮＡは、次いで、変性させ、対立遺伝子特異的な方式で増幅することができる。本発明のもう一つの好適実施態様では、一旦抽出したＤＮＡを、野生型ＤＮＡのいずれかの鎖のセグメントに相補的であるように設計したペプチド核酸（ＰＮＡ）と接触させる（すなわち温置する）。好ましくは、一般的増幅の段階で架橋プライマーが結合する、野生型ＤＮＡのセンス鎖のセグメントに相補的であるように、ＰＮＡを設計する。例えば、ＰＮＡは、（架橋プライマーが相補的である）センス鎖のセグメントと重なる、野生型ＤＮＡのセンス鎖のセグメントに相補的であることができる。ＤＮＡと接触したならば、ＰＮＡは、二本鎖ＤＮＡの構造に侵入し、その相補的ＤＮＡセグメントに結合して、一本鎖ＤＮＡのＤループを形成する。例えば、PerSeptive Biosystems 1994 Bioresearch Products Broc hureを参照されたい。野生型ＤＮＡに結合したＰＮＡは、野生型ＤＮＡへの増幅プライマーの接近を遮断する。この遮断の全体的な結果は、本発明の方法が生じる偽陽性の顕著な減少である。本発明の方法にＰＮＡを用いることは、約10⁵倍過剰な野生型ＤＮＡの存在下での変異対立遺伝子の検出を可能にできる。Ｄループを形成する一本のＤＮＡ鎖が増幅される可能性を排除するため、ＰＮＡ／ＤＮＡ複合体をヌクレアーゼ、例えばＳ１ヌクレアーゼという球菌のヌクレアーゼで処理して、Ｄループを切断することができる。ＰＮＡは、一般的増幅の段階の前や間に、および／または対立遺伝子特異的増幅の段階の間に、抽出したＤＮＡとともに温置することができる。ＰＮＡオリゴマーは、例えばPerSeptive Biosystems から商業的に入手でき、一定の仕様へと注文通りに合成することができる。好ましくは、本発明の方法に用いるＰＮＡは、約10以上、より好ましくは約15以上、更に好ましくは約20以上のヌクレオチドの長さである。本方法に用いるＰＮＡは、代表的には、野生型ＤＮＡの鎖、例えばセンスまたはアンチセンス鎖の一部またはセグメントに相補的であるように合成する。加えて、それぞれ野生型ＤＮＡの異なる鎖のセグメントまたは鎖に相補的である、いくつかのＰＮＡが合成できる。例えば、一方のＰＮＡは、このＤＮＡのセンス鎖に相補的であることができ、他方のＰＮＡは、このＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的であることができる。好ましくは、一般的増幅の段階で架橋プライマーが結合するＤＮＡのセグメントに重なる、野生型ＤＮＡのセグメントに相補的であるようにＰＮＡを合成する。野生型ＤＮＡへのＰＮＡの結合または「締結」は、野生型配列の増幅を阻害または干渉し、低頻度の誤対合プライミングと、さもなければ比較的高濃度の野生型ＤＮＡの存在下で偽陽性反応へと導く伸長との可能性を顕著に低下させる。本発明に用い得るＰＮＡのＰＮＡヌクレオチド配列の実例となる例は、H-GCC-TAC-GCC-ACC-AGC-TCC-AA-NH₂（配列番号１）である。ペプチド核酸は、リン酸バックボーンがペプチド様バックボーンに置き換えられた、ＤＮＡの類似体である。プリン（Ａ、Ｇ）およびピリミジン（Ｃ、Ｔ）塩基は、メチレンカルボニル結合によってバックボーンに付着している。野生型配列に安定的かつ効果的に結合するのを可能にする、ＰＮＡのいくつかの特性は、下記を包含する：（１）相補的ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の、対応するＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のそれより高い熱安定性。例えば、15ヌクレオチドの長さのＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖について、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を超えるＴ_mの上昇は、約15℃である；（２）ＰＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの、より強い相互作用の特異性。ＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖での一つのヌクレオチド誤対合は、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖での対応する誤対合より脱安定性であることを意味する。例えば、15ヌクレオチドの長さのＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖での一つの誤対合は、Ｔ_mを約15℃下げるが、ＤＮＡ／ＤＮＡでの対応する誤対合は、Ｔ_mを約11℃下げる；（３）ＤＮＡポリメラーゼにＰＮＡが認識できないこと。これはＰＮＡを伸長できなくする。本発明の方法にＰＮＡを用いることは、ＰＮＡのプリンおよびピリミジン塩基の側鎖を有するポリアミドのバックボーンは、ヌクレアーゼまたはプロテアーゼのいずれによっても容易に認識できないこと、およびＰＮＡは、広いpH範囲にわたって安定的であることも好都合である。一実施態様では、検出が求められる遺伝子の、特異的点突然変異に相補的な3' 末端ヌクレオチドを有するプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、対立遺伝子特異的増幅を実施する。ＰＣＲは、好ましくは、Saiki，" Amplification of Genomic DNA"，PCR Protocols，Eds．M.A．Innis et al.，Ac ademic Press，San Diego (1990)，pp．13に記載の方法によって実施する。加えて、ＰＣＲは、3'エキソヌクレアーゼ活性と、そのため増幅の際のＤＮＡプライマーの3'末端ヌクレオチドの単一の塩基誤対合を修復できる能力も欠く、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施する。特記したとおり、好適なＤＮＡポリメラーゼはT．aquaticusのＤＮＡポリメラーゼである。適切なT．aquaticusＤＮＡポリメラーゼは、Perkin-ElmerからAmpliTagＤＮＡポリメラーゼとして商業的に入手できる。もう一つの好適なポリメラーゼは、5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く、AmpliTagの Stoffel断片のＤＮＡポリメラーゼである。F.C．Law yer et al.（1993）PCR Methods and Applications 2:275-287を参照されたい。 3'エキソヌクレアーゼ活性を欠くその他の役立つＤＮＡポリメラーゼは、New En gland Biolabs，Inc.,から入手できるVent_R(exo-)（古細菌のThermococcus lito ralis からのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持する大腸菌の菌株から精製される）、Thermus flavusに由来し、Amersham Corporationから入手できるHot Tub ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにEpicentre Technologies，Molecular Biology Reso urce Inc．またはPerkin-Elmer Corp.から入手できる、Thermus thermophilusに由来するTth DNA ポリメラーゼを包含する。この方法は、４対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅を実施する。第一セットの４プライマーは、互いに独自である４個の対立遺伝子特異的プライマーを含む。この４対立遺伝子特異的プライマーを、それぞれ、対立遺伝子特異的プライマーから隔たった他方のＤＮＡ鎖と再対合する、隔たった一般的プライマーと対合させる。対立遺伝子特異的プライマーの一方は、野生型対立遺伝子に相補的である（すなわち、正常な対立遺伝子に対立遺伝子特異的である）が、他方は、このプライマーの3'末端ヌクレオチドに誤対合がある。特記したとおり、４個の独自なプライマーを、（例えばＰＣＲ増幅による）増幅のために、隔たった一般的プライマーと個別に対合させる。変異対立遺伝子が存在するときは、対立遺伝子特異的プライマーを含むプライマー対は、効率的に増幅し、検出できる産物を生じることになる。誤対合したプライマーは、再対合し得るが、その鎖が増幅の際に伸長されることはない。上記のプライマーの組合せは、問題の対立遺伝子のただ一ケ所に突然変異が存在することが既知である場合に役立つ。二ケ所のうち一つに突然変異が存在し得る場合は、８対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてよい。第一セットの４対は、上記のとおりである。第二の４対のプライマーは、センス鎖上の可能な第二の突然変異の部位に隣接する遺伝子配列に相補的な４個の対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを含む。これらの４プライマーは、野生型ヌクレオチドに、またはこの既知の第二の位置で生じ得る可能な３種類の突然変異の一つに相補的である、末端3'ヌクレオチドが異なる。４個の対立遺伝子特異的プライマーを、それぞれ、突然変異の上流のアンチセンス鎖に相補的である、単一の隔たった一般的プライマーと対合させる。上記のプライマーを用いるＰＣＲ増幅の際は、存在する対立遺伝子に完全に相補的であるプライマーのみが、再対合かつ伸長することになる。非相補的ヌクレオチドを有するプライマーは、部分的には再対合し得るが、増幅過程の際に伸長することはない。増幅は、一般に、適切な数、すなわち約20〜40、最も好ましくは約30のサイクルで進められる。この手法は、正常ＤＮＡの著しいバックグラウンドに対しても、変異した標的遺伝子の検出を可能にするのに充分な感度で、標的遺伝子の変異を含む断片を増幅する。 K-ras 遺伝子は、既知のコドンの既知の一または二ケ所で通常生じる点突然変異を有する。他の癌遺伝子は、既知ではあるが変化し得る場所での突然変異を有してよい。K-ras 遺伝子での突然変異は、代表的には、肺、膵臓および結腸の腺癌のような一定の癌に付随することが公知である。図１Ａ〜２Ｂは、K-ras 癌遺伝子の第12コドンの第１または２位で生じる突然変異を、ＰＣＲ増幅を通じて検出するための方針を示す。前記のとおり、K-ras の第12コドンの第１または２位での突然変異は、肺、膵臓および結腸の腺癌のような一定の癌に付随することが多い。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、患者の試料からのＤＮＡを、センスおよびアンチセンス鎖を表す２本の鎖（ＡおよびＢ）へと分離する。このＤＮＡは、同じコドン（すなわちコドン12）の第１位（Ｘ₁）で生じる点突然変異を有する癌遺伝子を表す。第１位での突然変異を検出するのに用いる対立遺伝子特異的プライマーは、それぞれ互いに独自であるＰ１センスプライマー４個のセットを含む。この４個のP1-Aプライマーは、野生型ヌクレオチド、またはこの既知の位置で生じ得る可能な３種類の突然変異の一つに相補的である、末端3'ヌクレオチドのみ互いに異なるのが好ましい。対立遺伝子の変異を含むセグメントに完全に相補的であるP1-Aプライマーのみが、増幅の際に再対合かつ伸長することになる。 P1-Aプライマーの位置より下流のＢ鎖のセグメントに相補的な、下流の一般的プライマー（P1-B）を、P1-Aプライマーのそれぞれと併用する。図１に示したP1 -Bプライマーは、ＰＣＲの際に対立遺伝子と再対合し、伸長される。表１に特定し、図１Ｂに示したP1-AおよびP1-Bプライマーは、ともに、161 塩基対を有する癌遺伝子の断片を増幅する。図２Ａおよび２Ｂは、４個の独自な対立遺伝子特異的プライマーの追加のセット（P2-A）を用いて、癌遺伝子のコドン12の第２位（Ｘ₂）に生じ得る突然変異を検出する図式を示す。コドン12の第１位（Ｘ₁）または第２位（Ｘ₂）のいずれかでの突然変異を検出するには、図１Ａおよび１Ｂに示した増幅方針を図２Ａおよび２Ｂに示したそれと併用することと思われる。図２Ａおよび２Ｂを参照すると、独自な４対立遺伝子特異的プライマーのセットを用いて、コドン12の第２位（Ｘ₂）に存在する突然変異を検出する。４個のP 2-Aプライマーは、第二の可能な突然変異の部位に隣接する遺伝子配列に相補的である。これら４プライマーは、互いに独自であり、野生型ヌクレオチド、または第二の既知の位置（Ｘ₂）に生じ得る３種類の可能な突然変異の一つに相補的である、末端の3'ヌクレオチドでのみ異なるのが好ましい。突然変異の上流のＡ鎖のセグメントに相補的な、上流の１個の一般的プライマー（P2-B）を独自なP2-Aプライマーのそれぞれと併用する。表１に特定し、図２Ｂに示したP2-AおよびP2-Bプライマーは、164 塩基対を有する断片を増幅する。増幅手順の際は、ポリメラーゼ連鎖反応を約20〜40サイクル、最も好ましくは 30サイクルの間進められる。約５分間の最初の変性期に続いて、各サイクルは、 AmpliTaqＤＮＡポリメラーゼを用いて、代表的には、95℃で約１分の変性、約58 ℃で２分のプライマーアニーリング、および72℃で１分の伸長を包含する。上記の温度およびサイクルの時間は、現在では好適であるが、様々な変更を加えてよいことが留意される。実際、異なるＤＮＡポリメラーゼ、および／または異なるプライマーを用いることは、増幅条件の変化を必要とし得る。当業者は、増幅条件を最適化することが容易にできると思われる。そのコドン12の第１または第２位のいずれかに点突然変異を有するK-ras 遺伝子を検出するための、本発明の方法を実施するのに役立つ例示的なＤＮＡプライマーを表１に示す。表１に示したプライマーは、当然、単なる例示にすぎない。当業者が理解するとおり、これらのプライマーには様々な変更を加えることができる。例えば、プライマーは、延長または短縮できると思われるが、3'末端ヌクレオチドは同じままでなければならない。加えて、3'末端から戻る３〜６ヌクレオチドには、いくつかの誤対合がなされてよく、有効性に干渉することはないと思われる。一般的プライマーを、異なる部位に相補的になるよう異なって構築して、より長いか、またはより短いかのいずれかの増幅産物を生じることもできる。一実施態様では、各対立遺伝子特異的プライマーの長さは、異なることができて、複数の対立遺伝子特異的プライマーを同じＰＣＲ反応での隔たった一般的プライマーと併用するのを可能にする。増幅産物の長さは、どの突然変異が標本中に存在するかを示すと思われる。表１ならびに図１Ｂおよび２Ｂに示したプライマーと、その他の用い得ると思われるものとは、当業者が容易に合成できる。例えば、類似のプライマーの調製が、Stork et al.（1991）Oncogene 6:857-862によって記載されている。その他の増幅方法および方針も、本発明の方法に従って生体液中の遺伝子配列を検出するのに用いることができる。例えば、もう一つの方策は、ＰＣＲとリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）との併用であると思われる。ＰＣＲは、ＬＣＲより早く増幅し、開始するのにより少ないコピーの標的ＤＮＡを必要とすることから、ＰＣＲを第一段階に用い、次いでＬＣＲへと進めることができると思われる。多少ともK-ras のコドン12を中心に約285 塩基対の長さの配列にまたがる、前記の対立遺伝子特異的増幅に用いられる一般的プライマーのようなプライマーは、標準的なＰＣＲ条件を用いて、この断片を増幅するのに用い得ると思われる。次いで、この増幅産物（ほぼ285 塩基対の配列）は、対立遺伝子特異的な方式でＬＣＲまたはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）に用い得るが、これは、突然変異の存否を示すと思われる。もう一つの、おそらくより感度の低い方策は、増幅と対立遺伝子特異的識別との双方にＬＣＲまたはＬＤＲを用いることであると思われる。後者の反応は、線形の増幅を招くのが好都合である。したがって、増幅産物の量は、初めの標本中の標的ＤＮＡの量の反映であり、そのため定量を可能にする。ＬＣＲは、標的配列の全長に相補的である隣接ヌクレオチドの対を利用する［ F．Barany（1991）PNAS，88:189-193; F．Barany（1991）PCR Methods and Appl ications 1:5-16］。標的配列が、これらの配列の接点のプライマーに完全に相補的であるならば、ＤＮＡリガーゼは、隣接する3'および5'末端ヌクレオチドを結合して、連結配列を形成することになる。熱安定性ＤＮＡリガーゼを熱周期処理で用いるならば、連結配列を逐次に増幅することになる。このオリゴヌクレオチドの接点でのただ１個の塩基の誤対合は、連結反応および増幅を排除する。したがって、この過程は対立遺伝子特異的である。3'ヌクレオチドがこの突然変異体に特異的であるもう１セットのオリゴヌクレオチドは、突然変異体の対立遺伝子を特定するためのもう一つの反応に用いられる。いかなる公知の部位での可能なすべての突然変異も検出するのに、一連の標準的条件を用い得ると思われる。ＬＣＲは、代表的には、４個のプライマーとのヌクレオチドハイブリダイゼーションのための標的として、ゲノムＤＮＡの両鎖をともに利用し、産物は、反復される熱周期処理によって指数関数的に増加する。この反応の変化形は、標的ＤＮＡに相補的であり、ＤＮＡリガーゼによって同様に連結される二つの隣接オリゴヌクレオチドを利用する、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）である［F．Barany（1991）PNAS，88:189-193］。多数の熱周期の後、産物を線形様式で増幅する。従って、ＬＤＲの産物の量は、標的ＤＮＡの量を反映する。プライマーの適切な標識化は、増幅産物の対立遺伝子特異的な方式での検出ばかりでなく、最初の標的ＤＮＡの量の定量も可能にする。この形式の反応の一つの利点は、それが、自動化による定量を可能にすることである［Nickerso n et al.（1990）PNAS 87:8923-8927］。対立遺伝子特異的な連結反応および増幅のためにＬＣＲで用いて、K-ras 遺伝子のコドン12の第１位での突然変異を特定するのに適したオリゴヌクレオチドの例を、下記の表２に示す。ＬＣＲを伴う増幅手順の際は、４個のオリゴヌクレオチドを一度に用いる。例えば、オリゴヌクレオチドＡ１と、別個に、Ａ２オリゴヌクレオチドのそれぞれとをセンス鎖上で対合させる。また、オリゴヌクレオチドＢ１と、別個に、Ｂ２オリゴヌクレオチドのそれぞれとをアンチセンス鎖上で対合させる。ＬＣＤの手順については、２個のオリゴヌクレオチド、すなわち、Ａ１とＡ２オリゴヌクレオチドのそれぞれとを、正常および変異標的ＤＮＡ配列の線形増幅のために対合させる。本発明の方法は、様々な生体液中に存在するＤＮＡのその他の癌遺伝子の検出および定量に適用できる。p53 遺伝子は、簡便な検出および定量が有用であり得ると思われる遺伝子であるが、それは、この遺伝子での変化は、ヒトの癌の、多くの解剖学的部位から出現する多くの組織学的類型の癌に生じる、最も一般的な遺伝子の異常だからである。p53 の突然変異は、遺伝子内の複数のコドンで生じ得るが、80％は、第５、６、７および８エキソンの保存領域、または「ホットスポット」内に局在する。p53 での突然変異を特定するための最も一般的な最新の方法は、多段階の手順である。それは、ゲノムＤＮＡからの第５〜８エキソンのＰＣＲ増幅を、個別にか、併用してか（すなわち複合化）、または、時には１個より多いエキソンの単位として必要とする。これに代わる方策は、総細胞ＲＮＡを単離し、これを逆転写酵素で転写することである。適切なオリゴヌクレオチドの対をプライマーとして用い、反応混合物の一部を直接ＰＣＲに付して、p53 のｃＤＮＡの領域を増幅する。これら二つの形式の増幅に続いて、一本鎖立体配座多型分析（ＳＳＣＰ）を実施するが、これは、正常なＤＮＡからの点突然変異を有する増幅された試料を、ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動したときの移動度の差によって特定することになる。ある断片が、突然変異を含むことがＳＳＣＰによって示されたならば、非対称ＰＣＲによって後者を増幅し、ジデオキシ鎖終結法によって配列を決定する［Murakami et al.（1991）Can．Res．51:3356-3 3612］。更に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、複数の突然変異を同時に評価することが比較的良くできることから、p53 については有用であり得る。突然変異を決定した後、臨床的経過の際の患者の血漿中の変異遺伝子のその後の複数回の定量のために、対立遺伝子特異的プライマーを調製することができる。好ましくは、本発明の方法は、約５mlの生体液試料を用いて実施する。しかし、本方法は、標本の供給が限られている場合は、より小さい試料サイズを用いて実施することもできる。そのような場合、初めに、試料中に存在するＤＮＡを、一般的プライマーを用いて増幅するのが好都合であり得る。その後、対立遺伝子特異的プライマーを用いて、増幅を進めることができる。本発明の方法は、診断キットとして具体化してもよい。そのようなキットは、ＤＮＡの単離のための試薬とともに、検出法に用いるプライマーのセット、および増幅に役立つ試薬を包含してよい。キットに役立つ試薬のうち、ＤＮＡポリメラーゼは、増幅を実施するのに用いられ、ＰＮＡは、偽陽性を減少させるのに用いられる。好適なポリメラーゼは、AmpliTagＤＮＡポリメラーゼおよびAmpliTaq Stoffel 断片ＤＮＡポリメラーゼとしてPerkin-Elmerより入手できる、Thermus aquaticus のＤＮＡポリメラーゼである。変異遺伝子配列の定量のために、該キットは、正の対照のための変異ＤＮＡの試料とともに、加工された配列を既知量で含む、競争的ＰＣＲによる定量のための管も有することができる。変異K-ras 配列の定量は、スロットブロットサザンハイブリッド形成または競争的ＰＣＲのいずれかを用いて達成できる。スロットブロットサザンハイブリッド形成は、Verlaan-de Vries et al.（1986）Gene 50:313-20，1986 に記載のような相対的緊縮条件下で、対立遺伝子特異的プライマーをプローブとして用いて実施することができる。血漿５mlから抽出した総ＤＮＡを、１０倍の連続希釈によりスロットブロットさせた後、一連の対立遺伝子特異的プライマーとＰＣＲおよびＬＣＲとによるふるい分けによって予め決定した限りでの、特定の患者の腫瘍ＤＮＡにおける既知の突然変異に相補的であるように選んだ、末端標識した対立遺伝子特異的プローブとハイブリッド形成させる。オートラジオグラフィーでの正のシグナルを、同様にしてスロットブロットとして調製した、K-ras のコドン12での同一突然変異を有する腫瘍細胞の培養からの標準的系列の希釈ＤＮＡ（１〜500 ng）との比較の後、光学密度測定法によって半定量的に等級付けることになる。修正した競争的ＰＣＲ［Gilliland et al.（1990）Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 87:2725-79; Gilliland et al.，"Competitive PCR for Quantitation of mR NA"，PCR Protocols(Acad．Press)，pp.60-69，1990］を、スロットブロットサザンハイブリッド形成定量法への、潜在的により鋭敏な代替策として役立て得ると思われる。この定量法では、同じプライマーの対を用いて二つのＤＮＡ鋳型を増幅し、それが、増幅の過程で互いに競争する。一方の鋳型は、未知量の問題の配列、すなわち変異K-ras であり、他方は既知量の加工した欠失突然変異体であって、増幅したときに、増幅した変異K-ras 配列から識別できる、より短い産物を生じる。血漿から上記のとおり抽出した総ＤＮＡは、放射性標識したヒト反復配列のプローブ（BLUR8）を用いた、スロットブロットサザンハイブリッド形成を用いて定量する。これは、抽出された総血漿ＤＮＡの定量を可能にする結果、ＰＣＲ反応のそれぞれに同じ量を用いることができる。各患者からのＤＮＡ（10 0 ng）を、各患者について予め特定した、特定の突然変異に対応するＰ１またはＰ２対立遺伝子特異的プライマーを含有するＰＣＲ親混合物に、総量を400 mlとして加える。血漿ＤＮＡ10ngを含有する親混合物40mlを、0.1 〜10aMにわたる競争的鋳型10mlを入れた10本の管にそれぞれ加える。各反応混合物は、ｄＮＴＰ（ 50 mCi／mlの［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰを含む25mMの最終濃度）、50pMの各プライマー、２mMのMgCl₂、２単位のT．aquaticusＤＮＡポリメラーゼ、１ｘＰＣＲ緩衝液、50mg／mlのＢＳＡ、および40mlの最終体積での水を含有する。30サイクルのＰＣＲの後、増幅産物の電気泳動を実施する。臭化エチジウムで特定した帯域を切り出し、計数し、欠失変異配列に対するK-ras 配列の比を算出する。分子量の差を補正するため、ゲノムK-ras の帯域について得られたcpm を、第１位（Ｐ１）または第２位（Ｐ２）のプライマーのいずれを用いたかに応じて、141/161 倍または126/146 倍する（正確な比は、欠失突然変異体の長さに依存すると思われる）。データを、欠失鋳型ＤＮＡ／K-ras ＤＮＡのlog 比対入力した欠失鋳型ＤＮＡのlog としてプロットする［Gilliland et al.（1990）Proc．Natl．Acad． Sci．USA 87:2725;79; Gilliland et al.，"Competitive PCR for mRNA"，PCR P rotocols（Acad．Press）pp.60-69，1990］。一方のプライマーが、ビオチン部分を有する修飾された5'末端を有し、他方のプライマーは、蛍光性発色団を有する5'末端を有する、修正された競争的ＰＣＲを開発することもできる。次いで、増幅産物を、固体の支持体に付着したアビジンまたはストレプトアビジンへの吸着によって、反応混合物から分離することができる。ＰＣＲで形成された産物の量は、アルカリを用いて固定化ＤＮＡを変性させ、こうして固体の支持体から蛍光性の一本鎖を溶離し、蛍光を測定することによって、二本鎖ＤＮＡに取り込まれた蛍光性プライマーの量を測定することによって定量できる［Landgalf et al.（1991）Anal．Biochem．182:231-235，199 1］。競争的鋳型は、野生型K-ras と、本明細書に記載のＰ１およびＰ２系列のプライマーで増幅した変異K-ras との遺伝子の断片に匹敵する配列を有するが、第10 ヌクレオチドの内部欠失がある、誘導された欠失突然変異体を含む。そのため、増幅産物はより小さい、すなわち、それぞれ54および52ヌクレオチドである。こうして、同じプライマーを用いることができ、しかも、誘導突然変異体からの増幅産物を、増幅ゲノム配列から容易に識別することができる。ＰＣＲを用いて、７個の欠失鋳型を生成する。出発材料は、Operon（Operon T echnologies，Alameda，CA）によって合成した52量体または54量体のオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰ２またはＰ１プライマーによる対立遺伝子特異的増幅によって増幅した62量体または64量体の配列と同じであるが、中央から10個のヌクレオチドが欠失した配列を有する。コドン12の野生型配列はもとより、このコドンのＰ１またはＰ２に生じ得る３種類の突然変異のそれぞれも含む、このオリゴヌクレオチドの７個の変化形がある。第１位のコドン12の突然変異は、Ｇ →Ａ（例えばＡ５４９腫瘍ＤＮＡで）、Ｇ→Ｔ（例えばCalul およびＰＲ３７１腫瘍ＤＮＡで）およびＧ→Ｃ（例えばＡ２１８２およびＡ１６９８腫瘍ＤＮＡで）を包含する。第２位のコドン12突然変異は、Ｇ→Ａ（例えばAspcl 腫瘍ＤＮＡで）、Ｇ→Ｔ（例えばＳＷ４８０腫瘍ＤＮＡで）およびＧ→Ｃ（例えば818-1、1 81-4 および818-7 腫瘍ＤＮＡで）を包含する。第１または２位でのＧ→Ｔトランスバージョンは、肺癌に見出される点突然変異の約80％を占め、GAT（アスパラギン酸）またはGTT（バリン）は、膵臓癌に最も一般的である。要約すると、Ｐ１およびＰ２プライマーを、正常な配列を有する54量体、およびそれぞれ特異的な突然変異を含む52量体または54量体と対立遺伝子特異的な方式で用いる。これらの欠失突然変異体を、ゲノムＤＮＡを増幅するのに用いた同じ対立遺伝子特異的プライマーを用いて増幅する。それぞれのＬ１またはＬ２プライマーとそれぞれ対合させた４個のＰ１プライマーと３個のＰ２プライマーとを用いるＰＣＲによって、７個のオリゴヌクレオチドを個別に増幅する。野生型のＰ１プライマーが生成する鋳型を、野生型Ｐ２反応のための鋳型として用いることもできる。したがって、野生型Ｐ２プライマーを用いた別個の野生型鋳型を生成する必要はない。この手順は、その後の競争的ＰＣＲに用い得る７バッチの 52ヌクレオチドまたは54ヌクレオチドの二本鎖鋳型を生成する。増幅産物は、それぞれ、ゲルで精製し、分光光度測定によってＤＮＡを定量する。次いで、７種類の増幅産物を配列決定して、その正しさを確認する。52ヌクレオチドまたは54 ヌクレオチドの全配列を得るために、二本鎖鋳型のそれぞれを、一般的プライマー（Ｌ１またはＬ２）と、相補的な対立遺伝子特異的な増幅プライマーとの双方で配列決定する。次いで、より短い鋳型を、上に概略を述べたとおり、競争的ＰＣＲにおける既知の連続希釈に用いることができる。いかなる意味でも更に限定すると解してはならない下記の実施例によって、本発明を更に例示する。本願全体を通して引用されたすべての引用参考文献（文献の参照、交付された特許、公開特許願、および同時継続出願中の特許を包含する）の内容は、これにより、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。実施例実施例１：血液からの可溶性ＤＮＡの単離 15％のＫ₃ ＥＤＴＡ0.05mlを入れた13ｘ75mmのバキュテーナーの管に、血液を採集した。直ちに管を、1,000 ｘｇ、４℃で30分間遠心分離し、血漿を取り出し、1,000 ｘｇ、４℃で更に30分間遠心分離した。血漿は、−70℃で貯蔵した。次に、５mlのアリコートに等量の20％NaClを加えることによって、ＤＮＡを除タンパク質し、次いで、これを３〜４分間煮沸した。冷却後、試料を3,000rpmで30分間遠心分離した。上清を取り出し、３回換える10mMトリス−HCl（pH7.5）／１mM ＥＤＴＡ（pH8.0）（「ＴＥ」）に対して４℃で18〜24時間透析した。２容のフェノール、２ｘ１容のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25： 24：１）、および２ｘ１容のクロロホルム：イソアミルアルコール（24：１）で１回ＤＮＡを抽出した。次いで、0.3 モルのNaCl、担体としての20mg／mlのグリコーゲン、および2.5 容の100 ％エタノールで、−24℃で24時間ＤＮＡを沈澱させた。Eppendorf 遠心機での４℃で30分間の遠心分離によって、ＤＮＡを回収した。次いで、ＤＮＡをＴＥ緩衝液に再懸濁させた。上記の方式で抽出かつ調製したＤＮＡは、それから増幅することができる。実施例２：尿からの可溶性ＤＮＡの単離膵臓癌の患者からの尿試料を採集し、Beckman ＴＪ６遠心機で3,000rpmで10分間の遠心分離に付して、細胞砕片を除去した。次いで、尿を滅菌するため、試料を10分間煮沸し、室温まで冷却させた。遠心分離を経由して沈澱を除去した。次いで、プロテイナーゼＫ500 μl を全試料に加え、試料を55℃で終夜温置した。次いで、試料を、２回換える水４リットルに対して冷室内で透析した（それぞれ４時間または終夜）。次いで、試料を煮沸して、プロテイナーゼＫを不活性化し、pHを測定し、7.4 に調整した。試料をエルチップelutip（プレフィルター付き）に装荷し、エルチップを20mM の低塩緩衝液１mlで、１ml／分以下の率で洗浄した。次いで、エルチップを高塩緩衝液で37℃、15分間で平衡させ、ＨＳＢ500 μl で、0.5 ml／分以下の率で溶出させた。溶出液を30,000NMWLのフィルターを通して遠心分離して、50μl 前後まで濃縮した。次いで、濃縮物を、６回換える水300 μl で洗浄し、水120 μl で希釈し、水80μl で希釈した20μl のＯＤ_260/280を測定する。尿からのＤＮＡの単離に続いて、本明細書に記載の方法を用いて、尿中の変異対立遺伝子を検出することができる。実施例３：血液から単離したＤＮＡの増幅実施例１に従って入手かつ調整したＤＮＡの対立遺伝子特異的増幅を、下記のとおりＰＣＲによって実施して、K-ras 遺伝子のコドン12の第１または２位に突然変異を有するＤＮＡのK-ras 遺伝子を検出した。それぞれ８本の反応管に、血漿0.5 mlから抽出したＤＮＡを加え、67mMのトリス−HCl（pH8.8）、10mMのβ− メルカプトエタノール、16.6mMの硫酸アンモニウム、6.7 mMのＥＤＴＡ、2.0mM のMgCl₂、50mg／mlのＢＳＡ、25mMのｄＮＴＰを含有する40mlの全体積とした。また、それぞれ50pMの表１に特定した各プライマー50pMを、Thermus aquaticus のＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-ElmerよりAmpliTaqとして入手できる）３単位とともに含ませた。95℃で５分間の最初の変性の後、ＤＮＡサーマルサイクラー（Cetus; Perkin-Elmer Corp.，Norwalk，Connecticut）中で30サイクルのＰＣＲ増幅によってＰＣＲを実施した。各増幅サイクルは、95℃で１分の変性、58℃ で２分のプライマー再対合、および72℃で１分の伸長を包含する。増幅の完了後は、２％アガロースゲル／１ｘＴＡＥ−0.5 mg／mlのEtBrでの電気泳動によって、それぞれ10〜15mlのＰＣＲ産物を分析する。電気泳動は、90分間の100 ボルトの印加電圧を用いる。次いで、標準的条件下で紫外光を用いて、試料の写真を撮影する。実施例４：ペプチド核酸の存在下での血漿ＤＮＡの増幅血漿からの可溶性ＤＮＡの単離：下記のようなQiagenのQIAmp Blood Kit を用いて、膵臓癌の患者の血液からの血漿200 μl からＤＮＡを単離した。血漿200 μl を1.5 ml微量遠沈管に入れた。次いで、Qiagenのプロテアーゼ25 μl、および緩衝液ＡＬ（40部の試薬ＡＬ２＋160 部の試薬ＡＬ１）200 μl を管に加え、内容を混合した。次いで、管を70℃で10分間温置した。EtOH210 mlを管に加え、内容を混合した。次いで、血漿混合物をQIAmp スピンカラムに入れ、 6,000 ｘｇ（8,000rpm）で１分間遠心分離した。次いで、QIAmp スピンカラムを清浄な捕集管に入れ、緩衝液ＡＷ500 μl を加えた。次いで、カラムを再び、6, 000 ｘｇ（8,000rpm）で１分間遠心分離した。QIAmp スピンカラムを再び清浄な捕集管に入れ、緩衝液ＡＷ500 μl を加えた。次いで、カラムを再び、6,000 ｘｇ（8,000rpm）で１分間遠心分離した。再びQIAmp スピンカラムを清浄な捕集管に入れ、緩衝液ＡＷ500 μl を更に加えた。カラムを6,000 ｘｇ（8,000rpm）で１分間、全速力で更に２分間遠心分離した。次いで、QIAmp スピンカラムを清浄な1.5 ml微量遠沈管に入れ、予め70℃に加熱した200 μl のｄＨ₂Ｏまたは10mM トリス−HCl、pH9.0 でＤＮＡを溶出させた。次いで、QIAmp スピンカラムを保有する微量遠沈管を6,000 ｘｇ（8,000rpm）で１分間遠心分離した。次いで、血漿ＤＮＡを200 μl の総量とした。鎖置換：鎖置換の前に、Millipore Ultrafree ＭＣ（30,000MWCO）フィルターユニット上で、ＤＮＡを20μl またはそれ以下の体積に濃縮した。血漿ＤＮＡを、１μM のペプチド核酸（ＰＮＡ）（H-GCC-TAC-GCC-ACC-AGC-TCC-AA-NH₂）（配列番号１）とともに0.5 μl 微量遠沈管に入れ、10／１のＴＥ、pH7.5（10mMトリス−HCl 、pH7.5 ／１mMＥＤＴＡ）で20μl の総量まで充分量を加えた。次いで、混合物を37℃で１時間温置した。ＤＮＡのスパンニングSpanning K-rasＰＣＲ増幅：次いで、鎖置換した血漿ＤＮＡ20μl を、ＰＣＲ親混合物（４単位のAmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼStoffel 断片、１ｘＰＣＲStoffel 緩衝液、２mMのMgCl₂、それぞれ50μM のｄＮＴＰ、１μM のＬ２K-ras スパンニングプライマー（5'GC C-TGC-TGA-AAA-TGA-CTG-AA3'）（配列番号22）、１μM のＣＰ−ＰＮＡ、１スパンニングプライマー（5'CAT-CCG-TTC-TCA-CGG-AAC-TGC-TAT-GTC-GAT3'）（配列番号23）、１μM のＰＮＡ、50μg ／mlのＢＳＡ、20μl まで充分量のｄＨ２０）20μl と混合した。ＰＣＲ周期処理の条件は、下記のとおりであった：最初の変性を94℃で５分間実施し、次いで、94℃で１分間（変性）、75℃で30秒間（ＰＮＡ再対合）、65℃で１分間（プライマー再対合）、および70℃で１分間（伸長）を30サイクル実施した。対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅：鎖置換した増幅された一般的ＤＮＡを、対立遺伝子特異的ＰＣＲに用いるために１：10,000に希釈した。ＰＣＲ親混合物は、４単位のAmpliTaqＤＮＡポリメラーゼStoffel 断片、１ｘＰＣＲStoffel 緩衝液、２mMのMgCl₂、それぞれ５μM のｄＮＴＰ、１μM のK-ras のコドン12の第１または２位に対する一般的プライマー（Ｌ１：5'TAT-GTC-GAT-TAA-GTC-TTA-GT3'）（配列番号24）またはＬ２：5' GCC-TGC-TGA-AAA-TGA-CTG-AA3'）（配列番号22））、１μM のK-ras のコドン12 の第１または２位に対する対立遺伝子特異的プライマー、および50μg ／mlのＢＳＡを含有した。次いで、下記のＰＣＲ周期処理条件下で、ＤＮＡを増幅した：最初の変性を94℃で５分間実施し、次いで、94℃で１分間（変性）、60℃で１分間（プライマー再対合）、72℃で１分間（伸長）、および72℃で７分間（最終伸長）を30サイクル実施した。１ｘＴＢＥ／0.5 mg／mlの臭化エチジウムへの3.5 ％アガロースゲルで、ＤＮＡを分析した。K-ras 第２位の産物は、62bpであり、 K-ras 第１位のは、64bpであった。上記の方法を下記の変化形で用いて、いくつかの実験を実施した：実験Ａ：ＰＮＡ鎖置換なし、またはスパンニングK-ras ＰＣＲ増幅でのＰＮＡなしでの野生型ＤＮＡ（10ng）の増幅野生型ＤＮＡ200 ngの対立遺伝子特異的増幅を、上記のとおり実施した。得られた増幅産物を、上記のとおりのアガロースゲル電気泳動によって分析した。対立遺伝子特異的増幅の段階には、ＰＮＡ鎖置換の段階を先行させなかった。この実験の結果を図３に示す。列１〜４は、K-ras 第２位プライマー２Ｃ（列１）（野生型）、２Ａ（列２）、２Ｇ（列３）、２Ｔ（列３）（偽陽性）による対立遺伝子特異的増幅で増幅した一般的ＤＮＡの１：10,000希釈を包含する。列５〜８は、K-ras 第１位プライマー１Ｇ（列５）（野生型）、１Ａ（列６）、１Ｃ（列７）および１Ｔ（列８）を包含する。実験Ｂに示す通り、野生型ＤＮＡ10ngを用いたならば、結果は同じであるが、産物の帯域は非常に希薄になる（図３を図４と比較されたい）。実験Ｂ：ＰＮＡ鎖置換なし、またはスパンニングK-ras ＰＣＲ増幅でＰＮＡを用いない野生型ＤＮＡ（10ng）および変異ＤＮＡ（10ngおよび100 pg）の増幅野生型ＤＮＡ10ng、変異ＤＮＡ10ngおよび100 pgの増幅を、上記のとおり実施した。得られた増幅産物を、上記のとおりのアガロースゲル電気泳動によって分析した。対立遺伝子特異的増幅の段階には、ＰＮＡ鎖置換の段階を先行させなかった。ＰＮＡなしのスパンニングK-ras ＰＣＲ増幅の段階があった。これらのＰＣＲ産物の１：10,000希釈を、対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅に用いた。この実験の結果を図４に示す。列１〜４は、K-ras 第２位プライマー２Ｃ（野生型：列１）、２Ａ（列２）、２Ｇ（列３）および２Ｔ（列３）（偽陽性）による野生型ＤＮＡ10ngからの産物を示す。列５〜８は、K-ras 第２位プライマー２Ｃ（列５）（偽陽性）、２Ａ（列６）（突然変異）、２Ｇ（列７）（偽陽性）および２Ｔ（列８）（偽陽性）による変異ＤＮＡ（GTT）10ngからの産物を示す。列９〜12は、K-ras 第２位プライマー２Ｃ（列９）（偽陽性）、２Ａ（列10）（突然変異）、２Ｇおよび２Ｔ（列11および12）（偽陽性）による変異ＤＮＡ（GGT）100 pg からの産物を示す。実験Ｃ：ＰＮＡ鎖置換があり、スパンニングK-ras ＰＣＲ増幅にＰＮＡを用いるが、または用いない野生型ＤＮＡ、変異ＤＮＡ、および野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡとの混合物の増幅野生型ＤＮＡ、変異ＤＮＡ、および野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡとの混合物の対立遺伝子特異的増幅を、上記のとおり実施した。得られた増幅産物を、上記のとおりのアガロースゲル電気泳動によって分析した。上記のとおり、対立遺伝子特異的増幅の段階に、ＰＮＡ鎖置換段階および／またはスパンニングK-ras ＰＣＲ／ＰＮＡ増幅段階を先行させた。この実験の結果を表３に要約し、図５に示す。この実験からの結果は、ＰＮＡ鎖置換、またはスパンニングＰＣＲ増幅での締結は、いずれも、スパンニングＰＣＲ増幅での野生型のＰＣＲ増幅を阻害するのに効果的であることを立証する。K-ras の野生型配列のＰＮＡ鎖置換は、スパンニングK-ras ＰＣＲの際のＰＮＡの添加があるか、またはない野生型K-ras の増幅を効率的に遮断する（図５の列１および６）。変異K-ras 配列は、野生型ＰＮＡによって影響されない（図５の列２、３、７および８）。実験Ｄ：ＰＮＡ鎖置換があり、かつスパンニングK-ras ＰＣＲ増幅にＰＮＡを用いる、野生型ＤＮＡ、および野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡとの混合物の増幅野生型ＤＮＡ10ng、および野生型ＤＮＡ５ngと変異ＤＮＡ５ngとの混合物を、様々なpH条件下で（pH5.5、pH6.5 およびpH7.5）１μM のＰＮＡとの鎖置換に付した。次いで、追加の１μM のＰＮＡ、および上記のスパンニングK-ras プライマーを用いて、ＤＮＡを増幅した。この実験の結果を図６に示す。列１、３および５は、ＰＮＡありの野生型ＤＮＡ10ngを包含し、列２、４および６は、ＰＮＡありの野生型ＤＮＡ５ng、および変異ＤＮＡ５ngを包含する。野生型の列では産物が皆無であり、ＰＮＡは野生型配列の増幅を阻害したことを示す。混合した野生型および変異ＤＮＡによる列では、産物の帯域は、変異ＤＮＡの増幅から生じる（すなわち列２、４および６）。列８〜11は、ＰＮＡの添加なしで増幅した野生型ＤＮＡを表し、ＰＮＡなしで、産物が形成されることを示す。実験Ｅ：ＰＮＡ鎖置換があり、かつスパンニングK-ras ＰＣＲ増幅にＰＮＡを用いる、野生型ＤＮＡ、および野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡとの混合物の増幅野生型ＤＮＡ10ng、および変異ＤＮＡ５ngと野生型ＤＮＡ５ngとの混合物をの増幅を、上記のとおり実施した。対立遺伝子特異的ＰＣＲ増幅には、ＰＣＲ産物の１：10,000の希釈を用いた。得られた増幅産物を、上記のとおりのアガロースゲル電気泳動によって分析した。この実験の結果を図７に示す。列１〜３は、K- ras 第２位プライマー２Ｃ（列１）（野生型）、２Ａ（列２）、２Ｔ（列３）による野生型ＤＮＡを包含する。列４〜６は、K-ras 第２位プライマー２Ｃ（列４）、２Ａ（列５）および２Ｔ（列６）（変異）による野生型ＤＮＡと変異ＤＮＡ（GAT）との混合物を包含する。これらの結果が立証するとおり、鎖置換段階、および最初のＰＣＲでのＰＮＡの使用は、対立遺伝子特異的増幅段階での偽陽性反応を排除する。等価物当業者は、より以上の定型的な実験を用いずに、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様の多くの等価物を認識するか、または確認できるものと思われる。そのような等価物は、下記の請求の範囲に包含されるものとする。

Claims

【特許請求の範囲】１．突然変異対立遺伝子を検出する方法であって、問題の突然変異対立遺伝子を有する可溶性ＤＮＡを含有する生体液の試料を与える段階と；該ＤＮＡを試料から抽出する段階と；該ＤＮＡを、該ＤＮＡの鎖のセグメントに相補的であるペプチド核酸と接触させる段階と；該ＤＮＡの第一鎖上の変異含有セグメントに相補的である１プライマー、および増幅の際に対立遺伝子特異的プライマーのそれぞれに対合させるための第一の一般的プライマー（該一般的プライマーは、該第一プライマーの位置から隔たった該ＤＮＡの第二鎖のセグメントに相補的である）を有する対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプライマー４個の少なくとも第一のセットを用いて、問題の突然変異対立遺伝子を対立遺伝子特異的な方式で増幅する段階と；問題の突然変異対立遺伝子の存在を検出する段階とを含む方法。２．問題の突然変異対立遺伝子を増幅する前に、ＤＮＡのセグメントに相補的であるペプチド核酸の存在下でＤＮＡを増幅する段階を更に含む請求項１記載の方法。３．ＤＮＡを抽出する前に、試料からタンパク質を除去し、試料中のいかなるＤＮアーゼも不活性化する段階を更に含む請求項１記載の方法。４．ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、突然変異対立遺伝子を対立遺伝子特異的な方式で増幅する請求項３記載の方法。５．増幅段階の後に、問題の突然変異対立遺伝子の存在を検出する段階が、ＰＣＲの増幅産物を用いて、対立遺伝子特異的なリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）またはリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）を実施する段階を含む請求項４記載の方法。６．塩溶液を試料に加え、次いで、試料を煮沸することによって、タンパク質を除去し、ＤＮアーゼを不活性化する請求項３記載の方法。７．生体液が、全血、血清、血漿、尿、喀痰、結腸流出液、内視鏡による逆行性胆管膵臓造影に起因する体液、骨髄、リンパ液および脳脊髄液よりなる群から選ばれる請求項３記載の方法。８．突然変異対立遺伝子が、既知の場所での点突然変異を有する遺伝子配列を含む請求項３記載の方法。９．第一ＤＮＡ鎖がセンス鎖であり、第二ＤＮＡ鎖がアンチセンス鎖である請求項８記載の方法。 10．ＰＣＲで突然変異対立遺伝子を増幅する段階を、3'エキソヌクレアーゼ活性を欠き、そのためプライマーの3'末端での単一ヌクレオチド誤対合を修復できる能力も欠くＤＮＡポリメラーゼを用いて実施する請求項３記載の方法。 11．ＤＮＡポリメラーゼがThermus aquaticus のＤＮＡポリメラーゼである請求項10記載の方法。 12．対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーの第一セットが、その１個が、センス鎖の一つの点突然変異に相補的である3'末端ヌクレオチドを有し、残余の３個が、増幅しようとするセグメントに対する野生型配列に、およびセンス鎖の変異した点で残余の２種類の可能な突然変異を有する配列に相補的である、４個のセンスプライマーと；センス鎖上の、センスプライマーが再対合する場所から隔たったアンチセンス鎖のセグメントに相補的である、増幅の際にセンスプライマーのそれぞれと対合する一般的アンチセンスプライマーと；を含む請求項10記載の方法。 13．相補的センスプライマーの3'末端ヌクレオチドが、センス鎖の変異ヌクレオチドと再対合する請求項12記載の方法。 14．突然変異対立遺伝子が、既知の２ケ所のうち一つでの点突然変異を有する遺伝子配列を含む請求項４記載の方法。 15．ＰＣＲによって突然変異対立遺伝子を増幅する段階が、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー４個の第二セットを第一セットとともに用いることを更に含み、第二セットの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、その１個が、センス鎖の一つの点突然変異に相補的である3'末端ヌクレオチドを有し、残余の３個が、増幅しようとするセグメントに対する野生型配列に、およびセンス鎖の変異した点で残余の２種類の可能な突然変異を有する配列に相補的である、４個のセンスプライマーと；センス鎖上の、センスプライマーが再対合する場所から隔たったアンチセンス鎖のセグメントに相補的である、増幅の際にセンスプライマーのそれぞれと対合する一般的アンチセンスプライマーと；を含む請求項14記載の方法。 16．相補的センスプライマーの3'末端ヌクレオチドが、センス鎖の変異ヌクレオチドと再対合する請求項15記載の方法。 17．検出しようとする突然変異対立遺伝子が、第12コドンの第１または２位に突然変異を有するK-ras 遺伝子配列である請求項16記載の方法。 18．第一セットの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、下記の配列：を有するセンスプライマー、および下記の配列：を含む請求項17記載の方法。 19．第二セットの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーが、下記の配列：を有するセンスプライマー、および下記の配列：を含む請求項15記載の方法。 20．増幅されたＤＮＡの存在を検出する段階を、１〜５％アガロースゲル中でのゲル電気泳動によって実施する請求項３記載の方法。 21．生体液が、全血、血清、血漿、尿、喀痰、結腸流出液、内視鏡による逆行性胆管膵臓造影に起因する体液、骨髄、リンパ液および脳脊髄液よりなる群から選ばれる請求項３記載の方法。 22．生体液中の、突然変異が第12コドンの第１位に存在する突然変異したK-ras 遺伝子配列の存在を検出するための診断キットであって、ＤＮＡの除タンパク質および単離を促進する試薬と；ＰＣＲによる増幅を容易にする試薬と；熱安定性ＤＮＡポリメラーゼと；下記の配列：を有する第一セットの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドセンスプライマーと；下記の配列：を有する第一の一般的アンチセンスプライマーとを含む診断用キット。 23．下記の配列：を有する第二セットの対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドのセンスプライマー、および下記の配列：を有する第二の一般的アンチセンスプライマーを更に含み、第二セットの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマー、および第二の一般的プライマーが、第12コドンの第２位で突然変異したK-ras 遺伝子配列の存在を生体液中で検出するのに役立つ請求項23記載の診断用キット。 24．ＰＣＲによる増幅を容易にする試薬が、ＤＮＡのセンス鎖のセグメントに相補的であるペプチド核酸を含む請求項22記載の診断用キット。