CN106755551A - 一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用 - Google Patents

一种egfr/l858r突变液体活检试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种EGFR基因L858R突变液体活检定量检测试剂盒及其应用。所述的EGFR基因L858R突变液体活检定量检测试剂盒，其特征在于，包含EGFR基因上游引物，EGFR突变型基因下游富集引物（野生型阻滞引物），EGFR野生型基因下游富集引物（突变型阻滞引物），qPCR反应体系试剂，突变型与野生型EGFR阳性质粒。本发明可用于肿瘤病人微创液体活检的突变型目的基因的相对定量，在肿瘤早期筛查、辅助诊断、复发监测及疗效评估上发挥重要的临床作用。此外，由于本发明不涉及探针的使用，试剂盒成本低廉，可大规模推广，降低液体活检费用。

Description

一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR) 是位于人类7号染色体短臂上原癌基因C-erbB-1（HER-1）的表达产物，是表皮生长因子受体家族（HER）中的4个成员之一，由188307个碱基组成，包括28个外显子，其酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。EGFR信号转导异常时会导致多种肿瘤的发生，如结直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌等。
EGFR基因编码区的突变主要发生在外显子18～21上。已经报道的EGFR基因突变类型大约有60种，其中29种突变最为常见，包括19种19（外显子编号） Del、3种20 Ins及21L858R、21 L861Q、20 T790M、20 S768I、18 G719A、18 G719S和18 G719C，它们约占EGFR基因突变类型的99%，其中21 L858R和21 L861Q约占40%～60%，19 Del约占45%，18 G719X约占5%， 20 Ins约占1%，耐药性位点20 T790M约占5%。
对于EGFR基因突变引起的肺癌，目前最常规的药物治疗是采用酪氨酸激酶抑制剂（TKI），主要代表为吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）两种药物，但是EGFR的L858R突变会改变细胞对TKI制剂的敏感性，也就是含L858R突变的肿瘤细胞会对TKI制剂产生抗性。为使患者尽可能地从最有效的治疗中受益，只要条件许可，所有EGFR基因引起的非小细胞肺癌患者和含腺癌成分的其他类型肺癌患者都应当尝试进行L858R突变检测。
北京协和医院一项研究发现，在对100个EGFR引起的非小细胞肺癌样品的基因检测中， L858R突变占43.9%。然而在临床应用中，约10%～15%的晚期非小细胞肺癌患者由于肿瘤组织不足或无法获取肿瘤组织而未进行分子检测。一些前瞻性研究表明，与肿瘤组织相比，血液循环肿瘤DNA（ctDNA）中EGFR突变检测同样具有较高的特异性，但是敏感度有待提高。基于此，我们开发了一种新的L858R突变液体活检试剂盒，检测下限可以达到0.4拷贝/μl，该试剂盒可在EGFR-TKIs治疗过程中连续、定量监测L858R ctDNA，利于患者尽可能从EGFR-TKI的治疗中受益。
发明内容
本发明的目的：提供一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒，灵敏度极高，对照阳性质粒的检测下限可以达到0.4拷贝/μl；利用试剂盒的富集扩增与定量方法可以估计血液样本中突变型基因占野生型基因拷贝数的比值；此外，试剂盒检测方法只涉及到染料法qPCR，不涉及探针的合成与修饰，检测费用低，有利于节省广大患者的基因检测费用。
本发明提供的EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的引物包括：
包含EGFR基因上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；
EGFR突变型基因下游富集引物（野生型阻滞引物）：核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；
EGFR野生型基因下游富集引物（突变型阻滞引物）：核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。
优选的技术方案是：上述EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的富集引物末端核苷酸经过调整，其中3’端第二位碱基与EGFR序列没有互补。EGFR基因上游引物和EGFR突变型基因下游富集引物可以特异扩增含L858R突变的58 bp的核酸片段，由于下游引物3’端连续两个碱基都与野生型模板不匹配，野生型EGFR不能够产生荧光信号。同样EGFR基因上游引物和EGFR野生型基因下游富集引物可以特异扩增野生型EGFR 58 bp的核酸片段，但是L858R突变型模板不能够产生荧光信号。
上述试剂盒中还包括EGFR基因L858R突变型和野生型的基因组片段阳性对照质粒。
本发明提供了一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1：针对突变位点设计合成目的基因上游引物，突变型基因下游富集引物（野生型阻滞引物），野生型基因下游富集引物（突变型阻滞引物）；
步骤2：样本处理与DNA的提取；
步骤3：qPCR扩增方法与定量。
在所述的步骤1中，EGFR的突变点为rs121434568（NCBI SNP数据库），两侧序列为：CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[G/T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAG，其中野生型为T，突变型为G，突变后氨基酸L [Leu] 转变为R [Arg]，形成错意突变。以该突变位置附近前后250bp为模板序列，设计上游引物，突变型基因下游富集引物和野生型基因下游富集引物。
在所述的步骤2中，取1 ml全血，2000 rpm离心 10 min，将上清移至新的离心管中；重复离心，将剩余上清转入离心管后，加入介孔纳米磁珠 50 μl；用NaCl调节 Na+ 浓度至0. 4 mol / L，漩涡震荡1 min；室温吸附 10 min ；将离心管轻微漩涡震荡5 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸弃液体；用洗涤液 300 μl（0. 4 mol / L NaCl）重复上述步骤2次；开盖干燥 10 min，加入去离子水 100 μl，漩涡震荡混匀，65℃ 水浴 10 min；将离心管漩涡震荡10 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸取液体备用。
在所述的步骤3中，qPCR扩增反应体系包括：
反应1：1μl EGFR基因上游引物（浓度5-10 μM ），1μl EGFR突变型基因下游富集引物（浓度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl。反应2：1μl EGFR基因上游引物（浓度5-10 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（浓度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl。
qPCR 程序设置为：94℃ 2 min; 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec, 35-50 cycles; 72℃ 1min; 4℃ ∞。
在所述的步骤3中的定量计算方法，相对值RQ=(1+Ex)-ΔCt, 其中ΔCt=Ctmut.-Ctwt, 在本试剂盒中，扩增效率Ex=97%，Ctmut为PCR反应1的Ct值，Ctwt为PCR反应2的Ct值。
本发明相对于现有技术具有如下的优点与效果：本发明的下游富集引物可以特异的扩增含单个碱基不同的目的基因；富集引物在富集扩增中可以阻滞非目的基因的扩增；在测定突变型的Ct值与野生型的Ct值后，可以快速判断突变型基因占野生型基因拷贝数的比值；由于不涉及到探针的使用，试剂盒操作简单，检测价廉，可以大规模推广；试剂盒检测速度快，检测过程只需要2.5小时完成。
附图说明
图1是本发明EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的引物设计策略。其中F-primer指EGFR基因上游引物，M-primer指EGFR突变型基因下游富集引物（野生型阻滞引物），W-primer指EGFR野生型基因下游富集引物（突变型阻滞引物），N表示碱基。
图2是本试剂盒对L858R突变型和野生型质粒的qPCR检测图。
图3是本试剂盒对L858R突变型和野生型质粒的qPCR产物的熔点分析图。
图4是本试剂盒对L858R突变型质粒的qPCR灵敏度检测，其中1×101，1×102，1×103，1×104，1×105表示25 μl PCR体系中的质粒拷贝数。
图5是本试剂盒对L858R野生型质粒的qPCR灵敏度检测，其中1×101，1×102，1×103，1×104，1×105表示25 μl PCR体系中的质粒拷贝数。
图6是本试剂盒对L858R突变型质粒不同梯度浓度qPCR后，用Ct值与不同梯度拷贝数的对数值拟合计算的标准曲线。
图7是本试剂盒对L858R野生型质粒不同梯度浓度qPCR后，用Ct值与不同梯度拷贝数的对数值拟合计算的标准曲线。
图8是本试剂盒对临床样本循环肿瘤DNA EGFR基因L858R突变型定量检测的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体应用要求的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
主要材料和仪器：ABI7500荧光定量PCR仪；热启动taq酶（Taq hot Startversion，Takala公司）；Oligo 7 引物分析软件；介孔纳米磁珠（珠海乔治生物技术有限公司），磁力架。
实施例1用于EGFR基因 L858R突变检测的引物设计及其特异性和敏感性验证。
1、查询目的基因序列：EGFR的 L858R 突变型在NCBI SNP数据库中的识别号为：rs121434568（CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[G/T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAG），其中野生型为T，突变型为G，突变后氨基酸L [Leu] 转变为R [Arg]，形成错意突变。
2、设计qPCR引物：参考图1的qPCR设计原理，用oligo7分子软件设计上游引物TGAAAACACCGCAGCATGTCA；下游L858R突变型富集扩增引物：GCACCCAGCAGTTTGGCTC；下游L858R野生型富集扩增引物：GCACCCAGCAGTTTGGCGA。由于下游引物3’端第二个碱基与模板非互补关系，只有3’端第一个碱基与模板互补的引物才能产生扩增产物。
3、PCR 扩增体系为2种，反应1：1μl EGFR基因上游引物（浓度5-10 μM ），1μl EGFR突变型基因下游富集引物（浓度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl。反应2：1μl EGFR基因上游引物（浓度5-10 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（浓度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl。
4、qPCR 程序设置为：94℃ 2 min; 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec,35-50 cycles; 72℃ 1min; 4℃∞。约2×103拷贝数的L858R突变型与L858R野生型质粒1∶1混合后作为模板。qPCR检测结果见图2。qPCR扩增产物连接T载体后，测序验证，验证结果与qPCR设计一致。
5、熔解曲线分析：经过 95℃预变性15 sec，升温速率为0.5℃/步，在65℃到95℃温度范围内采集SYBR荧光。实验结果见图3，两种反应体系的溶解曲线均呈现单峰，且出锋位置与退火温度一致，表明实验结果特异且有效。
6、扩增效率估计：末端经过改造的引物在PCR过程中，其扩增效率Ex会发生改变。用L858R突变型与L858R野生型阳性质粒稀释不同浓度（1×101，1×102，1×103，1×104，1×105）做qPCR后（图4，图5），发现能够检测到的最低质粒拷贝数的质粒量为0.4拷贝/ μl，用Ct值与各个梯度拷贝数的对数值拟合作图得出的标准曲线（如图6，图7），其中L858R突变型回归方程为y = -3.069x + 32.033，R²= 0.9986， L858R野生型
y = -3.403x + 32.985，R²= 0.9994，因此估计扩增效率E=10-1/斜率，Ex=（E-1）×100%，其中L858R突变型E值为2.11，而L858R野生型的E值为：1.97。考虑到质粒与实际标本扩增效率并不一致，因此估计本试剂盒的扩增效率Ex为97%。
实施例2用于EGFR/L858R突变液体活检试剂盒对临床样本的检测。
1、提取DNA：取1 ml全血，2000 rpm离心 10 min，将上清移至新的离心管中；重复离心，将剩余上清转入离心管后，加入介孔纳米磁珠 50 μl；用NaCl调节 Na+ 浓度至0. 4mol / L，漩涡震荡1 min；室温吸附 10 min ；将离心管轻微漩涡震荡5 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸弃液体；用洗涤液 300 μl（0. 4 mol / L NaCl）重复上述步骤2次；开盖干燥 10 min，加入去离子水 100 μl，漩涡震荡混匀，65℃ 水浴 10 min；将离心管漩涡震荡10 sec，立即置于磁力吸附架上，静置 5 sec，吸取液体-20℃保存备用。
2、PCR 扩增体系为2种，反应1：1μl EGFR基因上游引物（浓度5 μM ），1μl EGFR突变型基因下游富集引物（浓度5 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)；dNTP 0.5 mM；MgCl2 3 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl。反应2：1μl EGFR基因上游引物（浓度5 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（浓度5 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green(含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 3 mM，模板DNA 5 μl，总反应体系25 μl。
3、qPCR 程序设置为：94℃ 2 min; 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec,50 cycles; 72℃ 1min; 4℃ ∞。约2×103拷贝数的L858R突变型与L858R野生型质粒1∶1混合后作为模板。qPCR检测结果见图2。qPCR扩增产物连接T载体后，测序验证，验证结果与qPCR设计一致。
4、L858R突变型相对定量：对血液样本的DNA做qPCR结果如图8，突变型对野生型基因的相对值RQ=(1+Ex)-ΔCt, 其中ΔCt=Ctmut.- Ctwt, 在本试剂盒中扩增效率Ex=97%，其中Ctmut为PCR反应1的Ct值，Ctwt为PCR反应2的Ct值。在测试临床样本时，L858R野生型Ct值为23.8，L858R突变型Ct值为32.1，根据简要计算公式，突变型占野生型的比值为0.360%。
5、熔解曲线分析判断扩增特异性：经过 95℃预变性15 sec，升温速率为0.5℃/步，在65℃到95℃温度范围内采集SYBR荧光（参考图3）。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法与其核心思想，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈超 孙青 唐玉玲 孙塬 覃晓云 宋燕燕 李志鹏
<120> 一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒及其应用
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgaaaacacc gcagcatgtc a 21
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcacccagca gtttggctc 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcacccagca gtttggcga 19

Claims (6)

1.一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒，其特征在于，包含EGFR基因上游引物，EGFR突变型基因下游富集引物（野生型阻滞引物），EGFR野生型基因下游富集引物（突变型阻滞引物），qPCR反应体系试剂，突变型与野生型EGFR基因的阳性质粒。
2.一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的使用方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤1：针对突变位点设计合成EGFR基因上游引物，突变型基因下游富集引物（野生型阻滞引物），野生型基因下游富集引物（突变型阻滞引物）；
步骤2：样本处理与DNA提取；
步骤3：qPCR扩增方法与定量。
3.根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的使用方法，其特征在于：在所述的步骤3中qPCR中的DNA样本适用于病人血浆中的循环肿瘤DNA，石蜡切片组织或胸水来源的肿瘤DNA。
4.根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的使用方法，其特征在于：在所述的步骤3中qPCR扩增反应体系包括反应1：1μl EGFR基因上游引物（浓度5-10 μM），1μl EGFR突变型基因下游富集引物（浓度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl（1 ng），总反应体系25 μl。
5.据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的使用方法，其特征在于：在所述的步骤3中qPCR扩增反应体系包括反应2：1μl EGFR基因上游引物（浓度5-10 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（浓度5-10 μM ）；12.5 μl 2× SYBR Green (含热启动Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl2 2-5 mM，模板DNA 5 μl（1 ng），总反应体系25 μl。
6.根据权利要求2所述的一种EGFR/L858R突变液体活检试剂盒的使用方法，其特征在于：在所述的步骤3中的定量计算方法，突变型对野生型基因的相对值RQ=(1+Ex)-ΔCt, 其中ΔCt=Ctmut.-Ctwt, 在本试剂盒中扩增效率Ex=97%，Ctmut为PCR反应1的Ct值，Ctwt为PCR反应2的Ct值。
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