CN104531893A - 一种检测egfr基因突变的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测EGFR基因突变的试剂盒及其应用。发明针对EGFR基因的不同突变设计特异性引物并进行相关修饰，以样本DNA为模板，结合实时荧光定量PCR，通过扩增曲线和溶解曲线判断相关突变是否存在。本发明提供的试剂盒及对突变位点的检测方法具有较高的灵敏度和特异性，可以检测微量的突变，具有很好的临床应用价值。

Description

一种检测EGFR基因突变的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因检测领域，涉及医学诊断和生物技术，具体涉及一种检测EGFR基因突变的试剂盒及其应用。
背景技术
表皮生长因子受体家族(EGFR)属于酪氨酸激酶受体家族，其介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变，这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关。因此，EGFR基因突变的检测对癌症的个体化治疗具有重要的参考价值。
EGFR家族由四个成员组成，分别是erbB1(EGFR/HER1)，erbB2(neu/HER2)，erbB3(HER3)，erbB4(HER4)。EGFR家族成员结构相似，包括胞外区、跨膜区、胞内区三部分。正常情况下，EGFR胞外区与相应配体结合，受体二聚化，形成同源二聚体或与其他家族成员形成异源二聚体。受体二聚化后构象发生改变与ATP分子结合，激活胞内的酪氨酸激酶活性，导致自身磷酸化，启动下游信号转导通路。EGFR的主要信号转导途径有：RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路，PI3K-PDK通路，PLC-γ通路，JAK-STAT通路(Cao C,Lu S,Sowa A,et al.Primingwith EGFR tyrosine kinase inhibitor and EGF sensitizes ovarian cancer cells torespond to chemotherapeutical drugs[J].Cancer Letters.266(2):249-262)。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
EGFR基因位于第七号染色体短臂上(7p12)，长约118kb，由28个外显子组成。其转录形成的mRNA长约5.6kb，编码的EGFR是分子量为170kD的跨膜糖蛋白，编码蛋白由1186个氨基酸组成，具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TK)活性，是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白。
EGFR酪氨酸激酶功能区由外显子18-24编码。其中外显子18-20编码N-lobe，外显子21-24编码C-lobe。EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上(18-21)，目前发现的TK区域突变有30多种(Sharma S V,Bell D W,SettlemanJ,et a1.Epidermal growthfactor receptor mutations in lung cancer[J].Nat Rev Cancer.7(3):169-181)。突变类型主要有三种：缺失突变、点突变、复制或插入突变。缺失突变主要发生在外显子19上，最常见的是delE746-A750，点突变最常见的是发生在外显子21上的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。其中外显子19的缺失突变(del E746-A750)和外显子21上的点突变(L858R)又叫经典突变或热点突变，约占突变的90％。具体阐述如下：
1.外显子19碱基缺失。主要是第746-752位密码子的碱基缺失突变，导致EGFR蛋白中氨基酸(ELREATS)序列丢失，这一缺失改变了受体ATP结合囊(ATP-binding pocket，ABP)的角度，从而显著增强癌细胞对Gefitinib的敏感性(Sordella R,Bell DW,Haber DA,Settleman J.Gefitinib-sensitizing EGFRmutations in lung cancer activate anti-apoptotic pathways.Science.305(5687):1163-7；Kosaka T,Yatabe Y,Endoh H,Kuwano H,Takahashi T,Mitsudomi T.Mutations ofthe epidermal growth factor receptor gene in lung cancer:biological and clinicalimplications.Cancer Res.64(24):8919-23)。
2.外显子21的点突变。主要是第858位密码子出现T→G转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由亮氨酸转变为精氨酸(简称L858R),此突变位于DFG序列附近,其作用是使A-loop的稳定性提高,癌细胞对Gefitinib和Erlotinib的敏感性明显增强。
3.外显子20的点突变或碱基插入突变。点突变主要是第790位密码子出现C→T转换，引起EGFR蛋白中该位点的氨基酸由苏氨酸转变为甲硫氨酸(T790M)，这一突变仅见于药物治疗后复发者，突变使得癌细胞对Gefitinib和Erlotinib产生抗性(Pao W,Wang TY,Riely GJ,Miller VA,Pan Q,Ladanyi M,Zakowski MF,Heelan RT,Kris MG,Varmus HE.KRAS mutations and primaryresistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib.PLoS Med.2(1):e17)。
目前，EGFR基因突变检测的金标准是组织DNA样本的直接测序。该方法由Lynch(Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,Gurubhagavatula S,Okimoto RA,Brannigan BW,Harris PL,Haserlat SM,Supko JG,Haluska FG,Louis DN,ChristianiDC,Settleman J,Haber DA.Activating mutations in the epidermal growth factorreceptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.N EnglJ Med.350(21):2129-39)和Paez(Paez JG,PA,Lee JC,Tracy S,Greulich H,Gabriel S,Herman P,Kaye FJ,Lindeman N,Boggon TJ,Naoki K,Sasaki H,Fujii Y,Eck MJ,Sellers WR,Johnson BE,Meyerson M.EGFR mutations in lung cancer:correlation with clinical response to gefitinib therapy.Science.304(5676):1497-500)率先报道，其优点是可以确切了解EGFR基因突变的范围及类型，并且基因突变与Gefitinib临床疗效的关系已得到肯定。但是测序法操作复杂，费用昂贵，灵敏度不高，因此难以在临床上广泛开展。此外，有些方法如荧光实时聚合酶链式反应、高效液相色谱和毛细管电泳等，需要特殊的仪器设备，因而仍然不能在临床上进行大范围推广。聚合酶链式反应一单链构象多态性分析，尽管只能做定性的分析，但通过条件优化，临床上可以作为一种初筛突变的方法。总之，临床上亟待一种简便、快速、准确和经济的肺癌EGFR基因突变检测方法的出现，为肺癌个体化治疗服务。
本方法通过特异性设计PCR引物结合相关修饰，建立一种检测EGFR基因突变的方法。发明涉及的检测试剂盒可以通过有无PCR扩增来确定样品中有无EGFR基因突变。该方法和DNA测序、高效液相色谱和毛细管电泳等相比，有快速、准确、方法简单、成本低的优点，有利用临床使用和推广。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有高特异性和灵敏度的检测EGFR基因突变的引物、试剂盒及其应用。以基因组DNA、肿瘤组织DNA以及血中游离DNA为检测对象，结合普通PCR技术或实时荧光定量PCR技术，通过有无PCR扩增来确定样品中有无EGFR基因突变，可对EGFR基因的突变进行快速检测。
本发明的目的在于提供一套检测EGFR基因突变的引物组合，优选的，所述引物组合针对EGFR基因del E746-A750突变和/或EGFR基因del L747-S752突变。更优选的，所述针对EGFR基因del E746-A750突变的引物组合为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9，针对EGFR基因del L747-S752突变的引物组合物为SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24，并且SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：22的3’末端碱基进行磷酸化修饰。
本发明的目的在于提供一种包括上述引物组合的检测试剂盒。所述检测试剂盒为普通PCR检测试剂盒或荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒采用探针法或染料法或分子信标法。所述的荧光定量PCR检测试剂盒可采用市售的Taqman探针荧光定量PCR检测试剂盒、SYBR染料荧光定量PCR检测试剂盒、分子信标法荧光定量PCR检测试剂盒。所述的普通PCR试剂盒可采用市售的含PCR mix的检测试剂盒。
进一步，所述检测试剂盒组分包含下列组分中的一种或几种：聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、阴性对照、阳性对照、探针。所述PCR反应缓冲液可以加入一些PCR促进剂，如稳定酶活性的明胶、BSA、DTT、甘油、Triton X-100等，或降低解链温度、提供反应特异性的DMSO、甲酰胺、TMAC、甜菜碱等。
本发明的目的在于提供一种检测EGFR基因突变的方法，包括，1)加样：向离心管中加入待测样品、权利要求1所述的引物组合及PCR反应所需试剂；2)扩增：PCR反应条件为：90-95℃预变性10S-10min；90-95℃变性5S-3min，55-65℃退火5S-3min，72℃延伸5S-3min，共25-40个循环；最后72℃1-30min；3)检测。
优选的，检测EGFR基因del E746-A750突变的最佳反应体系为：每25μLPCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，57℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。检测EGFR基因del L747-S752突变的最佳反应体系为：每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix，三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，60℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
本发明的目的还在于提供上述引物组合及上述检测试剂盒在制备检测EGFR基因突变试剂中的应用。其对临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，监测肿瘤的预后具有很好的实际应用价值。
附图说明
图1检测系统对EGFR基因del E746-A750突变型的普通PCR检测
1，2泳道以EGFR基因delE746-A750突变型重组质粒为模板；3，4泳道以EGFR基因野生型重组质粒为模板
图2EGFR基因del E746-A750突变检测系统灵敏度的测定
图3检测系统对EGFR基因del E746-A750突变型的荧光定量PCR检测A为分别以107-10拷贝数的EGFR基因野生型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线；B为分别以107-10拷贝数的delE746-A750突变型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线
图4检测系统对EGFR基因del L747-S752突变型的普通PCR检测1，2泳道以EGFR基因del L747-S752突变型重组质粒为模板；3，4泳道以EGFR基因野生型重组质粒为模板
图5EGFR基因del L747-S752突变检测系统灵敏度的测定
图6检测系统对EGFR基因del L747-S752突变型的荧光定量PCR检测A为分别以107-10拷贝数的EGFR基因野生型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线；B为分别以107-10拷贝数的del L747-S752突变型重组质粒为模板进行荧光定量PCR的扩增曲线
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1
实施例一人工构建EGFR基因野生型、del E746-A750突变型、delL747-S752突变型重组质粒
实验步骤如下：
(1)于临床收集已明确EGFR基因野生型、del E746-A750、delL747-S752突变型的病人血样，提取基因组DNA，人工设计特异性引物(两端分别带有SalⅠ、XbaⅠ酶切位点)，具体序列如下：
SEQ ID NO：34Sense-1：AGGTCGACGGACTCTGGATCCCA
SEQ ID NO：35Reverse-2：TCTCTAGACCAGCATGGGAGAGGC
进行PCR扩增，PCR反应体系为：每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,正反向引物分别为10μM、10μM，模板40ng，其余为水。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，55℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
(2)双酶切步骤(1)中PCR产物和PMD 19-T vector、并纯化目的条带20ul酶切反应体系为2μL的10×FastDigest Green Buffer，限制性内切酶SalⅠ、XbaⅠ分别为1μL，PCR产物或PMD19-T vector 1ug，其余为水。反应条件为37摄氏度30min，65摄氏度5min。
(3)连接
其连接体系为：1uL的10×T4DNA Ligase Buffer，0.5uL的T4DNALigase，1uL的PMD 19-T vector，3ul酶切后的PCR产物，加水至总体积10uL。
其反应条件：16℃反应30分钟。
(4)转化
在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。观察菌落颜色，并测序。
实施例二、检测系统对EGFR基因del E746-A750突变型的普通PCR检测
(1)引物设计
针对EGFR基因del E746-A750突变，发明人设计了一系列引物(引物序列如表1所示，表内序列中带边框的碱基表示将该碱基进行磷酸化修饰)。引物设计完成后进行检测体系的优化及扩增条件的优化，包括退火温度的优化等。
表1EGFR基因del E746-A750突变检测相关引物
结果显示，第三组特异性引物为最优：野生型正向引物(SEQ ID NO：7)、突变型正向引物(SEQ ID NO：8)、公共反向引物(SEQ ID NO：9)。最佳反应体系为：每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，57℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
(2)分别以EGFR基因野生型、delE746-A750突变型重组质粒为模板，用上述检测引物及检测系统进行普通PCR。
(3)用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物(结果如图1所示)，以EGFR基因delE746-A750突变型重组质粒为模板，进行PCR得到192bp的产物；以EGFR基因野生型重组质粒为模板，无特异性扩增产物出现。
实施例三EGFR基因del E746-A750突变检测系统灵敏度的测定
(1)将delE746-A750突变型重组质粒依此稀释为107-10拷贝数待用
(2)分别以上述稀释后的重组质粒为模板，实施例二中所述的特异性引物为引物组(SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)进行普通PCR。反应体系为：每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，57℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
(3)用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物(结果如图2所示)，结果显示：检测系统对delE746-A750突变型的检测灵敏度达到100拷贝数。
实施例四检测系统对EGFR基因del E746-A750突变型的荧光定量PCR检测
(1)分别将EGFR基因野生型、delE746-A750突变型重组质粒依此稀释为107-10拷贝数待用
(2)分别以上述稀释后的重组质粒为模板，实施例二中特异性引物为引物进行荧光定量PCR。
反应体系为：
组分 体积(ul)
10×Pfu Buffer with MgSO4 2.5
20×Evagreen 0.5
dNTP mix 0.4
模板(107-10)copies/ul 1
野生型正向引物SEQ ID NO：7(10um) 0.5
突变型正向引物SEQ ID NO：8(10um) 0.5
公共反向引物SEQ ID NO：9(10um) 0.5
Pfu(2.5U/ul) 0.3
ddH2O 补平至25
反应条件为：95℃预变性5min，第一阶段：95℃20sec，65℃退火20sec，前5个循环每个循环降低1℃，72℃延伸30sec。第二阶段：95℃变性20sec，57℃退火1min，72℃延伸30sec，35个循环。第三阶段：72℃延伸5min。
结果如图3所示：将野生型重组质粒模板由107拷贝数按10倍逐及稀释，由高至低做7个浓度梯度107-10进行荧光定量PCR的扩增时，没有特异性扩增产物(见图3A)；将delE746-A750突变型重组质粒模板由107拷贝数按10倍逐及稀释，由高至低做7个浓度梯度107-10，扩增曲线由左至右。(见图3B所示)。
实施例五检测系统对EGFR基因del L747-S752突变型的普通PCR检测
(1)引物设计
针对EGFR基因del L747-S752突变，发明人设计了一系列引物(引物序列如表2所示，表内序列中带边框的碱基表示将该碱基进行磷酸化修饰)。引物设计的要求同实施例二。引物设计完成后进行检测体系的优化及扩增条件的优化，包括退火温度的优化等。
表2EGFR基因del L747-S752突变检测相关引物
结果显示，第二组特异性引物为最优：野生型正向引物(SEQ ID NO：22)、突变型正向引物(SEQ ID NO：23)、公共反向引物(SEQ ID NO：24)。最佳反应体系为：每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，60℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
(2)分别以EGFR基因野生型、del L747-S752突变型重组质粒为模板，检测体系同上步，用检测引物组(SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24)进行普通PCR。
(3)用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物(结果如图4所示)，以EGFR基因del L747-S752突变型重组质粒为模板，进行PCR得到301bp的产物；以EGFR基因野生型重组质粒为模板，无特异性扩增产物出现。
实施例六EGFR基因del L747-S752突变检测系统灵敏度的测定
(1)将del L747-S752突变型重组质粒依此稀释为107-10拷贝数待用
(2)分别以上述稀释后的重组质粒为模板，实施例五中特异性引物组(SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24)为引物进行普通PCR。反应体系为：每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20S，60℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
(3)用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物(结果如图5所示)，结果显示：检测系统对del L747-S752突变型的检测灵敏度达到100拷贝数。
实施例七检测系统对EGFR基因del L747-S752突变型的荧光定量PCR检测
(1)分别将EGFR基因野生型、del L747-S752突变型重组质粒依此稀释为107-10拷贝数待用
(2)分别以上述稀释后的重组质粒为模板，实施例五中特异性引物组(SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24)为引物进行荧光定量PCR。
反应体系为：
组分 体积(ul)
10×Pfu Buffer with MgSO4 2.5
20×Evagreen 0.5
dNTP mix 0.4
模板(107-10)copies/ul 1
野生型正向引物SEQ ID NO：22(10um) 0.5
突变型正向引物SEQ ID NO：23(10um) 0.5
公共反向引物SEQ ID NO：24(10um) 0.5
Pfu(2.5U/ul) 0.3
ddH2O 补平至25
反应条件为：95℃预变性5min，第一阶段：95℃20sec,65℃退火20sec，前5个循环每个循环降低1℃，72℃延伸30sec。第二阶段：95℃变性20sec，60℃退火1min，72℃延伸30sec，35个循环。第三阶段：72℃延伸5min。
结果如图6所示：将野生型重组质粒模板由107拷贝数按10倍逐及稀释，由高至低做7个浓度梯度107-10进行荧光定量PCR的扩增时，没有特异性扩增产物(见图6A)；将del L747-S752突变型重组质粒模板由107拷贝数按10倍逐及稀释，由高至低做7个浓度梯度107-10，扩增曲线由左至右。(见图6B所示)。
实施例八一种EGFR基因del E746-A750突变型的检测试剂盒
试剂盒组分：
PCR反应体系：
每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。
PCR反应条件为：
95℃预变性5min；95℃变性20S，57℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。
实施例九一种EGFR基因del L747-S752突变型的检测试剂盒
试剂盒组分：
PCR反应体系：
每25μL PCR反应体系包括：12.5μL的2×Tag mix,三条特异性引物分别为10μM、10μM、10μM，模板40ng，其余为水。
PCR反应条件为：
95℃预变性5min；95℃变性20S，60℃退火10S，72℃延伸9S，共35个循环；最后72℃5min。

Claims (10)

1.一套检测EGFR基因突变的引物组合，其特征在于，所述引物组合针对EGFR基因del E746-A750突变和/或EGFR基因del L747-S752突变。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合为SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24，所述SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：22的3’末端碱基进行磷酸化修饰。
3.一种包括权利要求1或2所述引物组合的检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒为普通PCR检测试剂盒或荧光定量PCR检测试剂盒。
5.根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒组分包含下列组分中的一种或几种：聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、阴性对照、阳性对照、探针。
6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR检测试剂盒采用探针法或染料法或分子信标法。
7.一种检测EGFR基因突变的方法，包括，1)加样：向离心管中加入待测样品、权利要求1所述的引物组合及PCR反应所需试剂；2)扩增：PCR反应条件为：90-95℃预变性10S-10min；90-95℃变性5S-3min，55-65℃退火5S-3min，72℃延伸5S-3min，共25-40个循环；最后72℃1-30min；3)检测。
8.根据权利要求7所述的检测EGFR基因突变的方法，其特征在于，所述退火的温度为57-60℃。
9.权利要求1或2所述的引物组合在制备检测EGFR基因突变试剂中的应用。
10.权利要求3-6任意一项所述的检测试剂盒在制备检测EGFR基因突变试剂中的应用。
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