CN106086169B - 用于检测微量组织中egfr基因突变的引物组合及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测微量组织中EGFR基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测18号外显子突变的引物组、用于检测19号外显子突变的引物组、用于检测20号外显子突变的引物组、用于检测21号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中EGFR基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测EGFR基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测EGFR基因第18、19、20和21号外显子的所有突变，本发明提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者EGFR基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。

Description

用于检测微量组织中EGFR基因突变的引物组合及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于微量组织中EGFR基因突变检测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。
背景技术
表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）是原癌基因C-erbB-1 (HER-1)的表达产物，一旦与表皮生长因子（EGF）组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增殖（Herbst RS, et al. 2008）。
EGFR是一个巨大的跨膜糖蛋白，分子量约为l80Kda，由28个外显子构成，具有配体诱导的酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine kinase，TK)活性，它是erbB这个保守的受体家族的一个成员，这个家族的其他成员包括HER2/Neu/ErbB2，HER3/ErbB3和HER4/ErbB4。EGFR由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。正常情况下，EGFR胞外区与相应配体结合，引起受体二聚化，形成同源二聚体或与其他家族成员形成异源二聚体。受体二聚体化后构象改变与ATP分子结合，激活胞内的酪氨酸激酶活性，导致自身磷酸化，启动下游多条信号转导通路，如Ras→Raf→MAPK通路，PI3K→Akt通路，PLC-γ通路，JAK→STAT通路等。通过这些途径，将胞外信号转化为胞内信号，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。这些特点使得EGFR成为具有良好前景的肿瘤诊断和个体化治疗的靶点（Appert-CollinA，et al. 2015）。
EGFR酪氨酸激酶功能区由18-24号外显子编码，其中18-20号外显子编码N-lobe，21-24号外显子编码C-lobe。EGFR突变主要集中在编码酪氨酸激酶结构域的18-21号外显子，包括三种不同突变类型：点突变、缺失突变和插入突变。其中，19号外显子多为缺失突变，导致19号外显子编码的4个高度保守的氨基酸Leu-Arg-Glu-Ala缺失；18号外显子G719X，20号外显子T790M以及21号外显子L858R也是比较常见的点突变。临床试验表明，EGFR的突变状态是决定EGFR-TKIs药物（吉非替尼、厄洛替尼等）一线疗效的关键。19号外显子缺失突变及21号外显子L858R突变对TKIs药物反应良好，被认为是优势突变，约占总突变的75%-90%，而20号外显子T790M突变的患者则对TKIs药物产生耐药性（Villadolid J, etal. 2015; Huang L, et al. 2015）。于此同时，19号外显子不同的缺失突变的病人对TKIs的反应疗效也是不同的。对于EGFR不突变的病人来说，TKIs的药物疗效很低，甚至无效（June-Koo Lee, et al. 2014）。因此，FDA现在已经强制要求在选择使用TKIs药物之前必须进行EGFR基因的突变检测，以利于为这些患者选择最好的治疗方法。
目前针对EGFR突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检测范围有限。多态性分析法（RFLP），是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使用扩增阻滞突变系统（ARMS）与荧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法（NASBA）、自序序列复制法（3SR）和链置换复制法（SDA）虽均为等温扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。
尽管如此，EGFR突变的检测方法仍以肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上常常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准确全面地检测微量组织中EGFR基因突变的产品及方法，以便于为肿瘤个性化治疗服务。
为此，本发明利用恒温扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织样本中EGFR基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，有利于临床使用和推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中EGFR基因突变的引物组合，以组织DNA为检测对象，结合恒温预扩增技术和普通PCR技术，通过直接测序法确定肿瘤样本中有无EGFR基因突变，可对EGFR基因的突变进行准确的检测。
本发明提供的引物组合能检测出EGFR基因发生在第18、19、20和21号外显子的所有突变。
本发明提供的用于检测EGFR基因突变的引物组合包括如SEQ ID NO：1- SEQ IDNO：18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO：19- SEQ ID NO：20所示的用于检测18号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO：21- SEQ ID NO：22所示的用于检测19号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO：23- SEQ ID NO：24所示的用于检测20号外显子突变的引物组、如SEQ IDNO：25- SEQ ID NO：26所示的用于检测21号外显子突变的引物组。
本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测EGFR基因突变的检测试剂中；
本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测EGFR基因突变的检测试剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种：聚合酶、引物组合、PCR反应缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。
本发明用于检测EGFR基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下：
（1）引物稀释
将primer1-prime18分别稀释后混匀制得Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.05-0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为1-3μM；primer19-primer26引物（表1）稀释至5-10μM。
（2）预扩增
在扩增管中加入1μL的10×反应缓冲液、2.5μL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板（本发明采用的DNA模板来源于肺癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方法提取组织DNA）、用去离子水补足至8.8μL；混匀，98℃预变性5-10min，然后置于冰上10-20min；再加入0.5μL dNTP (10mM each)、0.2μL 100×BSA以及0.5μL phi29 DNA聚合酶，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。
（3）使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。
（4）EGFR基因突变检测
针对EGFR基因的18-21号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示的引物组检测18号外显子突变；如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的引物组检测19号外显子突变；如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的引物组检测20号外显子突变；如SEQID NO:25- SEQ ID NO:26所示的引物组检测21号外显子突变。
配置PCR反应总体系为25μL：其中Pfu Mix混合液12.5μL、所述正向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、反向引物(5-10μM)的体积0.5-1μL、预扩增产物1-2μL、用水补足至25μL。PCR反应条件为：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；测序检测。
本发明的检测优势在于： 本发明采用多引物组合、利用恒温扩增及普通PCR相结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行EGFR基因突变检测的局限性。本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本。本发明方法扩增效率高，如100pg的DNA经扩增后可得到1000ng/μL；可同时检测多位点的突变情况。本发明方法DNA扩增后DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的EGFR基因的突变情况进行高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，以及监测肿瘤的预后具有很好的实际应用价值。
表1：引物1-26的核苷酸序列
。
附图说明
图1是本发明针对1000pg的DNA模板扩增结果；其中A图为预扩增结果（3次重复）；B图为EGFR基因18-21号外显子扩增结果；
图2是本发明针对500pg的DNA模板扩增结果；其中A图为预扩增结果（3次重复）；B图为EGFR基因18-21号外显子扩增结果；
图3是本发明针对100pg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果（3次重复）；B图为EGFR基因18-21号外显子扩增结果；
图4是本发明针对1000pg的DNA模板中EGFR基因18-21号外显子测序结果图；
图5是本发明针对500pg的DNA模板中EGFR基因18-21号外显子测序结果图；
图6是本发明针对100pg的DNA模板中EGFR基因18-21号外显子测序结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1：1000pg的DNA模板中EGFR基因突变检测
1、实验材料
phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer26，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
2、实验步骤及结果
2.1 预扩增
（1）引物稀释
将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM；配置如下体系：
；
（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性10min，然后迅速置于冰上20min；
（3）再加入如下体系：
；
将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热15min使酶失活。铺1%的胶检测（图1A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对1000pg的DNA模板扩增效果良好。
2.2 PCR产物纯化
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）；
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；
（4）向吸附柱CB1中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (～13,400×g)离心30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；
（5）重复操作步骤（4）；
（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液,将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；
（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。
2.3 EGFR基因突变检测
（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增EGFR基因的第18，19，20和21号外显子；
；
其中针对18号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对19号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示；针对20号外显子突变的引物如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示，针对21号外显子突变的引物如SEQ ID NO:25- SEQ IDNO:26所示。
（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；
（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图1B），结果显示第二轮PCR对EGFR基因的第18，19，20和21号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测。测序结果如图4所示，EGFR基因第18，19和21外显子均未检测到突变，第20号外显子发生同义突变c.2361G>A。
实施例2：500pg的DNA模板中EGFR基因突变检测
1、实验材料
phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer26，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
2、实验步骤
2.1 预扩增
（1）引物稀释。将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为2μM。
配置如下体系：
；
（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性5min，然后迅速置于冰上10min。
（3）再加入如下体系：
；
将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测（图2A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对500pg的DNA模板扩增效果良好。
2.2 PCR产物纯化
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。
（4）向吸附柱CB1中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (～13,400×g)离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。
（5）重复操作步骤4。
（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μL洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。
2.3 EGFR基因突变检测
（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增EGFR基因的第18，19，20和21号外显子，
；
其中针对18号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对19号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示；针对20号外显子突变的引物如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示，针对21号外显子突变的引物如SEQ ID NO:25- SEQ IDNO:26所示。
（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；
（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B），结果显示第二轮PCR对EGFR基因的第18，19，20和21号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测；测序结果如图5所示，EGFR基因第18，19和21外显子均未检测到突变，第20号外显子发生同义突变c.2361G>A。
实施例3：100pg的DNA模板中EGFR基因突变检测
1、实验材料
phi29 DNA聚合酶，10×reaction buffer，dNTP (10nM) ，100×BSA，1000pg的DNA模板，去离子水，primer1-prime18 (即Primer Mix)，2×Pfu Mix，primer19-primer26，PCR仪，超薄产物纯化试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司DP203），1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
2、实验步骤
2.1 预扩增
（1）引物稀释。将primer1-prime18分别稀释后混匀形成Primer Mix（表1），其中primer1-primer16引物的终浓度为0.05μM，primer17-primer18引物的终浓度为3μM。
配置如下体系：
；
（2）将上述试剂混匀后，98℃预变性8min，然后迅速置于冰上15min。
（3）再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测（图3A）。结果显示使用phi29DNA聚合酶对100pg的DNA模板扩增效果良好。
2.2 PCR产物纯化
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500 μL的平衡液BL，12,000 rpm (～13,400×g) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（2）估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000 rpm(～13,400×g)离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。
（4）向吸附柱CB1中加入600 μＬ漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000 rpm (～13,400×g)离心60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中。
（5）重复操作步骤4。
（6）12,000 rpm(～13,400×g)离心2 min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
（7）取出吸附柱CB1，放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50μＬ洗脱缓冲液EB，室温放置2 min。12,000rpm(～13,400×g)离心2 min，收集DNA溶液。
2.3 EGFR基因突变检测
（1）配置如下PCR反应体系，分别扩增EGFR基因的第18，19，20和21号外显子，
；
其中针对18号外显子突变的引物如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示；针对19号外显子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示；针对20号外显子突变的引物如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示，针对21号外显子突变的引物如SEQ ID NO:25- SEQ IDNO:26所示。
（2）反应条件：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；
（3）PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B），结果显示第二轮PCR对EGFR基因的第18，19，20和21号外显子均出现特异性扩增；然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序检测；测序结果如图6所示，EGFR基因第18，19和21外显子均未检测到突变，第20号外显子发生同义突变c.2361G>A。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>用于检测微量组织中EGFR基因突变的引物组合及其应用
<160>26
<170>PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 1
cgcctttcca ttctt 15
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
aacatgaccc tgaat 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 3
aactacttgg aggac 15
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 4
aaacaccgca gcatg 15
<210> 5
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 5
aagagaaaga atacc 15
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 6
ctgccttccc actag 15
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 7
cattctgggt gagct 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 8
gagccagagc tgctt 15
<210> 9
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 9
tcacctgggg ataac 15
<210> 10
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 10
ggctcacact accag 15
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 11
ccagaatgtc tggag 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 12
gctgacctaa agcca 15
<210> 13
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 13
gtgatcttga catgc 15
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 14
tcctccaagt agttc 15
<210> 15
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 15
gctctgcatc cgaat 15
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 16
tccacgtcga ggact 15
<210> 17
<211> 10
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 17
gggcaggang 10
<210> 18
<211> 8
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 18
nnatgtgg 8
<210> 19
<211> 37
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 19
agggttttcc cagtcacgag ctggcaagtg ccgtgtc 37
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 20
gcctgtgcca gggaccttac 20
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 21
agggttttcc cagtcacggg gtgcatcgct ggtaacat 38
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 22
taatacgact cactataggc cacacagcaa agcagaaact c 41
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 23
agggttttcc cagtcacggt ccatgtgccc ctccttc 37
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 24
taatacgact cactataggc cgtatctccc ttccctgatt ac 42
<210> 25
<211> 38
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 25
agggttttcc cagtcacgga gcctggcatg aacatgac 38
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 26
ctgacctaaa gccacctcct tact 24

Claims (3)

1.用于检测微量组织中EGFR基因突变的引物组合，其特征在于，由如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示的用于检测18号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的用于检测19号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的用于检测20号外显子突变的引物组、如SEQID NO:25- SEQ ID NO:26所示的用于检测21号外显子突变的引物组组成；
用于检测EGFR基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下：
（1）引物稀释
将primer1-prime18分别稀释后混匀制得Primer Mix，其中primer1-primer16引物的终浓度为0.05-0.1μM，primer17-primer18引物的终浓度为1-3μM；primer19-primer26引物稀释至5-10μM；
（2）预扩增
在扩增管中加入1μL的10×反应缓冲液、2.5μL的Primer Mix、100-1000pg微量DNA模板、用去离子水补足至8.8μL；混匀，98℃预变性5-10min，然后置于冰上10-20min；再加入0.5μL dNTP 10mM each、0.2μL 100×BSA以及0.5μL phi29 DNA聚合酶，30-35℃扩增过夜，65℃加热10-20min使酶失活；
（3）使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物；
（4）EGFR基因突变检测
针对EGFR基因的18-21号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO:19- SEQ ID NO:20所示的引物组检测18号外显子突变；如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO:22所示的引物组检测19号外显子突变；如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的引物组检测20号外显子突变；如SEQ IDNO:25- SEQ ID NO:26所示的引物组检测21号外显子突变；
配置PCR反应总体系为25μL：其中Pfu Mix混合液12.5μL、5-10μM正向引物0.5-1μL、5-10μM反向引物0.5-1μL、预扩增产物1-2μL、用水补足至25μL；
PCR反应条件为：①94℃，5min预变性；②94℃，30s变性；③55℃，30s退火；④72℃，35s延伸；循环②至④35次；⑤72℃，5min；测序检测。
2.权利要求1所述的引物组合在制备检测EGFR基因突变的检测试剂中的应用。
3.权利要求1所述的引物组合在制备检测EGFR基因突变的检测试剂盒中的应用。
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