CN109082466A

CN109082466A - 一种检测cacna1s基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN109082466A
Application number: CN201810951433.3A
Authority: CN
Inventors: 王凡; 吴勇; 余丁
Original assignee: NINGBO HEALTH GENE TECHNOLOGIES Co Ltd
Current assignee: NINGBO HEALTH GENE TECHNOLOGIES Co Ltd
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2018-12-25

Abstract

本发明公开了一种检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明采用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的CACNA1S基因的520C＞T和3257G＞A单核苷酸多态性(SNP)位点。试剂盒组成：用于扩增所述2个SNP位点及4个内参的引物组合物、PCR反应液、阳性对照液和无核酸酶水。试剂盒使用方法：(1)采集样本提取核酸，或采集口腔脱落细胞于细胞采集卡上；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离2个SNP位点及4个内参、(4)结果分析判读。本发明的优势是灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低，克服了传统方法存在的缺陷。

Description

一种检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种多重基因检测试剂盒，尤其是涉及一种同步检测CACNA1S基因2个单核苷酸多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

恶性高热(Malignant Hyperthermia，MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起的骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000～1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％～90％。若患者及时接收治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。

MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(L type voltage-dependent calcium channel，L型电压门控Ca²⁺通道)和编码罗纳丹的受体(Ryanodinereceptor，RYR1)。2017年8月EMHG公布，目前已确认检测CACNA1S和RYR1单核苷酸突变体(SNP)可以作为恶性高热易感性的重要判断依据。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。

目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。通过检测与恶性高热相关的SNP位点判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。

现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。现简述如下：

1、荧光定量PCR：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强；其缺点：

(1)通量低，如同时检测多个SNP位点，需要一个一个位点检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；

(2)难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；

(3)探针标记成本高。

2、基因芯片技术：

基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。

3、测序法：

Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能发现已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个一个位点测序，多个SNP位点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术还不够成熟。

由于以上技术均具有明显局限性。目前，国内外尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的恶性高热易感基因检测方案的报道。

发明内容

本发明提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低的检测CACNA1S基因多态性的试剂盒及其使用方法。其特征在于，采用多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的CACNA1S基因的2个单核苷酸多态性(SNP)位点：520C＞T和3257G＞A。

试剂盒组成：用于扩增所述2个SNP位点及4个内参的引物组合物(详见表1)、PCR反应液、阳性对照液和无核酸酶水。

试剂盒使用方法：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，直接扩增或提取核酸；亦可采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离CACNA1S基因2个SNP位点及4个内参；(4)结果分析判读

本试剂盒在检测所述2个SNP位点的PCR反应系统中加入3个人类基因组(huDNA)内参和一个PCR反应内参(pcDNA)(如表1所示)，同步进行PCR扩增，用于监测核酸提取及PCR反应过程，可避免假阴性和假阳性。

表1 SNP位点及内参引物组合

本试剂盒包括一管阳性对照液，内含上述CACNA1S基因的2个SNP位点和4个内参基因所对应的质粒混合物，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。

本发明所采用的PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。

检测步骤：

(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，亦可不进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提取的时间；

(2)以细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃1min，循环29次；60℃，15min；4℃直至收取PCR产物。

(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离2个SNP位点及4个内参。本发明采用毛细电泳分离PCR产物：在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.7μL，标准品SIZE-500 0.3μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细电泳。

(4)根据所设计的每个检测基因的片段长度可获得峰图，得到每个SNP位点的基因型检测结果。

(5)根据峰图进行结果分析，从而判断恶性高热易感性。如附图及表2所示。

表2 CACNA1S的SNP位点基因型所对应的临床参考信息

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明创立了一种同步检测CACNA1S基因的2个SNP位点的检测方案；灵敏度可达到清晰检测1个碱基的DNA突变；特异性和准确度可达到qPCR水平；可在短时间内(2.5小时)同时完成多个样品2个SNP位点的检测；DNA内参和反应内参的使用可监测DNA提取及PCR反应的效率，避免了假阴性和假阳性。

综上所述，本发明提供了一种同步检测恶性高热易感性相关的CACNA1S基因2个SNP位点的检测方案，具有快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低等优势。

附图说明

图1为一个人类的口腔脱落细胞采集卡样本(样品未经核酸提取直接PCR扩增)的CACNA1S基因的检测结果，该样本SNP位点均为野生纯合型。

图2为采用一个人类的血液样本(经核酸提取)的CACNA1S基因的检测结果，该样本SNP位点均为野生纯合型。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1和2所述引物组合物CA Primer Mix为表1所述用于扩增CACNA1S基因2个SNP位点的各3条引物：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6；

实施例1和2所述PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。

实施例1和2所述阳性对照品CA POS为表1所述内含所述2个SNP位点和所述4个内参基因所对应的质粒混合物。

实施例1

本实例以细胞采集卡为模板直接进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1.生产用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒，包括以下组分：

1)引物组合物CA Primer Mix；

2)PCR反应液；

3)阳性对照液CA POS；

4)无核酸酶水。

2.采集样本

使用口腔拭子采集人类的口腔脱落细胞，保存于细胞采集卡上。

3.以细胞采集卡为模板进行PCR反应

1)按表3在96孔样品板/PCR八联管中加入试剂和样品。配制PCR体系，向PCR管中加入PCR反应液、无核酸酶水和引物组合物CA Primer Mix，使用1.0mm打孔器取细胞采集卡样本加入到PCR管中。

表3 PCR反应体系

2)将配制好PCR体系混匀离心，按表4的程序进行PCR反应：

表4 PCR扩增程序

步骤	程序	时间
			1	95℃	5min
2	94℃	10s
			3	61℃	1min
4	70℃	1min
			5	N/A	重复2～4步骤29次
6	60℃	15min
			7	4℃	持续直至收取PCR产物

4.毛细电泳分离样品

1)制备电泳样品

按表5在96孔样品板中配制电泳样品。

2)毛细电泳分离样品

将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，详见ABI3500操作说明书。

表5电泳样品配制

试剂	量(μL)/孔
		Hi-Di	8.7
SIZE-500	0.3
		PCR产物	1
Total	10

5.结果分析

根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样本是否为恶性高热易感。附图1为一个人类的口腔脱落细胞采集卡样本检测峰图。该样本SNP位点均为野生纯合型，因此，可判断该样本不是恶性高热易感者(表6)。

表6 一个人类的口腔脱落细胞采集卡检测结果

实施例2

本实例采集血液样本并提取核酸，以提取的核酸为模板进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：

1.生产用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒

试剂盒组分如实施例1所述。

2.采集样本

采集一个人类的血液样本并提取核酸。

3.以提取的核酸为模板进行PCR反应

1)按表7在96孔样品板/PCR八联管上加入试剂和样品。配制PCR体系，向PCR管中均加入核酸样品、PCR反应液、无核酸酶水及引物组合物CA Primer Mix。

表7 PCR反应体系

试剂	量(μL)/孔
		PCR反应液	14
引物组合物	2
		核酸	2
水	2
		Total	20

2)将配制好的PCR体系混匀离心，进行PCR反应，PCR程序如实施例1所述。

3)毛细电泳分离样品，操作步骤如实施例1所述。

4.结果分析

根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样本是否为恶性高热易感。附图2为一个人类的血液样本检测结果。该样本CACNA1S基因的SNP位点均为野生纯合型，因此，可判断该样本不是恶性高热易感者(表8)。

表8 一个人类的血液样本检测结果

本发明采用了基于多重PCR和毛细管电泳(CE)分离技术。在同一个反应管中同时加入多对特异性基因扩增引物及内参引物，获得大小不一的基因扩增片段，使用毛细管电泳进行分离，进而分析SNP基因型。本发明所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：

1、高通量：能实现同步检测多个SNP位点；

2、准确性高：采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；

3、灵敏度高：本系统能检测含量低至1ng/反应的DNA样品，具有超高灵敏度；

4、方法简便，使用经济：本发明提供试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；检测成本低，利于大规模推广。

上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 宁波海尔施基因科技有限公司

<120> 一种检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法

<130> 2018.08.31

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

gatgcgttcc gagtgctcag acccctac 28

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

gttccgagtg ctcagacccc gct 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

agaactgggg gacaagggaa c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 4

agaactgggg gacaagggaa c 21

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

gtgacctgtc ctgttgtatg tgtcacatca 30

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

tgccctactc atcctgccct ac 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 7

actaggatcc tgcttcctgg ta 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

gttgaaggtc atcacagagc catg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

aactttgctc ctgcccttgg 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

gctgttcccc acccacagtt c 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

ccttatgcca tccttgttct gac 23

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

catggcctgc ttactcacaa g 21

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

gccagatata cgcgttgaca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

gggcgtactt ggcatatgat 20

Claims

1.一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括同步检测针对CACNA1S基因的520C＞T和3257G＞A基因多态性(SNP)位点和4个内参基因扩增的引物组合物、PCR反应液、阳性对照液和无核酸酶水，所述同步检测针对CACNA1S基因的520C＞T和3257G＞A基因多态性(SNP)位点和4个内参基因扩增的引物组合物如表1所示；

表1 CACNA1S基因的SNP位点及内参的引物组合

2.如权利要求1所述的一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物与另一段的野生型和突变型引物分别扩增出片段长短有2～10个碱基差异的片段。

3.如权利要求1所述的一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，在所述多重PCR反应中加入4个内参，包括3个人类基因组(huDNA)内参和一个PCR反应内参(pcDNA)。

4.如权利要求1所述的一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括一管阳性对照液，内含所述2个SNP位点和所述4个内参基因所对应的质粒混合物。

5.如权利要求1所述的一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用的PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。

6.一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，直接扩增或提取核酸；或者，采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离CACNA1S基因2个SNP位点及4个内参；(4)结果分析判读。

7.如权利要求6所述的一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒的使用方法，所述PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃1min，循环29次；60℃15min；4℃直至收取PCR产物。

8.如权利要求6所述的一种用于检测CACNA1S基因多态性的多重基因检测试剂盒的使用方法，所述步骤(3)试剂盒分离SNP位点及内参的方法为毛细电泳片段分析方法。