CN109207579A - 一种检测恶性高热易感基因的多重检测试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多重基因检测试剂盒。具体而言，本发明涉及检测恶性高热易感性单核苷酸多态性(SNP)的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其用途。本发明采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的37个SNP位点。试剂盒组成：用于扩增所述37个SNP位点及内参的4管引物组合物、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。试剂盒使用方法：(1)采集样本提取核酸，或采集口腔脱落细胞于细胞采集卡上；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离37个SNP位点；(4)结果分析判读。
Description
技术领域
本发明涉及一种多重基因检测试剂盒。具体而言，本发明涉及检测恶性高热易感性单核苷酸多态性(SNP)的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其用途。
背景技术
恶性高热(Malignant Hyperthermia,MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000-1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％-90％。若患者及时接受治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。
MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为罗纳丹受体(Ryanodine receptor,RYR1)和编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(L type voltage-dependent calcium channel，L型电压门控Ca2+通道)。2017年8月欧洲恶性高热组织(EMHG)公布，目前已确认37个单核苷酸多态性(SNP)可以作为恶性高热易感性的判断依据，包括RYR1的35个单核苷酸多态性和CACNA1S的2种单核苷酸多态性。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。
目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。然而CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。而通过检测与恶性高热相关的SNP位点来判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。
现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。
荧光定量PCR采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强。其缺点在于：通量低，如同时检测37个SNP位点，需要一个一个位点检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；探针标记成本高。
基因芯片是通过微加工技术，将数以万计乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，从而对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准，这也限制了基因芯片技术的普及。
Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能发现已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个一个位点进行测序，多个SNP位点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术还不够成熟。
综上所述，由于恶性高热易感基因SNP数量较多，以上技术均具有明显的局限性，因此很难应用于恶性高热易感基因的检测。本领域仍需要更有效的方法来检测恶性高热易感基因SNP。
发明内容
本发明采用的SNP检测方法基于多重聚合酶链式反应(PCR)和毛细管电泳(CE)分离技术。其特征在于，采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的37个单核苷酸多态性(SNP)位点，如表1.1-1.4所示。
表1.1 A组SNP位点及引物组合物
表1.2 B组SNP位点及引物组合物
表1.3 C组SNP位点及引物组合物
表1.4 D组SNP位点及引物组合物
因SNP位点只有1个碱基突变，本发明针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物与另一段的野生型和突变型引物分别扩增出片段长短有2-10个碱基差异的片段。在同一个反应管中同时加入多对特异性基因扩增引物及内参引物，获得大小不一的基因扩增片段，使用毛细管电泳进行分离，进而分析SNP基因型。
一方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括：用于扩增所述37个SNP位点及内参的4管引物组合物、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。
所述试剂盒将所述37个SNP位点分成四组，并在每组中加入4个内参(3个人类基因组内参(huDNA)和1个PCR反应内参(pcDNA))，同步检测4组引物组合物，如表1.1-1.4所示。所述四组引物组合物包括：MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C和MHPrimer Mix D，其中引物组合物MH Primer Mix A包含11个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.1-31及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-111、SEQ ID NO.116-119；引物组合物MH Primer Mix B包含9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ IDNO.32-56及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-109、SEQ ID NO.112-115、SEQ IDNO.118-119；引物组合物MH Primer Mix C包含10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.57-86及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-109、SEQ ID NO.112-113、SEQ ID NO.116-119；引物组合物MH Primer Mix D包含7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.87-107及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-109、SEQ IDNO.114-119。
所述人类基因组内参(huDNA)用于监测DNA样品的质量，DNA质量不好时，可避免假阴性；PCR反应内参(pcDNA)用于监测PCR反应过程，可避免因PCR反应失败造成的假阴性及因杂峰造成的假阳性。
所述试剂盒包括四组阳性对照品MH POS A、MH POS B、MH POS C、MH POS D，其中MH POS A为A组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MH POS B为B组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MH POS C为C组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MH POS D为D组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物。所述质粒混合物为：将包含每个SNP位点的基因片段及内参基因分别克隆到质粒载体中，再将克隆后的质粒混合而成，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。
本发明所采用的PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
使用所述试剂盒来检测恶性高热易感性SNP的步骤包括：
(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，亦可不进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提取的时间；
(2)将37个SNP位点分成两个或多个多重PCR反应体系，以细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃1min，循环29次；60℃，15min；4℃直至收取PCR产物。
(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离37个SNP位点及内参。本发明采用毛细电泳分离PCR产物：在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.7μL，标准品SIZE-500 0.3μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细电泳。
(4)根据所设计的每个检测基因的片段长度可获得峰图，得到每个SNP位点的基因型检测结果。
(5)根据峰图进行结果分析，从而判断恶性高热易感性。如附图1和2及表2.1-2.4所示。
表2.1 A组SNP位点基因型对应临床参考信息
表2.2 B组SNP位点基因型对应临床参考信息
表2.3 C组SNP位点基因型对应临床参考信息
表2.4 D组SNP位点基因型对应临床参考信息
另一方面，本发明提供了所述试剂盒用于制备检测样品中恶性高热易感性的检测试剂的用途。
本发明所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：(1)高通量：能实现同步检测37个SNP位点；(2)准确性高：采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；(3)灵敏度高：本系统能检测含量低至1ng/反应的DNA样品，具有超高灵敏度；(4)方法简便，使用经济：本发明提供试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；检测成本低，利于大规模推广。
附图说明
图1为人口腔脱落细胞采集卡样品(样品未经核酸提取直接进行PCR扩增)的恶性高热易感基因检测结果。A为A组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.6617C>G/T位点发生C>CT杂合子突变，导致患者对恶性高热易感；B为B组SNP检测结果，无突变；C为C组SNP检测结果，无突变；D为D组SNP检测结果，无突变。
图2为采用人血液样品(经核酸提取)检测恶性高热易感基因的结果。A为A组SNP检测结果，无突变；B为B组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.1654C>T位点发生C>CT杂合子突变，导致患者对恶性高热易感；C为C组SNP检测结果，无突变；D为D组SNP检测结果，无突变。
具体实施方式
本发明提供了一种检测恶性高热易感性的试剂盒，以及使用该试剂盒来检测恶性高热易感性SNP的方法。所述试剂盒将所述37个SNP位点分成四组，同步使用四组引物组合物及4个内参(3个人基因组内参和1个PCR反应内参)进行检测。因SNP位点只有一个碱基突变，本发明针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中两条引物(即正向引物)分别与野生基因和突变的易感基因互补结合，另一条共用的引物作为反向引物，分别扩增出长度相差2-10个碱基的两种PCR产物片段。所述SNP位点及引物如表1.1-1.4所示。
使用所述试剂盒来检测恶性高热易感性SNP的方法包括以下步骤：(1)采集样品，根据需要提取核酸或直接用于后续步骤；(2)将与恶性高热易感性相关的37个SNP位点分成两个或多个多重PCR反应体系，以步骤(1)的样品或从样品中提取的核酸为模板，使用表1.1-1.4中的引物组合物进行多重PCR扩增，获得扩增产物；(3)按照PCR产物片段长短/质量同步分离37个SNP位点及内参；(4)根据检测结果，例如峰图，获得每个SNP位点的基因型，根据表2.1-2.4判断恶性高热易感性。
在步骤(1)中，可以采集口腔脱落细胞样品或血液样品。采集的样品可以保存于本领域常用的细胞采集卡，例如苏州新海生物科技有限公司定制的指示型NACC口腔细胞采集卡。
在步骤(2)中，所述PCR反应体系可以是本领域常用的PCR反应体系，例如包括超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。PCR反应条件可以是本领域常规的反应条件，例如95℃5分钟；94℃10秒，61℃1分钟，70℃1分钟，循环29次；60℃15分钟；4℃直至收取PCR产物。
步骤(3)的分离方法可以是本领域的常规方法，例如毛细管电泳。具体电泳步骤可以是：首先配置电泳样品；然后将样品板置于基因分析仪中，根据操作说明书进行电泳。
本发明还提供了所述试剂盒用于制备检测样品中恶性高热易感性的检测试剂的用途。
在一个具体实施方案中，所述样品为人口腔脱落细胞样品或人血液样品。
在另一个具体实施方案中，所述人口腔脱落细胞样品保存于细胞采集卡上。
实施例
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明做出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例以苏州新海生物科技有限公司定制的指示型NACC口腔细胞采集卡(货号：NH9510)为模板直接进行多重PCR反应，通过毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1.设计表1.1-1.4中所示的引物，生产用于检测恶性高热易感性的多重基因检测试剂盒，其包括以下组分：
1)四组引物组合物MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C、MHPrimer Mix D；
2)PCR反应液；
3)四组阳性对照品MH POS A、MH POS B、MH POS C、MH POS D；
4)超纯水。
2.使用口腔拭子采集人口腔脱落细胞，保存于细胞采集卡上。
3.以细胞采集卡为模板进行PCR反应
1)按表3在96孔样品板/PCR八联管中加入试剂和样品。配制4个PCR体系，向4个PCR管中均加入PCR反应液、超纯水，使用1.0mm打孔器取细胞采集卡样品加入到4个管中，再分别向4个管中加入引物组合物MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C、MHPrimer Mix D。
表3 PCR反应体系
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| PCR反应液 | 14 |
| 引物组合物 | 2 |
| 细胞采集卡 | 0 |
| 水 | 4 |
| 总计 | 20 |
2)将配制好的4个PCR体系混匀离心，按表4的程序进行PCR反应：
表4 PCR扩增程序
| 步骤 | 程序 | 时间 |
| 1 | 95℃ | 5min |
| 2 | 94℃ | 10s |
| 3 | 61℃ | 1min |
| 4 | 70℃ | 1min |
| 5 | 不适用 | 重复2-4步骤29次 |
| 6 | 60℃ | 15min |
| 7 | 4℃ | 持续直至收取PCR产物 |
4.毛细电泳分离样品
1)按表5在96孔样品板中配制电泳样品。
2)将样品板置于3500DX基因分析仪中，根据ABI3500操作说明书，选择“fragment”电泳方法，进行电泳。
表5电泳样品配制
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| 高纯甲酰胺Hi-Di | 8.7 |
| 标准品SIZE-500 | 0.3 |
| PCR产物 | 1 |
| 总计 | 10 |
5.结果分析
根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样品是否为恶性高热易感。附图1为一个人口腔脱落细胞采集卡样品的检测峰图。该样品A组SNP位点中RYR1基因c.6617C>G/T位点出现C>CT杂合子突变，携带恶性高热易感基因。A组其他位点均为野生纯合型。B、C和D组SNP位点均为野生纯合型。因此，可判断该样品为恶性高热易感者(表6)。
表6人口腔脱落细胞采集卡检测结果
实施例2
本实施例采集血液样品并提取核酸，以提取的核酸为模板进行多重PCR反应，然后通过毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1.设计表1.1-1.4中所示的引物，生产用于筛查恶性高热易感性的多重基因检测试剂盒，试剂盒组分如实施例1所述。
2.采集一个人血液样品并提取核酸。
3.以提取的核酸为模板进行PCR反应
1)按表7在96孔样品板/PCR八联管上加入试剂和样品。配制4个PCR体系，向4个PCR管中分别加入核酸样品、PCR反应液、超纯水，再分别向4个管中加入引物组合物MH PrimerMix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C和MH Primer Mix D。
表7 PCR反应体系
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| PCR反应液 | 14 |
| 引物组合物 | 2 |
| 核酸 | 2 |
| 水 | 2 |
| 总计 | 20 |
2)将配制好的4个PCR体系混匀离心，进行PCR反应，PCR程序如实施例1所述。
3)毛细电泳分离样品，操作步骤如实施例1所述。
4.结果分析
根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样品是否为恶性高热易感。附图2为一个人血液样品检测结果。该样品B组SNP位点中RYR1基因c.1654C>T位点出现C>CT杂合子突变，携带恶性高热易感基因。B组其他位点均为野生纯合型。A、C和D组SNP位点均为野生纯合型。因此，可判断该样品为恶性高热易感者(表8)。
表8人血液样品检测结果
序列表
<110> 宁波海尔施基因科技有限公司
<120> 一种检测恶性高热易感基因的多重检测试剂盒及其用途
<130> CP1171144/CB
<160> 119
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<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agtgtggggc agcaaggtag ag 22
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gatgcgttcc gagtgctcag acccctac 28
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttccgagtg ctcagacccc gct 23
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
agaactgggg gacaagggaa c 21
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
agaactgggg gacaagggaa c 21
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gtgacctgtc ctgttgtatg tgtcacatca 30
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tgccctactc atcctgccct ac 22
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtcggttatg agtgcacaca gctcccccgt 30
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtatgagtgc acacagctcc cctat 25
<210> 34
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaggtagcga gtatgagtgc acacagctcc ccgtt 35
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aggtctgggc tgtggacgag ag 22
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gtccagcttg agtgcctcgg ccagatcag 29
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gcttgagtgc ctcggccaga taca 24
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agctagccat cgagagactg ag 22
<210> 39
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtaatcaggc gagagcgtgg aggagaaag 29
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gtggcgagag cgtggaggag atca 24
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgatgcggat ggcctcttcg atg 23
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gtgaagcctt gatcgacctg ctcggaag 28
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gccttgatcg acctgctcgg cca 23
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
accctggggc tgtcttggtc ac 22
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gatgcatggg tgaggccctg cggatcag 28
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtgggtgagg ccctgcggat aca 23
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tccatcccct ctgcaccttt g 21
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtattgtggg tgacagagga caggattg 28
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gtgggtgaca gaggacagga aga 23
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
actccccaaa cagagctggc ac 22
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtagagagcg ctacctggac ttcctgag 28
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gagcgctacc tggacttcct tca 23
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcatctcgag ggaggtgtgt gacc 24
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gtagagtggc tggtcagcaa gctggagc 28
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gtggctggtc agcaagctgg ctt 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
tgaggacaca gtacaggacc tcc 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
gttcaaggag cagctcaagc gct 23
<210> 58
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gtcgtgttca aggagcagct caagctac 28
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agattctctg ccccttcaga cgc 23
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gtgttgtata ggccattggt gctgtcg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gtataggcca ttggtgctgg gc 22
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
actcctaggc catgctgcac cag 23
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gtgggacccc tacctaggag ttgat 25
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gaagagtggg acccctacct aggagttcgg 30
<210> 65
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tgaattgcat agaccgccta aatgtc 26
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gtccaatctg cacgatgagc agcgagag 28
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gtctgcacga tgagcagcga tca 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
agctgggccc aagaggactt cgt 23
<210> 69
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gtaacctctt cgatggcagc cagcagac 28
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gtcttcgatg gcagccagca ccg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
agaacgccaa tgtggtggtg cgg 23
<210> 72
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gtaacgtcct ccaagggcac aagggagag 29
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gtcctccaag ggcacaaggg acca 24
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acaggcagag gaacgagggc tg 22
<210> 75
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gtggagtcca tggtgctctt cctggacag 29
<210> 76
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gtccatggtg ctcttcctgg aaca 24
<210> 77
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
agggattatg atatgtccac aatccc 26
<210> 78
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
gagaaggccc acggtcatca caag 24
<210> 79
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gtagcgagaa ggcccacggt catcacctc 29
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
agtgggtggt gaagggataa gg 22
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gacccaagag ggacatcacc ctat 24
<210> 82
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gaagtgaccc aagagggaca tcaccattc 29
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
actccccaaa cagagctggc ac 22
<210> 84
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gtctcagtaa taagatcttg gttggaac 28
<210> 85
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gtaagttctc agtaataaga tcttggttgg gga 33
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
ttatcccgat gcgctgtcct ttcc 24
<210> 87
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gagtagaggt ctgaaggaga aaaggtctg 29
<210> 88
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gaggtctgaa ggagaaaagg tgct 24
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
acaggcaaac ccatggtgag aag 23
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
gtatcttccc ccctcagctt ctctaatcag 30
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gtcccccctc agcttctcta ataca 25
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
tgaggacaca gtacaggacc tcc 23
<210> 93
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gtagacacgc catcatgtcc ttctatgcag 30
<210> 94
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gacgccatca tgtccttcta tgaca 25
<210> 95
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
atacccaaca ttgctagtcc aggacc 26
<210> 96
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gaccagtatg ggtgaggccc tgcggatac 29
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
gtatgggtga ggccctgcgg agct 24
<210> 98
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tccatcccct ctgcaccttt g 21
<210> 99
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
gatacgcacc atcctgtcct ctgtcacac 29
<210> 100
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gcaccatcct gtcctctgtc aact 24
<210> 101
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
tctaccttgc tgccccacac ac 22
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gtgggtcctc gatctcgtcc cgaa 24
<210> 103
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
gtacgttggg tcctcgatct cgtcccctg 29
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
atgtcgaatg aatgagtgac cag 23
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
gtggagtcca tggtgctctt cctggagc 28
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gtccatggtg ctcttcctgg tct 23
<210> 107
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
agcgattatg atatgtccac aatccc 26
<210> 108
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
actaggatcc tgcttcctgg ta 22
<210> 109
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
gttgaaggtc atcacagagc catg 24
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
aactttgctc ctgcccttgg 20
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
gctgttcccc acccacagtt c 21
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ttattccccc acgtggatac t 21
<210> 113
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ggctccatca tgaagaaaga gt 22
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
agctgtcatt gactgagccc 20
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
ttgtgacagc aacccttttg g 21
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
ccttatgcca tccttgttct gac 23
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
catggcctgc ttactcacaa g 21
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
gccagatata cgcgttgaca 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
gggcgtactt ggcatatgat 20
Claims (6)
1.一种试剂盒，所述试剂盒包括如表1.1-1.4所示的四组引物组合物MH Primer MixA、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C和MH Primer Mix D，其中引物组合物MH PrimerMix A包含11个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.1-31及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-111、SEQ ID NO.116-119；引物组合物MH Primer Mix B包含9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.32-56及4个内参的正反向扩增引物SEQID NO.108-109、SEQ ID NO.112-115、SEQ ID NO.118-119；引物组合物MH Primer Mix C包含10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.57-86及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-109、SEQ ID NO.112-113、SEQ ID NO.116-119；引物组合物MH PrimerMix D包含7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物SEQ ID NO.87-107及4个内参的正反向扩增引物SEQ ID NO.108-109、SEQ ID NO.114-119。
表1.1 A组SNP位点及引物组合物
表1.2 B组SNP位点及引物组合物
表1.3 C组SNP位点及引物组合物
表1.4 D组SNP位点及引物组合物
2.权利要求1的试剂盒，所述试剂盒还包括四组阳性对照品MH POS A、MH POS B、MHPOS C、MH POS D，其中MH POS A为A组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MH POS B为B组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MH POS C为C组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；MH POS D为D组所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物。
3.权利要求2的试剂盒，所述试剂盒还包括PCR反应液，其包含以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
4.权利要求1-3中任一项的试剂盒用于制备检测样品中恶性高热易感性的检测试剂的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述样品为人口腔脱落细胞样品或人血液样品。
6.权利要求5的用途，其中所述人口腔脱落细胞样品保存于细胞采集卡上，可直接进行PCR扩增。
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