CN105132545A - 用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法 - Google Patents

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Abstract

用于检测ALDH2基因的引物、探针及其检测方法，利用杂合子型ALDH2*1/*2、纯合子型ALDH2*2/*2和内参基因β-珠蛋白的引物探针配制PCR反应液，加入人全血样本DNA，通过荧光PCR仪检测ALDH2基因的多态性。本方法检测特异性探针对靶基因进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低；灵敏度为0.01％，即10000个细胞中有一个含ALDH2基因ALDH2*1/*2多态性、ALDH2基ALDH2*2/*2多态性就可以被检测出；扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理；全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性；快速：速度快、可在100分钟内完成。

Description

用于检测ALDH2基因的引物、探针及检测方法
技术领域：
本发明涉及检测人血液样本中ALDH2基因多态性的引物、探针及其检测方法，属于分子生物学领域。
背景技术：
乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenasegene,ALDH)是一组NAD(P)+依赖性酶，广泛参与由体内乙醇、氨基酸、生物胺、维生素、类胆固醇及脂质的代谢过程中产生的醛类物质的氧化反应，成为相应的羧酸，对减轻醛类物质对机体的毒性作用具有重要意义。ALDH有19种同工酶，常见的有ALDH1～ALDH4，其中以位于线粒体内的ALDH2活性最强，在清除体内醛类物质中起主要作用。ALDH2的活性变化与ALDH2基因多态性有关，突变的等位基因形成人群中三种基因型：具有正常催化活性的野生纯合子型ALDH2*1/*1；催化活性下降的杂合子型ALDH2*1/*2；催化活性丧失的突变纯合子型ALDH2*2/*2。在亚洲人群中，ALDH2*2是频率最高且最重要的突变型，其中研究显示中国人ALDH2*2的频率达18％。
研究表明，ALDH2基因多态性与硝酸甘油疗效、酒精代谢解毒能力和多种疾病的发生均有影响。
ALDH2基因多态性与硝酸甘油的用药有关：舌下含服硝酸甘油片是抗冠心病心绞痛急性发作的常规首选方法，但有些患者服用后并无疗效。ALDH2酶是硝酸甘油有效代谢物NO形成的关键，当ALDH2基因在rs671位点突变后，酶活性降低，硝酸甘油在体内生物转化过程受阻，有效活性产物NO生成减少，进而导致硝酸甘油治疗心绞痛效果降低。因此，ALDH2基因多态性检测有助于临床上指导硝酸甘油的合理利用，对实现个体化治疗具有重要意义。
ALDH2基因多态性与酒精性肝病的关系：ALDH2(Glu504Lys)基因突变使乙醛脱氢酶活性也降低10倍以上，使酒精在体内从乙醇→乙醛→乙酸→水、二氧化碳的代谢过程受阻，大量乙醛滞留在体内。加之高频饮酒易引发酒精依赖现象，进一步加重了肝脏的受累程度。长期大量饮酒会导致脂肪肝甚至酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重危害人民健康。对ALDH2基因多态性的检测将有助于揭示个体酒精代谢能力，指导检测者正确饮酒，预防酒精性肝病。
ALDH2基因多态性与食道癌和口腔癌等的关系：除了损伤肝脏导致脂肪肝、肝硬化，甚至肝癌，还与增加食道癌、咽癌和胃癌、结肠癌、肺癌等风险相关。研究显示，携带ALDH2突变等位基因的亚洲人因酗酒引发消化道癌症的几率明显较大：胃癌、结肠癌、肺癌为3～10倍；咽癌、食道癌为11～115倍；而食道癌、咽癌和肺癌同时发病的几率增加了50倍。ALDH2基因的检测将为食道癌、咽癌和胃癌、结肠癌、肺癌等相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据。
目前市场上常用的ALDH2基因检测方法有基因芯片法和PCR-RFLP，基因芯片法是目前市场上应用最多的一种方法，最大的优点是高通量，但也存在着不足之处：技术成本昂贵、操作复杂、检测灵敏度较低及重复性差等。PCR-限制性片段长度多态性技(PCR-RFLP)操作繁琐、耗时多、结果可信度低等缺点，未能普及。因此，本领域亟需一种快速、高效、准确、便捷、灵敏度高且结果准确性好的ALDH2基因型检测试剂。
发明内容：
为了克服现有技术检测能力有限，现提供一种多色荧光PCR检测ALDH2基因的方法。
本发明是采用多色荧光PCR检测ALDH2基因的方法：利用杂合子型ALDH2*1/*2、纯合子型ALDH2*2/*2和内参基因β-珠蛋白的引物探针配制PCR反应液，加入人全血样本DNA，通过荧光PCR仪检测ALDH2基因的多态性。
以上所述的引物探针序列如下：
ALDH2-F：5’-CCAACAGGCCCTGAGCC-3’
ALDH2-R：5’-CACCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3’
HBB-F1：5’-TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3’
HBB-F2：5’-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3’
P-W：5’-FAM-ACAGTTTTCACTTCAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3’
P-M：5’-HEX-AGTTTTCACTTTAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3’
HBB-P：5’-ROX-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-BHQ2-3’
本发明的主要原理：本发明基于荧光PCR方法结合Taqman多色荧光探针技术，采用三色荧光PCR和dUTP/UNG防污染措施在全封闭的扩增体系，以ALDH2*1/*2和ALDH2*2/*2作为检测目标，同时针对人的β-珠蛋白基因(HBB)保守区域设计特异性引物和探针作为内参对样本的采集、DNA的提取及扩增进行监控。将同一样本进行1管PCR扩增即可同时检测出ALDH2基因的多态性，为硝酸甘油的用药、饮酒指导及相关高风险疾病的提示提供有效的参考依据。
本方法与现有技术相比具有以下优势：
(1)检测特异性探针对靶基因进行识别，准确性高。同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
(2)灵敏度为0.01％，即10000个细胞中有一个含ALDH2基因ALDH2*1/*2多态性、ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性就可以被检测出。
(3)简便安全：操作简单、安全、能防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理。
(4)全程监控：本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。
(5)快速：速度快、可在100分钟内完成。
附图说明：
图1显示ALDH2基因ALDH2*1/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线；
图2显示ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线；
图3显示ALDH2基因无ALDH2*1/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性时，在PCR反应液中的扩增曲线。
具体实施方式：
附图1显示ALDH2基因ALDH2*1/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值；
附图2显示ALDH2基因ALDH2*2/*2多态性在PCR反应液中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值；
附图3显示ALDH2基因无ALDH2*1/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性时，在PCR反应液中的扩增曲线，其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值
下面结合具体实施例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
(1)引物探针的设计
根据GenBank所提供包含线粒体乙醛脱氢酶-2多态性位点上下游各1000bp的DNA序列进行分析，利用分子生物学软件包primerexpress进行引物探针辅助设计，Blast分析验证所设计引物的特异性，同时设计好的引物和探针在NCBI的dSNP库中进行比对，验证在序列中是否存在SNP位点。引物和探针由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
(2)PCR反应液的配制
利用步骤(1)中设计的引物探针进行PCR反应液的配制，具体的反应体系如下表1所示：
表1PCR反应液反应体系
(3)DNA的抽提
采用天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒抽提人血液组织中的DNA，按照试剂盒说明书进行操作。DNA提取后，取样2μL，用0.5％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的质量，再用紫外分光光度计检测纯度和浓度，以灭菌纯化水调整终浓度为25ng/μL。
(4)加样
分别向准备好PCR反应液的PCR反应管中加入已提取的样本的DNA提取液5μL，盖紧管盖如有气泡，可用手指弹击，去除气泡。5000转/分钟离心30秒至管壁无明显液珠。
(5)PCR扩增
将PCR管放入ABI7500扩增仪样品槽，按对应顺序设置待检样本、空白样本。
每个样品选择FAM、ROX和HEX3个通道。参比荧光(PassiveReference)设置为none。其PCR反应程序如下表2所示：
表2PCR扩增程序
反应体积设定50μL，保存文件，运行程序。
(4)结果分析
将Baseline设为3-15(根据实际情况，BaselineCycler可在一定范围内变化)，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为Undet。对FAM、HEX、ROX3个通道分别进行观察曲线的形状和记录Ct值。荧光标记和检测靶基因对应关系见表3。
表3荧光标记和检测靶基因对应关系
FAM HEX ROX
PCR扩增试剂 ALDH2*1/*2 ALDH2*2/*2 HBB
空白样本各通道均undet，内对照Ct为20±3的范围内，此反应有效：
若FAM通道Ct≤35，HEX通道undet，判定有ALDH2*1/*2多态性，无ALDH2*2/*2多态性；
若HEX通道Ct≤35，FAM通道undet，判定有ALDH2*2/*2多态性，无ALDH2*1/*2多态性；
若HEX通道Ct≤35，FAM通道Ct≤35，判定有ALDH2*2/*2多态性和ALDH2*1/*2多态性；
若FAM通道Ct≤35，HEX通道Ct≥35，判定有ALDH2*1/*2多态性，ALDH2*2/*2多态性的有无需重新提取样本DNA重新测试，在反应有效的前提下，HEX通道Ct≥35判定为无ALDH2*2/*2多态性，若HEX通道Ct≤35判定为无ALDH2*2/*2多态性；
若HEX通道Ct≤35，FAM通道Ct≥35，判定有ALDH2*1/*2多态性，ALDH2*2/*2多态性的有无需重新提取样本DNA重新测试，在反应有效的前提下，HEX通道Ct≥35判定为无ALDH2*2/*2多态性，若HEX通道Ct≤35判定为无ALDH2*2/*2多态性；
若HEX通道Ct≥35，FAM通道Ct≥35，ALDH2*1/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性的有无需重新提取样本DNA重新测试，在反应有效的前提下，HEX通道Ct≥35判定为无ALDH2*2/*2多态性，若HEX通道Ct≤35判定为无ALDH2*2/*2多态性；FAM通道Ct≥35判定为无ALDH2*1/*2多态性，若HEX通道Ct≤35判定为无ALDH2*1/*2多态性；
若FAM、HEX通道均undet，判定ALDH2*1/*2多态性和ALDH2*2/*2多态性均无。
空白样本不是各通道均undet，此反应无效，应重新提取样本再次测试。
内对照Ct不在20±3的范围内，此反应无效，应重新提取样本再次测试。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (2)

1.用于检测ALDH2基因的引物、探针，其特征在于：其引物探针序列如下：
ALDH2-F：5’-CCAACAGGCCCTGAGCC-3’
ALDH2-R：5’-CACCCTTTGGTGGCTACAAGATG-3’
HBB-F1：5’-TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3’
HBB-F2：5’-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3’
P-W：5’-FAM-ACAGTTTTCACTTCAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3’
P-M：5’-HEX-AGTTTTCACTTTAGTGTATGCCTGCAG-BHQ1-3’
HBB-P：5’-ROX-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-BHQ2-3’。
2.根据权利要求1中所述的用于检测ALDH2基因的引物、探针，其特征在于：利用权利要求1中所述的引物、探针检测ALDH2基因的检测方法：采用多色荧光PCR检测ALDH2基因的方法：利用杂合子型ALDH2*1/*2、纯合子型ALDH2*2/*2和内参基因β-珠蛋白的引物探针配制PCR反应液，加入人全血样本DNA，通过荧光PCR仪检测ALDH2基因的多态性。
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PB01 Publication
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RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20151209

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