CN112813144A - 一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。本发明采用五组或五组以上多重PCR体系，结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的49个单核苷酸多态性(SNP)位点。试剂盒组成：用于扩增所述49个SNP位点的引物组合物，PCR反应液和超纯水。检测步骤：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；(2)将上述49个SNP位点分成五组或五组以上，设计五组或五组以上的引物组合物；(3)采用步骤(1)所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；(4)按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；(5)结果分析判读。本发明的优势是快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。
背景技术
恶性高热(Malignant Hyperthermia，MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起的骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000～1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％～90％。若患者及时接收治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。
目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。
MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为罗纳丹受体(Ryanodine receptor，RYR1)和编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(L type voltage-dependent calcium channel，L型电压门控Ca2+通道)。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前通过检测RYR1和CACNA1S基因的突变，筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。通过检测与恶性高热相关的49个SNP位点判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。
现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。现简述如下：
1、荧光定量PCR：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强；其缺点：
(1)通量低，如同时检测49个SNP位点，需要至少分10个反应管检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；
(2)难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；
(3)探针标记成本高。
2、基因芯片技术：
基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。
3、测序法：
Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能发现已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个一个位点测序，多个SNP位点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术还不够成熟。
由于恶性高热易感基因SNP数量较多，以上技术均具有明显局限性，因此很难应用于恶性高热易感基因检测。
目前，国内外尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的恶性高热易感基因检测方案的报道。
发明内容
本发明基于多重聚合酶链式反应(PCR)和毛细电泳(CE)分离技术检测，提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低的检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。
具体地，本发明将与恶性高热相关的49个SNP位点分成五组或五组以上，根据分组的SNP位点，采用对应的五组或五组以上的引物组合物，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的49个单核苷酸多态性(SNP)位点。其中，各组引物组合物包含所检测的SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及3个人基因组DNA内参和1个PCR反应内参的正反向扩增引物。所述人类基因组内参基因(huDNA)用于监测样本DNA质量，可避免DNA质量不好而造成的假阴性；PCR反应内参(pcDNA)用于监测PCR反应过程，可避免PCR反应失败造成的假阴性。本发明针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中两条引物(即正向引物)分别与野生基因和突变的易感基因互补结合，另一条引物(即反向引物)作为共用引物，分别与野生型引物和突变型引物扩增出长度相差2～10bp的PCR产物片段。
本发明提供了一种检测恶性高热易感基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增49个SNP位点的引物组合物、PCR反应液和超纯水。
本发明所采用的PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
本发明提供的检测恶性高热易感基因的方法步骤如下：
(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；
(2)将49个SNP位点分成五组或五组以上；设计五组或五组以上的引物组合物；
(3)采用步骤(1)所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；
(4)毛细电泳，按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；
(5)结果分析判读，根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，从而判断恶性高热易感性，如表1所示。
表1 SNP位点基因型对应临床参考信息
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法的缺陷，具有以下优势：
(1)高通量，能实现49个SNP位点的同步检测；
(2)准确性高，采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性产物、引物二聚体和特异性产物分离，最大程度降低假阳性；
(3)灵敏度高，本试剂盒能检测含量低至1ng/反应的样品；
(4)使用经济，本发明提供的试剂盒检测成本低，利于大规模推广。
附图说明
图1为一个麻醉手术患者的口腔脱落细胞采集卡样本(样品未经核酸提取直接PCR扩增)的恶性高热易感基因的检测结果。49个SNP位点被分为五组，如表2.1～2.5所示。图1.A为A组SNP检测结果，无突变；图1.B为B组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.7361G＞A位点发生GG→GA杂合突变，导致患者对恶性高热易感；图1.C为C组SNP检测结果，无突变；图1.D为D组SNP检测结果，无突变；图1.E为E组SNP检测结果，无突变。
图2为一个麻醉手术患者的血液样本(经核酸提取)的恶性高热易感基因的检测结果。49个SNP位点被分为五组，如表2.1-2.5所示。图2.A为A组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.487C＞T位点发生CC→CT杂合突变，导致患者对恶性高热易感；图2.B为B组SNP检测结果，无突变；图2.C为C组SNP检测结果，无突变；图2.D为D组SNP检测结果，无突变；图2.E为E组SNP检测结果，无突变。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒。所述检测方法将49个易感基因SNP位点分成五组或五组以上，设计5组或5组以上的引物组合物对样本进行检测。所述SNP位点如表1所示。本发明针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中两条引物(即正向引物)，分别于野生基因和突变的易感基因互补结合，另一条引物(即反向引物)作为反向引物，分别扩增出长度相差2～10bp的PCR产物片段。
本发明所述检测方法包括如下步骤：
(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；
(2)将上述49个SNP位点分成五组或五组以上，设计五组或五组以上的引物组合物；
(3)采用步骤(1)所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；
(4)按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；
(5)结果分析判读，根据检测峰图，可获得每个SNP位点的基因型，从而判断恶性高热易感性，如表1所示。
在步骤(1)中，可以采集口腔脱落细胞样品或血液样品。采集的口腔细胞可以保存在本领域常用的细胞采集卡上，例如苏州新海生物科技股份有限公司定制的指示性NACC采集卡。
在步骤(3)中，所述PCR反应条件可以是本领域常规的反应条件，例如95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃1min，循环29次；60℃，15min；4℃直至收取PCR产物。
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所述的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1和2所述五组引物组合物MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH PrimerMix C、MH Primer Mix D及MH Primer Mix E见表2.1～2.5。
实施例1和2所述PCR反应液包括以下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
表2.1 A组SNP位点及引物组合物
表2.2 B组SNP位点及引物组合物
表2.3 C组SNP位点及引物组合物
表2.4 D组SNP位点及引物组合物
表2.5 E组SNP位点及引物组合物
实施例1
本实例使用苏州新海生物科技股份有限公司定制的指示性NACC采集卡(货号：NH9510)采集一名麻醉手术患者口腔脱落细胞。以细胞采集卡样品为模板直接进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1.采集样本
使用口腔拭子采集一个麻醉手术患者的口腔脱落细胞，保存于细胞采集卡上。
2.将49个SNP位点分成五组，如表2.1～2.5所示，设计如表所示的引物，生产用于检测恶性高热易感基因的试剂盒，包括以下组分：
(1)5组引物组合物MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C、MHPrimer Mix D和MH Primer Mix E；
(2)PCR反应液；
(3)超纯水。
3.以细胞采集卡为模板进行PCR反应
1)按表3在96孔样品板/PCR八联管中加入试剂和样品。配制5个PCR体系，向5个PCR管中均加入PCR反应液、超纯水，使用1.0mm打孔器取细胞采集卡样本加入到5个管中，再分别向5个管中加入引物组合物MH Primer Mix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C、MHPrimer Mix D和MH Primer Mix E。
表3 PCR反应体系
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| PCR反应液 | 14 |
| 引物组合物 | 2 |
| 细胞采集卡 | 0 |
| 水 | 4 |
| Total | 20 |
2)将配制好的5个PCR体系混匀离心，按表4的程序进行PCR反应：
表4 PCR扩增程序
4.毛细电泳分离样品
1)制备电泳样品
按表5在96孔样品板中配制电泳样品。
2)毛细电泳分离样品
将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，详见ABI3500操作说明书。
表5电泳样品配制
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| Hi-Di | 8.7 |
| SIZE-500 | 0.3 |
| PCR产物 | 1 |
| Total | 10 |
5.结果分析
根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样本是否为恶性高热易感。图1为一个麻醉手术患者的口腔脱落细胞采集卡样本检测峰图。该样本B组SNP位点中RYR1基因c.7361G＞A位点发生GG→GA杂合突变，携带恶性高热易感基因。B组其他位点均为野生纯合型。A、C、D和E组SNP位点均为野生纯合型。因此，可判断该样本为恶性高热易感者(表6)。
表6一个麻醉手术患者的口腔脱落细胞采集卡样本检测结果
实施例2
本实例采集一个麻醉手术患者的血液样本并提取核酸，以提取的核酸为模板进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1.采集样本
采集一个麻醉手术患者的血液样本并提取核酸。
2.将49个SNP位点分成五组，如表2.1～2.5所示，设计如表所示的引物，生产用于检测恶性高热易感基因的试剂盒，试剂盒组分如实施例1所述。
3.以提取的核酸为模板进行PCR反应
1)按表7在96孔样品板/PCR八联管上加入试剂和样品。配制5个PCR体系，向5个PCR管中均加入核酸样品、PCR反应液、超纯水，再分别向5个管中加入引物组合物MH PrimerMix A、MH Primer Mix B、MH Primer Mix C、MH Primer Mix D和MH Primer Mix E。
表7 PCR反应体系
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| PCR反应液 | 14 |
| 引物组合物 | 2 |
| 核酸 | 2 |
| 水 | 2 |
| Total | 20 |
2)将配制好的5个PCR体系混匀离心，进行PCR反应，PCR程序如实施例1所述。
3)毛细电泳分离样品，操作步骤如实施例1所述。
4.结果分析
根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样本是否为恶性高热易感。图2为一个人类的血液样本检测结果。该样本A组SNP位点中RYR1基因c.487C＞T位点发生CC→CT杂合突变，携带恶性高热易感基因。A组其他位点均为野生纯合型。B、C、D和E组SNP位点均为野生纯合型。因此，可判断该样本为恶性高热易感者(表8)。
表8一个麻醉手术患者的血液样本检测结果
本发明采用的SNP检测方法基于多重PCR和毛细管电泳(CE)分离技术。在同一个反应管中同时加入多对特异性基因扩增引物及内参引物，获得大小不一的基因扩增片段，使用毛细管电泳进行分离，进而分析SNP基因型。本发明所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：
1、高通量：能实现同步检测多个SNP位点；
2、准确性高：采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
3、灵敏度高：本系统能检测含量低至1ng/反应的DNA样品，具有超高灵敏度；
4、方法简便，使用经济：本发明提供试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；检测成本低，利于大规模推广；
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 宁波海尔施基因科技有限公司、 四川大学华西医院
<120> 一种检测恶性高热易感基因的方法及试剂盒
<130> 2019-07-10
<150> 2019111248357
<151> 2019-11-18
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tgaggacaca gtacaggacc tcc 23
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actgggagct ctgtgagacc ag 22
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gtaaggccac cacggtgtac aggtacat 28
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ttattccccc acgtggatac t 21
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agctgtcatt gactgagccc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 145
ccttatgcca tccttgttct gac 23
<210> 146
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 146
catggcctgc ttactcacaa g 21
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 147
gccagatata cgcgttgaca 20
<210> 148
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 148
agggcgtact tggcatatga t 21
Claims (6)
1.一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，所述方法用于非疾病诊断目的；将与恶性高热易感性相关的49个SNP位点分成五组或五组以上，采用五组或五组以上的引物组合物对样本进行多重PCR扩增，结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的49个SNP位点；所述49个SNP位点如表1所示：
表1恶性高热易感性相关的49个SNP位点
所述方法包括如下检测步骤：
(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸；
(2)将所述49个SNP位点分成五组或五组以上，设计五组或五组以上的引物组合物；
(3)采用步骤1所述细胞采集卡或核酸为模板进行多重PCR扩增；
(4)按PCR产物片段长短/质量同步分离49个SNP位点；
(5)结果分析判读。
2.如权利要求1所述的一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，检测步骤(1)所述口腔脱落细胞保存于细胞采集卡上，可不需要核酸提取，直接用于PCR扩增。
3.如权利要求2所述的一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，每组引物组合物中包含用于扩增其对应组的SNP位点、3个人基因组DNA内参和1个PCR反应内参的正反向引物。
4.如权利要求3所述的一种检测恶性高热易感基因的方法，其特征在于，针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物与野生型和突变型引物分别扩增出片段长短有2～10个碱基差异的片段。
5.一种检测恶性高热易感基因的试剂盒，其特征在于，包括同步扩增恶性高热易感性相关的49个SNP位点及4个内参基因的五组引物组合物；所述49个SNP位点包括RYR1基因的47个SNP位点及CACNA1S基因的2个SNP位点，如表1所示；所述五组引物组合物详见表2.1～2.5；其中，引物组合物MH Primer Mix A包含了A组13个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物MH Primer Mix B包含了B组9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物MH Primer Mix C包含了C组10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物MH Primer Mix D包含了D组9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物MH Primer Mix E包含了E组8个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物。
表2.1 A组SNP位点及引物组合物
表2.2 B组SNP位点及引物组合物
表2.3 C组SNP位点及引物组合物
表2.4 D组SNP位点及引物组合物
表2.5 E组SNP位点及引物组合物
6.如权利要求5所述的一种检测恶性高热易感基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下组分：超纯水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
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