CN109022555B - 一种检测ryr1基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法。本发明采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的RYR1基因35个单核苷酸多态性(SNP)位点。试剂盒组成：用于扩增所述35个SNP位点及内参的4管引物组合物、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。试剂盒使用方法：(1)采集样本提取核酸，或采集口腔脱落细胞于细胞采集卡上；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离35个SNP位点；(4)结果分析判读。本发明的优势是灵敏度高、特异性强、通量高、成本低，能快速同步检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及一种多重基因检测试剂盒，尤其是涉及一种同步检测RYR1基因35个单核苷酸多态性的引物组合物、多重基因检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
恶性高热(Malignant Hyperthermia，MH)是目前所知的唯一可由常规麻醉用药引起手术死亡的遗传性疾病。在全麻过程中，挥发性吸入麻醉药和去极化肌松药-琥珀胆碱可引起的骨骼肌异常高代谢状态，患者出现高热、酸中毒、低氧血症、高血钾、心律失常等一系列变化，一旦发病，病情发展迅速，在没有特效拮抗药丹曲林的情况下，一般临床措施难以控制病情，最终病人可因器官功能衰竭而死亡。恶性高热在普通人群中的发病率为1/10000～1/250000。由于临床上遇到恶性高热，往往都没有做好预防措施，治疗不及时，致死率高达70％～90％。若患者及时接收治疗并使用特效药丹曲林，致死率可降低到10％以内。
MH作为一种常染色体显性遗传病，研究证实至少有5个基因的异常与其发生有关，但已明确的致病基因仅为罗纳丹受体(Ryanodine receptor，RYR1)和编码二氢吡啶受体α1亚单位的CACNA1S(L type voltage-dependent calcium channel，L型电压门控Ca2+通道)。2017年8月EMHG公布，目前已确认35个单核苷酸突变体(SNP)可以作为恶性高热易感性的最重要判断依据，包括RYR1的35个单核苷酸突变体。因此，对于采用全麻麻醉的手术患者，术前筛查恶性高热易感性，可帮助医生调整麻醉方案，有效避免恶性高热发生。
目前，国际上公认咖啡因-氟烷体外肌挛缩试验(CHCT)是确诊MH易感性的金标准。CHCT价格昂贵，局限于专业测试中心使用，需要外科手术切取患者一块肌肉，创伤性较大，且不容易区分假阳性和假阴性结果，在某种程度上限制了其广泛应用。通过检测与恶性高热相关的RYR1基因SNP位点判断恶性高热易感性，操作方便，成本较低，是一种可行性较高的检测方案。
现有的SNP位点检测方法主要有三种：荧光定量PCR、基因芯片技术、测序法。现简述如下：
1、荧光定量PCR：采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对SNP位点设计特异性的探针。其优点是灵敏度高、准确性强；其缺点：
(1)通量低，如同时检测35个SNP位点，需要一个一个位点检测，耗时长，样品用量大，难以适应临床需求；
(2)难以设置内参质控，无法避免假阳性和假阴性；
(3)探针标记成本高。
2、基因芯片技术：
基因芯片是通过微加工技术，将数以万计、乃至百万计的特定序列的DNA片段(基因探针)，有规律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，构成的一个二维DNA探针阵列，利用这类芯片与标记的生物样品进行杂交，可对样品的基因表达谱生物信息进行快速定性和定量分析。其优点是通量高、操作简便；缺点是检测成本昂贵、重复性差、灵敏度较低。此外，芯片的种类较多，难以制定一个统一的质量控制标准也限制了基因芯片技术的普及。
3、测序法：
Sanger测序法是SNP分型金标准，不仅能发现已知SNP，也能发现未知SNP。但Sanger测序法操作复杂、成本较高、周期长，需要一个一个位点测序，多个SNP位点测序耗时长、累计价格相对昂贵。二代测序技术实现了边合成边测序，具有高通量、高效率的优势。然而二代测序平台价格昂贵、普及度低，作为SNP检测技术还不够成熟。
由于恶性高热易感基因SNP数量较多，以上技术均具有明显局限性，因此很难应用于恶性高热易感基因检测。
目前，国内外尚无有关以多重PCR和CE分离技术为基础的恶性高热易感基因检测方案的报道。
发明内容
本发明提供了一种快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低的检测RYR1基因多态性的试剂盒及其使用方法。其特征在于，采用两管以上多重PCR结合片段长短/质量分析方法，同步快速定性检测与恶性高热易感性相关的RYR1基因35个单核苷酸多态性(SNP)位点。
试剂盒组成：用于扩增所述35个SNP位点及内参的4管引物组合物(详见表1.1～1.4)、PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水。
试剂盒使用方法：(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，直接扩增或提取核酸；亦可采集血液样本并提取核酸；(2)采用步骤1所述细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增；(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离35个SNP位点；(4)结果分析判读。
本试剂盒将所述35个SNP位点分成四组，并在每组中加入4个内参(3个人类基因组内参(huDNA)和1个PCR反应内参(pcDNA))，同步检测4组引物组合物。其中，引物组合物Primer Mix A包含了A组9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物Primer Mix B包含了B组9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物Primer Mix C包含了C组10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物Primer Mix D包含了D组7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物(SNP位点及引物组合物如表1.1～1.4所示)。
表1.1 A组SNP位点及内参引物组合物
表1.2 B组SNP位点及内参引物组合物
表1.3 C组SNP位点及内参引物组合物
表1.4 D组SNP位点及内参引物组合物
本试剂盒包括四组阳性对照品(POS A、POS B、POS C、POS D)，用于SNP检测系统测试及每次引物订购后的质量控制。其中POS A为组别A所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；POSB为组别B所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；POSC为组别C所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；POSD为组别D所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物。
本发明所采用的PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
检测步骤：
(1)采集口腔脱落细胞保存于细胞采集卡，或采集血液样本并提取核酸。其中，保存于细胞采集卡上的口腔脱落细胞，亦可不进行核酸提取，直接用于PCR扩增，节省了核酸提取的时间；
(2)将与RYR1的35个SNP位点分成两个或多个多重PCR反应体系，以细胞采集卡或提取的核酸为模板进行多重PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5min；94℃10s，61℃1min；70℃1min，循环29次；60℃，15min；4℃直至收取PCR产物。
(3)按PCR产物片段长短/质量同步分离35个SNP位点及内参。本发明采用毛细电泳分离PCR产物：在96孔样品板中配制电泳样品，取高纯甲酰胺8.7μL，标准品SIZE-5000.3μL，PCR产物1μL，混匀离心。将配制好的电泳样品置于3500基因分析仪中，按操作说明进行毛细电泳。
(4)根据所设计的每个检测基因的片段长度可获得峰图，得到每个SNP位点的基因型检测结果。
(5)根据峰图进行结果分析，从而判断恶性高热易感性。如附图及表2.1～2.4所示。
表2.1 A组SNP位点基因型对应临床参考信息
表2.2 B组SNP位点基因型对应临床参考信息
表2.3 C组SNP位点基因型对应临床参考信息
表2.4 D组SNP位点基因型对应临床参考信息
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
本发明创立了一种同步检测RYR1基因的35个SNP位点的检测方案；灵敏度可达到清晰检测1个碱基的DNA突变；特异性和准确度可达到qPCR水平；可在短时间内(2.5小时)同时完成多个样品35个SNP位点的检测；huDNA内参和反应内参pcDNA的使用可监测DNA提取及PCR反应的效率，避免了假阴性和假阳性。
综上所述，本发明提供了一种同步检测与恶性高热易感性相关的RYR1基因35个SNP位点的检测方案，具有快速、灵敏度高、重复性好、特异性强、通量高、成本低等优势。
附图说明
图1为一个人类的口腔脱落细胞采集卡样本(样品未经核酸提取直接PCR扩增)的RYR1基因检测结果。图1.A为A组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.6617C＞G/T位点发生CC＞CT杂合子突变，导致患者对恶性高热易感；图1.B为B组SNP检测结果，无突变；图1.C为C组SNP检测结果，无突变；图1.D为D组SNP检测结果，无突变。
图2为采用一个人类的血液样本(经核酸提取)检测RYR1基因的结果。图2.A为A组SNP检测结果，无突变；图2.B为B组SNP检测结果，可见RYR1基因的c.1654C＞T位点发生CC＞CT杂合子突变，导致患者对恶性高热易感；图2.C为C组SNP检测结果，无突变；图2.D为D组SNP检测结果，无突变。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施例和附图作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于对本发明进一步说明，而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容后，该领域的技术人员对本发明作出一些非本质的改动或调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1和2所述四管引物组合物Primer Mix A、Primer Mix B、Primer Mix C、Primer Mix D见表1.1～1.4。
实施例1和2所述PCR反应液包括以下组分：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
实施例1和2所述四管阳性对照液POS A、POS B、POS C、POS D为表1.1～1.4所述SNP位点和4个内参基因所对应的质粒混合物。
实施例1
本实例以细胞采集卡为模板直接进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1.生产用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒，包括以下组分：
1)四管引物组合物Primer Mix A、Primer Mix B、Primer Mix C、Primer Mix D；
2)PCR反应液；
3)四管阳性对照液POS A、POS B、POS C、POS D；
4)无核酸酶水。
2.采集样本
使用口腔拭子采集人类的口腔脱落细胞，保存于细胞采集卡上。
3.以细胞采集卡为模板进行PCR反应
1)按表3在96孔样品板/PCR八联管中加入试剂和样品。配制4个PCR体系，向4个PCR管中均加入PCR反应液、无核酸酶水，分别向4个管中加入引物组合物Primer Mix A、PrimerMix B、Primer Mix C、Primer Mix D，再使用1.0mm打孔器取细胞采集卡样本加入到4个管中。
表3 PCR反应体系
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| PCR反应液 | 14 |
| 引物组合物 | 2 |
| 细胞采集卡 | 0 |
| 水 | 4 |
| Total | 20 |
2)将配制好的4个PCR体系混匀离心，按表4的程序进行PCR反应：
表4 PCR扩增程序
4.毛细电泳分离样品
1)制备电泳样品
按表5在96孔样品板中配制电泳样品。
2)毛细电泳分离样品
将样品板置于3500DX基因分析仪中，选择“fragment”电泳方法，进行电泳，详见ABI3500操作说明书。
表5电泳样品配制
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| Hi-Di | 8.7 |
| SIZE-500 | 0.3 |
| PCR产物 | 1 |
| Total | 10 |
5.结果分析
根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样本是否为恶性高热易感。附图1为一个人类的口腔脱落细胞采集卡样本检测峰图。该样本A组(图1.A)SNP位点中RYR1基因c.6617C＞G/T位点出现CC＞CT杂合子突变，携带恶性高热易感基因。A组其他位点均为野生纯合型。B、C和D组(图1.B、1.C和1.D)SNP位点均为野生纯合型。因此，可判断该样本为恶性高热易感者(表6)。
表6 一个人类的口腔脱落细胞采集卡检测结果
实施例2
本实例采集血液样本并提取核酸，以提取的核酸为模板进行多重PCR反应，最终用毛细电泳方法分离样品，具体步骤如下：
1.生产用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒
试剂盒组分如实施例1所述。
2.采集样本
采集一个人类的血液样本并提取核酸。
3.以提取的核酸为模板进行PCR反应
1)按表7在96孔样品板/PCR八联管上加入试剂和样品。配制4个PCR体系，向4个PCR管中均加入核酸样品、PCR反应液、无核酸酶水，再分别向4个管中加入引物组合物PrimerMix A、Primer Mix B、Primer Mix C和Primer Mix D。
表7 PCR反应体系
| 试剂 | 量(μL)/孔 |
| PCR反应液 | 14 |
| 引物组合物 | 2 |
| 核酸 | 2 |
| 水 | 2 |
| Total | 20 |
2)将配制好的4个PCR体系混匀离心，进行PCR反应，PCR程序如实施例1所述。
3)毛细电泳分离样品，操作步骤如实施例1所述。
4.结果分析
根据各特征峰出现的位置和数量，确定基因型，从而判断样本是否为恶性高热易感。附图2为一个人类的血液样本检测结果。该样本B组(图2.B)SNP位点中RYR1基因c.1654C＞T位点出现CC＞CT杂合子突变，携带恶性高热易感基因。B组其他位点均为野生纯合型。A、C和D组(图2.A、2.C和2.D)SNP位点均为野生纯合型。因此，可判断该样本为恶性高热易感者(表8)。
表8 一个人类的血液样本检测结果
本发明采用的SNP检测方法基于多重PCR和毛细管电泳(CE)分离技术。在同一个反应管中同时加入多对特异性基因扩增引物及内参引物，获得大小不一的基因扩增片段，使用毛细管电泳进行分离，进而分析SNP基因型。本发明所采用的检测方法和试剂盒能快速有效地检测多个SNP位点，克服了传统方法存在的缺陷，具有以下优势：
1、高通量：能实现同步检测35个SNP位点；
2、准确性高：采用CE技术对PCR产物进行分离，可将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；
3、灵敏度高：本系统能检测含量低至1ng/反应的DNA样品，具有超高灵敏度；
4、方法简便，使用经济：本发明提供试剂、多重PCR引物设计、结果分析等全套实验方案；检测成本低，利于大规模推广。
上述说明并非对发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 宁波海尔施基因科技有限公司
<120> 一种检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒及其使用方法
<130> 2018-06-14
<160> 113
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<213> 人工序列(Unknown)
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gtccagcttg agtgcctcgg ccagatcag 29
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<211> 24
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gcttgagtgc ctcggccaga taca 24
<210> 32
<211> 22
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agctagccat cgagagactg ag 22
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<211> 29
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gtaatcaggc gagagcgtgg aggagaaag 29
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gtggcgagag cgtggaggag atca 24
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tgatgcggat ggcctcttcg atg 23
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gccttgatcg acctgctcgg cca 23
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accctggggc tgtcttggtc ac 22
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gatgcatggg tgaggccctg cggatcag 28
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gtgggtgagg ccctgcggat aca 23
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tccatcccct ctgcaccttt g 21
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<400> 42
gtattgtggg tgacagagga caggattg 28
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gtgggtgaca gaggacagga aga 23
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actccccaaa cagagctggc ac 22
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tcatctcgag ggaggtgtgt gacc 24
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gtagagtggc tggtcagcaa gctggagc 28
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gtggctggtc agcaagctgg ctt 23
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tgaggacaca gtacaggacc tcc 23
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gtcgtgttca aggagcagct caagctac 28
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agattctctg ccccttcaga cgc 23
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gtgttgtata ggccattggt gctgtcg 27
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gtataggcca ttggtgctgg gc 22
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actcctaggc catgctgcac cag 23
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gaagagtggg acccctacct aggagttcgg 30
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gtccaatctg cacgatgagc agcgagag 28
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gtctgcacga tgagcagcga tca 23
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agctgggccc aagaggactt cgt 23
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gtcttcgatg gcagccagca ccg 23
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agaacgccaa tgtggtggtg cgg 23
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gtaacgtcct ccaagggcac aagggagag 29
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gtcctccaag ggcacaaggg acca 24
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acaggcagag gaacgagggc tg 22
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gagaaggccc acggtcatca caag 24
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agtgggtggt gaagggataa gg 22
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gacccaagag ggacatcacc ctat 24
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gaagtgaccc aagagggaca tcaccattc 29
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actccccaaa cagagctggc ac 22
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gtaagttctc agtaataaga tcttggttgg gga 33
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ttatcccgat gcgctgtcct ttcc 24
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gagtagaggt ctgaaggaga aaaggtctg 29
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gaggtctgaa ggagaaaagg tgct 24
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gtatcttccc ccctcagctt ctctaatcag 30
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gtcccccctc agcttctcta ataca 25
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tgaggacaca gtacaggacc tcc 23
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gtagacacgc catcatgtcc ttctatgcag 30
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gacgccatca tgtccttcta tgaca 25
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<400> 89
atacccaaca ttgctagtcc aggacc 26
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<400> 90
gaccagtatg ggtgaggccc tgcggatac 29
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gtatgggtga ggccctgcgg agct 24
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<400> 92
tccatcccct ctgcaccttt g 21
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gatacgcacc atcctgtcct ctgtcacac 29
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<213> 人工序列(Unknown)
<400> 94
gcaccatcct gtcctctgtc aact 24
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<400> 95
tctaccttgc tgccccacac ac 22
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gtgggtcctc gatctcgtcc cgaa 24
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atgtcgaatg aatgagtgac cag 23
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gtggagtcca tggtgctctt cctggagc 28
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Unknown)
<400> 100
gtccatggtg ctcttcctgg tct 23
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agcgattatg atatgtccac aatccc 26
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actaggatcc tgcttcctgg ta 22
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gttgaaggtc atcacagagc catg 24
<210> 104
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aactttgctc ctgcccttgg 20
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gctgttcccc acccacagtt c 21
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<211> 21
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ttattccccc acgtggatac t 21
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<400> 107
ggctccatca tgaagaaaga gt 22
<210> 108
<211> 20
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agctgtcatt gactgagccc 20
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<212> DNA
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<400> 109
ttgtgacagc aacccttttg g 21
<210> 110
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<212> DNA
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ccttatgcca tccttgttct gac 23
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<211> 21
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<400> 111
catggcctgc ttactcacaa g 21
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<400> 112
gccagatata cgcgttgaca 20
<210> 113
<211> 20
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<213> 人工序列(Unknown)
<400> 113
gggcgtactt ggcatatgat 20
Claims (5)
1.一种用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，包括同步扩增35个SNP位点及内参的4管引物组合物，PCR反应液、4管阳性对照液和无核酸酶水，所述同步扩增35个SNP位点及内参的4管引物组合物详见表1.1～1.4所示；其中，引物组合物PrimerMix A包含了A组9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物Primer Mix B包含了B组9个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物Primer Mix C包含了C组10个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；引物组合物Primer Mix D包含了D组7个SNP位点不同基因型的正反向扩增引物及4个内参的正反向扩增引物；
表1.1 A组SNP位点及内参的引物组合物
表1.2 B组SNP位点及内参的引物组合物
表1.3 C组SNP位点及内参的引物组合物
表1.4 D组SNP位点及内参的引物组合物
2.如权利要求1所述的一种用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，因SNP位点只有1个碱基突变，故针对每一个SNP位点设计了3条引物，其中2条引物分别与野生型基因和突变型基因互补结合，1条共用的引物与另一段的野生型和突变型引物分别扩增出片段长短有2～10个碱基差异的片段。
3.如权利要求1所述的一种用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，在多重PCR反应中加入3个人类基因组(huDNA)内参和一个PCR反应内参(pcDNA)。
4.如权利要求1所述的一种用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括四管阳性对照液(POS A、POS B、POS C、POS D)，其中POS A为组别A所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；POS B为组别B所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；POS C为组别C所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物；POS D为组别D所包含的SNP位点和内参基因所对应的质粒混合物。
5.如权利要求1所述的一种用于检测RYR1基因多态性的多重基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用的PCR反应液由以下组分组成：无核酸酶水、2×PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTP。
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