CN108441553A - 一种精准检测aldh2基因多态性的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，公开了一种ALDH2基因多态性检测试剂盒。本发明所提供的ALDH2基因检测试剂盒能够一次性确定ALDH2基因rs671多态性位点的突变基因型(G>A，G>T，G>C)。为实现此种功能，本发明所述试剂盒运用多重PCR技术与Taqman‑MGB荧光探针标记技术相结合的方法，设计四对特异性引物和四条标记不同荧光染料的特异性探针，其特征在于目的基因能且只能与其中一对引物和一条探针结合，保证检测结果的准确性。本发明所述试剂盒具有特异性强，准确度高，操作简便等优势。待测样本可以选择全血或口腔细胞，临床用于指导硝酸甘油的合理用药，指导健康饮酒预防酒精中毒，并在提示重大疾病方面具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域的基因多态性检测，具体涉及一种乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性检测试剂盒。
背景技术
乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)，位于第12号染色体，它的主要多态性是rs671。ALDH2基因包含13个外显子，在外显子12处存在一个单核苷酸多态性位点，该位点鸟嘌呤核苷酸突变为腺嘌呤核苷酸，即G→A，等位基因的突变导致其编码的氨基酸由谷氨酸变为赖氨酸，从而使ALDH2酶的活性降低甚至失活。ALDH2*1/*2和ALDH2*2/*2的脱氢酶活性分别仅为ALDH2*1/*1的13％～14％和2％，rs671位点产生突变的人群硝酸甘油催化效率分别为未发生突变人群的8％～15％和6％～7％。
ALDH2能够将乙醛氧化为乙酸，是酒精在人体内代谢的关键物质。乙醛脱氢酶2的活性降低不仅影响酒精的代谢解毒能力而且会降低硝酸甘油的疗效。硝酸甘油临床作为冠心病、急性心绞痛等的特效药，但是，临床数据显示25％以上的患者服用硝酸甘油无效。据统计，ALDH2*2/*1或ALDH2*2/*2突变普遍存在于亚洲黄种人，其频率分布具有明显的地域性和种族差异，ALDH2*2在中国人群中的频率高达39％，其中，不仅包括G＞A基因型突变，而且还包括G＞T和G＞C基因型突变。
目前，ALDH2基因多态性的检测方法主要有DNA微阵列芯片法、PCR毛细电泳片段分析法、PCR-PFLP、微测序等。上述方法都需要提取待检样本中的DNA，部分方法学需要借助凝胶电泳等分析结果，操作过程复杂，检测周期长。在检测过程中仅可检测等位基因G突变为A的情况，对于G突变为T和C的样本易造成假阴性或假阳性，导致错误的诊断结果。本发明所述ALDH2基因多态性检测试剂盒，采用多重PCR与Taqman-MGB探针结合的方法，设计多对PCR引物和荧光探针，有效解决由于G突变为T或C导致PCR扩增失败，结果误判的情况，提高检测准确度。本发明所述试剂盒检测样本为外周全血或唾液，采用在PCR反应液中加入BSA、Triton X-100以及明胶等辅料，省去提取DNA这一操作，简化操作步骤节省大量时间，PCR扩增结束即可获得检测结果。
发明内容
本发明的目的在于提供用一种精准检测ALDH2基因多态性的试剂盒，为临床合理使用硝酸甘油(NTG)、健康饮酒提供指导。
本发明所述ALDH2基因检测试剂盒将多重PCR技术与Taqman-MGB荧光探针技术相结合，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优点。
进一步，所述ALDH2基因共用上游引物具有SEQ NO.1碱基序列，共用下游引物具有SEQ NO.2所述碱基序列。Taqman-MGB荧光探针分别具有SEQ NO.3～6碱基序列。
表1引物序列表
S1：以待测标本中的DNA为模板，利用SEQ NO.1～6所述PCR引物和Taqman-MGB荧光探针进行多重PCR扩增。
S2：分析PCR扩增结果图，Ct值≥36该基因无扩增，Ct值＜36则该基因有扩增，据此确定SNP位点的基因型。
进一步，所述步骤S1中的待测标本为EDTA抗凝的外周全血或唾液，无需提取DNA，既避免提取DNA过程中的污染，又能够节省大量时间。
进一步，步骤S1中所述PCR扩增条件为：98℃预变性3～8min；98℃变性20～30s，54～65℃梯度退火25s，72℃延伸30s，循环45次；优选地，本试剂盒选定98℃预变性5min；98℃变性25s，55℃退火40s，72℃延伸30s(荧光采集)，循环45次，最终72℃延伸3min。
进一步，本发明所述试剂盒包括多重PCR反应液、引物混合液、唾液采集器、唾液保存液、质控品和空白对照品。
进一步，本发明所述试剂盒多重PCR反应液主要成分包括DNA聚合酶，二甲基亚砜，dNTPs，5×buffer。
进一步，本发明所述试剂盒引物混合液包括一对共用引物、四条特异性探针和内参β-actin引物和探针混合物。
进一步，本发明所述唾液保存液主要包括Tris-Hcl(pH＝7.8)缓冲液、甲醇、曲拉通-100和EDTA。
与现有技术相比，本发明所述试剂盒提供的ALDH2基因多态性检测试剂盒具有如下有益效果：
利用多重PCR技术与Taqman-MGB荧光探针相结合，设计多条特异性引物和荧光探针，相互间不存在交叉反应，并且提供质控品和空白对照品，能够更准确获得ALDH2基因rs671位点的突变结果。
本发明所述试剂盒，无需处理样本，仅需将PCR反应液、引物混合液和待测样本混合即可。操作简便，最大程度避免操作过程中产生的误差。
优选的，所述PCR反应pH值为7.5～8.5，由1～5U的热启动Taq酶、2～10mmol/L的dNTPs、20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成。
辅料明胶和BSA可以增加Taq酶的稳定性，减少管壁吸附造成的试剂损失。BSA还能克服全血样本中黑色素对PCR反应的抑制。Triton-100能够裂解全血样本和唾液样本中的细胞，释放DNA，同时，还能克服反应体系中残留的痕量离子型去垢剂对PCR反应的抑制作用。
本发明所述试剂盒检测样本，取样量小且采样方便，PCR扩增反应结束的同时即可获得检测结果。
附图说明
图1 FAM通道荧光阈值
图2 VIC通道荧光阈值
图3 TEXAS RED通道荧光阈值
图4 Cy5通道荧光阈值
具体实施方式
以下内容是结合具体的实施方案对本发明所作的进一步详细说明，但不能认定本发明的具体实施仅限于以下说明。
实施例1：基因分型标准的确定
收集运用Sanger测序法获得准确基因型的样本，其中，野生型、突变型和杂合型各100例，然后利用本发明所述试剂盒进行检测。
1.多重PCR扩增反应
1.1试剂准备：将试剂盒中的PCR反应液、引物混合液、唾液采集器、唾液保存液、质控品和灭菌超纯水恢复至室温。
1.2 PCR扩增系统构建
本发明所述试剂盒采用25μL反应体系，将上述试剂按照表2所述比例进行
混合，分装至PCR反应管中，加入待测标本上机检测。
表2多重PCR扩增体系
| 试剂 | 体积 |
| PCR反应液 | 10μL |
| 引物混合液 | 4μL |
| 模板 | 1μL |
| 灭菌ddH2O | 10μL |
以待测样本为模板，按照表3所述扩增体系混合均匀后，放入PCR仪，按照表2所示扩增条件进行多重PCR扩增。
表3多重PCR扩增条件
记录并分析Ct值，如图1～4所示，FAM通道PCR扩增曲线Ct值＜35.71时，该等位基因有扩增；VIC通道Ct值＜35.67时，该等位基因有扩增；TEXAS RED通道Ct值＜35.39时，该等位基因有扩增；Cy5通道Ct值＜35.62时，该等位基因有扩增。因此，本发明优选Ct值等于36作为判断PCR曲线有无扩增的阈值。
实施例2：外周血样本检测
取经过EDTA处理的新鲜全血30例，利用本发明所述试剂盒直接进行检测。分析多重PCR扩增曲线，结果与Sanger测序法对比，结果如表4所示。结果显示，本发明所述试剂盒基因分型结果与Sanger测序法结果符合率为100％。
表4全血样本基因分型准确度
| 样本编号 | PCR-荧光探针法 | Sanger测序法 | 符合率 |
| AL-01 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-02 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-03 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-04 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-05 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-06 | G/A | G/A | 100％ |
| AL-07 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-08 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-09 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-10 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-11 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-12 | G/C | G/C | 100％ |
| AL-13 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-14 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-15 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-16 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-17 | G/A | G/A | 100％ |
| AL-18 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-19 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-20 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-21 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-22 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-23 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-24 | G/A | G/A | 100％ |
| AL-25 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-26 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-27 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-28 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-29 | G/T | G/T | 100％ |
| AL-30 | G/G | G/G | 100％ |
实施例3：唾液样本检测
用试剂盒自带唾液采集器采集待测者唾液，并置于唾液保存液颠倒混匀，取1μL作为PCR扩增模板，按照表1所示多重PCR扩增体系混合均匀，表2所示PCR扩增条件进行PCR扩增。29例待测样本检测结果与Sanger测序法对比，结果如表5所示。
表5唾液样本基因分型准确度
| 样本编号 | PCR-荧光探针法 | Sanger测序法 | 符合率 |
| AL-S01 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S02 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S03 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S04 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S05 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S06 | G/A | G/A | 100％ |
| AL-S07 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S08 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S09 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S10 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S11 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S12 | G/C | G/C | 100％ |
| AL-S13 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S14 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S15 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S16 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S17 | G/A | G/A | 100％ |
| AL-S18 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S19 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S20 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S21 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S22 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S23 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S24 | G/A | G/A | 100％ |
| AL-S25 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S26 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S27 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S28 | G/G | G/G | 100％ |
| AL-S29 | G/T | G/T | 100％ |
结果显示，本发明所述试剂盒基因分型结果与Sanger测序法结果符合率为100％。
实施例4：全血样本与唾液样本分型结果一致性验证
随机选取100名待测者，分别取同一待测者的全血和唾液，按照表1所示多重PCR扩增体系和表2所示PCR扩增条件进行扩增。统计并分析分型结果，如表6所示。
表6不同样本分型结果一致性检测
随机抽取其中10例，其分型结果如表7所示：
表7不同样本分型结果
| 待测者编号 | 唾液样本 | 全血样本 | 一致性 |
| AH-04 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-11 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-36 | G/A | G/A | 一致 |
| AH-41 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-49 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-50 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-62 | A/A | A/A | 一致 |
| AH-70 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-76 | G/G | G/G | 一致 |
| AH-83 | G/T | G/T | 一致 |
实施例5：拟服用硝酸甘油患者全血样本检测
采集57例拟服用硝酸甘油患者的新鲜全血，按照表1所示多重PCR扩增体系和表2所示PCR扩增条件进行多重PCR扩增。ALDH2基因rs671位点的基因分型结果如表8所示，表9所示为临床诊断对检测结果的用药建议。
表8 ALDH2(rs671)基因分型结果
表9临床对ALDH2(rs671)基因分型检测结果用药建议
实施例6：拟了解自己酒精代谢能力的健康人群样本检测
随机抽取61例健康人群唾液作为检测样本，置于本发明所述试剂盒配套使用的唾液保存液，混匀后作为模板进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件分别按照表1和表2所示条件进行反应。表10所示为ALDH2(rs671)基因分型结果。
表10 ALDH2(rs671)基因多态性检测结果
序列表
<110> 普迈德（北京）科技有限公司
<120> 一种精准检测ALDH2基因多态性的试剂盒及其应用
<130> 2017
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 1
ggagcccagt cacccttt 18
<210> 2
<211> 18
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<210> 4
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<210> 6
<211> 23
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<213> 人工合成序列(人工序列)
<400> 6
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Claims (9)
1.一种检测ALDH2基因rs671位点多态性的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、一对共用上下游引物和四条探针SEQ NO.1～6。
2.根据权利要求书1所述试剂盒，其特征在于探针SEQ NO.3～NO.6的荧光标记基团为：
SEQ NO.3的5’端标记FAM基团，3’端标记BHQ-1基团；
SEQ NO.4的5’端标记VIC基团，3’端标记BHQ-1基团；
SEQ NO.5的5’端标记TEXAS RED基团，3’端标记BHQ-2基团；
SEQ NO.6的5’端标记Cy5基团，3’端标记BHQ-3基团。
3.根据权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于：
检测ALDH2基因的野生型引物能够与野生型样本模板特异性结合，并且能够与SEQNO.3探针特异性结合；
突变型(G＞A)引物能够与G突变为A的样本模板特异性结合，并且能够与SEQ NO.4探针特异性结合；
突变型(G＞T)引物能够与G突变为T的样本模板特异性结合，并且能够与SEQ NO.5探针特异性结合；
突变型(G＞C)引物能够与G突变为C的样本模板特异性结合，并且能够与SEQ NO.6探针特异性结合。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液pH值为7.5～8.5，由1～5U的热启动Taq酶、2～10mmol/L的dNTPs、20～100mmol/L的Tris-HCl、5～20mmol/L的MgCl2、0.1～1mg/mL的BSA、0.1％～2％的明胶、0.2％～2％的Triton X-100和0.1～0.5mmol/L的KCl组成。
5.一种检测ALDH2基因rs671多态性位点基因型的试剂盒，其特征在于包括如下步骤：
(1)获取目的基因序列；
(2)设计PCR引物，所述引物包括一对能够与野生型和突变型模板结合的共用上下游引物；
(3)设计4条特异性Taqman-MGB荧光探针，能够分别与野生型模板和突变型(G＞A，G＞T，G＞C)模板结合，所述荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团，四条荧光探针分别标记不同的荧光染料，且相互间无干扰；
(4)以待测样本为模板，利用步骤(2)和步骤(3)所设计的引物和探针进行多重PCR扩增；
(5)根据步骤(4)PCR扩增曲线的Ct值确定出ALDH2基因rs671位点的基因型。
6.根据权利要求书5所述试剂盒，其特征在于，上下游引物的混合比例为1∶1，四条特异性荧光探针混合比例为1∶1∶1∶1，且引物终浓度为0.20μM。
7.根据权利要求书5所述多重PCR扩增条件为：98℃预变性5min；98℃变性25s，55℃退火40s，72℃延伸30s(荧光采集)，循环45次，72℃最终延伸3min。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述Ct值为36。
9.一种检测ALDH2基因rs671多态性位点基因型的试剂盒，待测样本为EDTA抗凝外周全血或口腔细胞。
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|---|---|---|---|
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