CN111424089A - 用于检测braf基因突变的试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测braf基因突变的试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒及检测方法。用于检测BRAF基因突变的试剂盒包括BRAF反应液、BRAF阳性对照和BRAF阴性对照，BRAF反应液由引物和PCR缓冲液组成，BRAF阳性对照为质粒DNA，BRAF阴性对照为野生型人类基因组DNA。本发明准确率高、成本低、特异性好、对检测样品需求量低、检测通量高、精确度高、操作简单；检测速度快，整个检测过程仅需要150min即可完成。

Description

用于检测BRAF基因突变的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒及检测方法。
背景技术
BRAF绝大部分突变形式为BRAF V600E突变，主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。在结直肠癌患者中，BRAF基因突变率为15％，而BRAF在原发性黑色素瘤中突变率为80％、在转移性黑色素瘤中突变率为68％、在良性痣中的突变率高达82％。
目前，BRAF基因检测已被欧美地区列为大肠癌患者治疗前必做的常规检查。针对BRAF基因突变所研发的新型靶向药物威罗菲尼对于BRAF基因突变阳性患者疗效显著。人类BRAF基因V600E突变基因检测用于指导治疗结肠癌、黑色素瘤患者具有非常重要的指导意义。
目前常用的基因突变检测方法主要有测序法和荧光定量PCR法。这些方法均存在一定的缺陷。测序法灵敏度低(只有20％)，从而导致高的假阴性，而且步骤较多，操作复杂。荧光定量PCR法是目前主流的检测方法，灵敏度较高，操作简单，但是也存在对检测样品需求量大，检测通量较低和精确度不高的不足。因此，如何找到一种检测速度快、检测通量高、操作简单的基因检测方法至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，准确率高、成本低；本发明同时提供了采用用于检测BRAF基因突变的试剂盒的检测方法，对检测样品需求量低、检测速度快、检测通量高、精确度高、操作简单。
本发明所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，包括BRAF反应液、BRAF阳性对照和BRAF阴性对照，BRAF反应液由引物和PCR缓冲液组成，BRAF阳性对照为质粒DNA，BRAF阴性对照为野生型人类基因组DNA；
引物由PB-600-M1-F、PB-600-M2-F、PB-600-M3-F、PB-600-M4-F和PB-600-M-R组成；
PB-600-M1-F为PB-600-M1-F1或PB-600-M1-F2，
PB-600-M2-F为PB-600-M2-F1或PB-600-M2-F2，
PB-600-M3-F为PB-600-M3-F1或PB-600-M3-F2，
PB-600-M4-F为PB-600-M4-F1或PB-600-M4-F2，
PB-600-M-R为PB-600-M-R1或PB-600-M-R2；
PB-600-M1-F1、PB-600-M1-F2、PB-600-M2-F1、PB-600-M2-F2、PB-600-M3-F1、PB-600-M3-F2、PB-600-M4-F1、PB-600-M4-F2、PB-600-M-R1和PB-600-M-R2依次为SEQ IDNO.01～10所示的序列。
所述的引物优选由PB-600-M1-F1、PB-600-M2-F1、PB-600-M3-F1、PB-600-M4-F1和PB-600-M-R1组成。
所述的引物优选由PB-600-M1-F2、PB-600-M2-F2、PB-600-M3-F2、PB-600-M4-F2和PB-600-M-R2组成。
根据人类BRAF基因序列，本发明针对4种基因突变设计荧光引物。
SEQ ID NO.01～10引物序列见表1。
表1SEQ ID NO.01～10引物序列
引物名称 引物序列 序号
PB-600-M1-F1 HEX-CCGCATTTTGGTCTAGCTACCGAG SEQ ID NO:01
PB-600-M1-F2 HEX-CCGCATTTTGGTCTAGCTACAG SEQ ID NO:02
PB-600-M2-F1 HEX-GCATATCACATTTTGGTCTAGCTACAGAT SEQ ID NO:03
PB-600-M2-F2 HEX-GCATATCACATTTCAGTCTACCTACAGAT SEQ ID NO:04
PB-600-M3-F1 HEX-CCTCATGATCCATTGATTTTGGTCTAGCTACCAA SEQ ID NO:05
PB-600-M3-F2 HEX-CCTCATGATCAATTGATTTTGGTCTAGCAGA SEQ ID NO:06
PB-600-M4-F1 HEX-CCTACATAGATAAATATAAATTTTGGTCTAGCTACCGAA SEQ ID NO:07
PB-600-M4-F2 HEX-CCTAAATAGATACATATAAATTTTGGTCTAGCAGAA SEQ ID NO:08
PB-600-M-R1 ACCTATCGAAAATTTAATCAGTGGAAAAATAGC SEQ ID NO:09
PB-600-M-R2 ACCTATCGAAAATTTAATCAGTGGAAAAACCGC SEQ ID NO:10
所述的PCR缓冲液组成如下：
Figure BDA0002450240900000021
Figure BDA0002450240900000031
本发明所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒是以FFPE人类基因组DNA为检测样本。
BRAF反应液内包含相应的BRAF基因突变检测和内控检测试剂。内控检测选择的检测区域是人类基因组相对保守的区段，用于监控FFPE DNA样本质量和PCR反应过程。
采用本发明所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取FFPE样本人类基因组DNA；
(2)采用用于检测BRAF基因突变的试剂盒中的BRAF反应液构建PCR扩增反应体系进行PCR反应；
(3)对PCR产物进行毛细管电泳；
(4)根据毛细管电泳峰图显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
步骤(2)中所述的PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0002450240900000032
步骤(2)中所述的PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
本发明采用的是高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳相结合的方法来完成同时对多个基因突变位点高精准检测。多重PCR是在一个反应体系中加入多条引物来同时扩增多个突变检测位点，一般2-6个位点，本发明的高多重PCR反应体系中加入更多的引物来检测更多的突变位点(比如40-100个突变)，这样极大降低初始检测样品的需求量，提高检测通量，节省成本。高多重PCR所用的引物用荧光标记，PCR产物可以利用测序级的荧光毛细管电泳仪(如ABI3500测序仪)对荧光标记的PCR产物进行片段分析。这种毛细管电泳分辨率很高，可以区分一个碱基的差别，大大提高了突变检测的准确性和灵敏度。
本发明采用的这种高多重PCR和高精度毛细管电泳相结合的方法同目前主流的PCR方法相比从灵敏度和特异性上有了很大的提高。从一般PCR产物，通过紫外光激发检测，到荧光标记PCR产物，紫外光激发检测，再到荧光标记PCR产物，单频激光激发检测，灵敏度极大提高。这类方法，在一些先进的公司也有应用，但还比较少。突变检测中除了需要同时精准检测多个突变，另一个更重要的方面是检测方法需要有很高的特异性，将突变同野生型以及其它类似的突变区别开来。任何样品都有大量的野生型DNA，很多的突变多发生在相同的区域甚至是同一个位点，这样引物之间以及引物和突变/野生模板之间相互竞争都会导致非特异信号出现。本发明的方法主要是通过以下几个方面来控制非特异扩增的产生，从而来增加特异性：
1、引物设计：本发明根据引物中最后几个碱基具有和配对碱基最强的结合能力(最强的和非配对碱基的排斥能力)，将突变的位置设计到引物的末端的一个或两个碱基，从而区别突变和野生。
2、PCR缓冲液和Taq酶：本发明中所用的PCR缓冲液配方加入有利于灵敏度和扩增特异性的试剂成分，并对各组分进行了优化。所用的Taq酶缺少3’-5’外切功能，这样很大程度上保证即使引物错配，也不会有扩增，从而进一步提高特异性，同时所用的Taq酶是属于抗热启动型的酶，可以进一步控制非特异性扩增。
3、PCR循环程序：根据本发明引物的特殊设计，PCR循环采用两个不同的部分。第一个循环部分采用较低的复性温度，针对于短的引物的“中心区域”，既保证引物结合的特异性，同时保证引物和尽量多的突变模板结合，以增加灵敏度。第二个循环部分提高复性温度，以保证在高的特异性下扩增。
本发明基于高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳方法，开发一种高灵敏度检测BRAF 4种基因突变的试剂盒。本试剂盒以FFPE DNA为检测样本，通过检测BRAF基因突变，可以指导临床用药。本发明检测速度快，包括提取步骤在内的整个检测过程仅需150min即可完成，完全可以满足临床快速检测的实际需求。使用本发明的PCR缓冲液，扩增效率、稳定性和特异性大大提高。
本发明的有益效果如下：
本发明采用了特异性荧光引物，可以实现FFPE样本BRAF基因突变的快速检测。
(1)应用高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术对FFPE临床样本进行检测，体系中添加了多对引物，单管测BRAF基因的4种突变，结果明显；
(2)准确率高、成本低、特异性好、对检测样品需求量低、检测通量高、精确度高、操作简单；
(3)检测速度快，整个检测过程仅需要150min即可完成。
附图说明
图1是实施例1阳性对照结果毛细管电泳图。
图2是实施例1阴性对照结果毛细管电泳图。
图3是实施例1空白对照结果毛细管电泳图。
图4是实施例1中第一例临床样本V600E阳性结果毛细管电泳图。
图5是实施例1中第二例临床样本V600E阳性结果毛细管电泳图。
图6是实施例2阳性对照结果毛细管电泳图。
图7是实施例2阴性对照结果毛细管电泳图。
图8是实施例2空白对照结果毛细管电泳图。
图9是实施例2中第一例临床样本V600E阳性结果毛细管电泳图。
图10是实施例2中第二例临床样本V600E阳性结果毛细管电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
本发明用于检测BRAF基因突变的试剂盒组成见表2。
表2用于检测BRAF基因突变的试剂盒组成
Figure BDA0002450240900000051
实施例1
本实施例以基因工程构建的质粒为阳性质粒，以野生型人类基因组DNA作对照。利用本发明高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术检测BRAF基因突变和60例临床样本，并与荧光定量PCR检测进行对照。具体步骤及方法如下：
1.检测样本处理与DNA的提取：
(1)质粒处理与提取：各质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提质粒溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整质粒浓度到不同拷贝数，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)FFPE DNA提取方法：使用切片机对石蜡组织切片进行处理，切片厚度约5-20μm，每例样本所用切片数量约2-10片，将处理好的石蜡切片置于离心管内，之后DNA的提取采用FFPE DNA提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到不同浓度，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
2.构建PCR扩增反应体系见表3。
表3实施例1PCR扩增反应体系
名称 终浓度
PB-600-M1-F1 0.1-0.8μM
PB-600-M2-F1 0.1-0.8μM
PB-600-M3-F1 0.1-0.8μM
PB-600-M4-F1 0.1-0.8μM
PB-600-M-R1 0.1-0.8μM
模板(ng) 50-300ng
3.PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
4.毛细管电泳检测，采用混合PCR产物、变性剂以及片断大小标记物进行检测，检测体系见表4。
表4实施例1毛细管电泳检测体系
名称 体积
HI-DI 7-9μL
Rox350 0.5-2μL
PCR产物 0.5-2μL
Total 10μL
5.使用ABI 3500利用片段分析的方法进行毛细管电泳，根据毛细管电泳峰图1显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
6.在检测的所有60例临床样本中，检测出BRAF V600E突变26例，其中第一例和第二例分别见图4和5，阴性样本34例；每一组同时设置空白对照，结果见图3；阳性对照组见图1，阴性对照组见图2。
实施例2
本实施例以基因工程构建的质粒为阳性质粒，以野生型人类基因组DNA作对照。利用本发明高多重PCR(Highly Multiplexed PCR)和高精度毛细管电泳技术检测BRAF基因突变和60例临床样本。具体步骤及方法如下：
1.检测样本处理与DNA的提取：
(1)质粒处理与提取：各质粒的提取采用质粒提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提质粒溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整质粒浓度到不同拷贝数，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
(2)FFPE DNA提取方法：使用切片机对石蜡组织切片进行处理，切片厚度约5-20μm，每例样本所用切片数量约2-10片，将处理好的石蜡切片置于离心管内，之后DNA的提取采用FFPE DNA提取试剂盒进行提取，具体提取操作步骤按试剂盒说明书操作。所提DNA溶于Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)，经Nanodrop检测提取质量，确定其浓度，然后用Tris-EDTA(10mmol/L，pH 8.0)调整DNA浓度到不同浓度，作为PCR模板，取5μL进行PCR反应扩增。
2.构建PCR扩增反应体系见表5。
表5实施例2PCR扩增反应体系
名称 终浓度
PB-600-M1-F2 0.1-0.8μM
PB-600-M2-F2 0.1-0.8μM
PB-600-M3-F2 0.1-0.8μM
PB-600-M4-F2 0.1-0.8μM
PB-600-M-R2 0.1-0.8μM
模板(ng) 50-300ng
3.PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
4.采用混合PCR产物、变性剂以及片断大小标记物进行检测，检测体系见表6。
表6实施例2毛细管电泳检测体系
名称 体积
HI-DI 7-9μL
Rox350 0.5-2μL
PCR产物 0.5-2μL
Total 10μL
5.使用ABI 3500利用片段分析的方法进行毛细管电泳，根据毛细管电泳峰图6显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
6.在检测的所有60例临床样本中，检测出BRAF V600E突变26例，其中第一例和第二例分别见图9和图10，阴性样本34例；每一组同时设置空白对照，结果见图8；阳性对照组见图6，阴性对照组见图7。
本发明试剂盒检测的所有突变类型信息见表7。采用荧光定量PCR法对这些临床样本进行对比检测，实施例1-2结果表明本发明体系与荧光定量PCR法的符合率达到100％，见表8，进一步证明了本发明体系检测的准确性、快速性、低成本。可见，运用本发明检测FFPE样本BRAF基因突变，与荧光定量PCR法相比，具有相同的准确性，但速度更快、成本更低，可满足BRAF基因突变的快速检测。
表7试剂盒检测的所有突变类型信息
Figure BDA0002450240900000081
表8毛细管电泳法与荧光定量PCR法比较结果
Figure BDA0002450240900000082
注：表8中的检测时间是毛细管检测的时间。
序列表
<110> 天津普瑞赛斯分子诊断技术有限责任公司
<120> 用于检测BRAF基因突变的试剂盒及检测方法
<130> 1
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ccgcattttg gtctagctac cgag 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
ccgcattttg gtctagctac ag 22
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
gcatatcaca ttttggtcta gctacagat 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
gcatatcaca tttcagtcta cctacagat 29
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
cctcatgatc cattgatttt ggtctagcta ccaa 34
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
cctcatgatc aattgatttt ggtctagcag a 31
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 7
cctacataga taaatataaa ttttggtcta gctaccgaa 39
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
cctaaataga tacatataaa ttttggtcta gcagaa 36
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 9
acctatcgaa aatttaatca gtggaaaaat agc 33
<210> 10
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 10
acctatcgaa aatttaatca gtggaaaaac cgc 33

Claims (7)

1.一种用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于包括BRAF反应液、BRAF阳性对照和BRAF阴性对照，BRAF反应液由引物和PCR缓冲液组成，BRAF阳性对照为质粒DNA，BRAF阴性对照为野生型人类基因组DNA；
引物由PB-600-M1-F、PB-600-M2-F、PB-600-M3-F、PB-600-M4-F和PB-600-M-R组成；
PB-600-M1-F为PB-600-M1-F1或PB-600-M1-F2，
PB-600-M2-F为PB-600-M2-F1或PB-600-M2-F2，
PB-600-M3-F为PB-600-M3-F1或PB-600-M3-F2，
PB-600-M4-F为PB-600-M4-F1或PB-600-M4-F2，
PB-600-M-R为PB-600-M-R1或PB-600-M-R2；
PB-600-M1-F1、PB-600-M1-F2、PB-600-M2-F1、PB-600-M2-F2、PB-600-M3-F1、PB-600-M3-F2、PB-600-M4-F1、PB-600-M4-F2、PB-600-M-R1和PB-600-M-R2依次为SEQ ID NO.01～10所示的序列。
2.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于所述的引物由PB-600-M1-F1、PB-600-M2-F1、PB-600-M3-F1、PB-600-M4-F1和PB-600-M-R1组成。
3.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于所述的引物由PB-600-M1-F2、PB-600-M2-F2、PB-600-M3-F2、PB-600-M4-F2和PB-600-M-R2组成。
4.根据权利要求1所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒，其特征在于所述的PCR缓冲液组成如下：
Figure FDA0002450240890000011
Figure FDA0002450240890000021
5.一种采用权利要求1-4任一所述的用于检测BRAF基因突变的试剂盒的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)提取FFPE样本人类基因组DNA；
(2)采用用于检测BRAF基因突变的试剂盒中的BRAF反应液构建PCR扩增反应体系进行PCR反应；
(3)对PCR产物进行毛细管电泳；
(4)根据毛细管电泳峰图显示的扩增产物的片段大小、荧光标记颜色、峰值高低判断检测结果。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR扩增反应体系如下：
Figure FDA0002450240890000022
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于步骤(2)中所述的PCR反应条件：95℃预变性3分钟，1个循环；94℃变性5秒，51℃退火10秒，68℃延伸20秒，2个循环；94℃变性5秒，57℃退火10秒，72℃延伸20秒，40个循环；72℃延伸10分钟，1个循环。
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