CN105803077A - 硝酸甘油用药敏感型相关基因aldh2的snp检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents

硝酸甘油用药敏感型相关基因aldh2的snp检测试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒及其使用方法。以人基因组DNA为模板，分别加入检测ALDH2*2型多态性的对应特异引物和荧光探针，构成实时荧光定量PCR体系，经过Real‑time PCR反应，本领域技术人员通过荧光定量PCR仪所收集的数据确定ALDH2的基因型。具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。

Description

硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明涉及医疗检测领域，更具体的说是涉及一种硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
硝酸甘油(GTN，glyceryltrinitrate，nitroglycerin)用于治疗心绞痛和心力衰竭已有130年的历史，舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选药方，但其临床有效性常因人而异。有的人因它而及时挽救了生命，而有的人服用之后，效果却不甚明显。以往国内外医学界一直认为硝酸甘油对部分病人疗效不佳是因其“耐药性”所致，但研究结果证实并非如此。近来的研究表明基因突变是影响硝酸甘油药物疗效的决定性因素。
ALDH2基因是编码线粒体乙醛脱氢酶的基因，具有脱氢酶活性，对人体内乙醛的氧化发挥主要的作用(即与体内代谢酒精的能力直接相关)。除了上述的脱氢酶活性以外，ALDH2还有酯酶活性，可以催化硝酸甘油水解产生NO。最新的研究成果表明，ALDH2基因存在G1510A多态性，使得第504位的谷氨酸被赖氨酸替代并降低酶活性，从而影响硝酸甘油的疗效，此位点的多态性命名为ALDH2*2型。
目前针对基因多态性的检测方法最常见方法为测序法，该方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，它的临床推广存在一定的困难。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种能够实现快速检测硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒及其使用方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，包括下列体积份的组成构成：
所述引物包括：
正向引物：ALDH2*2-F：5’-CGGGAGTTGGGCGAGTA-3’；
反向引物：ALDH2*2-R：5’-TCCGAGCCACCAGCAGA-3’；
所述探针包括：
ALDH2*2野生型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTCAGTGTATGCC-MGB-3’；
ALDH2*2突变型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTTAGTGTATGCC-MGB-3’；
作为本发明的进一步改进，所述预混物为2×PCR酶反应预混液，所述2×PCR酶反应预混液含有0.1units/μl的TaqDNAPolymerase(recombinant)、4mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的dNTPs。
作为本发明的进一步改进，所述溶剂为双蒸水。
作为本发明的进一步改进，所述引物和探针体积比为1∶1。
作为本发明的进一步改进，所述正向引物和反向引物用量相同。
作为本发明的进一步改进，所述ALDH2*2野生型探针和ALDH2*2突变型探针用量相同。
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为包含体积分的：预混液10～25份，DNA模板1份，引物1～2份、探针1～2份；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
作为本发明的最优选方案，
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为30μL，包含2×PCR酶反应预混液15μL，DNA模板1μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，双蒸水10μL；
其中2×PCR酶反应预混液成分及含量：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.1units/μl；MgCl2：4mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.5mmol/L；
其中基因组DNA模板中DNA含量10-100ng，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
以人基因组DNA为模板，分别加入检测ALDH2*2型多态性的对应特异引物和荧光探针，构成实时荧光定量PCR体系，经过Real-timePCR反应，通过荧光定量PCR仪所收集的数据确定ALDH2的基因型。
本发明的有益效果，本发明与现有技术中的直接测序法相比，不需要复杂的设备，本身就是对人体基因组中的一个序列进行检测。通过正向引物：ALDH2*2-F：5’-CGGGAGTTGGGCGAGTA-3’；反向引物：ALDH2*2-R：5’-TCCGAGCCACCAGCAGA-3’；ALDH2*2野生型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTCAGTGTATGCC-MGB-3’；ALDH2*2突变型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTTAGTGTATGCC-MGB-3’；用荧光PCR法直接对提取出来的人DNA进行检测，具有较高的分辨度，不需要测序仪器，就可以实现对于硝酸甘油用药敏感型相关基因的检测。同时，大大缩短了检测时间，在判断上也十分直观，从最终导出的数据图中就可以直接得出结论，在判断上更加容易。
本申请方案具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。
附图说明
图1为ALDH2*2位点野生型(G/G)样品荧光定量PCR曲线图；
图2为ALDH2*2位点杂合突变型(G/A)样品荧光定量PCR曲线图；
图3为ALDH2*2位点纯合突变型(A/A)样品荧光定量PCR曲线图。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
参照图1所示，本实施例的一种硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，包括下列体积份的组成构成：
所述引物包括：
正向引物：ALDH2*2-F：5’-CGGGAGTTGGGCGAGTA-3’；
反向引物：ALDH2*2-R：5’-TCCGAGCCACCAGCAGA-3’；
所述探针包括：
ALDH2*2野生型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTCAGTGTATGCC-MGB-3’；
ALDH2*2突变型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTTAGTGTATGCC-MGB-3’；
作为本发明的进一步改进，所述预混物为2×PCR酶反应预混液，所述2×PCR酶反应预混液含有0.1units/μl的TaqDNAPolymerase(recombinant)、4mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的dNTPs。
作为改进的一种具体实施方式，所述溶剂为双蒸水。
作为改进的一种具体实施方式，所述引物和探针体积比为1∶1。
作为改进的一种具体实施方式，所述正向引物和反向引物用量相同。
作为改进的一种具体实施方式，所述ALDH2*2野生型探针和ALDH2*2突变型探针用量相同。
试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为包含体积份的：预混液10～25份，DNA模板1份，引物1～2份、探针1～2份；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
作为本发明的最优选方案，
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为30μL，包含2×PCR酶反应预混液15μL，DNA模板1μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，双蒸水10μL；
其中2×PCR酶反应预混液成分及含量：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.1units/μl；MgCl2：4mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.5mmol/L；
其中基因组DNA模板中DNA含量10-100ng，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
以最优方案进行检测，选取样本为ALDH2*2位点野生型(G/G)样品、ALDH2*2位点杂合突变型(G/A)样品、ALDH2*2位点纯合突变型(A/A)样品进行检测。检测结果如图1至图3所示。
通过图1至图3的数据显示，本发明的试剂盒在检测硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2时，具有快速、灵敏、容易判断等优点，适合临床的检测和推广。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，其特征在于：包括下列体积份的组成构成：
所述引物包括：
正向引物：ALDH2*2-F：5’-CGGGAGTTGGGCGAGTA-3’；
反向引物：ALDH2*2-R：5’-TCCGAGCCACCAGCAGA-3’；
所述探针包括：
ALDH2*2野生型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTCAGTGTATGCC-MGB-3’；
ALDH2*2突变型探针：5’-荧光基团-GTTTTCACTTTAGTGTATGCC-MGB-3’。
2.根据权利要求1所述的硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述预混物为2×PCR酶反应预混液，所述2×PCR酶反应预混液含有0.1units/μl的TaqDNAPolymerase(recombinant)、4mmol/L的MgCl2、0.5mmol/L的dNTPs。
3.根据权利要求1或2所述的硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述溶剂为双蒸水。
4.根据权利要求3所述的硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述引物和探针体积比为1∶1。
5.根据权利要求1所述的硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述正向引物和反向引物用量相同。
6.根据权利要求1所述的硝酸甘油用药敏感型相关基因ALDH2的SNP检测试剂盒，其特征在于：所述ALDH2*2野生型探针和ALDH2*2突变型探针用量相同。
7.如权利要求1至6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为包含体积份的：预混液10～25份，DNA模板1份，引物1～2份、探针1～2份；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
8.如权利要求7所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)提取待测人的基因组DNA；
2)每个PCR体系为30μL，包含2×PCR酶反应预混液15μL，DNA模板1μL，正向反向引物各1μL，野生型和突变型荧光探针各1μL，双蒸水10μL；
其中2×PCR酶反应预混液成分及含量：TaqDNAPolymerase(recombinant)：0.1units/μl；MgCl2：4mmol/L；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.5mmol/L；
其中基因组DNA模板中DNA含量10-100ng，正向反向引物浓度100-1000nM，野生型和突变型荧光探针浓度100-1000nM；
3)将配置好的PCR体系放入荧光定量PCR仪中，进行Real-timePCR检测；反应条件为：
95℃10分钟预变性；循环阶段，95℃15秒并在此采集荧光信号，60℃1分钟，40-60个循环；
4)通过荧光定量PCR仪所收集数据确定检测位点的基因型。
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