CN111334568A - 一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒 - Google Patents

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CN111334568A CN202010133425.5A CN202010133425A CN111334568A CN 111334568 A CN111334568 A CN 111334568A CN 202010133425 A CN202010133425 A CN 202010133425A CN 111334568 A CN111334568 A CN 111334568A
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Abstract

本发明涉及先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选领域，本发明提供一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒，所述多重连接探针扩增探针及试剂盒均具有如SEQ ID NO.1‑34所示的核苷酸序列。本发明提供的多重连接探针扩增探针及试剂盒可以同时检测多种先天性心脏病基因拷贝数变异类型和易感者筛选基因标志物MALAT1基因rs619586位点单核苷酸多态性，特异性好，反应灵敏，检测时间短，方法简单，成本低廉，临床应用价值高。

Description

一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接 探针扩增探针组合及试剂盒
【技术领域】
本发明涉及先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选领域，特别涉及一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒。
【背景技术】
先天性心脏病(congernital heart diseases，CHD)现已成为广泛发生一种先天性出生缺陷。我国每年约有15-20万先天性心脏病患儿出生，是新生儿非感染性死亡的重要死亡原因之一。先天性心脏病按照有无合并其他畸形大致分为两类，一类为孤立型的先天性心脏病，另一类为综合征型先天性心脏病。综合征型先天性心脏病患儿多呈现出典型的外貌特征，伴或不伴有不同程度智力或生长发育异常及先天性多器官发育畸形等，其常见综合征型先天性心脏病为Down氏综合征，Holt-Oram综合征，努南综合征，DiGeoge综合征等。
近年来，大量流行病学调查研究显示多种因素包括遗传因素，环境因素及其二者的共同作用参与了先天性心脏病的发生，其中，遗传因素与先天性心脏病发生密切相关，其中基因拷贝数变异也是胚胎染色体异常的常见类型。尽管每种基因拷贝数变异综合征发病率都很低，但由于临床检测技术的限制，大量的基因拷贝数变异综合征患者在产前筛查和产前诊断中无法检出，更为重要的是作为胚胎植入前诊断的最主要的样本类型，平衡易位患者的胚胎必须通过分析基因拷贝数变异来判定胚胎是否发生异常。因此，如果在试管婴儿技术中能够避免移植有基因拷贝数变异的胚胎，将具有很重要的意义。
目前基因拷贝数变异检测技术主要有高分辨率核型分析、荧光原位杂交、微阵列此较基因组杂交、SNP芯片、低深度高通量测序技术，其中高分辨率核型分析、荧光原位杂交分辨率有限，费时费力；微阵列此较基因组杂交、SNP芯片、低深度高通量测序技术平台要求高，成本高，周期长。
【发明内容】
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合及试剂盒，以能够同时检测多种先天性心脏病基因拷贝数变异类型和易感者筛选基因标志物MALAT1基因rs619586位点单核苷酸多态性，特异性好，反应灵敏，检测时间短，方法简单，成本低廉，临床应用价值高。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合，该多重连接探针扩增探针组合分别是针对内参基因GAPDH，目标基因MALAT1的rs619586位点、NKX2-6、GATA1、SON、TBX1、RCAN1、GJA5、DGCR8、SRY、TBX6、NHS、CRKL、GATA6、MYH11、DTNA而设计的特异性序列；该多重连接探针扩增探针组共有17组，其中，针对GAPDH基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:1和SEQID NO:2所示，针对MALAT1基因rs619586位点AA型多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:3和SEQID NO:4所示，针对MALAT1基因rs619586位点GG型多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:5和SEQID NO:6所示，针对NKX2-6基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:7和SEQID NO:8所示，针对GATA1基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:9和SEQID NO:10所示，针对SON基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:11和SEQID NO:12所示，针对TBX1基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:13和SEQID NO:14所示，针对RCAN1基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:15和SEQID NO:16所示，针对GJA5基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:17和SEQID NO:18所示，针对DGCR8基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:19和SEQID NO:20所示，针对SRY基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:21和SEQID NO:22所示，针对TBX6基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:23和SEQID NO:24所示，针对NHS基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:25和SEQID NO:26所示，针对CRKL基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:27和SEQID NO:28所示，针对GATA6基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:29和SEQID NO:30所示，针对MYH11基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:31和SEQIDNO:32所示，针对DTNA基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQID NO:33和SEQID NO:34所示。
其中，多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification，多重连接探针扩增)的基本原理包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物毛细管电泳并收集数据，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。
多重连接探针扩增探针是一条包括一段引物序列和一段特异性序列的寡核苷酸片段。在多重连接探针扩增反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
为实现本发明的技术目的，本发明再一方面提供一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选基因标志物的试剂盒，其包括上述的多重连接探针扩增探针组合和通用引物，通用引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:35，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO:36所示。
其中，所述试剂盒还包括反应液。
其中，所述反应液包括常规的用于多重连接探针扩增杂交连接反应的缓冲剂、连接酶、聚合酶以及用于PCR反应的缓冲剂、连接酶、聚合酶或其他相关试剂。
其中，上述试剂可以通过市售获得。
为实现本发明的技术目的，本发明再提供一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选基因标志物的方法，其采用上述多重连接探针扩增探针组合或试剂盒对待测样本进行检测。
其中，所述对待测样本进行检测是指对待测样本的全基因组DNA进行检测。
其中，所述待测样本可以是任意一种可以提取出的全基因组DNA的样本，包括但不限于血液、羊水细胞、皮肤组织等。
其中，所述采用上述多重连接探针扩增探针组合或试剂盒对待测样本进行检测包括：
提取待测样本的DNA溶液后，进行变性处理，得到变性后的基因组DNA；
利用所述多重连接探针扩增探针组合或试剂盒中的多重连接探针扩增探针组合与变性后的基因组DNA进行杂交连接反应，获得连接产物；
将得到连接产物进行PCR反应后，对PCR扩增产物进行毛细管电泳，得到毛细管电泳结果；
对毛细管电泳结果进行分析后，判断待测样本是否发生先天性心脏病基因拷贝数变异。
其中，所述变性处理是将DNA溶液在98℃处理5分钟。
其中：
1.杂交
单人份杂交连接反应液配液标准为：
Figure BDA0002393449580000041
其中，杂交连接反应液加入200ng待检基因组DNA样本，枪头反复吹吸至完全混匀，短暂离心使管壁上的液体甩至管底。反应条件为95℃1min，60℃温浴杂交反应3小时。
2.连接
单人份杂交连接反应液配液标准为：
Figure BDA0002393449580000042
其中，步骤1的杂交产物加入步骤2连接混合液16μl，反应条件为54℃15min，98℃5min。
3.PCR扩增
其中，PCR反应的反应液为：
组分 加入量
dNTP(1mM) 2.0μl
PCR primers 2.0μl
10×PCR buffer 2.5μl
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 1.5μl
Hot start Taq(5U/μl) 0.2μl
ddH<sub>2</sub>O 15.8μl
其中，配制好的PCR反应液以每管24μl分装于200μl PCR薄壁反应管中，加入1μl连接产物作为PCR反应模板，上机扩增；PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
综上，本发明的有益效果是：
本发明方法利用具有SEQ ID NO.1-34所示的核苷酸序列的多重连接探针扩增探针或试剂盒可以在一个管中同时检测多种先天性心脏病基因拷贝数变异类型和易感者筛选基因标志物MALAT1基因rs619586位点单核苷酸多态性，特异性好，反应灵敏，检测时间短，方法简单，成本低廉，临床应用价值高。
【附图说明】
图1是本发明中用到的多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependentprobe amplification，多重连接探针扩增)的基本原理图。
图2是本发明进行毛细管电泳的检测结果图。
【具体实施方式】
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解的是这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照生产商所建议的条件。
本实施方式中，涉及到的多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，多重连接探针扩增)的基本原理，其原理如图1所示。该原理为：包括探针和靶序列DNA进行杂交，之后通过连接、PCR扩增，产物毛细管电泳并收集数据，分析软件对收集的数据进行分析最后得出结论。
多重连接探针扩增探针是一条包括一段引物序列和一段特异性序列的寡核苷酸片段。在多重连接探针扩增反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链；反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的。最后，通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker软件分析，得出结论。只有当连接反应完成，才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。
一、多重连接探针扩增探针及试剂盒
1、多重连接探针扩增探针的设计与合成
依据内参基因GAPDH和目的基因(MALAT1的rs619586位点、NKX2-6、GATA1、SON、TBX1、RCAN1、GJA5、DGCR8、SRY、TBX6、NHS、CRKL、GATA6、MYH11、DTNA)的序列信息，设计相应的多重连接探针扩增探针，设计好的探针用DNA folding form(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝mfold/DNA-Folding-Form)评估其二级结构，用多重连接探针扩增自带软件RaW-Probe评估其Tm值。设计好的引物探针序列及内参基因GAPDH如下：
Figure BDA0002393449580000061
Figure BDA0002393449580000071
Figure BDA0002393449580000081
2、试剂盒
该试剂盒上述的多重连接探针扩增探针组合和通用引物，通用引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:35，反向引物的核苷酸序列如SEQID NO:36所示，其中还包括杂交连接反应用的反应液和PCR反应用的反应液。
杂交连接反应用的反应液为本领域多重连接探针扩增反应常规使用的缓冲液、连接酶或其他相关试剂；PCR反应液为本领域常规使用的PCR反应常规使用的Buffer、dNTP、MgCl2、多重连接探针扩增-F、多重连接探针扩增-R、Hot start Taq、ddH-2-O。
本发明的试剂盒所使用的条件包括杂交连接反应条件和PCR反应条件，其中，杂交连接反应条件为95℃反应1min，60℃温浴杂交反应3小时；PCR反应的条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
二、正常DNA样本的检测
利用实施例1中的试剂盒对人的正常DNA进行检测，该DNA从人的血液中提取，具体操作如下：
1.样本的获取及处理
采集人的外周血，并采用常规的DNA提取试剂盒提取样本中的全基因组DNA，获得全基因组DNA样本，利用紫外可见分光光度计测量DNA样本浓度，并统一稀释至40ng/μl，备用；
抽取其中的5μl基因组DNA(总量为200ng)于200μl PCR反应管中98℃变性5分钟，25℃，1分钟，得到变性后的全基因组DNA；
2.反应液的配制
将试剂盒中的每条探针分别稀释至500nmol/μl(注：先将100μM原液用ddH2O稀释2倍至50μM；再将50μM的探针用ddH2O稀释100倍至500nmol/μl)，取58μl的H2O至1.5ml离心管中，再各加入1.0μl探针(500nmol/μl)至离心管中，配制成Probe mix。然后配制杂交连接反应液，即
Figure BDA0002393449580000091
其中，杂交连接反应液加入200ng待检基因组DNA样本，枪头反复吹吸至完全混匀，短暂离心使管壁上的液体甩至管底。反应条件为95℃1min，60℃温浴杂交反应3小时。
3.连接
单人份杂交连接反应液配液标准为：
Figure BDA0002393449580000101
其中，步骤1的杂交产物加入步骤2连接混合液16μl，反应条件为54℃15min，98℃5min。
4.PCR扩增
配制PCR反应液，并以每管24μl分装于200μl PCR薄壁反应管中，取步骤3得到的连接产物1μl作为PCR反应模板进行PCR扩增，得到扩增产物。
其中，PCR反应液为：
组分 加入量
dNTP(1mM) 2.0μl
PCR primers 2.0μl
10×PCR buffer 2.5μl
MgCl<sub>2</sub>(25mM) 1.5μl
Hot start Taq(5U/μl) 0.2μl
ddH<sub>2</sub>O 15.8μl
其中，PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃退火20s，72℃聚合20s，35个循环后，72℃延长聚合10min，4℃保存。
5、PCR产物毛细管电泳
1)取适量待检PCR产物进行常规的凝胶电泳，对比待检样品与质控样品的条带亮度，根据亮度确定PCR产物稀释倍数(此次实验为稀释30倍)。
2)预备阶段：换胶、换running buffer、换水；检查各装置是否完好、毛细管的取样末端是否损坏、样品板是否正确组装等。
3)样品准备：将PCR产物进行稀释，样品排板；取1μL样本到上机板，每孔加入9μLHiDi：Liz 500(体积比：250:1)，离心、震荡混匀、再离心；95℃变性5min，迅速降到4℃。
4)使用ABI 3730 XL检测。
5)数据读取和导出。
6.数据分析
通过毛细管电泳实验，采集的荧光数据通过ABI 3730XL测序仪处理后，将峰面积数据以Excel格式输出。取每个基因的峰面积(area)数据，通过相对定量的方式，计算是否存在拷贝数变异。即：
Figure BDA0002393449580000111
当计算结果为0.80＜DQ＜1.20，则判定样本正常，没有发生基因拷贝数变异；
当计算结果为DQ＝0.00，则判断样本为纯合子缺失；
当计算结果为0.4 0＜DQ＜0.6 5，则判断样本为杂合子缺失(单拷贝)；
当计算结果为1.3＜DQ＜1.6 5，则判断样本为杂合子重复(三拷贝)；
当计算结果为1.75＜DQ＜2.15，则判断样本杂合子/纯合子三倍重复(四拷贝)。
根据图2所示的毛细管电泳图可以看出，本发明的包含多个引物的多重连接探针扩增探针对一个样本进行检测的峰图清晰，无噪音，可见，本发明提供多重连接探针扩增探针特异性好、灵敏度高，而且多对多重连接探针扩增探针可以同时对一个样本进行检测，效率高，成本低廉。
应用实施例
采集8份患有先天性心脏病的患者的血液样本，采用常规方法提取其全基因组DNA，获得8份待检测的样本。先将8份待检测的样本采用常规的荧光原位杂交方法进行基因检测，得到如表1所示的检测结果，再将8份待检测的样本采用本发明的方法进行检测，获得如表2所示的计算结果。
表1常规方法检测结果
Figure BDA0002393449580000112
Figure BDA0002393449580000121
表2本发明方法检测结果
Figure BDA0002393449580000122
注：图中斜体字体表示杂合子重复，斜体加黑字体表示杂合子缺失。
根据表1和表2所示的检测结果可知，本发明方法所检测的结果与常规方法检测结果相同，均检测出样本73819、80388的MALAT1基因rs619586位点基因型为A/G，ZJG、HJH、1601、CHD14、XX04、76520的MALAT1基因rs619586位点基因型为A/A；均检测出样本ZJG、HJH、1601、CHD14、73819发生了杂合子重复，XX04、76520、80388发生了杂合子缺失，而且，根据表2所示的检测结果，还可以根据正常DNA样本的检测步骤6中的判断标准直接判断样本中杂合子重复或杂合子缺失发生的具体基因以及发生类型。
并且，在试验中还发现，采用常规方法进行需要对样本进行多次的不同基因检测才能判定样本是否发生了杂合子重复或/和杂合子缺失，检测时间长达2天以上，而本发明方法一次性就可以检测一个样本是否发生了杂合子重复或杂合子缺失，而且可以判断该样本中发生了杂合子重复或杂合子缺失的具体基因及发生类型，仅需8小时。
可见，本发明具有与常规方法同样的检测效果，而且检测效率高，准确率高。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Figure BDA0002393449580000141
Figure BDA0002393449580000151
Figure BDA0002393449580000161
Figure BDA0002393449580000171
Figure BDA0002393449580000181
Figure BDA0002393449580000191
Figure BDA0002393449580000201
Figure BDA0002393449580000211
Figure BDA0002393449580000221
Figure BDA0002393449580000231
Figure BDA0002393449580000241
Figure BDA0002393449580000251

Claims (4)

1.一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选的多重连接探针扩增探针组合，其特征在于：所述多重连接探针扩增探针组合分别是针对内参基因GAPDH，目标基因MALAT1的rs619586位点、NKX2-6、GATA1、SON、TBX1、RCAN1、GJA5、DGCR8、SRY、TBX6、NHS、CRKL、GATA6、MYH11、DTNA而设计的特异性序列；所述多重连接探针扩增探针组共有17组，其中，针对GAPDH基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，针对MALAT1基因rs619586位点AA型多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示，针对MALAT1基因rs619586位点GG型多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，针对NKX2-6基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，针对GATA1基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，针对SON基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示，针对TBX1基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，针对RCAN1基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，针对GJA5基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示，针对DGCR8基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:19和SEQID NO:20所示，针对SRY基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22所示，针对TBX6基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ IDNO:23和SEQ ID NO:24所示，针对NHS基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26所示，针对CRKL基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示，针对GATA6基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30所示，针对MYH11基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示，针对DTNA基因的多重连接探针扩增探针组合的核苷酸序列如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示。
2.一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选基因标志物的试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1所述的多重连接探针扩增探针组合和通用引物，所述通用引物中，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:35，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:36所示。
3.一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选基因标志物的检测方法，其特征在于：其使用权利要求1或2任一所述的多重连接探针扩增探针组合或试剂盒实现。
4.根据权利要求3所述的一种先天性心脏病基因拷贝数变异及易感者筛选基因标志物的检测方法，所述使用方法为非治疗和诊断目的的方法，其特征在于：所述使用权利要求1或2任一所述的多重连接探针扩增探针组合或试剂盒实现包括：
提取待测样本的DNA溶液后，进行变性处理，得到变性后的基因组DNA；
利用所述多重连接探针扩增探针组合或试剂盒中的多重连接探针扩增探针组合与变性后的基因组DNA进行杂交连接反应，获得连接产物；
将得到连接产物进行PCR反应后，对PCR扩增产物进行毛细管电泳，得到毛细管电泳结果；
对毛细管电泳结果进行分析后，判断待测样本是否发生先天性心脏病基因拷贝数变异。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113889187A (zh) * 2021-09-24 2022-01-04 上海仁东医学检验所有限公司 单样本等位基因拷贝数变异检测方法、探针组和试剂盒

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