CN109234369A - 一种检测人braf基因突变的pcr试剂盒 - Google Patents

一种检测人braf基因突变的pcr试剂盒 Download PDF

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包文静
高伙妮
金安娜
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明涉及基因突变检测技术领域，具体是一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其技术要点是：包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针。该检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒采用等位基因特异性扩增定量PCR技术，对BRAF基因V600E和V600K突变进行定性检测，从而辅助结直肠癌、甲状腺癌和黑色素瘤临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度。

Description

一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，具体是一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒。
背景技术
BRAF基因是人类最重要的原癌基因之一,位于人染色体7q34,由18个外显子组成,编码蛋白约94kDa。BRAF能够活化丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路,该通路将细胞外的各种生长因子、细胞因子及激素的改变信息传递到细胞核,通过配体与酪氨酸激酶受体表面相结合形成二聚体和酪氨酸残基自磷酸化。BRAF突变直接导致丝裂原活化的细胞外信号调节蛋白激酶(MEK)活化并继续活化ERK,致使MAPK通路激活,进而导致细胞周期和循环失控,促进肿瘤的发生。
BRAF是黑色素瘤最常见的突变基因,突变发生率为40％-60％,V600E(1799T>A)突变是主要的BRAF突变类型。另一种此位置的突变类型是V600K(1798G>A),较少发生,但发生V600K突变的黑色素瘤患者较V600E突变的患者更易发生肺和脑转移,并且生存率更低,提示V600E突变影响蛋白表达。BRAF突变和黑色素瘤的发病部位及病理分型有一定关系,浅表扩散型突变率为63.2％,结节性黑色素瘤为50.4％,恶性雀斑样黑色素瘤和肢端雀斑样黑色素瘤突变率较少,分别为20％和11％。随着FDA批准BRAF突变抑制剂威罗菲尼应用,对于那些不能切除的或者转移的黑色素瘤进行靶向治疗的尝试,已取得了良好的效果。
根据组织发生和形态结构甲状腺癌可分为乳头状甲状腺癌(papillary thyroidcarcinoma,PTC)、滤泡型癌、髓样癌、未分化癌、转移癌。其中,乳头状甲状腺癌是最常见的甲状腺癌的类型,约占甲状腺癌的50％。BRAF基因发生在甲状腺癌的突变位点几乎都是V600E突变,突变率为40％～68％。BRAF突变在儿童PTC的发生率明显较低,约31％。研究发现,BRAF基因突变和乳头状癌病理类型明显相关,而在滤泡型癌、髓样癌和良性甲状腺增生中均未见突变。BRAF V600E突变还和肿瘤不良的病理生物行为有关,Xing等发现V600E突变与肿瘤的复发密切相关并和甲状腺包膜外侵袭、肿瘤多中心型、肿瘤III和IV分期、肿瘤包膜缺如相关。Finkelstein等提出,BRAF突变和PTC的典型肿瘤细胞核特征、浸润性生长、包膜不完整或缺如、淋巴结转移、复发等相关,推测V600E突变后使得BRAF活性增加,促进细胞增殖从而引发肿瘤,这可能是PTC发生的一个重要分子机制。基于以上研究,BRAF突变已被认为可以作为PTC预后评估的一个独立指标,更多临床应用研究的展开也为PTC患者的治疗及综合方案的制定提供明确依据。
直肠结肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的恶性肿瘤。研究表明,CRC发生与多种基因突变密切相关,其中包括KRAS、BRAF、MEK、ERK。以上基因均参与细胞增殖、分化、凋亡以及血管形成等过程的调节。有50％左右的CRC患者表现为BRAF和KRAS基因突变,这些突变病例采用外科治疗存在一定困难,所以倾向于选择基因靶向治疗。BRAF V600E突变更易发生在具有不稳定的微小卫星肿瘤病例中。存在错配基因参与的林奇(Lynch)综合征的患者并没有发生BRAF突变,所以通过临床BRAF突变的检测可筛选出那些属于真正林奇综合征相关直肠结肠癌患者。还有研究发现,BRAF突变和因癌致死的高风险联系在一起,约有超过半数的BRAF突变阳性标本呈现不良的癌分化,伴淋巴结转移和神经侵犯。在CRC肝转移的患者中,BRAF突变往往提示不良预后,所以,部分学者考虑将BRAF作为肿瘤分子标志物对CRC预后进行分级评估。
由于BRAF基因突变在以上疾病诊疗中的重要作用，目前对于BRAF基因突变状态的检测已成为辅助肿瘤诊断和治疗的重要手段之一。临床上基因突变检测的金标准是Sanger测序法，此方法的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低。经过几十年的临床应用，已经得到广大医务人员的认可，但该技术检测灵敏度较不高，且检测周期较长。随着荧光定量PCR技术的发展，越来越多的相关基因检测产品被推上市场，相比Sanger测序法，荧光PCR技术仅需2小时即可得到检测结果，分辨率可低至1％，具有明显的优势。鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针；BRAF V600E反应液和BRAFV600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针，所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示。
作为本发明再进一步的方案：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中还包括用于对样本质量进行质控的内参引物和探针，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB基因。
作为本发明再进一步的方案：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于扩增ACTB基因的引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7-9所示。
作为本发明再进一步的方案：所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中包含的引物含量的浓度为：100μmol/L的引物各0.06μL，浓度为100μmol/L的探针各0.04μL。
作为本发明再进一步的方案：所述核酸扩增试剂还包括BRAF PCR MIX，BRAF PCRMIX中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶；该MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
作为本发明再进一步的方案：所述检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照，其中，阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株DNA混合物。
作为本发明再进一步的方案：所述突变质粒包含的BRAF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)该检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒采用等位基因特异性扩增定量PCR技术，对BRAF基因V600E和V600K突变进行定性检测，从而辅助结直肠癌、甲状腺癌和黑色素瘤临床诊断并指导相关患者进行治疗和检测，具有高特异性、准确性和高灵敏度。
(2)该检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒采用的ARMS-PCR技术，利用TaqMan DNA聚合酶缺少3’→5’外切酶活性，PCR引物的3’末端的错配会导致产物的急剧减少，通过设计特异性引物，使其扩增受野生型模板阻滞，从而达到检测突变型的目的。使用本发明设计的引物探针通过ARMS荧光定量PCR方法可以对肿瘤组织中低至0.1％丰度的突变进行检测。
附图说明
图1为检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒的ARMS-PCR方法检测原理图。
图2为检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒对V600E位点不同突变型和野生型模板检测结果。
图3为检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒对V600K位点不同突变型和野生型模板检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
请参阅图1-3，一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液，BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针；所述BRAFV600E反应液和BRAF V600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针。所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中的引物探针序列及修饰如下：
V600E反应液中的上游引物(序列表中序列1)：5’-GATTTTGGTCTAGCTACAGA-3’
V600E反应液中的下游引物(序列表中序列2)：5’-CACAAAATGGATCCAGAC-3’
V600E反应液中的荧光探针(序列表中序列3)：5’-FAM-GAAATCTCGATGGAGTGGGTCC-TAMRA-3’
V600K反应液中的上游引物(序列表中序列4)：5’-GATTTTGGTCTAGCTATAAA-3’
V600K反应液中的下游引物(序列表中序列5)：5’-CACAAAATGGATCCAGAC-3’
V600K反应液中的荧光探针(序列表中序列6)：5’-FAM-GAAATCTCGATGGAGTGGGTCC-TAMRA-3’
上述两种反应液中除了分别用于检测突变位点的引物和探针以外，还包括用于对样本质量进行质控的内参引物和探针。内参基因为基因组保守区选择的一段基因序列，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB基因，用于扩增ACTB基因的引物探针序列及修饰如下：
ACTB基因的上游引物(序列表中序列7)：5’-ATGGGTCAGAAGGATTCCT-3’
ACTB基因的下游引物(序列表中序列8)：5’-AGATTTTCTCCATGTCGT-3’
ACTB基因的荧光探针(序列表中序列9)：5’-VIC-TGGGCGACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG-TAMRA-3’
上述反应液中包含的引物含量的浓度为：100μmol/L的引物各0.06μL，浓度为100μmol/L的探针各0.04μL。
核酸扩增试剂还包括BRAF PCR MIX，BRAF PCR MIX中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶。该MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
本试剂盒所检测样本为结直肠癌、甲状腺癌及黑色素瘤石蜡包埋组织样本，通过核酸提取试剂纯化组织样本中的DNA，再取总量50ng的DNA进入反应体系进行检测。
所述检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒中还包括阳性对照和阴性对照。其中阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株DNA混合物。突变质粒包含的BRAF基因片段序列如下：
BRAF V600E(序列表中序列10)：
TATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTA；
BRAF V600K(序列表中序列11)：
TATAGAAATTAGATCTCTTACCTAAACTCTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGAAAATGAGATCTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAAAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGTAAGAATTGAGGCTATTTTTCCACTGATTAAATTTTTGGCCCTGAGATGCTGCTGAGTTACTAGAAAGTCATTGAAGGTCTCAACTA。
上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
序列表
<110> 申请人名称
<120> 一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
gattttggtc tagctacaga 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
cacaaaatgg atccagac 18
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
amgaaatctc gatggagtgg gtcctamra 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gattttggtc tagctataaa 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 5
cacaaaatgg atccagac 18
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 6
amgaaatctc gatggagtgg gtcctamra 29
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 7
atgggtcaga aggattcct 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 8
agattttctc catgtcgt 18
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 9
vctgggcgac gaggcccaga gcaagagagg tamra 35
<210> 10
<211> 300
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 10
tatagaaatt agatctctta cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag 60
atctactgtt ttcctttact tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag 120
taaaaatagg tgattttggt ctagctacag agaaatctcg atggagtggg tcccatcagt 180
ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga 240
ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta 300
<210> 11
<211> 300
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 11
tatagaaatt agatctctta cctaaactct tcataatgct tgctctgata ggaaaatgag 60
atctactgtt ttcctttact tactacacct cagatatatt tcttcatgaa gacctcacag 120
taaaaatagg tgattttggt ctagctacaa agaaatctcg atggagtggg tcccatcagt 180
ttgaacagtt gtctggatcc attttgtgga tggtaagaat tgaggctatt tttccactga 240
ttaaattttt ggccctgaga tgctgctgag ttactagaaa gtcattgaag gtctcaacta 300

Claims (7)

1.一种检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中分别含有用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针；BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中均包含一对上游引物和下游引物，以及TaqMan荧光探针，所述BRAF V600E反应液和BRAF V600K反应液中用于检测BRAF V600E和V600K突变的特异性引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-6所示。
2.根据权利要求1所述的检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述BRAFV600E反应液和BRAF V600K反应液还包括用于对样本质量进行质控的内参引物和探针，本试剂盒中选择的内参引物为ACTB基因。
3.根据权利要求1或2所述的检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述BRAFV600E反应液和BRAF V600K反应液中用于扩增ACTB基因的引物和探针的核苷酸序列如SEQID NO：7-9所示。
4.根据权利要求3所述的检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述BRAFV600E反应液和BRAF V600K反应液中包含的引物含量的浓度为：100μmol/L的引物各0.06μL，浓度为100μmol/L的探针各0.04μL。
5.根据权利要求1所述的检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂还包括BRAF PCR MIX，BRAF PCR MIX中包括dNTP、KCl、Tris-HCl、MgCl2和Taq酶；该MIX为2×工作液，配制时加入体积为总体系量的一半。
6.根据权利要求1所述的检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，其中，阴性对照为工艺用水，阳性对照为突变质粒和野生型细胞株DNA混合物。
7.根据权利要求6所述的检测人BRAF基因突变的PCR试剂盒，其特征在于，所述突变质粒包含的BRAF基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。
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