CN110964833A - 一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒 - Google Patents

一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种一管检测血浆游离DNA中KRAS和BRAF基因突变的试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明所述试剂盒包括：KRAS‑G12S‑F、KRAS‑G12R‑F、KRAS‑G12C‑F、KRAS‑G12S‑R、KRAS‑G12D‑R、KRAS‑G12A‑R、KRAS‑G12V‑R、KRAS‑G12D‑F、KRAS‑Probe1、KRAS‑Probe2、KRAS‑Blocker1、BRAF‑V600‑F、BRAF‑V600‑R和BRAF‑Probe。本发明试剂盒能够一管同时对外周血游离DNA样本中的人KRAS基因和BRAF基因突变进行快速检测。

Description

一种一管检测血浆游离DNA中KRAS和BRAF基因突变的试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种一管能检测人类血浆游离DNA中KRAS基因7个热点突变和BRAF基因1个热点突变的的引物及其试剂盒。
背景技术
RAS基因家族与人类肿瘤密切相关的基因有三种HRAS、KRAS和NRAS，这三种基因编码的蛋白质大约有90％的氨基酸序列同源，分子量均为21KDa，又称为RASp21蛋白。KRAS信号通路是EGFR和其他信号转导的下游通路，当RAS基因发生突变时，其编码的RAS蛋白水解GTP-RAS能力下降，使得信号转导通路一直处于持续激活状态，剌激细胞不断增殖分化，最终导致细胞恶变。
KRAS是一种原癌基因，长约35kb，位于12号染色体，是RAS基因家族成员之一，编码的蛋白主要参与PI3K、PTEN、AKT和RAF、MEK、ERK信号通路的调控。KRAS是许多恶性肿瘤的常见突变基因，其最常见的突变位点主要在2号外显子的第12、13密码子以及3号外显子的第61位密码子上。其中，第12、13密码子突变频率较高，占90％以上。KRAS基因处于EGFR信号传导的下游通路，调控EGFR的活化状态，起到“分子开关”的作用，当KRAS基因发生激活突变后，将促使肿瘤细胞不受控制地增殖，最终导致靶向药物失去对EGFR的抑制作用。
BRAF基因，全名鼠类肉瘤滤过性毒菌(V-Raf)致癌同源体B1，位于人染色体7q34，包含18个外显子，编码蛋白质分子全长约94Kd。BRAF基因属于RAF基因家族，同属于RAF基因家族的，还有ARAF(基因)和CRAF(基因)。虽然ARAF和CRAF这两个基因，和BRAF同属于RAF基因家族，但是，在肿瘤病例当中，很少发现有ARAF和CRAF的基因突变。统计数据表明：在肿瘤病例当中，ARAF和CRAF的突变比例都不高于1％。
BRAF基因编码的BRAF蛋白是一个丝氨基、酪氨酸激酶。主要有三个保守区，分别是CR1、CR2和CR3。其中CR3区为激酶的结构域，含甘氨酸环，是ATP的结合位点和主要激活区域，而且这区域的两个位点T598和S601的磷酸化对激活BRAF蛋白起着至关重要的作用。几乎BRAF基因上所有的突变都处于激酶结构域，主要是第600位密码子产生突变，包括V600E、V600K、V600R、V600D、V600M和V600L等，另外还有1798_1799ins、1799_1801del等。BRAF突变后，上述信号通路被持续激活，从而引起细胞的异常增殖分化。在恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等癌症中均发现不同比例的BRAF突变，其中BRAF突变在恶性黑色素瘤中约有60％，在乳头状甲状腺癌中约44％，在结直肠癌中约5-15％。研究发现大约80～90％的BRAF基因突变发生在第15号外显子的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。临床研究发现，在结直肠癌中，BRAF突变对EGFR靶向药物治疗耐药。同时，BRAF激酶抑制剂用于治疗携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者效果更好。此外，BRAF基因突变检测可作为甲状腺癌患者诊断的一项重要指标。大量研究表明BRAF基因突变作为乳头状甲状腺癌(PTC)发生的驱动性突变，已经成为乳头状甲状腺癌细针穿刺细胞学标本诊断和病情预后的一个重要指标。因此，对BRAF基因突变的检测，可以为肿瘤患者的个体化治疗提供更确切的依据。
随着分子生物学的飞速发展，越来越多的分子生物学方法应用于检测人KRAS基因和BRAF基因突变，包括测序、基因芯片、探针杂交等。荧光定量PCR(Q-PCR)技术在人RAS家族基因突变诊断领域的应用也已越来越广泛，越来越为人所重视，在人RAS家族基因突变的实验诊断中，Q-PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性。
外周血游离DNA是血中游离于细胞外的的机体内源性DNA片段。1994年，在肿瘤病人的血液中检测到RAS基因的突变，1997年Lo等发现孕妇血浆中存在游离的胎儿DNA。应用分子生物学手段对循环游离核酸的研究兴趣日益增加。血中游离DNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要价值。外周血液中癌细胞的突变DNA是存在于大量野生型基因背景下的极为稀少的突变基因，其存在比率一般在1％左右，能否准确无创地检测这类稀有突变对现有检测技术提出了挑战。
发明内容
本发明的目的在于提供一种一管检测血浆游离DNA中KRAS和BRAF基因突变的试剂盒，即提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高的人KRAS基因和BRAF基因突变检测试剂盒；应用本发明试剂盒，能够一管同时对外周血游离DNA样本中的人KRAS基因和BRAF基因突变进行快速检测。
本发明提供了用于检测人类KRAS基因7个热点突变的引物探针组，所述引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的KRAS-G12S-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的KRAS-G12R-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的KRAS-G12C-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的KRAS-G12S-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的KRAS-G12D-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的KRAS-G12A-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的KRAS-G12V-R和核苷酸序列如SEQID NO:9所示的KRAS-G12D-F；
所述探针包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的KRAS-Probe1和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的KRAS-Probe2；
所述探针包括经锁核苷酸和磷酸化修饰的阻滞剂探针KRAS-Blocker1，所述KRAS-Blocker1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述KRAS-Blocker1的第7位的G和第14位的G经锁核苷酸修饰，3’端的T经磷酸化修饰。
优选的是，所述荧光基团包括FAM，所述淬灭基团包括BHQl。
本发明还提供了用于检测人类BRAF基因1个热点突变的引物探针组，
所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的BRAF-V600-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的BRAF-V600-R；
所述探针包括SEQ ID NO:14所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的BRAF-Probe。
优选的是，所述荧光基团包括VIC，所述淬灭基团包括BHQl。
本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组和上述技术方案所述引物探针组的检测人类血浆游离DNA中KRAS基因7个热点突变和BRAF基因1个热点突变的试剂盒，所述的试剂盒包括：上述技术方案所述引物探针组。
优选的是，所述试剂盒还包括：其它配合所述探针和/或引物的检测试剂。
优选的是，所述试剂盒的反应体系每50μL包括：Taq酶和UNG酶共5个单位、l0mM的dNTPs和2.5mM的dUTP各0.4μL、100mM的Mg2+0.75μL、20×PCR缓冲液2.5μL、10μM的引物序列各自1～2μL、10μM的探针序列3～4μL，Enhancer 2μL、牛血清白蛋白2μL、山梨糖醇水溶液2μL、二甲基亚枫1.25μL和余量的水。
本发明提供了一种一管检测血浆游离DNA中KRAS和BRAF基因突变的试剂盒。本发明所述试剂盒能够实现提高通量、结果判别快速清晰的各种生物样本当中KRAS基因和BRAF基因突变进行风险预测，为临床提供是否需要进行进一步进行高通量测序提供判断依据。本发明解决了单管反应中联合检测KRAS基因7类和BRAF基因1个热点突变的难题，以往的试剂盒通常为单管反应检测单个热点突变，该项KRAS基因和BRAF联合检测手段节省了物力和人力成本，为大量样本同时检测KRAS基因突变和BRAF突变检测提供了途径。此外，以往的试剂盒通常采用ΔΔCt的算法对检测结果进行判读，l00ng野生型人DNA即易产生较强非特异性扩增，造成结果判别不清导致的假阳性结果。而本发明检测结果判读快速直观，KRAS基因突变和BRAF联合检测手段无需ΔΔ的算法，有突变即有扩增信号，结果判别快速清晰。
附图说明
图1为本发明提供的样本中不含KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变的野生型样本的荧光PCR扩增曲线；
图2为本发明提供的样本中含有KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变的荧光PCR扩增曲线；
图3为本发明提供的KRAS灵敏度实验结果；
图4为本发明提供的KRAS基因重复性实验结果；
图5为本发明提供的样本中不含BRAF基因V600E突变的野生型样本的荧光PCR扩增曲线；
图6为本发明提供的样本中含有BRAF基因V600E突变的荧光PCR扩增曲线；
图7为本发明提供的BRAF灵敏度实验结果；
图8为本发明提供的BRAF基因重复性实验结果。
具体实施方式
本发明提供了用于检测人类KRAS基因7个热点突变的引物探针组，所述引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的KRAS-G12S-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的KRAS-G12R-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的KRAS-G12C-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的KRAS-G12S-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的KRAS-G12D-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的KRAS-G12A-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的KRAS-G12V-R和核苷酸序列如SEQID NO:9所示的KRAS-G12D-F；
本发明根据KRAS基因12密码子第1位核苷酸由G突变为T而设计的一对上下游引物指SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。
根据KRAS基因12密码子第1位核苷酸由G突变为A而设计的一对上下游引物指SEQID NO:1和SEQ ID NO:4。
根据KRAS基因12密码子第1位核苷酸由G突变为C而设计的一对上下游引物指SEQID NO:2和SEQ ID NO:4。
根据KRAS基因12密码子第2位核苷酸由G突变为T而设计的一对上下游引物指SEQID NO:8和SEQ ID NO:9。
根据KRAS基因12密码子第2位核苷酸由G突变为A而设计的一对上下游引物指SEQID NO:6和SEQ ID NO:9。
根据KRAS基因12密码子第2位核苷酸由G突变为C而设计的一对上下游引物指SEQID NO:7和SEQ ID NO:9。
根据KRAS基因13密码子第2位核苷酸由G突变为A而设计的一对上下游引物指SEQID NO:12和SEQ ID NO:9。具体序列如下：
KRAS-G12S-F:5’-ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAA-3’(SEQ ID NO:1)；
KRAS-G12R-F:5’-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAACTC-3’(SEQ ID NO:2)；
KRAS-G12C-F:5’-ATATAAACTTGTGGTAGTTGGTGTTT-3’(SEQ ID NO:3)；
KRAS-G12S-R:5’-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCG-3’(SEQ ID NO:4)；
KRAS-G12D-R:5’-GCACTCTTGCCTACGCCTT-3’(SEQ ID NO:6)；
KRAS-G12A-R:5’-GGCACTCTTGCCTACGTCAG-3’(SEQ ID NO:7)；
KRAS-G12V-R:5’-GCACTCTTGCCTACGCGAA-3’(SEQ ID NO:8)；
KRAS-G12D-F:5’-CACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGC-3’(SEQ ID NO:9)；
所述探针包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的KRAS-Probe1和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的KRAS-Probe2；
具体的，本发明与目标核酸KRAS杂交的Taqman探针序列及其修饰如下：
KRAS-Probe1:FAM-5’-CCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTT-3’-BHQ1(SEQ ID NO:5)；
KRAS-Probe2:FAM-5’-CACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGC-3’-BHQ1(SEQ IDNO:10)；
所述探针包括经锁核苷酸和磷酸化修饰的阻滞剂探针KRAS-Blocker1，所述KRAS-Blocker1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述KRAS-Blocker1的第7位的G和第14位的G经锁核苷酸修饰，3’端的T经磷酸化修饰。在本发明中，所述阻滞剂探针为特异性与野生型目的核酸结合的阻滞剂探针，与目标核酸野生型基因进行杂交。
KRAS-Blocker1:5’-GCCTACGCCACCAGCTCCAACT-3’-Pho(标记下划线的碱基进行锁核酸化修饰，3’的-pho表示进行磷酸化修饰)(SEQ ID NO:11)。
在本发明中，所述荧光基团包括FAM，所述淬灭基团包括BHQl。
本发明还提供了用于检测人类BRAF基因1个热点突变的引物探针组，
所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的BRAF-V600-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示的BRAF-V600-R(根据BRAF基因V600E第2位核苷酸由T突变为A而设计的一对上下游引物)。
BRAF-V600-F:5’-GTGATTTTGGTCTAGCTTCGGA-3’(SEQ ID NO:12)；
BRAF-V600-R:5’-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-3’(SEQ ID NO:13)；
所述探针包括SEQ ID NO:14所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的BRAF-Probe(与目标核酸BRAF杂交)。
BRAF-Probe:VIC-5’-TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGA-3’-BHQ1(SEQ ID NO:14)。
在本发明中，所述荧光基团包括VIC，所述淬灭基团包括BHQl。
本发明还提供了上述技术方案所述引物探针组和上述技术方案所述引物探针组的检测人类血浆游离DNA中KRAS基因7个热点突变和BRAF基因1个热点突变的试剂盒，所述的试剂盒包括：上述技术方案所述引物探针组。在本发明中，所述试剂盒还包括：其它配合所述探针和/或引物的检测试剂。具体的，当本发明所述试剂盒为荧光PCR试剂盒时，所述试剂盒还可包括特异性扩增KRAS基因和BRAF基因的特定突变区域的引物对，用于扩增内参基因的引物和探针，以及PCR缓冲液等试剂。
在本发明中，所述的试剂盒还可包括说明所述的探针的使用方法的使用说明书，以用于指导本领域技术人员正确地使用。
利用本发明所述的试剂盒，可以一管非诊断性地检测KRAS基因和BRAF基因具体位点突变，具体过程为：以经过Sanger测序法确认的样本，采用试剂盒与该基因样本的结合情况，从而获得待测基因样本的KRAS基因和BRAF基因具体某位点突变情况。
在本发明中，所述试剂盒的反应体系每50μL包括：Taq酶和UNG酶共5个单位、l0mM的dNTPs和2.5mM的dUTP各0.4μL、100mM的Mg2+0.75μL、20×PCR缓冲液2.5μL、10μM的引物序列各自1～2μL、10μM的探针序列3～4μL，Enhancer2μL、牛血清白蛋白2μL、山梨糖醇水溶液2μL、二甲基亚枫1.25μL和余量的水。
本发明针对KRAS基因的7个热点突变位点，设计特异性PCR引物及特异性TaqMan探针，并加入经过LNA修饰的阻滞剂，针对BRAF基因的1个热点突变位点，设计特异性PCR引物及特异性探针，对待测样本在1个PCR孔进行检测。
本发明所述KRAS基因突变具体详见表1：
表1：KRAS基因12和13密码子的7种热点突变
COSMIC 氨基酸变化 碱基变化
516 G12C GGT>TGT
517 G12S GGT>AGT
518 G12R GGT>CGT
520 G12V GGT>GTT
521 G12D GGT>GAT
522 G12A GGT>GCT
532 G13D GGC>GAC
本发明所述BRAF基因突变具体相见表1：
表2：BRAF基因V600E热点突变
COSMIC 氨基酸变化 碱基变化
476 V600E GTG＞GAG
本发明将荧光定量PCR技术(TaqMan探针法)与经过锁核苷酸(LNA)修饰的阻滞探针技术相结合，实现了对基因突变的高效荧光PCR检测，即人KRAS基因第12和第13位密码子和BRAF V600E发生的突变的检测。本发明分别采用针对其不同突变方式设计的引物及特定设计的锁核苷酸修饰的阻滞探针对待测样品进行检测，并对PCR程序进行了改良。在特定的温度下，阻滞探针与野生型样品DNA结合使其无法得到扩增，而突变型样品则发生解链并与特异性的引物结合退火，随后只有突变型样品能被顺利扩增出双链DNA产物，发出荧光信号从而被检测到，采用不同报告基团标记的探针，实现在一管内检测两种基因的热点突变。
在普通的PCR反应过程中，当温度升至95℃时，DNA双链会解开形成单链，随后温度下降至55-60℃时，引物会退火并在特定位置与模板DNA结合，在温度继续升至72℃后，聚合酶开始DNA合成，多次重复这个过程就可以得到大量的目的基因片段。特别地，在检测KRAS基因突变的过程中，野生型DNA占据绝大多数，而突变形式的DNA比例极低，当DNA单链退火形成双链时，突变DNA会与野生型DNA形成杂合形式的双链，这种杂合链在突变位置的碱基是不匹配的，因此其Tm值相比纯合双链会降低。针对此种Tm值的差异，本发明对PCR程序进行了优化。
本发明设计了一种3'端被磷酸化、个别碱基进行了锁核苷酸(LNA)修饰的阻滞剂探针，该探针仅与野生型DNA结合并可以阻止其扩增，锁核苷酸的修饰可以提高探针的Tm值，增强与DNA的结合力。本发明所述阻滞剂探针与突变DNA形成的杂合双链的Tm值为60度。在温度为Tc(低于Tm)时，只有含有突变的杂合DNA会发生解链，而阻滞剂与野生型DNA形成的纯合DNA则仍保持双链状态(其Tm较Tc要高)；随后温度降低，特异性引物退火并与带有突变的DNA结合，在聚合酶的作用下进行DNA合成，完成PCR反应发出荧光并被检测到。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种一管检测血浆游离DNA中KRAS和BRAF基因突变的试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明以KRAS基因12和13密码子的7种突变和BRAFV600E的1种突变为检测对象，通过优化引物探针组合,将荧光定量PCR技术(TaqMan探针法)与经过锁核苷酸(LNA)修饰的阻滞探针技术相结合，从而实现在外周血样品中快速准确、简单地检测8种突变，检测突变的能力高达0.5％～1％。
2种野生型及其他8种突变型以经过基因工程构建的质粒作为模板，建立一管同时使用荧光PCR检测KRAS基因7种突变和BRAF基因1种突变的反应体系并用于KRAS基因和BRAF基突变的快速检测。此方法主要包括以下步骤：
1)根据Cosmic数据库所公布的KRAS基因12和13密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计多对高特异性简并引物，特异性探针以及经过锁核酸修饰(LNA)的阻滞剂。
2)根据Cosmic数据库所公布的BRAF基因V600E的野生型基因序列和1种突变基因序列，设计多对高特异性引物，特异性探针。
2)待测样品处理和模板DNA提取。
3)施行荧光PCR扩增。
4)检测荧光信号，直接以达到设定阈值时有无Ct值作为结果判断的标准。
步骤1)中根据Cosmic数据公布的KRAS基因12和13密码子的野生型基因序列和7种突变基因序列，设计多对高特异性简并引物和特异性探针。
步骤2)中根据Cosmic数据公布的BRAF基因V600E的野生型基因序列和1种突变基因序列，设计引物和特异性探针。
其中步骤2)样品处理和模板提取，样品适用范围包括血液、血浆等标本。对于样本的处理参照市场上相应的游离DNA提取试剂盒的操作说明。
步骤3)的荧光PCR扩增的反应体系为：
Figure BDA0002356714810000101
Figure BDA0002356714810000111
步骤3)的反应条件是：
第一阶段，95℃5分钟，1个循环；
第二阶段，95℃15秒，60℃30秒，6个循环；
第三阶段，95℃15秒，70℃30秒，77℃10秒，60℃20秒，72℃35秒，44个循环；其中，72℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光；
第四阶段，40℃30秒，1个循环。
反应过程中检测荧光信号的Ct值，是采用ABI 7500荧光PCR扩增仪退火阶段收集荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳性质控)。反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，直接观察有无信号进行结果判读。
实施例1
1.KRAS基因突变检测
以检测临床采集的血浆样本KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变为例。
KRAS-G12S-F:-ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAA-(SEQ ID NO:1)
KRAS-G12R-F:-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAACTC-(SEQ ID NO:2)
KRAS-G12C-F:-ATATAAACTTGTGGTAGTTGGTGTTT-(SEQ ID NO:3)
KRAS-G12S-R:-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCG-(SEQ ID NO:4)
KRAS-G12D-R:-GCACTCTTGCCTACGCCTT-(SEQ ID NO:6)
KRAS-G12A-R:-GGCACTCTTGCCTACGTCAG-(SEQ ID NO:7)
KRAS-G12V-R:-GCACTCTTGCCTACGCGAA-(SEQ ID NO:8)
KRAS-G12D-F:-CACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGC-(SEQ ID NO:9)
KRAS-Probe1:FAM-CCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTT-BHQ1(SEQ ID NO:5)
KRAS-Probe2:FAM-CACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGC-BHQ1(SEQ ID NO:10)
KRAS-Blocker1:GCCTACGCCACCAGCTCCAACT-Pho(标记下划线的碱基进行锁核酸化修饰，3'的-pho表示进行磷酸化修饰)(SEQ ID NO:11)
BRAF-V600-F:-GTGATTTTGGTCTAGCTTCGGA-(SEQ ID NO:12)
BRAF-V600-R:-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-(SEQ ID NO:13)
BRAF-Probe:VIC-TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGA-BHQ1(SEQ ID NO:14)
利用上述荧光定量PCR体系检测临床采集的血浆样本KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变的方法包括如下步骤：
(1)样品处理和模板提取
1)用EDTA抗凝采血管采集血液，4℃离心装有血样的采血管12分钟，转速2000rpm，随后将上清转移至干净的1.5ml离心管，4℃离心8分钟，转速10000rpm.
2)将上清取2ml转移至15ml离心管内，加入3ml裂解液GHH，200μl蛋白酶K，30μl磁珠，以及1μl Carrier RNA，漩涡震荡混匀，室温孵育20分钟，期间每3-5分钟上下颠倒混匀10秒，使磁珠和核酸充分结合。
3)将离心管置于磁力架上2分钟，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管，加入750μl缓冲液GDF，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
4)加入750μl漂洗液PWG,上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管，重复加入PWG溶液步骤一次。
5)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min，加入65μl洗脱缓冲液TBC，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min，将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于适当条件保存。
(2)荧光PCR扩增，其反应体系为
Figure BDA0002356714810000131
反应条件是：
第一阶段，95℃5分钟，1个循环；
第二阶段，95℃15秒，60℃30秒，6个循环；
第三阶段，95℃15秒，70℃30秒，77℃10秒，60℃20秒，72℃35秒，44个循环；其中，72℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光；
第四阶段，40℃30秒，1个循环。
反应过程中检测荧光信号的Ct值，是采用ABI 7500荧光PCR扩增仪退火阶段收集荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳性质控)。反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，直接观察有无信号并进行结果判读。
图1为样本中不含KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变的野生型样本的荧光PCR扩增曲线，无样本扩增；图2为样本中含有KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变的荧光PCR扩增曲线，样本均有扩增。
(3)灵敏度分析：
以合成的含有KRAS基因GGT>GCT(G12A)突变的质粒DNA与合成的含有KRAS野生型序列的质粒DNA进行不同比例的配比，在总浓度为1500拷贝数的条件下，本发明的PCR荧光检测方法最低可检测1％突变率，绝对拷贝数为15-20copies。KRAS灵敏度实验结果见图3，总浓度为1500拷贝数的条件下，KRAS 1％突变率，绝对拷贝数为15-20copies的样本能够得到扩增。
(4)重复性实验
分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值的CV值<10％。KRAS基因重复性实验结果见图4，结果显示，均一性良好。
实施例2
1.BRAF基因突变检测
以检测临床采集的血浆样本BRAF基因V600E突变为例。
KRAS-G12S-F:-ATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCAA-(SEQ ID NO:1)
KRAS-G12R-F:-AATATAAACTTGTGGTAGTTGGAACTC-(SEQ ID NO:2)
KRAS-G12C-F:-ATATAAACTTGTGGTAGTTGGTGTTT-(SEQ ID NO:3)
KRAS-G12S-R:-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCG-(SEQ ID NO:4)
KRAS-G12D-R:-GCACTCTTGCCTACGCCTT-(SEQ ID NO:6)
KRAS-G12A-R:-GGCACTCTTGCCTACGTCAG-(SEQ ID NO:7)
KRAS-G12V-R:-GCACTCTTGCCTACGCGAA-(SEQ ID NO:8)
KRAS-G12D-F:-CACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGC-(SEQ ID NO:9)
KRAS-Probe1:FAM-CCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTT-BHQ1(SEQ ID NO:5)
KRAS-Probe2:FAM-CACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGC-BHQ1(SEQ ID NO:10)
KRAS-Blocker1:GCCTACGCCACCAGCTCCAACT-Pho(标记下划线的碱基进行锁核酸化修饰，3'的-pho表示进行磷酸化修饰)(SEQ ID NO:11)
BRAF-V600-F:-GTGATTTTGGTCTAGCTTCGGA-(SEQ ID NO:12)
BRAF-V600-R:-AACTCAGCAGCATCTCAGGG-(SEQ ID NO:13)
BRAF-Probe:VIC-TCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGA-BHQ1(SEQ ID NO:14)
利用上述荧光定量PCR体系检测临床采集的血浆样本BRAF基因V600E突变的方法包括如下步骤：
(1)样品处理和模板提取
1)用EDTA抗凝采血管采集血液，4℃离心装有血样的采血管12分钟，转速2000rpm，随后将上清转移至干净的1.5ml离心管，4℃离心8分钟，转速10000rpm.
2)将上清取2ml转移至15ml离心管内，加入3ml裂解液GHH，200μl蛋白酶K，30μl磁珠，以及1μl Carrier RNA，漩涡震荡混匀，室温孵育20分钟，期间每3-5分钟上下颠倒混匀10秒，使磁珠和核酸充分结合。
3)将离心管置于磁力架上2分钟，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管，加入750μl缓冲液GDF，上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管。
4)加入750μl漂洗液PWG,上下颠倒混匀30sec使磁珠充分悬浮，将离心管置于磁力架上1min，待磁珠完全吸附时用移液器小心去除液体，取下离心管，重复加入PWG溶液步骤一次。
5)将离心管置于磁力架上，室温晾干5-10min，加入65μl洗脱缓冲液TBC，用移液器吹吸使磁珠重新悬浮，56℃孵育5min，将离心管放置于磁力架上静置2min，待磁珠完全吸附时小心将核酸溶液转移至新的离心管中，并于适当条件保存。
(2)荧光PCR扩增，其反应体系为
荧光PCR扩增，其反应体系为
Figure BDA0002356714810000161
反应条件是：
第一阶段，95℃5分钟，1个循环；
第二阶段，95℃15秒，60℃30秒，6个循环；
第三阶段，95℃15秒，70℃30秒，77℃10秒，60℃20秒，72℃35秒，44个循环；其中，72℃时收集FAM和VIC荧光信号，每个循环收集一次荧光；
第四阶段，40℃30秒，1个循环。
反应过程中检测荧光信号的Ct值，是采用ABI 7500荧光PCR扩增仪退火阶段收集荧光，一次可检测96份样品(包括阴阳性质控)。反应结束后，根据扩增曲线划定阈值，直接观察有无信号并进行结果判读。
图5为样本中不含BRAF基因V600E突变的野生型样本的荧光PCR扩增曲线，无样本扩增；图6为样本中含有BRAF基因V600E突变的荧光PCR扩增曲线，样本均有扩增；
(3)灵敏度分析：
以合成的含有BRAF基因V600E突变的质粒DNA与合成的含有BRAF野生型序列的质粒DNA进行不同比例的配比，在总浓度为1500拷贝数的条件下，本发明的PCR荧光检测方法最低可检测1％突变率，绝对拷贝数为15-20copies。BRAF灵敏度实验结果见图7，总浓度为1500拷贝数的条件下，BRAF 1％突变率，绝对拷贝数为15-20copies的样本能够得到扩增。
(4)重复性实验
分别取10例经传统测序方法验证为阳性和阴性的样品，重复10次进行荧光PCR扩增，10次Ct值的CV值<10％。BRAF基因重复性实验结果见图8，均一性良好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 一种一管检测血浆游离DNA中KRAS和BRAF基因突变的试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atataaactt gtggtagttg gagcaa 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatataaact tgtggtagtt ggaactc 27
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atataaactt gtggtagttg gtgttt 26
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acctctattg ttggatcata ttcg 24
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttgacgat acagctaatt cagaatcatt t 31
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcactcttgc ctacgcctt 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcactcttg cctacgtcag 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcactcttgc ctacgcgaa 19
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacattttca ttatttttat tataaggc 28
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacaagttta tattcagtca ttttcagcag gc 32
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcctacgcca ccagctccaa ct 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgattttgg tctagcttcg ga 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aactcagcag catctcaggg 20
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcccatcagt ttgaacagtt gtctgga 27

Claims (7)

1.用于检测人类KRAS基因7个热点突变的引物探针组，其特征在于，所述引物包括：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的KRAS-G12S-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的KRAS-G12R-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的KRAS-G12C-F、核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的KRAS-G12S-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的KRAS-G12D-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的KRAS-G12A-R、核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的KRAS-G12V-R和核苷酸序列如SEQID NO:9所示的KRAS-G12D-F；
所述探针包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的KRAS-Probe1和SEQ ID NO:10所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的KRAS-Probe2；
所述探针包括经锁核苷酸和磷酸化修饰的阻滞剂探针KRAS-Blocker1，所述KRAS-Blocker1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述KRAS-Blocker1的第7位的G和第14位的G经锁核苷酸修饰，3’端的T经磷酸化修饰。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括FAM，所述淬灭基团包括BHQl。
3.用于检测人类BRAF基因1个热点突变的引物探针组，其特征在于，
所述引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示的BRAF-V600-F和核苷酸序列如SEQ IDNO:13所示的BRAF-V600-R；
所述探针包括SEQ ID NO:14所示核苷酸序列5’端标记荧光基团、3’端标记猝灭基团的BRAF-Probe。
4.根据权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述荧光基团包括VIC，所述淬灭基团包括BHQl。
5.一种基于权利要求1或2所述引物探针组和权利要求3或4所述引物探针组的检测人类血浆游离DNA中KRAS基因7个热点突变和BRAF基因1个热点突变的试剂盒，所述的试剂盒包括：权利要求1或2所述引物探针组和权利要求3或4所述引物探针组。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：其它配合所述探针和/或引物的检测试剂。
7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系每50μL包括：Taq酶和UNG酶共5个单位、l0mM的dNTPs和2.5mM的dUTP各0.4μL、100mM的Mg2+0.75μL、20×PCR缓冲液2.5μL、10μM的引物序列各自1～2μL、10μM的探针序列3～4μL，Enhancer 2μL、牛血清白蛋白2μL、山梨糖醇水溶液2μL、二甲基亚枫1.25μL和余量的水。
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