具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义,本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解,但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用,术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的,且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案,这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”,“所述”,包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10%,优选±5%。
此外,说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类,是用于区分相似的元素,不是描述顺序或时间次序必须的。应理解,如此应用的术语在适当的环境下可互换,并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者,单链核酸可为不来源于任何双链DNA的单链核酸。
下面结合实施例对本发明做进一步的较为完整、详细的描述。
实施例1:抗抑郁个性化用药相关基因位点及检测引物组合的筛选
本实施例综合根据国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定的《药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)》专家指南、CPIC、诊疗指南、FDA药物说明书以及pharmGKB数据库中临床的证据级进行的影响抗抑郁用药药效的作用靶点的筛选。
本实施例初筛了22种抗抑郁药:阿米替林、氯米帕明、多塞平、安非他酮、西酞普兰、地昔帕明、艾司西酞普兰、氟西汀、氟伏沙明、丙咪嗪、米氮平、去甲替林、帕罗西汀、舍曲林、文拉法辛、曲米帕明、奈法唑酮、奥沙西泮/劳拉西泮、度洛西汀、左旋米那普仑、司来吉兰、伏硫西汀。这些药物的作用靶点包括如下:ANKK1、CYP2B6、CYP2C19、CYP2D6、FKBP5、GRIK4、HTR1A、HTR2A、HTR1B、SLC6A4、UGT2B15。再根据所述基因靶点,确定的检测位点以及根据pharmGKB确定的相关性等级情况如下表:
进一步,综合各位点基因序列的特点,体系中位点的大小排布以及体系优化的难度情况,最终选择的作用靶点基因如下:ANKK1、CYP2C19、CYP2D6、FKBP5、GRIK4、HTR1A、HTR2A、SLC6A4、UGT2B15。
根据作用靶点基因最终确定的SNP位点信息如下:
针对上述位点进行引物的初步设计,根据等位基因特异性PCR原理,每条特异引物只能与对应基因型的DNA模板结合并进行扩增,初步设计引物序列如下:
ANKK1基因2137G>A位点:
正向野生型引物:5’-AGCCATCCTCAAAGTGCTGGTCG-3’,
正向突变型引物:5’-ACACAGCCATCCTCAAAGTGCTGGTCA-3’,
反向共用引物:5’-TGCCCTCTAGGAAGGACATGATG-3’;
UGT2B15基因253T>G位点:
正向野生型引物:5’-AGAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAATA-3’,
正向突变型引物:5’-ATCGAGAATTTTCAGAAGAGAATCTTCCAAATC-3’,
反向共用引物:5’-GCCCACAGAATACAGCCATTGGATAA-3’;
FKBP5基因-20+18122T>C位点:
正向野生型引物:5’-ATAGTGAGGAGTTATTGGACCAAGAT-3’,
正向突变型引物:5’-CGAGATAGTGAGGAGTTATTGGACCAAGAC-3’,
反向共用引物:5’-GTGATCTGCCCATCCTGGCCTCCTA-3’;
SLC6A4基因S-/L-型:
正向引物:5’-CCCTGTACCCCTCCTAGGATCGCTC-3’,
反向荧光引物:5’-GGTAGGGTGCAAGGAGAATGCTGGA-3’;
HTR1A基因-1019G>C位点:
正向野生型引物:5’-ATGGAAGAAGACCGAGTGTGTCTTCC-3’,
正向突变型引物:5’-ATTGATGGAAGAAGACCGAGTGTGTCTTCG-3’,
反向共用引物:5’-TGGACTGTTAGATGATAACGGAGGT-3’;
HTR2A基因614-2211T>C位点:
正向野生型引物:5’-TTGCATAGGCAAGTGACAAATATTGTT-3’,
正向突变型引物:5’-GGGCTTGCATAGGCAAGTGACAAATATTGTC-3’,
反向共用引物:5’-CATGTCACCTCACATTGGCCATCGTGG-3’;
GRIK4基因83-10039T>C位点:
正向野生型引物:5’-CAAAAGCAATTGGAGACTGGTTATT-3’,
正向突变型引物:5’-CAACCAAAAGCAATTGGAGACTGGTTATC-3’,
反向共用引物:5’-AGATTCTTCCTGTTAACATTCCTACG-3’;
CYP2C19*2基因681G>A位点:
正向野生型引物:5’-TTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCG-3’,
正向突变型引物:5’-TAATTTTCCCACTATCATTGATTATTTCCCA-3’,
反向共用引物:5’-AACTAGTCAATGAATCACAGATACGC-3’;
CYP2C19*3基因636G>A位点:
正向野生型引物:5’-AACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGG-3’,
正向突变型引物:5’-TGAAAACATCAGGATTGTAAGCACCCCCTGA-3’,
反向共用引物:5’-GATATTCACCCCATGGCTGTCTA-3’;
CYP2C19*4基因1A>G位点:
正向野生型引物:5’-GTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCAA-3’,
正向突变型引物:5’-GGTTGTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCAG-3’,
反向共用引物:5’-ACATTGGTTAAGGATTTGCTGAC-3’;
CYP2C19*17基因-806C>T位点:
正向野生型引物:5’-GGCGCATTATCTCTTACATCAGAGATG-3’,
正向突变型引物:5’-TCGTGGCGCATTATCTCTTACATCAGAGATA-3’,
反向共用引物:5’-ATCTCTCGGGCTGTTTTCCTTAGATAA-3’;
CYP2D6*2(rs1135840)基因1457G>C位点:
正向野生型引物:5’-TGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAG-3’,
正向突变型引物:5’-ACCATGGTGTCTTTGCTTTCCTGGTGAC-3’,
反向共用引物:5’-CGTACCCCTGTCTCAAATGCGGCCA-3’;
CYP2D6*2(rs16947)基因886C>T位点:
正向野生型引物:5’-AGCAGCTTCAATGATGAGAACCTGC-3’,
正向突变型引物:5’-TGAGAGCAGCTTCAATGATGAGAACCTGT-3’,
反向共用引物:5’-ACTCCTTCTTGCCTCCTATGTTGG-3’;
CYP2D6*3基因775delA位点:
正向野生型引物:5’-GCTGGGCTGGGTCCCAGGTCATCCTG-3’,
正向突变型引物:5’-GGGGGCTGGGCTGGGTCCCAGGTCATCC G-3’,
反向共用引物:5’-CTCTGGGCAAGGAGAGAGGGTGGAG-3’;
CYP2D6*4基因506-1G>A位点:
正向野生型引物:5’-TTACCCGCATCTCCCACCCCCAG-3’,
正向突变型引物:5’-CCCCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAA-3’,
反向共用引物:5’-TATGCAAATCCTGCTCTTCCGAGGCCC-3’;
CYP2D6*6基因454delT位点:
正向野生型引物:5’-GGCGGCCTCCTCGGTCACCCAC-3’,
正向突变型引物:5’-GGCAGGCGGCCTCCTCGGTCACCCC-3’,
反向共用引物:5’-GGGTGGTGGATGGTGGGGCTA-3’;
CYP2D6*10基因100C>T位点:
正向野生型引物:5’-GGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGG-3’,
正向突变型引物:5’-CCCGGGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGA-3’,
反向共用引物:5’-CCCAATGGGCAGTGAGGCAGCCAT-3’;
CYP2D6*17基因320C>A位点:
正向野生型引物:5’-ACCGCCCGCCTGTGCCCATCAC-3’,
正向突变型引物:5’-GCCGACCGCCCGCCTGTGCCCATCAA-3’,
反向共用引物:5’-CCCCATGCTCACACCTCCCTAGTGCAG-3’;
CYP2D6*41基因985+39G>A位点:
正向野生型引物:5’-AAACAGTGCAGGGGCCGAGGGAGG-3’,
正向突变型引物:5’-TGGGAAACAGTGCAGGGGCCGAGGGAGA-3’,
反向共用引物:5’-ACTCCTTCTTGCCTCCTATGTTGG-3’;
为了协调扩增效率、改进产物峰型、便于毛细管电泳检测,本发明进一步对所有都引物进行一系列特定的改动或修饰。示例性的,以rs1135840位点引物筛选为例,该位点引物分别对野生型引物和突变型引物进行了5’端和3’端引入了不同强度的错配,具体筛选结果如图1,(rs1135840位点的三条引物以1:1:1比例混合,分别以金标准确定的野生、杂合、突变样本为模板进行扩增检测,结果显示正确,且无杂峰)。
综上,经过各位点引物的单独筛选,各位点引物的组合优化(优化结果可参考实施例2组合17结果图),确定了本实施例所采用的经过改进优化的最终引物序列如下:
ANKK1基因2137G>A位点:
反向共用引物:5’-TGCCCTCTAGGAAGGACATGATG-3’(SEQ ID NO.3)
UGT2B15基因253T>G位点:
反向共用引物:5’-GCCCACAGAATACAGCCATTGGATAA-3’(SEQ ID NO.6)
FKBP5基因-20+18122T>C位点:
反向共用引物:5’-GTGATCTGCCCATCCTGGCCTCCTA-3’(SEQ ID NO.9)
SLC6A4基因S-/L-型:
正向引物:5’-CCCTGTACCCCTCCTAGGATCGCTC-3’(SEQ ID NO.10)
反向荧光引物:5’-GGTAGGGTGCAAGGAGAATGCTGGA-3’(SEQ ID NO.11)
HTR1A基因-1019G>C位点:
正向野生型引物:5’-ATGGAAGAAGACCGAGTGTGTCTACC-3’(SEQ ID NO.12)
反向共用引物:5’-TGGACTGTTAGATGATAACGGAGGT-3’(SEQ ID NO.14)
HTR2A基因614-2211T>C位点:
反向共用引物:5’-CATGTCACCTCACATTGGCCATCGTGG-3’(SEQ ID NO.17)
GRIK4基因83-10039T>C位点:
反向共用引物:5’-AGATTCTTCCTGTTAACATTCCTACG-3’(SEQ ID NO.20)
CYP2C19*2基因681G>A位点:
反向共用引物:5’-AACTAGTCAATGAATCACAGATACGC-3’(SEQ ID NO.23)
CYP2C19*3基因636G>A位点:
反向共用引物:5’-GATATTCACCCCATGGCTGTCTA-3’(SEQ ID NO.26)
CYP2C19*17基因-806C>T位点:
反向共用引物:5’-ATCTCTCGGGCTGTTTTCCTTAGATAA-3’(SEQ ID NO.29)
CYP2C19*4基因1A>G位点:
正向野生型引物:5’-GTCTTAACAAGAGGAGAAGGCTTCTA-3’(SEQ ID NO.30)
反向共用引物:5’-ACATTGGTTAAGGATTTGCTGAC-3’(SEQ ID NO.32)
CYP2D6*2(rs1135840)基因1457G>C位点:
反向共用引物:5’-CGTACCCCTGTCTCAAATGCGGCCA-3’(SEQ ID NO.35)
CYP2D6*2(rs16947)基因886C>T位点:
反向共用引物:5’-ACTCCTTCTTGCCTCCTATGTTGG-3’(SEQ ID NO.38)
CYP2D6*3基因775delA位点:
反向共用引物:5’-CTCTGGGCAAGGAGAGAGGGTGGAG-3’(SEQ ID NO.41)
CYP2D6*4基因506-1G>A位点:
反向共用引物:5’-TATGCAAATCCTGCTCTTCCGAGGCCC-3’(SEQ ID NO.44)
CYP2D6*6基因454delT位点:
反向共用引物:5’-GGGTGGTGGATGGTGGGGCTA-3’(SEQ ID NO.47)
CYP2D6*10基因100C>T位点:
正向野生型引物:5’-GGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTCG-3’(SEQ ID NO.48)
反向共用引物:5’-CCCAATGGGCAGTGAGGCAGCCAT-3’(SEQ ID NO.50)
CYP2D6*17基因320C>A位点:
正向野生型引物:5’-ACCGCCCGCCTGTGCCCATCCC-3’(SEQ ID NO.51)
反向共用引物:5’-CCCCATGCTCACACCTCCCTAGTGCAG-3’(SEQ ID NO.53)
CYP2D6*41基因985+39G>A位点:
反向共用引物:5’-ACTCCTTCTTGCCTCCTATGTTGG-3’(SEQ ID NO.56)
性别内参位点:
正向引物:5’-CCCTGGGCTCTGTAAAGAATAG-3’(SEQ ID NO.57)
反向引物:5’-ATCAGAGCTTAAACTGGGAAGCTG-3’(SEQ ID NO.58)
内参基因位点1:
正向引物:5’-GTGGTGTCCCAGATAATCTGTAC-3’(SEQ ID NO.59)
反向引物:5’-GGTGAATAACTCCAAATACTCC-3’(SEQ ID NO.60)
内参基因位点2:
正向引物:5’-AGGCTCTAGCAGCAGCTCATG-3’(SEQ ID NO.61)
反向引物:5’-CTGGAAATGACACTGCTACAACTC-3’(SEQ ID NO.62)
其中,1.“-”单下划线代表各引物在引物的3’端-2至-5位改动了1至3个碱基(如上序列是改动后的碱基序列)。
2.“=”双下划线代表引物在引物3’端-15位之后的序列进行了改动,包括末端增加其他序列、改变部分碱基序列(如上序列是改动后的碱基序列)。
3.“▂”粗下划线代表引物在相应位置可进行锁核酸修饰。
4.所有检测位点共用引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
5.对照位点正向引物均在5’端进行FAM或HEX荧光标记。
实施例2:抗抑郁个性化用药相关基因位点检测体系的优化
本实施例对检测抗抑郁个性化用药相关基因19个基因多态性位点的检测体系进行了优化,该体系包含引物组合如实施例1最终优化的引物部分,所有引物按等比例进行混合,配制成10×引物mix。体系中还包含酶、PCR扩增缓冲液,其中PCR扩增缓冲液中包含dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP,以及Mg2+等成分,酶包含热启动DNA Taq酶和UDG酶。
为能够保证高GC位点的扩增,且不影响其他正常GC以及低GC位点的扩增,同时能够对所有位点进行正常判型的条件下,本发明针对所选择的位点引物体系,在体系中添加了DMSO、7-deaze-dGTP、甲酰胺、甜菜碱中的一种或多种,进行添加剂及组合的筛选;同时,对于各种添加剂,分别选取相应的浓度梯度进行测试,具体PCR体系中的工作浓度如下表所示:
|
DMSO |
10mM 7-deaze-dGTP |
5M甜菜碱 |
甲酰胺 |
组合1 |
1.0% |
\ |
\ |
\ |
组合2 |
2.5% |
\ |
\ |
\ |
组合3 |
5.0% |
\ |
\ |
\ |
组合4 |
\ |
0.1mM |
\ |
\ |
组合5 |
\ |
0.25mM |
\ |
\ |
组合6 |
\ |
0.5mM |
\ |
\ |
组合7 |
\ |
\ |
\ |
1.3% |
组合8 |
\ |
\ |
\ |
2.5% |
组合9 |
\ |
\ |
\ |
5.0% |
组合10 |
\ |
\ |
1M |
\ |
组合11 |
\ |
\ |
1.5M |
\ |
组合12 |
\ |
\ |
2M |
\ |
组合13 |
1.0% |
0.1mM |
\ |
\ |
组合14 |
2.5% |
0.25mM |
\ |
\ |
组合15 |
5.0% |
0.5mM |
\ |
\ |
组合16 |
1.0% |
0.1mM |
2M |
\ |
组合17 |
2.5% |
0.25mM |
1.5M |
\ |
组合18 |
5.0% |
0.5mM |
1M |
\ |
综上,根据添加剂的组合实验条件的效果测试,经毛细管电泳检测显示,组合17效果明显优于其他组合,体系中无影响判型的杂峰或非特异性峰,结果见图2。
实施例3:抗抑郁个性化用药相关基因位点检测体系检测性能测试
本实施例中对体系的最低检出限进行测试,同时检测19个基因多态性位点,并加入了个体化识别的三个位点,同时基于毛细管电泳平台进行判读。具体实验步骤如下:
1、准备DNA样本
用收集的新鲜外周血样本采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取基因组DNA,并采用NanoDrop2000(Thermo)测定DNA的浓度及纯度,然后保存基因组DNA。
对提取的DNA进行浓度梯度的稀释,浓度梯度分别为0.5ng/ul、1.0ng/ul、2ng/ul、5ng/ul。
2、PCR扩增体系的配制
该体系包含引物组合如实施例1确定引物部分seq id no.1-62,分别在生工生物工程(上海)有限公司进行,并且所有引物按照实验摸索的等比例进行混合,配制成10×引物mix。
该体系还包含酶、PCR扩增缓冲液,其中PCR扩增缓冲液中包含dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP,Mg2+等以及实施例3中所述组合17的添加剂成分,酶包含热启动DNA Taq酶和UDG酶。
按照下表各组分进行PCR扩增体系的配制,振荡混匀后,根据样本数量进行分装,每管19ul。
组分名称 |
每20ul体系各组分用量(ul) |
PCR扩增缓冲液 |
10 |
10×引物mix |
2 |
酶(含UDG酶) |
0.5 |
模板 |
1 |
水 |
6.5 |
共计 |
20 |
3、加入模板
向对应PCR反应管中,加入各浓度梯度的DNA样本1ul,同时,设置质控对照(质控:1ul质控品,阴性对照:1ul无核酸纯水)。
4、PCR扩增
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内,设置反应体系为20μL。
按以下反应程序进行PCR扩增:
5、扩增产物进行毛细血管电泳检测
配制混有分子量内标和甲酰胺的上样混合液:(0.5μL分子量内标+8.5μL甲酰胺)×检测样品数,涡旋振荡混匀10-15秒;用移液器给每个检测孔分装9μL的甲酰胺和内标混合物;取1ul扩增产物加入甲酰胺和内标混合物里,盖上封板胶盖。按照遗传分析仪用户使用手册步骤进行检测。
6、数据分析
向GeneMapper软件中导入相关文件,输入检测仪下机的原始数据(.fsa文件),分析数据。
结果见下表总结:
根据上表统计检测结果显示,该体系以四个浓度梯度DNA为模板时均能够扩增检测出各目的位点的基因型,且结果一致,但是该体系在以0.5ngDNA为模板时,整体效率低,且对照位点D5S818未出峰,结果经过重复检测,最终得出该体系最低检出限定为1ng(见图3)。
可见,该体系的灵敏度好,可以在DNA量不足的情况下,完成样本的检测,且对检测结果没有影响。
实施例4:临床样本直扩检测以及与测序结果的对比
本实施例采用本发明体系制备成试剂盒,对血液样本直接进行扩增检测,具体以1例抗凝血临床样本的为例进行扩增检测,同时,使用测序的方法对该试剂盒的扩增检测结果进行验证,进而正式本发明引物体系及试剂盒的有效性、特异性及准确性。
一、检测体系
本发明的试剂盒包含PCR Master Mix、质控品、内标。其中PCR Master Mix主要组分包含热启动DNA Taq酶、UDG酶、扩增缓冲液、实施例3中所用添加剂以及各位点扩增引物等。
二、检测方法
步骤1:PCR扩增反应
1)PCR预混溶液分装(在试剂准备区完成)
振荡混匀PCR预混溶液(PCR Master Mix),预计进行3个检测数,每个PCR反应管分装19ul。
2)加入模板(在标本制备区完成)
向对应PCR反应管中,加入待检测血液样本1ul,同时,设置质控对照(质控:1ul质控品,阴性对照:1ul无核酸纯水)。
3)PCR扩增(在扩增区完成)
将各反应管放入PCR扩增仪反应槽内,设置反应体系为20μL。
按实施例3的反应程序条件设置PCR仪,并进行PCR扩增。
步骤2和3:扩增产物的检测和数据的分析
按照实施例3的第5和6进行操作。
步骤4:检测结果的判定
如图所示,图4为临床样本的扩增检测结果图,其中图中野生型SNP标识为“Wt”,突变型则标识为“Mu”。Amel位点男性样本显示为“XY”,女性样本则显示为“X”。
三、Sanger法测序验证:
根据最终确定的SNP位点进行目标样本各位点所在片段的扩增和测序。
四、CE结果与测序结果的对比
根据毛细管电泳检测图,分析得到临床样本通过试剂盒扩增检测的结果分型。对测序公司测序得到的数据进行分析,得到临床样本各位点测序的结果分型。
各位点分型对比结果如下表:
样本检测结果对比
由此可分别获得临床血液样本9个基因19个多态性位点的试剂盒检测结果分型以及测序结果分型,同时,检测结果显示所述试剂盒对临床血液样本进行检测的结果与扩增测序的结果一致。因此,该试剂盒的检测结果与金标准对比是可靠的,可以根据所检测的基因分型及其对应的临床参考信息对病人使用到的药物进行个性化用药。
综上所述,本发明的技术要领及特点,其目的在于让熟知此技术的业内人士能够了解本发明的内容并能以此实施。本发明的内容并不局限在上述的实施例中,凡根据本发明技术思想实质所作的等效变化或修饰,都在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京阅微基因技术有限公司
<120> 一种抗抑郁症个体化用药基因分型检测的复合扩增体系及试剂盒
<130> 2020
<141> 2020-11-04
<160> 62
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaccatcctc aaagtgctgg tag 23
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atacagccat cctcaaagtg ctgggca 27
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgccctctag gaaggacatg atg 23
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgcttttca gaagagaatc ttccaacta 29
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
atgcagaatt ttcagaagag aatcttccaa agc 33
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
gcccacagaa tacagccatt ggataa 26
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
attgtgagga gttattggac caagtt 26
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
attgatagtg aggagttatt ggaccaaaac 30
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
gtgatctgcc catcctggcc tccta 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ccctgtaccc ctcctaggat cgctc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
ggtagggtgc aaggagaatg ctgga 25
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
atggaagaag accgagtgtg tctacc 26
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
atgcatggaa gaagaccgag tgtgtcatcg 30
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tggactgtta gatgataacg gaggt 25
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
atgcataggc aagtgacaaa tattgat 27
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gtttcttcat aggcaagtga caaatatcgt c 31
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
gaaaagcaat tggagactgg ttctt 25
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
atgccaaaag caattggaga ctggttagc 29
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
agattcttcc tgttaacatt cctacg 26
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<211> 27
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<213> Artificial Sequence
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attcccacta tcattgacta tttccag 27
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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aactagtcaa tgaatcacag atacgc 26
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gttaacaatc aggattgtaa gcaccccatg a 31
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attgcattat ctcttacatc agtgatg 27
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