KR20160106041A - Ｎｒａｓ 및 ｂｒａｆ 핵산의 멀티플렉스 분석을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

NRAS 및/또는 BRAF 변경(예를 들어, 카피수 및 발현 수준의 변이, 및/또는 점 돌연변이를 포함한 돌연변이의 존재)의 검출과 관련되어 있는 방법 및 검정이 본 명세서에 기재되어 있다. 기존의 방법들은, 예를 들어 제한된 감도, 실험실간 불일치(inter-lab discordance), 또는 필요한 멀티플렉스 능력(multiplex ability)의 제공 불가능에 의해 그들의 임상적 유용성에 있어서 제한된다. 본 명세서에 제공된 방법 및 검정은 환자의 더 신속하고 더 비용-효과적인 검사 및 스크리닝을 위한 멀티모달 멀티플렉스 검정(multimodal, multiplex assaying)을 가능하게 하여 개선된 건강관리(heathcare)를 가능하게 한다.

Description

ＮＲＡＳ 및 ＢＲＡＦ 핵산의 멀티플렉스 분석을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR MULTIPLEX ANALYSIS OF NRAS AND BRAF NUCLEIC ACIDS}

관련 출원과의 상호참조

본 출원은 2013년 8월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/865,754호에 대하여 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 이득을 주장하며, 그의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출되고 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 서열 목록을 포함한다. 2014년 7월 29일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 046264-078891-PCT_SL.txt로 명명되고 크기는 28,830 바이트이다.

본 명세서에 기재된 기술은 점 돌연변이를 포함한 돌연변이의 존재 및/또는 부재의 검출을 가능하게 하는 검정(assay) 및 방법(method)에 관한 것이다.

개인맞춤형 의약(personalized medicine)의 발달은 돌연변이되고/되거나 변경될 때 질병에 기여할 수 있는 유전자의 확인으로 이어져 왔다. 예를 들어, 유전자를 인코딩하는 서열은 야생형 또는 건강한 대상체와 비교하여 주어진 질병을 갖거나 그를 발생시킬 위험에 있는 대상체에서 돌연변이될 수 있다.

예를 들어, NRAS 및 BRAF는 암에 관여하고 있으며, 임의의 주어진 암 세포는 NRAS 및 BRAF 중 하나 또는 둘 모두의 돌연변이를 보여줄 수 있다. 이들 돌연변이는, 예를 들어 질병 중증도 및/또는 특정 치료 선택지(therapeutic option)에 대한 반응성에 연관되어 왔다. 그러한 돌연변이를 검출하기 위한 전통적인 접근법은 종합적인 임상 진단학에 필요한 것보다 더 적은 멀티플렉스 능력(multiplex ability)을 제공한다. 멀티플렉스 검정(multiplex assay)의 개발은 환자의 더 신속하고 더 비용-효과적인 검사 및 스크리닝을 가능하게 할 수 있어서 개선된 건강관리(heathcare)를 가능하게 한다.

본 명세서에 기재된 기술은 NRAS 및/또는 BRAF의 돌연변이, 예를 들어 서열의 변경을 검출하기 위한 방법 및 검정에 관한 것이다. 본 발명자들은 단일 멀티플렉스화 검정(single multiplexed assay)에서 NRAS 및/또는 BRAS 돌연변이의 존재 또는 부재를 신뢰성 있게 결정하기 위한 검정을 개발하고 그렇게 하기 위한 방법을 찾아내었다.

일 태양에서, NRAS 및/또는 BRAF의 돌연변이를 검출하기 위한 검정이 본 명세서에 기재되며, 본 검정은 핵산 샘플의 일부분을 일 세트의 프라이머들과 접촉시키는 단계로서, 일 세트의 프라이머들은 프라이머 쌍들의 하위세트들을 포함하며, 여기서 각 프라이머 쌍은 서열 변이를 포함하는 NRAS 또는 BRAF 서열을 증폭시키는 것인 단계; 샘플의 일부분 및 하나 이상의 세트의 프라이머들을 포함하는 반응 혼합물에 대하여 가닥 분리, 프라이머 어닐링(annealing), 및 프라이머 신장(extension)의 사이클을 포함하는 PCR 증폭 계획(amplification regimen)을 수행하는 단계; 각 프라이머 쌍에 대하여 앰플리콘(amplicon)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 앰플리콘의 존재는 그 프라이머 쌍이 특이적인 서열 변이의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하며, 프라이머들 중 하나 이상은 서열 번호 1-39로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 서열 변이는 점 돌연변이이다. 일부 실시 형태에서, NRAS 점 돌연변이는 G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, BRAF 점 돌연변이는 V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2의 존재 또는 부재가 검출된다. 일부 실시 형태에서, V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA의 존재 또는 부재가 검출된다.

일부 실시 형태에서, 핵산 샘플은 FFPE 종양 샘플로부터 준비된다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및/또는 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 하나 이상의 프라이머가 이중 도메인 프라이머이다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 구별될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 뚜렷이 다른 크기(distinct size)들을 가짐으로써 구별된다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 상이한 검출가능한 표지들로 표지됨으로써 구별된다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들은 대략 실시예 1의 농도로 반응 혼합물 내에 존재한다.

일 태양에서, 조성물이 본 명세서에 기재되며, 본 조성물은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 조성물은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 프라이머 쌍들을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 조성물은 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 프라이머 쌍들을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 혼성화된다. 일부 실시 형태에서, 각 프라이머 쌍의 적어도 하나의 구성원이 형광 표지된다(fluorescently-labelled).

일 태양에서, 조성물이 본 명세서에 기재되며, 본 조성물은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍들에 의한 표적 폴리뉴클레오티드들의 증폭으로부터 생성된 형광 표지 증폭 산물들을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 본 조성물은 완충액; dNTP; 및 DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 반응 혼합물 성분들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 조성물은 FFPE 종양 샘플로부터 준비된 핵산 샘플을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 조성물은 위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및/또는 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들은 대략 실시예 1의 농도로 존재한다.

도 1은 실시예 1에 기재된 실시 형태에 따른 ICEPlex 시스템 상에서의 NRA/BRAF 표적들의 멀티플렉스 검출의 결과를 묘사한다. 상측 패널은 4개의 BRAF 표적들이 TYE 채널에서 검출되었음을 입증한다. 하측 패널은 12개의 NRAS 표적들이 FAM 채널에서 검출되었음을 입증한다.
도 2는 실시예 1에 기재된 기준 유전자 대조군들의 멀티플렉스 검출의 결과를 묘사한다.

본 명세서에 기재된 기술의 실시 형태는 NRAS 및/또는 BRAF의 변이, 예를 들어 서열의 변이(돌연변이), 발현 수준의 변이, 및/또는 유전자 카피수의 변이를 검출하기 위한 방법 및 검정, 및 특히 NRAS 및/또는 BRAF 변이를 검출하는 멀티플렉스화 및 멀티모달 검정 및 방법에 관한 것이다. 프라이머 세트들 및/또는 프라이머 쌍 서브세트들 사이의 간섭이 멀티플렉스 PCT 검정에서 접하게 되는 문제이다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 고감도를 갖는 단일 반응에서 그리고 프라이머 쌍들 사이의 유의한 교차-반응 없이 적어도 복수의 상이한 NRAS 및/또는 BRAF 돌연변이(예를 들어, SNP)들의 멀티플렉스 검출을 가능하게 함으로써 기존의 기술을 개선한다.

다수의 상이한 NRAS 및/ BRAF 변이들이 알려져 있으며, 하나의 샘플에서 그러한 일 그룹의 변이들의 존재 및/또는 부재를 구별하는 것이 기존의 단일 반응 기술에서는 문제가 있는데, 그 이유는 이들 변이가 가깝게 이격되어 있으며, 심지어 일부 경우에는 중첩되어 있기도 하기 때문이다. 백그라운드 신호가 최소화되어야 하거나 검정은 특이적 돌연변이들을 확인하는 데 신뢰성 있게 수행되지 않을 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "NRAS" 또는 "신경아세포종 RAS 바이러스성 발암유전자 상동체(neuroblastoma RAS viral oncogene homolog)"는 염색체 1 상에 인코딩된 작은 GTPase Ras 패밀리 단백질을 지칭한다. NRAS의 서열은 다수의 종(species)에 대해 당업계에 잘 알려져 있다: 예를 들어, 인간 NRAS(NCBI 유전자 ID: 4893; 서열 번호 40(NCBI 참조 서열: NM_002524; mRNA); 서열 번호 41(NCBI 참조 서열: NP_002515; 폴리펩티드)).

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "BRAF" 또는 "v-Raf 뮤린 육종 바이러스성 발암유전자 상동체 B(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B)"는 AKT1; CRaf, HRAS, 및 YWHAB와 상호작용하는 Raf 키나제 패밀리 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나제를 지칭한다. BRAF의 서열은 다수의 종에 대해 당업계에 잘 알려져 있다: 예를 들어, 인간 BRAF(NCBI 유전자 ID: 673; 서열 번호 42(NCBI 참조 서열: NM_004333; mRNA); 서열 번호 43(NCBI 참조 서열: NP_004324; 폴리펩티드)).

일 태양에서, NRAS 및/또는 BRAF의 돌연변이를 검출하기 위한 검정이 본 명세서에 기재되며, 본 검정은 핵산 샘플의 일부분을 일 세트의 프라이머들과 접촉시키는 단계로서, 일 세트의 프라이머들은 프라이머 쌍들의 하위세트들을 포함하며, 여기서 각 프라이머 쌍은 서열 변이를 포함하는 NRAS 또는 BRAF 서열을 증폭시키는 것인 단계; 샘플의 일부분 및 하나 이상의 세트의 프라이머들을 포함하는 반응 혼합물에 대하여 가닥 분리, 프라이머 어닐링, 및 프라이머 신장의 사이클을 포함하는 PCR 증폭 계획을 수행하는 단계; 각 프라이머 쌍에 대하여 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 앰플리콘의 존재는 그 프라이머 쌍이 특이적인 서열 변이의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 프라이머들 중 하나 이상은 서열 번호 1-39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들 중 하나 이상은 서열 번호 1-18의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들 중 하나 이상은 서열 번호 19-39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들은 서열 번호 1-18의 서열을 갖는 분자들로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들은 서열 번호 19-39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진다.

BRAF 및/또는 NRAS의 변이는, 진단, 예후, 및/또는 치료 선택에 있어서 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, BRAF 및/또는 NRAS의 다수의 돌연변이는 동일한 반응 혼합물 내에서, 예를 들어 동일한 관, 웰(well), 또는 베셀(vessel) 내에서 검출된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 검정은 단일관 내에서 일어나며, 예를 들어 다수의 하위세트들의 프라이머 쌍들이 단일 반응 혼합물 및/또는 베셀 또는 용기(container) 내에 존재한다. 따라서, 상기 실시 형태에서는, 단일 증폭 계획이 다수의 돌연변이의 존재 및/또는 부재에 관한 데이터를 제공할 것이다.

일 태양에서, 본 명세서에 기재된 검정 및 방법은 NRAS 및/또는 BRAF 내의 서열 변이의 존재를 검출하는 것과 관련되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "서열 변이"는 치환, 삽입, 결실, 중복, 또는 재배열을 지칭할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 서열 변이는 점 돌연변이이다.

예를 들어 점 돌연변이, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)을 포함한 서열 변이는 표현형적으로 중립(phenotypically neutral)일 수 있거나, 또는 그 좌위(locus)에서 우세한 서열에 의해 나타나는 것과 그것을 구별하는 관련 변이체 표현형을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "중립 다형성"은 서열 변이가 유전자 기능을 변경시키지 않는 다형성을 지칭하고, "돌연변이" 또는 "기능적 다형성"은 유전자 기능을 변경시키고, 이에 따라 관련 표현형을 갖는 서열 변이를 지칭한다. 집단에서 일어나는 좌위의 서열 변이는 대립유전자(allele)로 지칭된다. 2개 이상의 대립유전자가 집단 내에서 발생하는 특이적 좌위에 관하여 개체의 유전자형을 언급하는 경우, "우세 대립유전자"는 대상이 되는 집단 내에서 가장 빈번하게 발생하는 것이다(즉, 2개의 대립유전자가 있는 경우, 집단의 50% 초과로 발생하는 대립유전자가 우세 대립유전자이고; 2개 초과의 대립유전자가 있는 경우, "우세 대립유전자"는 최고의 빈도로, 예를 들어 그 부위에서의 다른 대립유전자에 비하여 적어도 5% 더 높은 빈도로 대상 집단 내에서 발생하는 것이다). 용어 "변이형 대립유전자(variant allele)"는 그 집단에서의 우세 대립유전자보다 덜 빈번하게 발생하는 대립유전자 또는 대립유전자들을 지칭하기 위해 사용된다(예를 들어, 2개의 대립유전자가 있는 경우, 변이형 대립유전자는 대상 집단의 50% 미만으로 발생하는 것이고; 2개 초과의 대립유전자가 있는 경우, 변이형 대립유전자들은 우세 대립유전자보다 덜 빈번하게, 예를 들어 적어도 5% 덜 빈번하게 발생하는 것들 전부이다). 서열 변이는 유전자의 gDNA 및/또는 mRNA 내에 존재할(그리고 이에 따라 거기에서 검출될) 수 있다.

일부 실시 형태에서, 서열 변이체는 점 돌연변이일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "점 돌연변이"는 (삽입 및 결실을 포함한) 게놈 좌위의 돌연변이체 카피(mutant copy)에서의 돌연변이의 부위에 존재하는 뉴클레오티드의 정체(identity)를 지칭하며, 즉 이는 야생형 서열로부터의 단일 염기 위치에서의 뉴클레오티드의 서열의 변경을 지칭한다. SNP(단일 뉴클레오티드 다형성)는 집단 내의 상이한 개체들 사이의 동일한 게놈 좌위에서 발생하는 점 돌연변이의 하나의 유형이다. 점 돌연변이는 이것이 동일한 개체 내의 상이한 세포들 사이에서 발생한다는 점에서 체세포 돌연변이일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 서열 변이는 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단일 뉴클레오티드 다형성" 또는 "SNP"는 단일 뉴클레오티드 결실, 삽입, 또는 염기 변화 또는 치환을 포함한 단일 뉴클레오티드 잔기에서의 핵산 서열 변이를 지칭한다. SNP는 대립유전자 SPN일 수 있다. 일부 SNP는 명확한 표현형, 예를 들어 질병 표현형을 가지며, 한편 다른 것들은 어떠한 기지의 관련 표현형도 갖지 않는다. 본 명세서에 기재된 SNP 검출 방법은 표현형 특성의 예측, 예를 들어 약물에 대한 반응성 또는 민감성의 예측에 사용될 수 있다. 이에 관하여, 본 명세서에 기재되고 당업계에 알려진 SNP 유전자형 결정(genotyping)은 반드시 질병 또는 질병에 대한 감수성의 진단인 것은 아니다.

기재된 바와 같이, 일부 실시 형태에서, 변경은 SNP를 포함한다. SNP 좌위의 적어도 4개의 대립유전자가 가능하지만, 표적 부위에 있는 2개의 뉴클레오티드들 사이에서만 변동하는 SNP는 드물지 않다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 SNP 좌위의 단일 대립유전자를 검출할 수 있는 프라이머 쌍들의 하위세트에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 SNP 좌위의 2개의 대립유전자를 검출할 수 있는 일 세트의 프라이머들에 관한 것이다(즉, 본 방법 및 조성물은 2개의 SNP 대립유전자의 긍정적 검출(affirmative detection), 또는 그러한 SNP의 "2상(biphasic)" 유전자형 결정을 가능하게 하는 검정에 관한 것일 수 있다). 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 SNP 좌위의 3개의 대립유전자를 검출할 수 있는 일 세트의 프라이머들에 관한 것이다(즉, 본 방법 및 조성물은 3개의 SNP 대립유전자의 긍정적 검출, 또는 그러한 SNP의 "3상(biphasic)" 유전자형 결정을 가능하게 하는 검정에 관한 것일 수 있다). 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 SNP 좌위의 4개의 대립유전자의 긍정적 검출을 가능하게 하는 검정에 관한 것이다(즉, 본 방법 및 조성물은 4개의 SNP 대립유전자의 멀티플렉스 검출, 또는 그러한 SNP의 "4상(quaduphasic)" 유전자형 결정을 가능하게 하는 검정에 관한 것일 수 있다). 일부 실시 형태에서, SNP의 우세 및/또는 야생형 대립유전자가 검출된다. 일부 실시 형태에서, SNP의 우세 및/또는 야생형 대립유전자가 검출되지 않는다. "긍정적으로 검출되다"란, 검정이 그러한 특이적 대립유전자의 증폭을 가능하게 함을 의미한다. 예를 들어 단지 2개의 가능성만이 SNP 부위에 존재하는 것으로 알려져 있는 경우에, 긍정적 검출의 대안이 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 검정은 2개의 변이체들 중 하나는 증폭되고, 다른 하나는 그렇지 않도록 설계될 수 있으며; 검정은 그러한 증폭된 변이체를 긍정적으로 검출하고 다른 하나는 소극적으로 검출할 수 있는데, 즉 산물의 결여는 다른 대립유전자 또는 변이체가 존재함을 의미한다.

일부 실시 형태에서, NRAS 및/또는 BRAF 서열 변이(들)는 점 돌연변이일 수 있다. 일부 실시 형태에서, NRAS 점 돌연변이는 다음의 아미노산 잔기 변화 중 하나를 가져오는 점 돌연변이일 수 있다: G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2. 일부 실시 형태에서, BRAF 점 돌연변이는 다음의 아미노산 잔기 변화 중 하나를 가져오는 점 돌연변이일 수 있다: V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA.

다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 적어도 일 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭 계획을 수행하는 것과 관련되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프라이머"는, 폴리뉴클레오티드 주형에 서열-특이적으로 어닐링하고 주형-의존성 중합효소에 대한 기질로서의 역할을 하는 3' 말단을 제공하여 폴리뉴클레오티드 주형에 상보적인 신장 산물을 생성할 수 있는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 분자 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 개시 및 신장에 대한 조건은 통상, 적합한 완충액 중에서(이와 관련하여, "완충액"은 용매(일반적으로 수성)와 pH, 이온 강도 등에 영향을 주는 데 필요한 보조인자(cofactor) 및 시약을 포함함) 그리고 적합한 온도에서, 적어도 하나의, 그러나 더 바람직하게는 모든 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오시드 삼인산염 및 중합 유도제, 예컨대 DNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재를 포함한다. 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 프라이머는 일반적으로 단일가닥이며, 프라이머 및 그의 보체를 어닐링하여 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따른 프라이머는 300개 이하의 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 300, 또는 250, 또는 200, 또는 150, 또는 100, 또는 90, 또는 80, 또는 70, 또는 60, 또는 50, 또는 40개 이하, 그리고 바람직하게는 30개 이하, 또는 20개 이하, 또는 15개 이하, 그러나 적어도 10개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "세트"는 일 그룹의 핵산 샘플들, 프라이머들 또는 다른 실체(entity)들을 의미한다. 일 세트는 기지의 수의 그리고 적어도 2개의 그러한 실체들을 포함할 것이다. 일 세트의 프라이머들은 표적 서열에 특이적인 적어도 하나의 순방향 프라이머 및 적어도 하나의 역방향 프라이머를 포함한다. 일 세트의 프라이머들은 적어도 하나의 프라이머 쌍 하위세트, 예를 들어 일 프라이머 쌍 하위세트, 두 프라이머 쌍 하위세트들, 셋 프라이머 쌍 하위세트들, 넷 프라이머 쌍 하위세트들, 다섯 프라이머 쌍 하위세트들, 여섯 프라이머 쌍 하위세트들, 또는 그 이상의 프라이머 쌍 하위세트들을 포함할 것이다. 일부 실시 형태에서, 일 세트의 프라이머들이 NRAS, BRAF, 또는 NRAS 및 BRAF 둘 모두에서의 돌연변이를 검출하는 프라이머 쌍 서브세트들을 포함할 수 있다.

따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "일 프라이머 쌍 하위세트"는 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하는, 일 그룹의 적어도 2개의 프라이머들을 지칭하며, 이들 중 하나는 표적 핵산 서열의 제1 가닥에 어닐링되고, 이들 중 다른 하나는 제1 가닥의 보체에 어닐링된다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 쌍 하위세트의 제1 프라이머는 표적 핵산 서열의 제1 가닥에 어닐링될 수 있고, 일 프라이머 쌍 하위세트의 제2 프라이머(예를 들어, 역방향 프라이머)는 그 가닥의 보체에 어닐링될 수 있다. 표적 및/또는 그의 보체에 어닐링될 때 프라이머들의 배향은, 프라이머 쌍 하위세트의 하나의 프라이머의 프라이머 신장으로부터 진행되는 핵산 합성이 프라이머 쌍 하위세트의 제2 프라이머의 적어도 하나의 영역에 상보적인 핵산 서열을 생성하도록 하는 배향일 수 있다. 핵산 표적 및/또는 서열의 "제1 가닥"은 표적 뉴클레오티드 및/또는 표적 부위 좌위의 서열을 포함하는 이중가닥 핵산의 어느 한 가닥일 수 있지만, 일단 선택되면, 제2 가닥으로서 그의 보체를 규정한다. 따라서, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "순방향 프라이머"는 핵산 표적의 제1 가닥에 어닐링되는 프라이머이며, 한편 동일한 그 세트의 "역방향 프라이머"는 핵산 표적의 제1 가닥의 보체에 어닐링되는 프라이머이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 표적 핵산에 특이적인 프라이머와 관련하여 사용될 때 "특이적"은, 어닐링 온도가 존재하도록 하는, 프라이머와 표적 사이의 상보성의 수준을 지칭하는데, 이때 어닐링 온도에서는 프라이머가 표적 핵산에 어닐링되어 그의 증폭을 매개하게 될 것이고 샘플 내에 존재하는 비표적 서열에 어닐링되지 않거나 그의 증폭을 매개하지 않게 될 것이다. 서열 변이를 증폭시키는 프라이머 쌍 하위세트들과 관련하여, 하위세트의 프라이머들 중 적어도 하나는 서열 변이에 특이적이며, 예를 들어 이 프라이머 쌍 하위세트는 서열 변이를 포함하지 않는 야생형 서열을 증폭시키지 않을 것이다.

프라이머의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 다수의 상업적 공급원이 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따른 프라이머를 제공하기에 적합한 올리고뉴클레오티드 합성 서비스를 제공하는데, 예를 들어 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 Life Technologies사의 INVITROGEN™ Custom DNA Oligos 또는 미국 아이오와주 코랄빌 소재의 IDT사로부터의 Custom DNA Oligos가 있다.

일부 실시 형태에서, 하나 이상의 프라이머가 이중 도메인 프라이머일 수 있다. 이중 도메인 프라이머는 2013년 2월 22일에 출원되고 WO2013/126743호로 공개된 PCT/US13/27383호에 상세히 기재되어 있으며, 이 출원의 내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 이중 도메인 프라이머는, 예를 들어 다양한 소스로부터의 백그라운드를 감소시킴으로써 증가된 감도를 가능하게 할 수 있다.

프라이머의 예시적인 실시 형태가 본 명세서에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 하나 이상의 프라이머가 서열 번호 1-39로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 프라이머 쌍들의 하위세트들이 표 1 및 표 4에 묘사되어 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머들은 대략 실시예 1에 기재된 농도로 반응 혼합물(들) 내에 존재할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은

서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 및 서열 번호 17과 18로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 및 서열 번호 17과 18로 이루어진 군을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 및 서열 번호 17과 18로 이루어진다.

일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 및 서열 번호 31과 32로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 및 서열 번호 31과 32로 이루어진 군을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 프라이머 쌍들은 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 및 서열 번호 31과 32로 이루어진다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 계획을 수행하는 것과 관련되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "증폭 계획"은 관심 핵산 서열을 특이적으로 증폭시키는, 즉 그의 풍부도(abundance)를 증가시키는 과정을 지칭하며, 더 상세하게는, 이전 중합효소 신장의 산물들이 신장의 연속적 라운드를 위한 주형으로서의 역할을 할 때 일어나는 지수적 증폭을 지칭한다. 본 발명에 따른 PCR 증폭 계획은 적어도 2회, 그리고 바람직하게는 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35회 또는 그 이상의 반복 사이클을 포함하며, 여기서 각 사이클은 하기 단계를 포함한다: 1) 가닥 분리(예를 들어, 열 변성); 2) 주형 분자에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링; 및 3) 어닐링된 프라이머의 핵산 중합효소 신장. 이들 단계 각각에 대해 필요한 조건 및 시간은 당업자에 의해 안출될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에 따른 증폭 계획은 바람직하게는 열 사이클러에서 수행되며, 이들 중 다수는 구매가능하다.

일부 실시 형태에서, 핵산 샘플은, 예를 들어 mRNA에서의 변경이 본 명세서에 기재된 바와 같이 결정되어야 할 때, 본 명세서에 기재된 PCR 증폭 계획 전에 역전사를 거칠 수 있다. 역전사 프로토콜 및 시약은 당업계에 잘 알려져 있으며 구매가능하다. 역전사 계획의 예시적인 실시 형태는 다음과 같다: RNA 및 gDNA(예를 들어, 25 ng의 RNA 및 2.5 ng의 gDNA) 둘 모두를 포함하는 5 uL의 핵산 샘플을 RT 완충액, 0.5 mM dNTP, 5 nM RT 프라이머, 및 20개 단위의 SuperScript III™ 역전사효소(RNA-의존성 DNA 중합효소)를 포함하는 반응 혼합물에 첨가한다. 이어서, 반응물을 50℃에서 30분 동안, 90℃에서 5분 동안, 그리고 4℃에서 5분 동안 인큐베이팅한다.

PCR은 핵산 중합효소의 사용을 필요로 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "핵산 중합효소"는 뉴클레오시드 삼인산염의 주형-의존성 중합을 촉매하여 주형 핵산 서열에 상보적인 프라이머 신장 산물들을 형성하는 효소를 지칭한다. 핵산 중합효소의 효소는 어닐링된 프라이머의 3' 말단에서 합성을 개시하고 주형의 5' 말단을 향하는 방향으로 진행한다. 다수의 핵산 중합효소가 당업계에 알려져 있으며 구매가능하다. 일 그룹의 바람직한 핵산 중합효소들은 열안정성이며, 즉 이들은 상보적인 핵산의 어닐링된 가닥을 변성시키기에 충분한 온도에 노출된 후에 기능을 보유하는데, 이러한 온도는, 예를 들어 94℃, 또는 때때로 그 이상이다. 일부 실시 형태에서, 중합효소는 델타-엑소-Apta Taq 중합효소일 수 있다.

당업계에서 이해되는 바와 같이, PCR은 가닥 분리 단계를 포함하는 사이클을 필요로 하는데, 가닥 분리 단계는 일반적으로 반응 혼합물의 가열을 수반한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "가닥 분리" 또는 "가닥들을 분리하는"이란, 상보적인 이중가닥 분자들이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 대한 어닐링에 이용가능한 2개의 단일 가닥으로 분리되도록 핵산 샘플을 처리하는 것을 의미한다. 더 구체적으로는, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 가닥 분리는 핵산 샘플을 그의 T_m을 초과하여 가열함으로써 달성된다. 일반적으로, 핵산 중합효소에 적합한 완충액 중에 핵산 분자가 들어 있는 샘플의 경우, 94℃로의 가열이 가닥 분리를 달성하기에 충분하다. 예시적인 완충액은 50 mM KC1, 10 mM Tric-HCl(25℃에서 pH 8.8), 0.5 내지 3 mM MgCl₂, 및 0.1% BSA를 함유한다.

당업계에서 또한 이해되는 바와 같이, PCR은 프라이머를 주형 핵산에 어닐링하는 것을 필요로 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "어닐링"은 2개의 상보적인 또는 실질적으로 상보적인 핵산 가닥이 혼성화(hybridize)될 수 있게 하는 것을 지칭하며, 더 상세하게는, PCR과 관련하여 사용될 때, 주형-의존성 중합효소를 위한 프라이머 신장 기질이 형성되도록 혼성화하는 것을 지칭한다. 프라이머-표적 핵산 어닐링에 대한 조건은 프라이머의 길이 및 서열에 따라 변동하고, 프라이머에 대해 계산된 T_m에 기초한다. 일반적으로, 증폭 계획에서의 어닐링 단계는 가닥 분리 단계 후에 온도를, 그러한 어닐링을 가능하게 하기에 충분한 시간 동안 프라이머 서열에 대해 계산된 T_m에 기초한 온도까지 감소시키는 것을 수반한다.

T_m은 다수의 널리 입수가능한 알고리즘들(예를 들어, OLIGO™(미국 콜로라도주 소재의 Molecular Biology Insights Inc.사) 프라이머 설계 소프트웨어 및 VENTRO NTI™(미국 캘리포니아주 소재의 Invitrogen, Inc.사) 프라이머 설계 소프트웨어, 및 Primer3 및 Oligo Calculator를 포함한 인터넷 상에서 입수가능한 프로그램들) 중 임의의 것을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 예측될 수 있다. 예를 들어, T_m은 NetPrimer 소프트웨어(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재의 Premier Biosoft사; 및 월드 와이드 웹 상에서 http://www.premierbiosoft.com/netoprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.html에서 무료로 입수가능함)를 사용하여 계산될 수 있다. 프라이머의 T_m은 또한 다음 식을 사용하여 계산될 수 있는데, 이 식은 NetPrimer 소프트웨어에 의해 사용되고 문헌[Frieir et al. PNAS 1986 83:9373-9377]에 더 상세히 기재되어 있으며, 이 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

T_m　=　ΔH/(ΔS + R * ln(C/4)) + 16.6 log ([K⁺]/(1 + 0.7 [K⁺])) - 273.15

이 식에서, ΔH는 나선 형성을 위한 엔탈피이고; ΔS는 나선 형성을 위한 엔트로피이고; R은 몰 기체 상수(molar gas constant)(1.987 cal/℃ * mol)이고; C는 핵산 농도이고; [K⁺]는 염 농도이다. 대부분의 증폭 계획의 경우, 어닐링 온도는 예측된 T_m보다 약 5℃ 미만이도록 선택되지만, T_m에 더 가깝거나 그를 초과하는 온도(예를 들어, 예측된 T_m보다 1℃ 내지 5℃ 미만 또는 예측된 T_m보다 1℃ 내지 5℃ 초과)가 선택될 수 있으며, 이는, 예를 들어 예측된 T_m보다 5℃ 초과 미만인 온도(예를 들어, 6℃ 미만, 8℃ 미만, 10℃ 미만 또는 그보다 더 낮은 온도)일 수 있는 바와 같다. 일반적으로, 어닐링 온도가 T_m에 더 가까울수록, 어닐링은 더 특이적이다. PCR 증폭 계획 동안 프라이머 어닐링을 가능하게 하는 시간은 반응의 부피에 크게 좌우되어 더 큰 부피는 더 긴 시간을 필요로 하지만, 또한 프라이머 및 주형 농도에도 좌우되어 주형에 대한 프라이머의 더 높은 상대 농도는 더 낮은 상대 농도보다 더 적은 시간을 필요로 한다. 부피 및 상대 프라이머/주형 농도에 따라, 증폭 계획에서의 프라이머 어닐링 단계는 1초 내지 5분 정도일 수 있지만, 일반적으로는 10초 내지 2분이며, 바람직하게는 30초 내지 2분의 정도일 것이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 어닐링하다"는 특이적으로 증폭된 산물의 검출가능한 수준을 생성하기에 충분한 PCR 증폭 계획 동안의 어닐링의 정도를 지칭한다.

PCR은 또한 각 사이클에서 어닐링된 프라이머의 중합효소 신장에 의지한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "중합효소 신장"은 핵산 중합 효소에 의한 어닐링된 프라이머의 3' 말단 상에의 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오티드의 주형-의존성 혼입을 의미한다. 중합효소 신장은 바람직하게는 하나 초과의 뉴클레오티드, 바람직하게는 최대로 주형의 전체 길이에 상응하는 뉴클레오티드에 이르기까지 부가시킨다. 중합효소 신장에 대한 조건은 중합효소의 정체에 따라 변동한다. 중합효소 신장에 사용되는 온도는 일반적으로 그 효소의 알려진 활성 특성에 기초한다. 그렇기는 하지만, 어닐링 온도가, 예를 들어 효소에 대한 최적 온도보다 낮을 것을 필요로 하는 경우에, 더 낮은 신장 온도를 사용하는 것이 종종 허용될 것이다. 일반적으로, 효소는 그의 최적 신장 온도 미만에서 적어도 부분적인 활성을 보유하긴 하지만, 가장 일반적으로 사용되는 열안정성 중합효소(예를 들어, Taq 중합효소 및 그의 변이체)에 의한 중합효소 신장은 65℃ 내지 75℃, 바람직하게는 약 68 내지 72℃에서 수행된다.

프라이머 신장은 어닐링된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 신장을 가능하게 하는 조건 하에서 수행된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "신장 산물들이 생성되도록, 어닐링된 올리고뉴클레오티드의 신장을 가능하게 하는 조건"은, 예를 들어 온도, 염 및 보조인자 농도, pH, 및 핵산 중합효소가 프라이머 신장을 촉매하는 효소 농도를 포함하는 조건 세트를 지칭한다. 그러한 조건은 사용되는 핵산 중합효소의 정체에 따라 변동하겠지만, 다수의 유용한 중합효소에 대한 조건이 당업자에게 잘 알려져 있다. 일 예시적인 조건 세트는 50 mM KC1, 10 mM Tric-HCl(25℃에서 pH 8.8), 0.5 내지 3 mM MgCl₂, 200 uM 각 dNTP, 및 0.1% BSA가 72℃에 있는 것으로, 이 온도 하에서 Taq 중합효소가 프라이머 신장을 촉매한다.

일부 실시 형태에서, 열사이클링 조건은 실시예 1에 묘사된 프로토콜에 따를 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 검정에 사용하기 위한 완충액은 Tris 완충액, 트레할로스, 아세트산칼륨, 글리세롤, 베타인, 염화마그네슘, 염화칼륨, 황산암모늄, DMSO, DTT, BSA, dNTP, Tween-20 및 중합효소를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 검정에 사용하기 위한 완충액은 10 내지 400 mM Tris 완충액(pH 7.5 내지 9.5), 2 내지 20% 트레할로스, 10 내지 300 mM 아세트산칼륨, 1 내지 7.5% 글리세롤, 100 mM 내지 2M 베타인, 2.5 내지 12.5 mM 염화마그네슘, 1 내지 10 mM 염화칼륨, 1 내지 10 mM 황산암모늄, 0.1 내지 2% DMSO, 1 내지 10 mM DTT, 10 내지 1,000 ug/mL BSA, 50 내지 400 mM dNTP, 0 내지 1% Tween-20 및 1 내지 10개 효소 단위의 중합효소를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "증폭된 산물" 또는 "앰플리콘"은 특정 표적 핵산 서열 및/또는 그의 상보적인 서열 - 이는 뉴클레오티드 서열에서 주형 핵산 서열 및/또는 그의 상보적인 서열에 상응함 - 의 일부분의 카피인 PCR 반응으로부터 생성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 증폭된 산물은 일반적으로 이중가닥 DNA이겠지만, 그의 개별 가닥들을 언급할 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법은 유전자 돌연변이를 정량화하거나 평가하기 위해 PCR을 사용한다. 본 명세서에 기재된 방법들 중 임의의 것에 있어서, 복수의 사이클에서 PCR 반응으로부터 샘플을 인출하여, 인출된 샘플 내의 앰플리콘들의 양을 분리하고 검출함으로써 정량화가 달성될 수 있다. 이러한 방식으로 측정된 각 앰플리콘에 대한 증폭 프로파일은 초기 주형의 정량화를 가능하게 한다. 예를 들어 미국 특허 제8,321,140호 및 미국 특허 출원 공개 제2013/0053274호를 참조하며; 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 멀티플렉스 PCR과 관련되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "멀티플렉스 PCR"은 PCR의 변형을 지칭하는데, 여기서는 일 세트 내의 한 쌍 초과의 플라이머들(예를 들어, 적어도 하나 초과의 순방향 및/또는 하나 초과의 역방향 프라이머)을 사용함으로써, 하나의 반응 베셀 내에서의 하나 초과의 표적 핵산 서열의 동시 증폭 또는 다수의 산물들의 병행 검출이 달성될 수 있다. 멀티플렉스 증폭은 복수의 표적들의 존재를 검출하는 데 있어서 뿐만 아니라, 결실, 돌연변이, 및 다형성의 분석, 검출, 및/또는 유전자형 결정, 및/또는 발현 수준에 있어서도 유용하고/하거나 정량적인 검정에 있어서도 유용할 수 있다. 멀티플렉스는 단일 반응에서 2 내지 1,000개의 상이한 표적 서열들의 검출 및/또는 표적 핵산의 변경의 검출을 지칭할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 멀티플렉스는 단일 반응에서의 2 내지 1,000개, 예를 들어 5 내지 500개, 25 내지 1000개, 또는 10 내지 100개의 상이한 표적 서열들의 임의의 범위의 검출 등을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 기재된 방법의 일부로서의 멀티플렉스 PCR 반응은 단일 반응에서 적어도 2개의 상이한 대립유전자 표적 부위 좌위들에서의 적어도 2개의 SNP의 2개 이상의 가능한 대립유전자의 존재를 긍정적으로 검출할 수 있다. PCR에 적용될 때의 용어 "멀티플렉스"는 동일한 PCR 반응에서 적어도 2개의 상이한 표적 서열들에 특이적인 프라이머들이 존재함을 암시한다. 따라서, 2개의 상이한 표적 서열들에 특이적인 프라이머 세트들이 존재하는 반응이 멀티플렉스 증폭인 것으로 여겨지는데, 이는 실제로, 주어진 샘플에서 적어도 2개의 표적 서열들 중 단지 하나만이 검출된다 하더라도(또는 심지어는 어느 것도 검출되지 않는다 하더라도) 그러하다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 멀티플렉스 PCR은 또한 다수의 쌍들의 프라이머들을 포함하는 반응을 지칭할 수 있으며, 여기서 반응은 하나의 또는 다수의 표적들이 반응에 존재할 때 하나의 또는 다수의 특이적인 증폭된 산물들을 생성할 수 있다.

예를 들어 증폭 반응 동안에 또는 그 후에 임의의 시간에서의 반복된 샘플링에 이어 증폭 산물들의 분리 및 검출을 행함으로써, 정량적 측면이 실시될 수 있다. 샘플링은, 예를 들어 반응의 분취물(aliquot)을 회수하는 것을 포함할 수 있다. 샘플링은, 예를 들어 매 사이클마다 종료 시에, 또는 수 회 사이클마다, 예를 들어 2회 사이클마다, 3회 사이클마다, 4회 사이클마다 등의 종료 시에 일어날 수 있다. 균일한 샘플링 간격이 대부부의 경우에 요구되겠지만, 샘플링이 균일한 간격으로 수행되는 것이 필요조건은 아니다. 단지 한 예로서, 샘플링 루틴은 최초의 5회 사이클에 대해서는 매 사이클 후마다 샘플링하고, 이어서 다른 사이클 후마다 샘플링하거나 또는 그 반대로 하는 것을 수반할 수 있다.

증폭 반응으로부터의 분취물의 샘플링 또는 분배는 몇몇 상이한 일반적 포맷들 중 임의의 것으로 수행될 수 있다. 샘플링 또는 회수 방법은 이용가능한 장비, 분석하고자 하는 샘플들의 수, 및 샘플 수집(예를 들어, 병행적 대 순차적)에 따른 검출 시기를 포함하지만 이로 한정되지 않는 다수의 인자들 중 임의의 것에 좌우될 수 있다. 샘플의 회수 또는 추출의 정확한 방법은 반드시 본 명세서에 기재된 방법의 제한은 아니다. 샘플링은 바람직하게는, 특히 고처리량 응용의 경우, 자동화 장치를 사용하여 수행된다. 샘플링은 또한 PCR 반응으로부터 모세관 전기영동 장치 내로의 직접적인 동전학적 또는 수력학적 주입(direct electrokinetic or hydrodynamic injection)을 사용하여 수행될 수 있다. 본 방법에서 사용되는 샘플링 방법은 바람직하게는, 예를 들어 단회 분취물이 인출된 후에 처분되는 피펫팅 팁 또는 니들을 사용함으로써, 또는 동일한 PCR 반응 베셀로부터 샘플을 분배하기 위하여 동일한 팁 또는 니들을 사용함으로써 사이클링 반응(들)의 오염을 최소화하도록 되어 있다. 샘플링과 검출의 동시 수행을 위한 방법은 당업자에게 알려져 있다(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2004/0166513호를 참조하며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다).

샘플링 단계에서 분배되는 분취물의 부피 및/또는 핵산의 양은, 예를 들어 증폭 반응의 총 부피, 산물 검출의 감도, 및 사용되는 샘플링 및/또는 분리의 유형에 따라 변동할 수 있다. 증폭 부피는 수 마이크로리터로부터 수백 마이크로리터까지(예를 들어, 5 ㎕, 10 ㎕, 20 ㎕, 40 ㎕, 60 ㎕, 80 ㎕, 100 ㎕, 120 ㎕, 150 ㎕, 또는 200 ㎕ 또는 그 이상), 바람직하게는 10 내지 150 ㎕의 범위, 더 바람직하게는 10 내지 100 ㎕의 범위로 변동할 수 있다. 증폭 반응의 정확한 부피는 본 발명의 제한이 아니다. 분취물 부피는 반응 혼합물의 0.01% 내지 30%로 변동할 수 있다. 모세관 전기영동 장치 내로의 동전학적 주입은 일반적으로 핵산을 로딩하지만 샘플링된 반응의 부피를 상당히 감소시키지는 않을 것이다. 증폭 계획은, 선택적으로 멀티웰 용기 내에서, 복수의 독립적인 핵산 증폭 혼합물들에 대해 수행될 수 있다. 증폭 반응(들)이 수행되는 용기(들)는 반드시 본 명세서에 기재된 방법의 제한은 아니다.

다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 각 표적 핵산 서열에 대해, 예를 들어 각 표적 변경에 대해 증폭된 산물들(예를 들어, 앰플리콘들)을 검출하는 것과 관련되어 있다. 일부 실시 형태에서, 각 표적 핵산 서열에 대해 증폭된 산물의 검출은 샘플 내의 표적 핵산 서열의 존재를 긍정적으로 지시한다. 일부 실시 형태에서, 각 표적 핵산 서열에 대해 증폭된 산물의 정량적인 검출은 샘플 내의 그러한 표적 핵산 서열의 수준을 긍정적으로 지시한다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 서로 구별가능해야 하는 둘 이상의 프라이머 쌍 하위세트들의 증폭된 산물들과 관련되어 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 둘 이상의 프라이머 쌍 하위세트들의 증폭된 산물들이 뚜렷이 다른 크기들을 가짐으로써 구별될 수 있는 PCR 증폭 계획과 관련되어 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 핵산은 그것이 상이한 크기의 핵산들로부터 분해가능하다면(resolvable) "뚜렷이 다른 크기"를 갖는다. "상이한 크기들"은 적어도 1개의 뉴클레오티드 길이에 의해 상이한 핵산 분자들을 지칭한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 유용한 뚜렷이 다른 크기의 증폭 산물들은 주어진 분리 또는 검출 방법에 사용되는 분리 과정을 위한 분해 한계(limit of resolution) 이상의 뉴클레오티드들의 수에 의해 상이하다. 예를 들어, 분리의 분해 한계가 1개의 염기인 경우, 뚜렷이 다른 크기의 증폭 산물들은 적어도 1개의 염기 길이에 의해 상이하지만, 2개의 염기, 5개의 염기, 10개의 염기, 20개의 염기, 50개의 염기, 100개의 염기 또는 그 이상에 의해 상이할 수 있다. 분해 한계가, 예를 들어 10개의 염기인 경우, 뚜렷이 다른 크기의 증폭 산물들은 적어도 10개의 염기에 의해 상이하겠지만, 11개의 염기, 15개의 염기, 20개의 염기, 30개의 염기, 50개의 염기, 100개의 염기 또는 그 이상에 의해 상이할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 프라이머들 또는 이들의 임의의 부분의 길이 및 이들이 어닐링되는 표적 핵산 서열의 세그먼트의 길이 둘 모두는 변동할 수 있다. 증폭된 표적 서열의 길이에 있어서, 예를 들어 더 멀거나 더 가깝게 떨어진 순방향 및 역방향 프라이머의 선택된 배치에 의한 변동은 상이한 표적들로부터의 산물들 사이의 용이한 구별을 보장하기 위한 간단한 접근법이다. 프라이머의 길이의 변동, 특히 이중 도메인 프라이머들의 5' 꼬리 영역들의 길이의 변동이 특히 효과적인데, 예를 들어 검정에서 주어진 표적 좌위의 특이적 대립유전자들의 산물들을 구별하는 것이다.

일부 실시 형태에서, 증폭된 산물들은 상이한 검출가능한 표지들로 표지됨으로써 구별된다. 일부 실시 형태에서, 표지는 프라이머 내로 혼입된다. 일부 실시 형태에서, 표지는 프라이머에 접합된다.

일부 실시 형태에서, 표지는 PCR 증폭 계획이 완료된 후에 프라이머에 결합된다. 일부 실시 형태에서, 표지는 프라이머에, 또는 그에 부착된 모이어티(moiety)에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 항체 또는 그의 일부분에 접합된다.

2개의 검출가능한 표지는 하나의 표지로부터의 신호가 다른 하나로부터의 신호와 구별될 수 있다면 상이한 것으로 여겨진다. 검출가능한 표지들은, 예를 들어 광-흡수 염료, 형광 염료, 또는 방사성 표지를 포함할 수 있다. 형광 염료가 바람직하다. 일반적으로, 형광 신호는 피크 방출 파장들이 적어도 20 nm만큼 분리되어 있다면 다른 형광 신호와 구별가능하다. 더 큰 피크 분리가 바람직하며, 좁거나 더 갑작스러운 피크들이 아니라, 주어진 반응에서의 형광단들의 방출 피크들이 넓은 경우에 특히 바람직하다.

검출가능한 표지, 그의 검출 방법, 및 그를 증폭된 산물 내로 혼입하거나 그를 증폭된 산물에 커플링 및/또는 결합하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있다. 다음은 비제한적인 예로 제공된다.

일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전자기적, 방사화학적, 또는 화학적 수단, 예컨대 형광, 화학형광, 또는 화학발광, 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 검출가능한 표지는 1차 표지(표지가 직접 검출가능한 모이어티 또는 직접 검출가능한 모이어티를 생성하는 모이어티를 포함하는 경우) 또는 2차 표지(검출가능한 표지가 다른 모이어티에 결합하여 검출가능한 신호를 생성하는 경우로서, 예를 들어 2차 및 3차 항체를 사용하는 면역학적 표지화에서 일반적인 바와 같음)일 수 있다.

검출가능한 표지는 공유 또는 비공유 수단에 의해 핵산에 연결될 수 있다. 대안적으로, 검출가능한 표지는, 예를 들어 리간드-수용체 결합 쌍 배열을 통해 다른 핵산에 대한 결합을 달성하는 분자 또는 다른 그러한 특이적 인식 분자들를 직접 표지화함으로써 연결될 수 있다. 검출가능한 표지는 방사성 동위원소, 생물발광 화합물, 발색단, 항체, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 금속 킬레이트, 및 효소를 포함할 수 있지만 이로 한정되지 않는다.

일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지는 형광 염료 분자 또는 형광단일 수 있으며, 이에는 하기가 포함되지만 이로 한정되지 않는다: 플루오레세인, 피코에리트린, Cy3™, Cy5™, 알로피코시아닌, 텍사스 레드(Texas Red), 페리디닌 클로로필, 시아닌, 탠덤 접합체(tandem conjugate), 예컨대 피코에리트린-Cy5™, 녹색 형광 단백질, 로다민, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 및 오레곤 그린(Oregon Green)™, 로다민 및 유도체(예를 들어, 텍사스 레드 및 테트라로다민 이소티오시아네이트(TRITC)), 비오틴, 피코에리트린, AMCA, CyDyes™, 6-카르복시플루오레세인(약어 FAM 및 F로 일반적으로 알려짐), 6-카르복시-2',4',7',4,7-헥사클로로플루오레세인(HEX), 6-카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인(JOE 또는 J), N,N,N',N'-테트라메틸-6카르복시로다민(TAMRA 또는 T), 6-카르복시-X-로다민(ROX 또는 R), 5-카르복시로다민-6G(R6G5 또는 G5), 6-카르복시로다민-6G(R6G6 또는 G6), 및 로다민 110; 시아닌 염료, 예를 들어 Cy3, Cy5 및 Cy7 염료; 쿠마린, 예를 들어 움벨리페론; 벤즈이미드 염료, 예를 들어 Hoechst 33258; 페난트리딘 염료, 예를 들어 텍사스 레드; 에티듐 염료; 아크리딘 염료; 카르바졸 염료; 페녹사진 염료; 포르피린 염료; 폴리메틴 염료, 예를 들어 시아닌 염료, 예컨대 Cy3, Cy5 등; BODIPY 염료 및 퀴놀린 염료.

일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지는³H,　¹²⁵I,　³⁵S,　¹⁴C,　³²P, 및　³³P를 포함하지만 이로 한정되지 않는 방사성 표지(radiolabel)일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지는 고추냉이 퍼옥시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함하지만 이로 한정되지 않는 효소일 수 있다. 효소적 표지(enzymatic label)는, 예를 들어 화학발광 신호, 색 신호, 또는 형광 신호를 생성할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지는 루미놀, 루시페린 또는 루시게닌을 포함하지만 이로 한정되지 않는 화학발광 표지이다.

일부 실시 형태에서, 검출가능한 표지는 콜로이드성 금 또는 착색 유리 또는 플라스틱(예를 들어, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 및 라텍스) 비드를 포함하지만 이로 한정되지 않는 스펙트럼 비색 표지(spectral colorimetric label)일 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 둘 이상의 프라이머 쌍 하위세트들의 증폭된 산물들이 서열화됨으로써 구별될 수 있는 PCR 증폭 계획과 관련되어 있다. 핵산의 서열화 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 시판되는 서열화 서비스가 널리 입수가능하다(예를 들어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 Genscript사).

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 둘 이상의 프라이머 쌍 하위세트들의 증폭된 산물들이 융해-곡선 분석에 의해 구별될 수 있는 PCR 증폭 계획과 관련되어 있다. 융해-곡선 분석의 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Ririe et al. Analytical Biochemistry 1997 245:154-160]; 문헌[Wittwer et al. Clinical Chemistry 2003 49:853-860]; 및 문헌[Liew et al. Clinical Chemistry 2007 50:1156-1164]; 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함됨).

크기-분리된 증폭 산물들의 직접 검출이 바람직하다. 그러나, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 둘 이상의 프라이머 쌍 하위세트들의 증폭된 산물들이 올리고뉴클레오티드 혼성화에 의해 구별될 수 있는 PCR 증폭 계획과 관련되어 있다. 당업자는, 표적 핵산 서열들의 서열 정보를 사용하여, 단일 표적에는 완전히 상보적이고 다른 표적 핵산 서열들에는 그렇지 않은 프로브(probe)를 설계할 수 있다. 혼성화 조건은 완전히 상보적이지 않은 혼성화에 의한 백그라운드 신호를 최소화하도록 일상적으로 최적화될 수 있다. 혼성화 프로브는 프라이머 서열, 또는 프라이머에 의해 포함되지 않은 증폭된 산물의 일부에 대해 혼성화하도록 설계될 수 있는데, 단 프로브가 혼성화할 서열은 반응에 존재하는 적어도 하나의 다른 증폭된 산물과 그것을 구별가능하다.

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 PCR 증폭 계획은 멀티플렉스 계획이다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 쌍 하위세트의 증폭 산물은 적어도 2가지 접근법에 의해 다른 프라이머 쌍 서브세트들의 증폭 산물들과 구별될 수 있으며, 예를 들어 각 프라이머 하위세트는 고유의 검출가능한 형광 표지 및 검출가능한 크기 차이를 갖는 앰플리콘들을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 쌍 하위세트의 증폭 산물은 적어도 2가지 접근법에 의해 다른 프라이머 쌍 서브세트들의 증폭 산물들과 구별될 수 있으며, 예를 들어 1) NRAS 돌연변이에 특이적인 각 프라이머 하위세트는 제1 검출가능한 형광 표지를 갖는 앰플리콘들을 생성할 수 있으며, 한편 BRAF 돌연변이에 특이적인 각 프라이머 하위세트는 제2 검출가능한 형광 표지를 갖는 앰플리콘들을 생성할 수 있고, 2) 각 프라이머 하위세트는 검출가능한 크기 차이를 갖는 앰플리콘을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 일 프라이머 쌍 하위세트의 증폭 산물은 적어도 2가지 접근법에 의해 다른 프라이머 쌍 서브세트들의 증폭 산물들과 구별될 수 있으며, 예를 들어 1) NRAS 돌연변이에 특이적인 각 프라이머 하위세트는 제1 검출가능한 형광 표지를 갖는 앰플리콘들을 생성할 수 있으며, 한편 BRAF 돌연변이에 특이적인 각 프라이머 하위세트는 제2 검출가능한 형광 표지를 갖는 앰플리콘들을 생성할 수 있고, 2) 동일한 검출가능한 형광 표지를 갖는 각 프라이머 하위세트는 검출가능한 크기 차이를 갖는 앰플리콘을 생성할 수 있다(예를 들어, BRAF 표적 서열로부터 생성된 모든 앰플리콘들은 동일한 형광 표지를 갖고 크기에 의해 서로 구별될 수 있으며, 한편 이들은 상이한 형광 표지를 가짐으로써 NRAS 표적 서열에 의해 생성된 앰플리콘들과 구별된다).

일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 프라이머 세트들은, 예를 들어 PCR 증폭 조건 하에서 약 30% 미만의 교차-혼성화율을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 프라이머 세트들은, 예를 들어 PCR 증폭 조건 하에서 약 20% 미만의 교차-혼성화율을 가질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 프라이머 세트들은, 예를 들어 PCR 증폭 조건 하에서 약 10% 미만의 교차-혼성화율을 가질 수 있다.

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 표적 핵산 서열의 존재 및/또는 수준, 예를 들어 샘플 내의 유전자 변경의 존재 및/또는 수준의 검출과 관련되어 있다. 표적 핵산은 RNA 또는 DNA일 수 있다. 표적 핵산은 이중가닥(ds) 핵산 또는 단일가닥(ss) 핵산, 예를 들어 dsRNA, ssRNA, dsDNA, 또는 ssDNA일 수 있다. 표적 핵산의 비제한적인 예에는 핵산 서열, 돌연변이를 포함하는 핵산 서열, 결실을 포함하는 핵산 서열, 삽입을 포함하는 핵산 서열, 서열 변이체, 대립유전자, 다형성, 점 돌연변이, SNP, microRNA, 단백질 코딩 RNA, 비-단백질 코딩 RNA, mRNA, 병원체(예를 들어, 세균, 바이러스, 또는 기생충)로부터의 핵산, 질병과 관련되거나 또는 질병을 갖게 되거나 발생시킬 가능성(likelihood)과 관련된 핵산(예를 들어, 마커 유전자, 질병과 관련되거나 또는 질병을 갖게 되거나 발생시킬 가능성과 관련된 다형성, 또는 발현이 질병과 관련되거나 또는 질병을 갖게 되거나 발생시킬 가능성과 관련된 RNA)이 포함된다.

본 발명에 유용한 샘플은 핵산을 포함할 것이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 단백질, 세포, 유체, 생물학적 유체, 보존제, 및/또는 다른 물질들을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 대상체로부터 얻어질 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 대상체로부터 얻어진 진단용 샘플일 수 있다. 제한적인 예로서, 샘플은 볼 면봉채취물(cheek swab), 혈액, 혈청, 혈장, 가래, 뇌척수액, 소변, 눈물, 치조 단리물, 흉막액, 심막액, 낭액(cyst fluid), 종양 조직, 조직, 생검물, 타액, 흡인물, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 절제(resection) 또는 생검으로부터 얻어질 수 있다.

일부 실시 형태에서, 샘플은, 예를 들어 원심분리에 의한, 청징화된 유체 샘플이다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 저속 원심분리(예를 들어, 3,000 x g 이하) 및 상청액의 수집에 의해 청징화되는데, 이때 상청액은 청징화된 유체 샘플을 포함한다.

일부 실시 형태에서, 샘플은 새로 수집될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용되기 전에 보관될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 처리되지 않은 샘플이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "처리되지 않은 샘플"은 용액 중의 희석 및/또는 현탁을 제외하고는 사전에 어떠한 샘플 전처리도 갖지 않은 생물학적 샘플을 지칭한다.

일부 실시 형태에서, 샘플은 대상체로부터 얻어지고 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 이용되기 전에 보존되거나 가공될 수 있다. 제한적인 예로서, 샘플은 파라핀 왁스 중에 포매되거나, 냉장되거나, 또는 냉동될 수 있다. 냉동된 샘플은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 따라 핵산의 존재를 결정하기 전에 해동될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 가공되거나 처리된 샘플일 수 있다. 샘플을 처리 또는 가공하기 위한 예시적인 방법은 원심분리, 여과, 초음파 처리, 균질화, 가열, 냉동 및 해동, 보존제(예를 들어, 항응혈제 또는 뉴클레아제 억제제)와의 접촉 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 화학적 및/또는 생물학적 시약으로 처리될 수 있다. 화학적 및/또는 생물학적 시약은 가공 및/또는 보관 동안 샘플 또는 샘플에 의해 포함된 핵산의 안정성을 보호 및/또는 유지하기 위해 사용될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 화학적 및/또는 생물학적 시약은 샘플의 다른 성분들로부터 핵산을 방출하기 위해 사용될 수 있다. 제한적인 예로서, 혈액 샘플은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 이용되기 전에 항응혈제로 처리될 수 있다. 숙련된 기술자는 핵산 분석을 위하여 샘플을 가공, 보존, 또는 처리하기 위한 방법 및 공정을 잘 알고 있다.

일부 실시 형태에서, 핵산 샘플은 FFPE 종양 샘플로부터 준비될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 샘플은 위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및/또는 갑상선암을 갖거나 이를 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sattler et al. Ther Adv Med Oncol 2011 3:171-184]을 참조하며; 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. "익스팬더(expander)" 폴리뉴클레오티드가, 예를 들어 FFPE 샘플에 의한 성능을 개선하기 위하여 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 혼입 및/또는 첨가될 수 있다. 익스팬더 폴리뉴클레오티드 및 그의 사용 방법은 국제 특허 공개 WO 2013/010074호에 기재되어 있다.

일부 실시 형태에서, 샘플 내에 존재하는 핵산은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 이용되기 전에 단리되거나, 부화(enrich)되거나, 또는 정제된다. 샘플로부터 핵산을 단리, 부화, 또는 정제하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 제한적인 예로서, 다양한 샘플 유형들로부터 게놈 DNA를 단리하기 위한 키트는 구매가능하다(예를 들어, 카탈로그 번호 51104, 51304, 56504, 및 56404; 미국 매릴랜드주 저먼타운 소재의 Qiagen사).

용어 "대상체" 및 "개체"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 샘플이 얻어지는 유기체를 지칭한다. 대상체는 유기체 내의 또는 그러한 유기체를 구성하거나 그 안에 함유되어 있는 하나 이상의 세포 내의 핵산의 존재를 결정하도록 요구되는 임의의 유기체일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "대상체"는 유기체, 예를 들어 세균, 기생충, 식물, 또는 동물을 의미할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 대상체는 인간 또는 동물일 수 있다. 통상, 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥용 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰로거스 원숭이, 거미 원숭이, 및 마카크, 예를 들어 벵골 원숭이를 포함한다. 설치류는, 예를 들어 마우스, 래트, 우드척(woodchuck), 페럿, 래빗 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥용 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양잇과 종, 예를 들어 집고양이, 갯과 종, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예를 들어 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 개체 또는 대상체는 전술된 것의 임의의 하위세트, 예를 들어 상기 전부를 포함한다.

편의상, 본 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구범위에 사용되는 일부 용어 및 어구의 의미가 이하에 제공된다. 달리 기재되거나 문맥으로부터 암시되지 않는 한, 하기의 용어 및 어구는 이하에 제공된 의미를 포함한다. 이들 정의는 특정 실시 형태를 설명하는 데 도움이 되기 위하여 제공되고, 청구된 본 발명을 제한하고자 하지 않는데, 그 이유는 본 발명의 범주는 단지 청구범위에 의해서만 제한되기 때문이다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당업계에서의 용어의 용법과 본 명세서에 제공된 그의 정의 사이에 명백한 불일치가 있다면, 본 명세서에 제공된 정의가 우선할 것이다.

편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서, 본 발명에서 사용되는 소정의 용어를 여기에 모아둔다.

용어 "감소시키다", "감소된", "감소", 또는 "억제하다"는 모두 통계학적으로 유의한 양에 의한 감소를 의미하기 위하여 본 명세서에 사용된다. 일부 실시 형태에서, "감소시키다", "감소" 또는 "저하시키다" 또는 "억제하다"는 전형적으로 기준 수준(예를 들어, 주어진 처리의 부재)과 대비하여 적어도 10%만큼의 감소를 의미하며, 예를 들어 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 이상만큼의 감소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "감소" 또는 "억제"는 기준 수준과 대비하여 완전한 억제 또는 감소를 포함하지 않는다. "완전한 억제"는 기준 수준과 대비하여 100% 억제이다. 감소는 바람직하게는 주어진 장애를 갖지 않는 개체에 대해 정상의 범위 내에 있는 것으로 허용되는 수준으로 내려간 것일 수 있다.

용어 "증가된", "증가시키다", "향상시키다", 또는 "활성화하다"는 모두 통계학적으로 유의한 양에 의한 증가를 의미하기 위하여 본 명세서에 사용된다. 일부 실시 형태에서, 용어 "증가된", "증가시키다", "향상시키다", 또는 "활성화하다"는 기준 수준과 대비하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어 기준 수준과 대비하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 또는 최대 100%에 이르기까지의 증가 또는 10 내지 100%의 임의의 증가, 또는 기준 수준과 대비하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배의 증가, 또는 2배 내지 10배 또는 그 이상의 임의의 증가를 의미할 수 있다. 마커 또는 증상과 관련하여, "증가"는 그러한 수준의 통계학적으로 유의한 증가이다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "변경된"은, 예를 들어 기준과 대비하여 수준 또는 수(예를 들어, 유전자 발현 수준 또는 유전자 카피수)의 통계학적으로 유의한 변화 또는 기준(예를 들어, 야생형 및/또는 공통 서열)과 대비하여 서열의 변화, 예를 들어 핵산 서열의 적어도 단일 뉴클레오티드 변화를 지칭할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "정규화하다"는 제1 값이 제2 값에 상대적으로 표현되도록 제1 값을 제2 값으로 나누는 과정, 예를 들어 y의 수준에 대해 x의 수준을 얻는 과정을 지칭한다. x는 전형적으로 측정되는 것, 예를 들어 NRAS 및/또는 BRAF의 카피수 또는 발현 수준이며, 한편 y는 기준, 예를 들어 기준 유전자의 카피수 또는 발현 수준이다. 정규화는, 다수의 샘플들 및/또는 반응들에서 측정된 수준들이, 예를 들어 샘플들 내에 존재하는 핵산의 수준을 제어할 뿐만 아니라 반응들 사이의 효율을 상이하게 함으로써, 비교될 수 있게 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "부분"은 전체의 일부분 또는 일부, 예를 들어 전체 분자의 일부분 또는 일부를 지칭한다. 특정 분자는 다수의 부분들, 예를 들어 2개의 부분, 3개의 부분, 4개의 부분, 5개의 부분, 또는 그 이상의 부분을 가질 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단리된" 또는 "부분적으로 정제된"은, 핵산의 경우에, 핵산의 천연 공급원에서 발견되는 바와 같이 핵산과 함께 존재하고/하거나 세포에 의해 발현될 때 핵산과 함께 존재하게 될 적어도 하나의 다른 성분(예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드)으로부터 분리된 핵산을 지칭한다. 화학적으로 합성된 핵산 또는 시험관내(in vitro) 전사/번역을 사용하여 합성된 것은 "단리된" 것으로 여겨진다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열"은 리보핵산, 데옥시리보핵산 또는 그의 유사체의 단위들을 혼입시킨 중합체 분자를 지칭한다. 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 단일가닥 핵산은 변성된 이중가닥 DNA의 한 가닥일 수 있다. 대안적으로, 이는 임의의 이중가닥 DNA로부터 유래되지 않은 단일가닥 핵산일 수 있다. 일 태양에서, 주형 핵산은 DNA이다. 다른 태양에서, 주형은 RNA이다. 적합한 핵산 분자는 DNA를 포함하며, 이에는 게놈 DNA 및 cDNA가 포함된다. 다른 적합한 핵산 분자는 RNA를 포함하며, 이에는 mRNA, rRNA 및 tRNA가 포함된다. 핵산 분자는 게놈 DNA에서와 같이 천연 발생일 수 있거나, 또는 이는 합성일 수 있으며, 즉 인간 활동에 기초하여 제조될 수 있거나, 또는 이들 둘의 조합일 수 있다. 핵산 분자는 또한, 소정의 개질, 예컨대 2'-데옥시, 2'-데옥시-2'-플루오로, 2'-O-메틸, 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP), 2'-O-디메틸아미노에틸(2'-O-DMAOE), 2'-O-디메틸아미노프로필(2'-O-DMAP), 2'-O-디메틸아미노에틸옥시에틸(2'-O-DMAEOE), 또는 2'-O--N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA), 콜레스테롤 부가, 및 미국 특허 출원 공개 제20070213292호에 기재된 바와 같은 포스포로티오에이트 골격; 및 미국 특허 제6,268,490호에 기재된 바와 같은, 메틸렌 단위와, 2'-산소 원자와 4'-탄소 원자 사이에서 연결된 소정의 리보뉴클레오시드를 가질 수 있으며, 여기서 특허 및 특허 출원 둘 모두는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동가능하게 연결될 때 시험관내 또는 생체내(in vivo)에서 RNA로 전사되는 (DNA인) 핵산 서열을 의미한다. 유전자는 코딩 영역에 선행하는 조절 영역 및 코딩 영역에 후행하는 조절 영역, 예를 들어 5' 비번역(5'UTR) 또는 "리더(leader)" 서열 및 3' UTR 또는 "테일러(trailer)" 서열뿐만 아니라 개별 코딩 세그먼트(엑손)들 사이의 개재 서열(인트론)도 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "상보적"은 2개의 주어진 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리뉴클레오티드 서열들이 서로 어닐링될 때, DNA에서 A는 T와 쌍을 이루고 G는 C와 쌍을 이루고, RNA에서 G는 C와 쌍을 이루고 A는 U와 쌍을 이루도록 하는, 뉴클레오티드 염기 G, A, T, C 및 U 이들 사이의 수소-결합 염기 쌍 형성 선호도의 계층구조(hierarchy)를 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "실질적으로 상보적인"은 제2 뉴클레오티드 서열과 프라이머의 전체 길이에 대하여 적어도 90%의 상보성을 갖는, 예를 들어 90% 상보적인, 95% 상보적인, 98% 상보적인, 99% 상보적인, 또는 100% 상보적인 프라이머를 지칭한다.

용어 "통계학적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계학적 유의성을 지칭하며, 일반적으로 2 표준 편차(2SD) 또는 더 큰 차이를 의미한다.

작동 실시예에서 이외에, 또는 달리 지시된 경우 이외에, 본 명세서에 사용되는 반응 조건 또는 성분의 양으로 표현되는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "약"은 백분율과 관련하여 사용될 때 ±1%를 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 조성물, 방법, 및 그 방법 또는 조성물에 본질적인 이들의 각각의 구성요소(들)와 관련하여 사용되면서도 여전히, 본질적이지든 그렇지 않든 지정되지 않은 요소들의 포함에 대해 개방되어 있다.

용어 "이루어진"은 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물, 방법 및 이들의 각각의 구성요소들을 지칭하며, 이들은 그 실시 형태의 그러한 설명에서 언급되지 않은 어떠한 요소도 배제한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "본질적으로 이루어진"은 주어진 실시 형태에 필요한 요소들을 지칭한다. 이 용어는 그러한 실시 형태의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 요소들의 존재를 허용한다.

단수형 용어("a", "an", 및 "the")는 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 그 문맥이 달리 명백히 나타내지 않는 한 "및"을 포함하고자 한다. 본 명세서에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기재되어 있다. 약어 "예를 들어(e.g.)"는 라틴어(exempli gratia)에서 유래되며, 비제한적인 예를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 약어 "예를 들어"는 용어 "예컨대"와 동의어이다.

세포 생물학 및 분자 생물학에서 공통된 용어들의 정의는 문헌["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 문헌[Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10:　0763766321)]; 및 문헌[Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 찾을 수 있다.

달리 기재되지 않는 한, 본 발명은, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001)]; 문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995)]; 또는 문헌[Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987)]에 기재된 바와 같이 표준 절차를 사용하여 수행하였으며; 이들은 모두 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

다른 용어들은 본 발명의 다양한 태양들의 설명에서 본 명세서에 정의되어 있다.

본 출원 전체에 걸쳐 인용된 서적 참고문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원, 및 공계류 중인 특허 출원을 포함한 모든 특허 및 다른 간행물은, 예를 들어 본 명세서에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 간행물들에 기재된 방법론을 설명 및 개시하려는 목적을 위하여 명시적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 전에 오로지 그들의 개시를 위해서만 제공된다. 이에 관하여 어떤 것도, 본 발명자들이 종래 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시보다 선행하지 않음을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이들 문헌의 내용에 관한 표현 및 날짜에 관한 모든 진술은 본 출원인들이 이용가능한 정보에 기초하며, 이들 문헌의 내용 또는 날짜의 정확함에 대해 어떠한 것도 인정하는 것으로 여겨지지 않는다.

본 발명의 실시 형태들에 대한 설명은 본 발명을 망라하거나 개시된 정확한 형태로 본 발명을 제한하고자 하지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시 형태 및 그를 위한 실시예가 예시적인 목적으로 본 명세서에 기재되어 있지만, 관련 기술분야의 숙련자들이 인식하는 바와 같이, 다양한 등가의 변형이 본 발명의 범주 내에서 가능하다. 예를 들어, 방법 단계들 또는 기능들이 주어진 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 실시 형태들이 상이한 순서로 기능들을 수행할 수 있거나, 또는 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 본 발명의 교시 내용은 적절한 경우에 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시 형태들을 조합하여 추가의 실시 형태들을 제공할 수 있다. 본 발명의 태양들은, 필요하다면, 상기 참고문헌들 및 출원의 조성물, 기능 및 개념을 사용하여 본 발명의 또 다른 추가의 실시 형태들을 제공하기 위하여 변형될 수 있다. 상세한 설명에 비추어, 이들 및 다른 변화가 본 발명에 대해 이루어질 수 있다. 모든 그러한 변형은 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것이고자 한다.

전술된 실시 형태들 중 임의의 것의 구체적인 요소들은 조합되거나 다른 실시 형태들 내의 요소들 대신 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 소정의 실시 형태들과 관련된 이점이 이들 실시 형태와 관련하여 기재되어 있지만, 다른 실시 형태들이 또한 그러한 이점을 나타낼 수 있으며, 본 발명의 범주 내에 속하기 위하여 모든 실시 형태들이 반드시 그러한 이점을 나타낼 필요는 없다.

본 명세서에 기재된 기술은 하기의 실시예에 의해 추가로 예시되는데, 이러한 실시예는 어떤 식으로든 추가의 제한인 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 명세서에 기재된 기술의 일부 실시 형태가 번호를 매긴 하기 단락들 중 어느 하나에 따라 정의될 수 있다:

1. NRAS 및/또는 BRAF의 돌연변이를 검출하기 위한 검정으로서,

핵산 샘플의 일부분을 일 세트의 프라이머들과 접촉시키는 단계로서,

일 세트의 프라이머들은 프라이머 쌍들의 하위세트들을 포함하며, 여기서 각 프라이머 쌍은 서열 변이를 포함하는 NRAS 또는 BRAF 서열을 증폭시키는 것인 단계;

샘플의 일부분 및 일 세트 이상의 프라이머들을 포함하는 반응 혼합물에 대하여 가닥 분리, 프라이머 어닐링, 및 프라이머 신장의 사이클을 포함하는 PCR 증폭 계획을 수행하는 단계;

각 프라이머 쌍에 대하여 앰플리콘의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서,

앰플리콘의 존재는 그 프라이머 쌍이 특이적인 서열 변이의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하며,

프라이머들 중 하나 이상은 서열 번호 1-39로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정.

2. 프라이머 쌍들은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단락 1의 검정.

3. 하나 이상의 서열 변이가 점 돌연변이인, 단락 1 또는 단락 2의 검정.

4. NRAS 점 돌연변이는 G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단락 1 내지 단락 3 중 어느 하나의 단락의 검정.

5. BRAF 점 돌연변이는 V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 단락 1 내지 단락 4 중 어느 하나의 단락의 검정.

6. G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2의 존재 또는 부재가 검출되는, 단락 1 내지 단락 5 중 어느 하나의 단락의 검정.

7. V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA의 존재 또는 부재가 검출되는, 단락 1 내지 단락 6 중 어느 하나의 단락의 검정.

8. 핵산 샘플은 FFPE 종양 샘플로부터 준비되는, 단락 1 내지 단락 7 중 어느 하나의 단락의 검정.

9. 샘플은 위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 포함하는, 단락 1 내지 단락 8 중 어느 하나의 단락의 검정.

10. 하나 이상의 프라이머가 이중 도메인 프라이머인, 단락 1 내지 단락 9 중 어느 하나의 단락의 검정.

11. 일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들이 구별될 수 있는, 단락 1 내지 단락 10 중 어느 하나의 단락의 검정.

12. 일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 뚜렷이 다른 크기들을 가짐으로써 구별되는, 단락 1 내지 단락 11 중 어느 하나의 단락의 검정.

13. 일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 상이한 검출가능한 표지들로 표지됨으로써 구별되는, 단락 1 내지 단락 12 중 어느 하나의 단락의 검정.

14. 프라이머들은 대략 실시예 1의 농도로 반응 혼합물 내에 존재하는, 단락 1 내지 단락 13 중 어느 하나의 단락의 검정.

15. 조성물로서,

서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍들을 포함하는, 조성물.

16. 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 프라이머 쌍들을 포함하는, 단락 15의 조성물.

17. 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 프라이머 쌍들을 포함하는, 단락 15의 조성물.

18. 프라이머 쌍들은 표적 폴리뉴클레오티드들에 특이적으로 혼성화되는, 단락 15 내지 단락 17 중 어느 하나의 단락의 조성물.

19. 각 프라이머 쌍의 적어도 하나의 구성원은 형광 표지되는, 단락 15 내지 단락 18 중 어느 하나의 단락의 조성물.

20. 조성물로서,

서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍들에 의한 표적 폴리뉴클레오티드들의 증폭으로부터 생성된 형광 표지 증폭 산물들을 포함하는, 조성물.

21. 완충액; dNTP; 및 DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 반응 혼합물 성분들을 추가로 포함하는, 단락 15 내지 단락 20 중 어느 하나의 단락의 조성물.

22. FFPE 종양 샘플로부터 준비된 핵산 샘플을 추가로 포함하는, 단락 15 내지 단락 21 중 어느 하나의 단락의 조성물.

23. 위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 추가로 포함하는, 단락 15 내지 단락 22 중 어느 하나의 단락의 조성물.

24. 프라이머들은 대략 실시예 1의 농도로 존재하는, 단락 15 내지 단락 23 중 어느 하나의 단락의 조성물.

실시예

실시예 1

NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널의 개발이 본 명세서에 기재되는데, 즉, 이 분석 패널은 단일 반응에서, 예를 들어 ICEPlex™ 시스템 또는 유사 시스템 상에서 핵산 샘플을 사용하여 12개의 가장 임상적으로 중요한 NRAS 돌연변이 및, 이와 함께 4개의 다른 BRAF 돌연변이를 검출할 수 있는 멀티플렉스 PCR 검정이다.

RAS 유전자는 인간 암에서 자주 돌연변이되는 원발암유전자(proto-oncogene)이며, 다음 3개의 편재적으로 발현되는 유전자(ubiquitously expressed gene)에 의해 인코딩된다: HRAS, KRAS, 및 NRAS. 이들 RAS 유전자는 GTP/GDP 결합 및 GTPase 활성을 가지며, 그들의 단백질은 세포 성장의 제어에 관여할 수 있다. RAS 단백질은 동형-특이적(isoform-specific) 기능을 나타내며, NRAS에서, 아미노산 잔기 12, 13, 또는 61을 변화시키는 유전자 돌연변이는, 다양한 인간 종양, 특히 피부, 혈액, 및 림프구양 조직의 암에 관여하는, 배양된 세포를 형질전환시킬 인코딩된 단백질의 잠재성을 활성화시킨다.

NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널 검출 프라이머들을 설계하고, 이어서 프라이머-프라이머 상호작용에 대해 인실리코(in silico)로 분석하였다. ThermoBlast™ 프로그램, 야생형 세포주 gDNA, 및 합성 DNA 주형들을 사용하여 교차-반응성을 결정하였다. 반응 조건을 ICEPlex™ 시스템 상에서 최적화하였다.

단일-반응 NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널은 NRAS 및 BRAF 유전자에서의 16개의 가장 임상적으로 중요한 돌연변이를 표적으로 한다. 본 검정은, DNA 단편화 대조군으로서의 역할을 하고 돌연변이 상태를 결정하기 위하여 델타 Ct의 계산을 위한 기준 유전자 대조군(Reference Gene Control, RGC)들; 및 PCR 앰플리콘들의 크기를 결정하기 위한 보정 대조군(calibration control)들(C1 내지 C3)을 포함한다. NRAS/BRAF SNP 패널이 의도된 표적들에 특이적임이 본 명세서에 입증되어 있다.

NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널은 단일 웰 반응에서 돌연변이 상태를 검출한다. 본 명세서에 기재된 방법 및 검정은, 예를 들어 암에서의 게놈 돌연변이의 검출을 가능하게 한다.

본 명세서에 기재된 태양들의 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 검정은 ICEPlex™ 시스템 상에서 수행될 수 있다. ICEPlex™ 시스템은 증폭 모듈(서모사이클러(thermocycler))과 검출 모듈(모세관 전기영동 카트리지, 488 nm 및 639 nm에서 여기 최대치를 갖는 2개의 고상 레이저, 및 CCD 카메라를 갖는 분광광도계)을 겸비한 완전 자동화 실시간 PCR 플랫폼이다. ICEPlex™ 시스템은 형광 표지 PCR 산물(앰플리콘)들을 발생시키며, 이들 산물은 모세관 겔 전기영동(capillary gel electrophoresis, CE)에 의해 그들의 상이한 크기에 기초하여 분리된다. 형광 앰플리콘의 양은 ICEPlex™ 시스템의 소프트웨어에 의해 실시간으로 모니터링되는데, 이 소프트웨어는 형광 신호를 증폭 곡선으로 변환시키고 모든 PCR 표적들에 대하여 사이클 역치(Ct)를 계산한다. PCR과 CE의 조합은, 많게는, 예를 들어 48개의 개별 반응들의 멀티플렉스 표적들의 검출과 정량화의 동시 수행을 가능하게 한다.

프라이머 설계:

NCBI로부터 입수가능한 NRAS 유전자 서열 및 BRAF 유전자 서열에 기초하여 프라이머들을 설계하였다. 프라이머들을 PrimerBlast™(NCBI)를 사용하여 인실리코로 시험하였다. 태그 서열들을 돌연변이체 프라이머들에 부가하였는데, 태그는 표적 서열에 대해서는 상동성을 갖지 않도록 해야 하고 근연 프라이머들에 대해서는 6개 미만의 뉴클레오티드 상동성을 갖도록 해야 한다. Geneious Pro™ 소프트웨어를 위해 Cross-Hyb™ 플러그-인을 사용하여 멀티플렉스에서의 프라이머-프라이머 상호작용에 대해 프라이머들을 시험하였다. 프라이머들을 합성하였다.

상이한 크기의 앰플리콘들을 생성하도록 설계된 프라이머들의 목록

프라이머 명칭	프라이머 서열	서열 번호
NRAS-G12S	5'-TAGGATGGCCAATATTTTTGGTGGTTGGAGCAA-3'	1
NRAS-G12D	5'-AAGCTTCGTGATTAATAAATTAATGGTGGTTGGAGCAGA-3'	2
NRAS-G13R	5'-ATCGGACTTCTTAAAATAATAAATTAATTGGTTGGAGCAGGTC-3'	3
NRAS-G13A	5'-AACTTCTGGGATTTAAAAATATTTTATAATATATGGTTGGAGCAGGTGC	4
NRAS-G13D	5'-ATCTATATAAAAAAATTAAAAATTAATAAATATTAATAAGGTTGGAGCAGGTGA-3'	5
NRAS-G13V	5'-ACCATGGTTTTTATTTATTAATATTATTTATTTAATTTTTATAAGGTTGGAGCAGGTGT-3'	6
NRAS-G13C	5'-TGAGTTACCAAATATTTATTTATAATATAAAAATTATTAAAATAATATAGGTTGGAGCAGGTT-3'	7
NRAS-12-13-Intron-R	/56-FAM/AGACAGGATCAGGTCAGCGG	8
NRAS-Q61K	5'-TCAGAAGGACAATAAAAATACTGGATACAGCTGGAA-3'	9
NRAS-Q61L	5'-TGGCAGTAGGATAATAATATTAATACTGGATACAGCTGGACT-3'	10
NRAS-Q61R-1	5'-TGTGGAGATTTAATAATTTTAATATAAATACTGGATACAGCTGGACG-3'	11
NRAS-Q61R-2	5'-AGAAGGACCGATTAATTAAAATTTTTATATTTATACTGGATACAGCTGGACGG-3'	12
NRAS-Q61H-1	5'-AAACGCACAATAATTAATAATAAAATAATTTAATTATATACTGGATACAGCTGGACAC-3'	13
NRAS-61-Intron-R	/56-FAM/AGATCATCCTTTCAGAGAAAATAATGC	14
V600D-TG/AT-F	5'GCATATCACATTTTGGTCTAGCTACAGAT-3'	15
V600E-T/A-F	5'-CCGCATTTTGGTCTAGCTACAGAG-3'	16
V600E-TG/AA-F	5'-CATACATAGATACATATAAATTTTGGTCTAGCTACAGAA-3'	17
V600K-GT/AA-F	5'-CATCATGATCAATTGATTTTGGTCTAGCTACAAA-3'	18

증폭 조건: 1x 멀티플렉스 PCR 완충액(각 프라이머에 대해 0.3 uM, 0.25x ICEPlex™ 보정물질(calibrator) 1, 및 1 U의 Apta Taq Δexo DNA 중합효소 중에서 PCR 반응을 수행하였다. 총 반응 부피는 25 uL였으며, ICEPlex™ 시스템 상에서 반응을 수행하였다. PCR 증폭 조건은 다음과 같았다:

6분 동안 96℃; 54℃에서 45초 동안, 72℃에서 45초 동안, 그리고 96℃에서 20초 동안 2회 사이클; 64℃에서 45초 동안, 72℃에서 45초 동안, 그리고 98℃에서 5초 동안 16회 사이클; 64℃에서 45초 동안, 72℃에서 220초 동안, 96℃에서 10초 동안 28회 사이클.

[표 2]

표 1의 프라이머들에 의해 검출된 변경

ICEPlex NRAS / BRAF 패널 검출

이 검정은 4개의 BRAF 표적들 및 12개의 NRAS 표적들의 검출과 구별을 동시에 수행할 수 있다(도 1). 2개의 상이한 염료(FAM 및 TYE)를 사용하였다. 보정 대조군들을 사용하여 이 검정에서 표적들의 크기를 결정하였다.

내부 DNA 단편화 대조군들을 가능하게 하기 위하여 기준 유전자 대조군들을 개발하였다. 이들 대조군은 DNA 출발 재료의 품질의 결정뿐만 아니라 델타 Ct의 계산도 가능하게 한다. 세 프라이머 쌍들이 NRAS 유전자 상에서 기준 유전자 대조군들을 증폭시킨다. 3개의 표적들 - TYE-RGC1, 2, 및 3이 TYE 채널에서 검출되고, 2개의 표적들이 FAM 채널에서 검출된다(FAM-RGC1, 및 2)(도 2). 기준 유전자 대조군들은 표 1의 프라이머들과 함께 단일 멀티플렉스 반응에 포함될 수 있다.

[표 3] NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널의 교차-반응성 연구로부터의 결과. 단지 2개의 표적들에 대해서 관찰된 교차-반응성으로 고감도를 입증하였다.

NRAS 및 BRAF 발암유전자 바이오마커에서의 점 돌연변이의 검출을 위해 개발된 NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널이 본 명세서에 기재되어 있다. 고 멀티플렉스 NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널은 모든 표적 NRAS/BRAF 돌연변이뿐만 아니라 DNA 단편화 및 델타 Ct 계산을 위한 기준 유전자 대조군들 및 크기 결정을 위한 보정 대조군들도 검출한다. 본 명세서에 기재된 연구로부터의 결과는 NRAS/BRAF 점 돌연변이 분석 패널이 고 멀티플렉스 단일관 포맷에서 모든 표적화된 NRAS/BRAF 돌연변이의 식별에 고도로 특이적임을 입증한다.

실시예 2

표 1에 제시된 BRAF 프라이머들을 포함한, 실시예 1에 기재된 조건들과 양립가능한 대안적인 세트의 NRAS 프라이머들.

표적 명칭	프라이머 서열	코어 앰플리콘 크기	ModaPlex 상에서의 실제 크기	서열 번호
NRAS-G12D-Primary-cDNA	TAAATTTTAATTTTAAAACCATGGTTTCAAGCTTCATAAATTAATGGTGGTTGGAGCAGA	55	135	19
NRAS-G12S-Primary-cDNA	ATAAATGGTATTTTAATTTTAAAACCATGGTTTCTAGGATGGCTTTGGTGGTTGGAGCAA	55	139	20
NRAS-G13A-Primary-cDNA	TAACTTCTGGGATTAAATATTTTATAATATATGGTTGGAGCAGGTGC	55	119	21
NRAS-G13C-Primary-cDNA	ATATATTGAGTTACCAAATATTTATTTATAATATAAAAATTATTAAAATAATATAGGTTGGAGCAGGTT	55	144	22
NRAS-G13D-Primary-cDNA	GCTATATAAAATTAAAAATTAATAAATATTAATAAGGTTGGAGCAGGTGA	55	123	23
NRAS-G13R-Primary-cDNA	ATAAAACCATGGTTTATCGGACTTCAATAATAAATTAATTGGTTGGAGCAGGTC	55	127	24
NRAS-G13V-Primary-cDNA	ATACCATGGTTTTTATTTATTAATATTATTTATTTAATTTTTATAAGGTTGGAGCAGGTGT	55	131	25
NRAS-Q61H-1-Primary-cDNA	ATATTAAAACGCACAATAATTAATAATAAAATAATTTAATTATATACTGGATACAGCTGGACAC	72	138	26
NRAS-Q61H-2-Primary-cDNA	TTATTAAAACTTATATCGAAATAATATTATATTATAATTTATTTATTAATATACTGGATACAGCTGGACAT	72	126	27
NRAS-Q61K-Primary-cDNA	TATCAGAAGGACAATAAAAATACTGGATACAGCTGGAA	72	142	28
NRAS-Q61L-Primary-cDNA	AATTGGCAGTAGGATAATAATATTAATACTGGATACAGCTGGACT	72	122	29
NRAS-Q61R-1-Primary-cDNA	TAAATTGTGGAGATTTAATAATTTTAATATAAATACTGGATACAGCTGGACG	72	130	30
NRAS-Q61R-2-Primary-cDNA	TAAATTAGAAGGACCGATTAATTAAAATTTTTATATTTATACTGGATACAGCTGGACGG	72	134	31
NRAS_61_F_cDNA	/56-FAM/TAGGATGGCCTTATTAATATTAGAGGAAGCCTTCGCCTGTC			32
NRAS_12&13_F_cDNA	/5TYE665/TAGGATGGCCTAATTAATAATAAAATAATTTAATTATTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGC			33
NRAS-Ref-3 F	AACAGCAGCCATTACCAGACCCATCCATTCCCGTG	89	118	34
NRAS-Ref-6 F	AATTATATTTTGGAAGAACCCAGGGCAGAA	149	170	35
NRAS-Ref-10 F	CTTTGACAGATTTATGGAATCCCACACGGGACGTTTCAAT	181	220	36
NRAS-Ref-3 R	/5TYE665/ATATATTTTATCACCGCCTGGTTACTGTGTCCTG			37
NRAS-Ref-6 R	/5TYE665/AGTTGAGATATAGCTCCTGCTACTTCCCCAG			38
NRAS-Ref-10 R	/5TYE665/ACAGTAATAACTTACATAATCCCCCTTGTCGTTTGAGGT			39

표 4의 프라이머들은 cDNA 주형들뿐만 아니라 게놈 DNA와도 양립가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> PRIMERADX INC. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR MULTIMODAL ANALYSIS OF NRAS AND BRAF NUCLEIC ACIDS <130> 046264-078891-PCT <140> <141> <150> 61/865,754 <151> 2013-08-14 <160> 43 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 1 taggatggcc aatatttttg gtggttggag caa 33 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 2 aagcttcgtg attaataaat taatggtggt tggagcaga 39 <210> 3 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 3 atcggacttc ttaaaataat aaattaattg gttggagcag gtc 43 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 4 aacttctggg atttaaaaat attttataat atatggttgg 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Synthetic primer" <400> 9 tcagaaggac aataaaaata ctggatacag ctggaa 36 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 10 tggcagtagg ataataatat taatactgga tacagctgga ct 42 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 11 tgtggagatt taataatttt aatataaata ctggatacag ctggacg 47 <210> 12 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 12 agaaggaccg attaattaaa atttttatat ttatactgga tacagctgga cgg 53 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 13 aaacgcacaa taattaataa taaaataatt taattatata ctggatacag ctggacac 58 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <220> <221> source <223> /note="5'-56-FAM" <400> 14 agatcatcct ttcagagaaa ataatgc 27 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 15 gcatatcaca ttttggtcta gctacagat 29 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 16 ccgcattttg gtctagctac agag 24 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 17 catacataga tacatataaa ttttggtcta gctacagaa 39 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 18 catcatgatc aattgatttt ggtctagcta caaa 34 <210> 19 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: 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Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 24 ataaaaccat ggtttatcgg acttcaataa taaattaatt ggttggagca ggtc 54 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 25 ataccatggt ttttatttat taatattatt tatttaattt ttataaggtt ggagcaggtg 60 t 61 <210> 26 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 26 atattaaaac gcacaataat taataataaa ataatttaat tatatactgg atacagctgg 60 acac 64 <210> 27 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 27 ttattaaaac ttatatcgaa ataatattat attataattt atttattaat atactggata 60 cagctggaca t 71 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 28 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ttggacatac 420 tggatacagc tggacaagaa gagtacagtg ccatgagaga ccaatacatg aggacaggcg 480 aaggcttcct ctgtgtattt gccatcaata atagcaagtc atttgcggat attaacctct 540 acagggagca gattaagcga gtaaaagact cggatgatgt acctatggtg ctagtgggaa 600 acaagtgtga tttgccaaca aggacagttg atacaaaaca agcccacgaa ctggccaaga 660 gttacgggat tccattcatt gaaacctcag ccaagaccag acagggtgtt gaagatgctt 720 tttacacact ggtaagagaa atacgccagt accgaatgaa aaaactcaac agcagtgatg 780 atgggactca gggttgtatg ggattgccat gtgtggtgat gtaacaagat acttttaaag 840 ttttgtcaga aaagagccac tttcaagctg cactgacacc ctggtcctga cttccctgga 900 ggagaagtat tcctgttgct gtcttcagtc tcacagagaa gctcctgcta cttccccagc 960 tctcagtagt ttagtacaat aatctctatt tgagaagttc tcagaataac tacctcctca 1020 cttggctgtc tgaccagaga atgcacctct tgttactccc tgttattttt ctgccctggg 1080 ttcttccaca gcacaaacac acctctgcca ccccaggttt ttcatctgaa aagcagttca 1140 tgtctgaaac agagaaccaa accgcaaacg tgaaattcta ttgaaaacag tgtcttgagc 1200 tctaaagtag caactgctgg tgattttttt tttcttttta ctgttgaact tagaactatg 1260 ctaatttttg gagaaatgtc ataaattact gttttgccaa gaatatagtt attattgctg 1320 tttggtttgt ttataatgtt atcggctcta ttctctaaac tggcatctgc tctagattca 1380 taaatacaaa aatgaatact gaattttgag tctatcctag tcttcacaac tttgacgtaa 1440 ttaaatccaa ctttcacagt gaagtgcctt tttcctagaa gtggtttgta gacttccttt 1500 ataatatttc agtggaatag atgtctcaaa aatccttatg catgaaatga atgtctgaga 1560 tacgtctgtg acttatctac cattgaagga aagctatatc tatttgagag cagatgccat 1620 tttgtacatg tatgaaattg gttttccaga ggcctgtttt ggggctttcc caggagaaag 1680 atgaaactga aagcacatga ataatttcac ttaataattt ttacctaatc tccacttttt 1740 tcataggtta ctacctatac aatgtatgta atttgtttcc cctagcttac tgataaacct 1800 aatattcaat gaacttccat ttgtattcaa atttgtgtca taccagaaag ctctacattt 1860 gcagatgttc aaatattgta aaactttggt gcattgttat ttaatagctg tgatcagtga 1920 ttttcaaacc tcaaatatag tatattaaca aattacattt tcactgtata tcatggtatc 1980 ttaatgatgt atataattgc cttcaatccc cttctcaccc caccctctac agcttccccc 2040 acagcaatag gggcttgatt atttcagttg agtaaagcat ggtgctaatg gaccagggtc 2100 acagtttcaa aacttgaaca atccagttag catcacagag aaagaaattc ttctgcattt 2160 gctcattgca ccagtaactc cagctagtaa ttttgctagg tagctgcagt tagccctgca 2220 aggaaagaag aggtcagtta gcacaaaccc tttaccatga ctggaaaact cagtatcacg 2280 tatttaaaca tttttttttc ttttagccat gtagaaactc taaattaagc caatattctc 2340 atttgagaat gaggatgtct cagctgagaa acgttttaaa ttctctttat tcataatgtt 2400 ctttgaaggg tttaaaacaa gatgttgata aatctaagct gatgagtttg ctcaaaacag 2460 gaagttgaaa ttgttgagac aggaatggaa aatataatta attgatacct atgaggattt 2520 ggaggcttgg cattttaatt tgcagataat accctggtaa ttctcatgaa aaatagactt 2580 ggataacttt tgataaaaga ctaattccaa aatggccact ttgttcctgt ctttaatatc 2640 taaatactta ctgaggtcct ccatcttcta tattatgaat tttcatttat taagcaaatg 2700 tcatattacc ttgaaattca gaagagaaga aacatatact gtgtccagag tataatgaac 2760 ctgcagagtt gtgcttctta ctgctaattc tgggagcttt cacagtactg tcatcatttg 2820 taaatggaaa ttctgctttt ctgtttctgc tccttctgga gcagtgctac tctgtaattt 2880 tcctgaggct tatcacctca gtcatttctt ttttaaatgt ctgtgactgg cagtgattct 2940 ttttcttaaa aatctattaa atttgatgtc aaattaggga gaaagatagt tactcatctt 3000 gggctcttgt gccaatagcc cttgtatgta tgtacttaga gttttccaag tatgttctaa 3060 gcacagaagt ttctaaatgg ggccaaaatt cagacttgag tatgttcttt gaatacctta 3120 agaagttaca attagccggg catggtggcc cgtgcctgta gtcccagcta cttgagaggc 3180 tgaggcagga gaatcacttc aacccaggag gtggaggtta cagtgagcag agatcgtgcc 3240 actgcactcc agcctgggtg acaagagaga cttgtctcca aaaaaaaagt tacacctagg 3300 tgtgaatttt ggcacaaagg agtgacaaac ttatagttaa aagctgaata acttcagtgt 3360 ggtataaaac gtggttttta ggctatgttt gtgattgctg aaaagaattc tagtttacct 3420 caaaatcctt ctctttcccc aaattaagtg cctggccagc tgtcataaat tacatattcc 3480 ttttggtttt tttaaaggtt acatgttcaa gagtgaaaat aagatgttct gtctgaaggc 3540 taccatgccg gatctgtaaa tgaacctgtt aaatgctgta tttgctccaa cggcttacta 3600 tagaatgtta cttaatacaa tatcatactt attacaattt ttactatagg agtgtaatag 3660 gtaaaattaa tctctatttt agtgggccca tgtttagtct ttcaccatcc tttaaactgc 3720 tgtgaatttt tttgtcatga cttgaaagca aggatagaga aacactttag agatatgtgg 3780 ggttttttta ccattccaga gcttgtgagc ataatcatat ttgctttata tttatagtca 3840 tgaactccta agttggcagc tacaaccaag aaccaaaaaa tggtgcgttc tgcttcttgt 3900 aattcatctc tgctaataaa ttataagaag caaggaaaat tagggaaaat attttatttg 3960 gatggtttct ataaacaagg gactataatt cttgtacatt atttttcatc tttgctgttt 4020 ctttgagcag tctaatgtgc cacacaatta tctaaggtat ttgttttcta taagaattgt 4080 tttaaaagta ttcttgttac cagagtagtt gtattatatt tcaaaacgta agatgatttt 4140 taaaagcctg agtactgacc taagatggaa ttgtatgaac tctgctctgg agggagggga 4200 ggatgtccgt ggaagttgta agacttttat ttttttgtgc catcaaatat aggtaaaaat 4260 aattgtgcaa ttctgctgtt taaacaggaa ctattggcct ccttggccct aaatggaagg 4320 gccgatattt taagttgatt attttattgt aaattaatcc aacctagttc tttttaattt 4380 ggttgaatgt tttttcttgt taaatgatgt ttaaaaaata aaaactggaa gttcttggct 4440 tagtcataat tctt 4454 <210> 41 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 Val Phe Ala Ile Asn Asn Ser Lys Ser Phe Ala Asp Ile Asn Leu Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Thr Arg Thr Val Asp Thr Lys 115 120 125 Gln Ala His Glu Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Met Lys Lys Leu Asn Ser Ser Asp Asp 165 170 175 Gly Thr Gln Gly Cys Met Gly Leu Pro Cys Val Val Met 180 185 <210> 42 <211> 2949 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 cgcctccctt ccccctcccc gcccgacagc ggccgctcgg gccccggctc tcggttataa 60 gatggcggcg ctgagcggtg gcggtggtgg cggcgcggag ccgggccagg ctctgttcaa 120 cggggacatg gagcccgagg ccggcgccgg cgccggcgcc gcggcctctt cggctgcgga 180 ccctgccatt ccggaggagg tgtggaatat caaacaaatg attaagttga cacaggaaca 240 tatagaggcc ctattggaca aatttggtgg ggagcataat ccaccatcaa tatatctgga 300 ggcctatgaa gaatacacca gcaagctaga tgcactccaa caaagagaac aacagttatt 360 ggaatctctg gggaacggaa ctgatttttc tgtttctagc tctgcatcaa tggataccgt 420 tacatcttct tcctcttcta gcctttcagt gctaccttca tctctttcag tttttcaaaa 480 tcccacagat gtggcacgga gcaaccccaa gtcaccacaa aaacctatcg ttagagtctt 540 cctgcccaac aaacagagga cagtggtacc tgcaaggtgt ggagttacag tccgagacag 600 tctaaagaaa gcactgatga tgagaggtct aatcccagag tgctgtgctg tttacagaat 660 tcaggatgga gagaagaaac caattggttg ggacactgat atttcctggc ttactggaga 720 agaattgcat gtggaagtgt tggagaatgt tccacttaca acacacaact ttgtacgaaa 780 aacgtttttc accttagcat tttgtgactt ttgtcgaaag ctgcttttcc agggtttccg 840 ctgtcaaaca tgtggttata aatttcacca gcgttgtagt acagaagttc cactgatgtg 900 tgttaattat gaccaacttg atttgctgtt tgtctccaag ttctttgaac accacccaat 960 accacaggaa gaggcgtcct tagcagagac tgccctaaca tctggatcat ccccttccgc 1020 acccgcctcg gactctattg ggccccaaat tctcaccagt ccgtctcctt caaaatccat 1080 tccaattcca cagcccttcc gaccagcaga tgaagatcat cgaaatcaat ttgggcaacg 1140 agaccgatcc tcatcagctc ccaatgtgca tataaacaca atagaacctg tcaatattga 1200 tgacttgatt agagaccaag gatttcgtgg tgatggagga tcaaccacag gtttgtctgc 1260 taccccccct gcctcattac ctggctcact aactaacgtg aaagccttac agaaatctcc 1320 aggacctcag cgagaaagga agtcatcttc atcctcagaa gacaggaatc gaatgaaaac 1380 acttggtaga cgggactcga gtgatgattg ggagattcct gatgggcaga ttacagtggg 1440 acaaagaatt ggatctggat catttggaac agtctacaag ggaaagtggc atggtgatgt 1500 ggcagtgaaa atgttgaatg tgacagcacc tacacctcag cagttacaag ccttcaaaaa 1560 tgaagtagga gtactcagga aaacacgaca tgtgaatatc ctactcttca tgggctattc 1620 cacaaagcca caactggcta ttgttaccca gtggtgtgag ggctccagct tgtatcacca 1680 tctccatatc attgagacca aatttgagat gatcaaactt atagatattg cacgacagac 1740 tgcacagggc atggattact tacacgccaa gtcaatcatc cacagagacc tcaagagtaa 1800 taatatattt cttcatgaag acctcacagt aaaaataggt gattttggtc tagctacagt 1860 gaaatctcga tggagtgggt cccatcagtt tgaacagttg tctggatcca ttttgtggat 1920 ggcaccagaa gtcatcagaa tgcaagataa aaatccatac agctttcagt cagatgtata 1980 tgcatttgga attgttctgt atgaattgat gactggacag ttaccttatt caaacatcaa 2040 caacagggac cagataattt ttatggtggg acgaggatac ctgtctccag atctcagtaa 2100 ggtacggagt aactgtccaa aagccatgaa gagattaatg gcagagtgcc tcaaaaagaa 2160 aagagatgag agaccactct ttccccaaat tctcgcctct attgagctgc tggcccgctc 2220 attgccaaaa attcaccgca gtgcatcaga accctccttg aatcgggctg gtttccaaac 2280 agaggatttt agtctatatg cttgtgcttc tccaaaaaca cccatccagg cagggggata 2340 tggtgcgttt cctgtccact gaaacaaatg agtgagagag ttcaggagag tagcaacaaa 2400 aggaaaataa atgaacatat gtttgcttat atgttaaatt gaataaaata ctctcttttt 2460 ttttaaggtg aaccaaagaa cacttgtgtg gttaaagact agatataatt tttccccaaa 2520 ctaaaattta tacttaacat tggattttta acatccaagg gttaaaatac atagacattg 2580 ctaaaaattg gcagagcctc ttctagaggc tttactttct gttccgggtt tgtatcattc 2640 acttggttat tttaagtagt aaacttcagt ttctcatgca acttttgttg ccagctatca 2700 catgtccact agggactcca gaagaagacc ctacctatgc ctgtgtttgc aggtgagaag 2760 ttggcagtcg gttagcctgg gttagataag gcaaactgaa cagatctaat ttaggaagtc 2820 agtagaattt aataattcta ttattattct taataatttt tctataacta tttcttttta 2880 taacaatttg gaaaatgtgg atgtctttta tttccttgaa gcaataaact aagtttcttt 2940 ttataaaaa 2949 <210> 43 <211> 766 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Met Ala Ala Leu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Glu Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ala Leu Phe Asn Gly Asp Met Glu Pro Glu Ala Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30 Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Asp Pro Ala Ile Pro Glu Glu Val Trp 35 40 45 Asn Ile Lys Gln Met Ile Lys Leu Thr Gln Glu His Ile Glu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Lys Phe Gly Gly Glu His Asn Pro Pro Ser Ile Tyr Leu Glu 65 70 75 80 Ala Tyr Glu Glu Tyr Thr Ser Lys Leu Asp Ala Leu Gln Gln Arg Glu 85 90 95 Gln Gln Leu Leu Glu Ser Leu Gly Asn Gly Thr Asp Phe Ser Val Ser 100 105 110 Ser Ser Ala Ser Met Asp Thr Val Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu 115 120 125 Ser Val Leu Pro Ser Ser Leu Ser Val Phe Gln Asn Pro Thr Asp Val 130 135 140 Ala Arg Ser Asn Pro Lys Ser Pro Gln Lys Pro Ile Val Arg Val Phe 145 150 155 160 Leu Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Pro Ala Arg Cys Gly Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ser Leu Lys Lys Ala Leu Met Met Arg Gly Leu Ile Pro 180 185 190 Glu Cys Cys Ala Val Tyr Arg Ile Gln Asp Gly Glu Lys Lys Pro Ile 195 200 205 Gly Trp Asp Thr Asp Ile Ser Trp Leu Thr Gly Glu Glu Leu His Val 210 215 220 Glu Val Leu Glu Asn Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Val Arg Lys 225 230 235 240 Thr Phe Phe Thr Leu Ala Phe Cys Asp Phe Cys Arg Lys Leu Leu Phe 245 250 255 Gln Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Gln Arg Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Val Pro Leu Met Cys Val Asn Tyr Asp Gln Leu Asp Leu 275 280 285 Leu Phe Val Ser Lys Phe Phe Glu His His Pro Ile Pro Gln Glu Glu 290 295 300 Ala Ser Leu Ala Glu Thr Ala Leu Thr Ser Gly Ser Ser Pro Ser Ala 305 310 315 320 Pro Ala Ser Asp Ser Ile Gly Pro Gln Ile Leu Thr Ser Pro Ser Pro 325 330 335 Ser Lys Ser Ile Pro Ile Pro Gln Pro Phe Arg Pro Ala Asp Glu Asp 340 345 350 His Arg Asn Gln Phe Gly Gln Arg Asp Arg Ser Ser Ser Ala Pro Asn 355 360 365 Val His Ile Asn Thr Ile Glu Pro Val Asn Ile Asp Asp Leu Ile Arg 370 375 380 Asp Gln Gly Phe Arg Gly Asp Gly Gly Ser Thr Thr Gly Leu Ser Ala 385 390 395 400 Thr Pro Pro Ala Ser Leu Pro Gly Ser Leu Thr Asn Val Lys Ala Leu 405 410 415 Gln Lys Ser Pro Gly Pro Gln Arg Glu Arg Lys Ser Ser Ser Ser Ser 420 425 430 Glu Asp Arg Asn Arg Met Lys Thr Leu Gly Arg Arg Asp Ser Ser Asp 435 440 445 Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly 450 455 460 Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val 465 470 475 480 Ala Val Lys Met Leu Asn Val Thr Ala Pro Thr Pro Gln Gln Leu Gln 485 490 495 Ala Phe Lys Asn Glu Val Gly Val Leu Arg Lys Thr Arg His Val Asn 500 505 510 Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Ser Thr Lys Pro Gln Leu Ala Ile Val 515 520 525 Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr His His Leu His Ile Ile 530 535 540 Glu Thr Lys Phe Glu Met Ile Lys Leu Ile Asp Ile Ala Arg Gln Thr 545 550 555 560 Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp 565 570 575 Leu Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Asp Leu Thr Val Lys Ile 580 585 590 Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp Ser Gly Ser His 595 600 605 Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val 610 615 620 Ile Arg Met Gln Asp Lys Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr 625 630 635 640 Ala Phe Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly Gln Leu Pro Tyr 645 650 655 Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met Val Gly Arg Gly 660 665 670 Tyr Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Ala 675 680 685 Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg 690 695 700 Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ala Ser Ile Glu Leu Leu Ala Arg Ser 705 710 715 720 Leu Pro Lys Ile His Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser Leu Asn Arg Ala 725 730 735 Gly Phe Gln Thr Glu Asp Phe Ser Leu Tyr Ala Cys Ala Ser Pro Lys 740 745 750 Thr Pro Ile Gln Ala Gly Gly Tyr Gly Ala Phe Pro Val His 755 760 765

Claims (24)

1. NRAS 및/또는 BRAF의 돌연변이를 검출하기 위한 검정으로서,
   핵산 샘플의 일부분을 일 세트의 프라이머들과 접촉시키는 단계로서,
   일 세트의 프라이머들은 프라이머 쌍들의 하위세트들을 포함하며, 여기서 각 프라이머 쌍은 서열 변이를 포함하는 NRAS 또는 BRAF 서열을 증폭시키는 것인 단계;
   샘플의 일부분 및 일 세트 이상의 프라이머들을 포함하는 반응 혼합물에 대하여 가닥 분리, 프라이머 어닐링(annealing), 및 프라이머 신장(extension)의 사이클을 포함하는 PCR 증폭 계획(amplification regimen)을 수행하는 단계;
   각 프라이머 쌍에 대하여 앰플리콘(amplicon)의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서,
   앰플리콘의 존재는 그 프라이머 쌍이 특이적인 서열 변이의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하며,
   프라이머들 중 하나 이상은 서열 번호 1-39로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정.
2. 제1항에 있어서,
   프라이머 쌍들은 서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   하나 이상의 서열 변이가 점 돌연변이인, 검정.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   NRAS 점 돌연변이는 G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   BRAF 점 돌연변이는 V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA로 이루어진 군으로부터 선택되는, 검정.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   G12D; G12S; G13A; G13C; G13D; G12R; G13V; Q61H1; Q61K; Q61L; Q61R1; 및 Q61R2의 존재 또는 부재가 검출되는, 검정.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   V600D TG/AT; V600E T/A; V600E TG/AA; 및 V600K GT/AA의 존재 또는 부재가 검출되는, 검정.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   핵산 샘플은 FFPE 종양 샘플로부터 준비되는, 검정.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   샘플은 위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 포함하는, 검정.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 프라이머가 이중 도메인 프라이머인, 검정.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들이 구별될 수 있는, 검정.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 뚜렷이 다른 크기(distinct size)들을 가짐으로써 구별되는, 검정.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    일 프라이머 세트의 둘 이상의 프라이머 쌍들로부터의 증폭된 산물들은 상이한 검출가능한 표지들로 표지됨으로써 구별되는, 검정.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    프라이머들은 대략 실시예 1의 농도로 반응 혼합물 내에 존재하는, 검정.
15. 조성물로서,
    서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍들을 포함하는, 조성물.
16. 제15항에 있어서,
    서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 프라이머 쌍들을 포함하는, 조성물.
17. 제15항에 있어서,
    서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 프라이머 쌍들을 포함하는, 조성물.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    프라이머 쌍들은 표적 폴리뉴클레오티드들에 특이적으로 혼성화되는, 조성물.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    각 프라이머 쌍의 적어도 하나의 구성원은 형광 표지되는(fluorescently-labelled), 조성물.
20. 조성물로서,
    서열 번호 1과 8; 서열 번호 2와 8; 서열 번호 3과 8; 서열 번호 4와 8; 서열 번호 5와 8; 서열 번호 6과 8; 서열 번호 7과 8; 서열 번호 9와 14; 서열 번호 10과 14; 서열 번호 11과 14; 서열 번호 12와 14; 서열 번호 13과 14; 서열 번호 15와 18; 서열 번호 16과 18; 서열 번호 17과 18; 서열 번호 19와 33; 서열 번호 20과 33; 서열 번호 21과 33; 서열 번호 22와 33; 서열 번호 23과 33; 서열 번호 24와 33; 서열 번호 25와 33; 서열 번호 26과 32; 서열 번호 27과 32; 서열 번호 28과 32; 서열 번호 29와 32; 서열 번호 30과 32; 서열 번호 31과 32; 서열 번호 34와 37; 서열 번호 35와 38; 및 서열 번호 36과 39의 서열을 갖는 분자들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 쌍들에 의한 표적 폴리뉴클레오티드들의 증폭으로부터 생성된 형광 표지 증폭 산물들을 포함하는, 조성물.
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    완충액; dNTP; 및 DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 반응 혼합물 성분들을 추가로 포함하는, 조성물.
22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    FFPE 종양 샘플로부터 준비된 핵산 샘플을 추가로 포함하는, 조성물.
23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    위암; 직장암; 담관종; 폐암; 뇌암; 자궁경부암; 결장암; 두경부암; 간세포암; 비소세포 폐암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 난소암; 육종; 및 갑상선암으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환을 갖는 것으로 진단된 대상체로부터의 종양 세포를 추가로 포함하는, 조성물.
24. 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    프라이머들은 대략 실시예 1의 농도로 존재하는, 조성물.

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