CN104073573A - 一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒 - Google Patents
一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104073573A CN104073573A CN201410335816.XA CN201410335816A CN104073573A CN 104073573 A CN104073573 A CN 104073573A CN 201410335816 A CN201410335816 A CN 201410335816A CN 104073573 A CN104073573 A CN 104073573A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- primer
- probe
- sequence
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 27
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 5
- 230000002023 papillomaviral effect Effects 0.000 title abstract 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 title abstract 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 102100037111 Uracil-DNA glycosylase Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 114
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 32
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims description 23
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 15
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 10
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 4
- 102000001621 Mucoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010093825 Mucoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 101000693922 Bos taurus Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 2
- 102000006943 Uracil-DNA Glycosidase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 abstract 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 16
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 16
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 12
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 12
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 12
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 12
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 11
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 8
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 7
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 101150013707 HBB gene Proteins 0.000 description 2
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 2
- 102100029796 Protein S100-A10 Human genes 0.000 description 2
- 102100032420 Protein S100-A9 Human genes 0.000 description 2
- 102100040029 Zinc finger protein 197 Human genes 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 102200110702 rs60261494 Human genes 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：包括DNA提取液，HPV16、58、35、HBB-PCR反应液，HPV18、33、51、66-PCR反应液，HPV45、59、39、56-PCR反应液，HPV31、52、68、53-PCR反应液，Taq/UNG酶混合液，阳性对照，阴性对照。本发明提供的试剂盒能用于检测宫颈分泌物样本中人乳头瘤病毒核酸的存在。
Description
技术领域
本发明属体外诊断试剂领域，具体地，涉及一种试剂盒，更具体地，涉及一种人乳头瘤病毒(15个型)核酸分型检测试剂盒，主要适用于检测宫颈分泌物样本中人乳头瘤病毒(15个型)核酸的存在。
背景技术
宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，世界上每年的新发病例约为50万，死亡率为50％。WHO指出如不尽快采取措施，在未来十年因宫颈癌导致的死亡人数将上升约25％。大量临床实验表明99.7％的宫颈癌可检测到人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)DNA，HPV的持续性感染是宫颈癌发生的必要条件。
HPV是一组双链环状DNA病毒，具有严格的嗜上皮性。目前确定HPV型别约有120多种，根据生物学特征、致癌潜能可分为高危型和低危型。其中HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68属于高危型，其基因组能整合到人基因组中，可导致宫颈上皮内高度病变与宫颈癌的发生。由于不同HPV基因型会对宫颈癌的形成造成不同的风险。因此，快速、准确的检测出高危型HPV感染并对其进行分型对于诊断和预防宫颈癌的发生具有重要的意义。
目前HPV分型方法主要有核酸杂交(核酸印迹原位杂交、斑点印迹杂交、原位杂交和PCR-反向点杂交)和基因芯片。核酸杂交具有较好的特异性，但操作复杂，耗时长不合适临床上大规模使用。基因芯片法能检测同一样本中多种亚型，但价格昂贵，大大制约了其在临床上的应用。
荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，而且运用Taqman探针的5′末端标记上不同的荧光染料(FAM、JOE等)技术可以进行基因分型方面的研究。因此应用多色荧光PCR技术开发一种人乳头瘤病毒核酸(15个型)分型检测试剂盒是非常必要的。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，利用多色荧光PCR技术提供一种特异性强、灵敏度高、重复性好且准确度高的人乳头瘤病毒(15个型)核酸分型的试剂盒。
本发明提供的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：包括DNA提取液，HPV16、58、35、HBB-PCR反应液，HPV18、33、51、66-PCR反应液，HPV45、59、39、56-PCR反应液，HPV31、52、68、53-PCR反应液，Taq/UNG酶混合液，阳性对照，阴性对照。
其中，DNA提取液包括1-10mM、pH为5-9的EDTA、1-10mM、pH为5-9的Tris-HCl和体积分数为5-10％的Chexel-100。
本发明所涉及的HPV16、58、35、HBB-PCR反应液包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV16的引物和探针、1-100μM的HPV58的引物和探针、1-100μM的HPV35的引物和探针、1-100μM的HBB的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，HPV16的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3；HPV58的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列；HPV35的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9所示的序列；HBB的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的序列。
具体地，HPV16、58、35、HBB-PCR反应液包括10×PCR buffer(1-100mM KCl、1-100mM(NH4)2SO4、1-200mM Tris-HCl(pH8.5))、1-25mM MgCl2、dNTPs(1-25mMdATP、1-25mM dGTP、1-25mM dCTP、1-12.5mM dUTP、1-12.5mM dTTP混合物)、1-100μM HPV16基因上游引物A1、1-100μM HPV16基因下游引物B1、1-100μMHPV16基因荧光探针P1(FAM)、1-100μM HPV58基因上游引物A11、1-100μMHPV58下游引物B11、1-100μM HPV58荧光探针P11(JOE)、1-100μM HPV35基因上游引物A5、1-100μM HPV35基因下游引物B5、1-100μM HPV35基因荧光探针P5R(ROX)、1-100μM HBB基因上游引物A17、1-100μM HBB基因下游引物B17、1-100μM HBB基因荧光探针P17(CY5)和无菌蒸馏水。
其中，A1序列为：5-AGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGT-3
B1序列为：5-CACACTTGCAACAAAAGGTTACAAT-3
P1序列为：5-ACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCA-3
其中5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A11序列为：5-GGTTTCATAATATTTCGGGTCGTT-3
B11序列为：5-CTCTCATGGCGTTGTTACAGGTT-3
P11序列为：5-TGGAGACCCCGACGTAGACAAAC ACAAGT-3
其中，5′端标记JOE荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A5序列为：5-CAGCACAAGCATTATTTCATGCA-3
B5序列为：5-GCTCACGCTGCTAAGTGGACTAC-3
P5R序列为：5-AGCAAACACACAAAGAGGCTGTACAGGTCC-3
其中，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团；
A17序列为：5-TGAAGGCTCATGGCAAGAAAGT-3
B17序列为：5-TTGTCACAGTGCAGCTCACTCA-3
P17序列为：5-ACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCAC-3
其中，5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团。
本发明所涉及的HPV18、33、51、66-PCR反应液10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV18的引物和探针、1-100μM的HPV33的引物和探针、1-100μM的HPV51的引物和探针、1-100μM的HPV66的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，HPV18的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15；HPV33的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQID NO.18所示的序列；HPV51的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20、SEQ ID NO.21所示的序列；HPV66的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的序列。
具体地，HPV18、33、51、66-PCR反应液包括10×PCR buffer(100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、200mM Tris-HCl(pH8.5))、1-25mM MgCl2、dNTPs(1-25mMdATP、1-25mM dGTP、1-25mM dCTP、1-12.5mM dUTP、1-12.5mM dTTP混合物)、1-100μM HPV18基因上游引物A2、1-100μM HPV18基因下游引物B2、1-100μMHPV18荧光探针P2(FAM)、1-100μM HPV33基因上游引物A4、1-100μM HPV33下游引物B4、1-100μM HPV33荧光探针P4(JOE)、1-100μM HPV51基因上游引物A8、1-100μM HPV51下游引物B8、1-100μM HPV51荧光探针P8R(ROX)、1-100μM HPV66基因上游引物A13、1-100μM HPV66下游引物B13、1-100μMHPV66荧光探针P13C(CY5)和无菌蒸馏水。
A2序列为：5-GGAAGAAAACGATGAAATAGATGGA-3
B2序列为：5-CAACATTGTGTGACGTTGTGGTT-3
P2序列为：5-CATCAACATTTACCAGCCCGACGAGC-3
其中，5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A4序列为：5-TAAGTGACAGCTCAGATGAGGATGA-3
B4序列为：5-ACGAACTGTGGTGTTACAAGTGTGA-3
P4序列为：5-ATGGACAAGCACAACCAGCCACAGC-3
其中，5′端标记JOE荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A8序列为：5-CCATGAAATAGCGGGACGTT-3
B8序列为：5-TTACCACGCATGGCTTTATTACA-3
P8R序列为：5-CGCTAATTGCTGGCAACGTACACGACA-3
其中，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团；
A13序列为：5-GAGGAGCTACGTGTGGTACAACAG-3
B13序列为：5-CCCTCCCCATTTGTACCTTCA-3
P13C序列为：5-AGTAACGTGCCCACTCTGCGCGTCA-3
其中，5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团；
本发明所涉及的HPV45、59、39、56-PCR反应液包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV45的引物和探针、1-100μM的HPV59的引物和探针、1-100μM的HPV39的引物和探针、1-100μM的HPV56的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，HPV45的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQID NO.27；HPV59的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQID NO.30所示的序列；HPV39的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.31、SEQ IDNO.32、SEQ ID NO.33所示的序列；HPV56的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的序列。
具体地，HPV45、59、39、56-PCR反应液包括10×PCR buffer(100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、200mM Tris-HCl(pH8.5))、1-25mM MgCl2、dNTPs(1-25mMdATP、1-25mM dGTP、1-25mM dCTP、1-12.5mM dUTP、1-12.5mM dTTP混合物)、1-100μM HPV45基因上游引物A7、1-100μM HPV45基因下游引物B7、1-100μMHPV45基因荧光探针P7(FAM)、1-100μM HPV59基因上游引物A12、1-100μMHPV59基因下游引物B12、1-100μM HPV59基因荧光探针P12(JOE)、1-100μMHPV39基因上游引物A6、1-100μM HPV39基因下游引物B6、1-100μM HPV39基因荧光探针P6(ROX)、1-100μM HPV56基因上游引物A10、1-100μM HPV56基因下游引物B10、1-100μM HPV56基因荧光探针P10C(CY5)和无菌蒸馏水。
A7序列为：5-TGGAAATAGTAATACGTGGGA-3
B7序列为：5-TCGACGTGGAGGCGTGTT-3
P7序列为：5-TGACTCTATGTGCAGTACCA-3
其中，5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A12序列为：5-CTCGGAGTCGGAGTCAGGTAA-3
B12序列为：5-AACGACAAGCGCGTAGTGAA-3
P12序列为：5-TGCTCGTAGCACACAAGGTCAACTTCCTC-3
其中，5′端标记JOE荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A6序列为：5-CACCTTGCAGGACATTACAATAGC-3
B6序列为：5-GGTTCCCCGTCCCTATATACTACA-3
P6序列为：5-TATTGCAGACGACCACTACAGCAAACCGAG-3
其中，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团；
A10序列为：5-CCAAAGAGGACCTGCGTGTT-3
B10序列为：5-ACCTTCAGGTGACGCCATTG-3
P10C序列为：5-AGTAACGTGCCCACTCTGCGCRTCA-3
其中，5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团；
本发明所涉及的HPV31、52、68、53-PCR反应液包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV31的引物和探针、1-100μM的HPV52的引物和探针、1-100μM的HPV68的引物和探针、1-100μM的HPV53的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，HPV31的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQID NO.39；HPV52的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQID NO.42所示的序列；HPV68的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.44、SEQ ID NO.45所示的序列；HPV53的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的序列。
具体地，HPV31、52、68、53-PCR反应液包括10×PCR buffer(100mM KCl、100mM(NH4)2SO4、200mM Tris-HCl(pH8.5))、1-25mM MgCl2、dNTPs(1-25mMdATP、1-25mM dGTP、1-25mM dCTP、1-12.5mM dUTP、1-12.5mM dTTP混合物)、1-100μM HPV31基因上游引物A3-1、1-100μM HPV31基因下游引物B3-1、1-100μM HPV31基因荧光探针P3-1(FAM)、1-100μM HPV52基因上游引物A9-2、1-100μM HPV52基因下游引物B9、1-100μM HPV52基因荧光探针P9(JOE)、1-100μM HPV68基因上游引物A14、1-100μM HPV68基因下游引物B14、1-100μMHPV68基因荧光探针P14(ROX)、1-100μM HPV53基因上游引物A18、1-100μMHPV53基因下游引物B18、1-100μM HPV53基因荧光探针P18(CY5)和无菌蒸馏水。
A3序列为：5-GCTCAGATGAGGAGGATGTTATAGACA-3
B3序列为：5-CACACTGACAACAAAAGGTAACGATA-3
P3序列为：5-TGGACAAGCAAAACCGGACACATCC-3
其中，5′端标记FAM荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A9序列为：5-GTCAAACGCCATTATGTCCTGAA-3
B9序列为：5-CTCCACGCATGACGTTACACTT-3
P9序列为：5-TGTTGGAGACCCCGACCTGTGACC-3
其中，5′端标记JOE荧光报告基团，3′端标记BHQ1荧光淬灭基团；
A14序列为：5-CAAAGGTTGTAGTTCAATGCTGTCA-3
B14序列为：5-TCTGGACATTGTTCGTTTACATAGG-3
P14序列为：5-TGCACCTGTGCCCCGATTTGTG-3
其中，5′端标记ROX荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团；
A18序列为：5-ACCAACGACTCACACCTACAACAC-3
B18序列为：5-AATGCCATGAGCAATTGAACAG-3
P18序列为：5-TCCCGTCTAGCTTGCTGTGGCTGC-3
其中，5′端标记CY5荧光报告基团，3′端标记BHQ2荧光淬灭基团。
本发明所涉及的Taq/UNG酶混合液包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
本发明所涉及的阴性对照为含有黏蛋白和BSA的TE缓冲液。
本发明所涉及的阳性对照包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和人β-globin的线性化重组质粒的混合液、黏蛋白和BSA的TE缓冲液。
上述方法制造的试剂盒为人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒。优选为一种人乳头瘤病毒(15个型)核酸分型检测试剂盒，主要适用于检测宫颈分泌物样本中人乳头瘤病毒(15个型)核酸的存在。
本发明的作用和效果
本发明提供的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)样本的采集和保存；
(2)PCR扩增试剂配制；
(3)样本、阴性对照和阳性对照的处理；
(4)加样；
(5)PCR扩增；
(6)结果分析。
本发明利用不同荧光标记的探针，采用同一样本进行4管PCR扩增的方法，能同时检测15种高危HPV和人β-globin，并确定其型别，与现有HPV基因分型检测试剂盒相比，具有以下优势：
(1)具有更高的特异性和灵敏度。
(2)封闭检测，无需PCR后反应，避免交叉污染和环境污染。
(3)可实现一管PCR反应检测多种型别，更简便和快速。
(4)分四管扩增能检测15种高危HPV，检测型别多，使用方便。
附图说明
附图1、显示阳性样本在4种PCR反应液中的扩增曲线，
其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
附图2、显示阴性样本在4种PCR反应液中的扩增曲线，
其中，横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进一步说明，但发明的保护范围并不限于此。
实施例1：试剂盒的组成
人乳头瘤病毒(15个型)核酸分型检测试剂盒的组成如表1所示：
表1 人乳头瘤病毒(15个型)核酸分型检测试剂盒的组成
其中，DNA提取液为含有5％Chelex-100的TE缓冲液(pH9.0)。
在本发明中，DNA提取液还可以为：包括(1mM、pH5.0)或(2mM、pH6.0)或(5mM、pH7.0)或(8mM、pH8.0)或(10mM、pH9.0)的EDTA、(1mM、pH5.0)或(2mM、pH6.0)或(5mM、pH7.0)或(8mM、pH8.0)或(10mM、pH9.0)的Tris-HCl和体积分数为(5％、8％、9％、10％)的Chexel-100。
其中，HPV16、58、35、HBB-PCR反应液中各组分的终浓度为1×PCR缓冲液、引物各100nM、探针各50nM、dNTPs(0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dCTP、0.2mM dTTP、0.2mM dUTP)、4mM MgCl2；
在本发明中，HPV16、58、35、HBB-PCR反应液中各组分的终浓度还可以为10×PCR缓冲液{(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4)2SO4、(1mM或20mM或50mM或100mM或150mM或200mM)Tris-HCl(pH8或pH8.5或pH9)}、引物各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、探针各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、dNTPs{(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dATP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dGTP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dCTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dUTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dTTP}、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)MgCl2。
其中，HPV18、33、51、66-PCR反应液中各组分的终浓度为1×PCR缓冲液、引物各100nM、探针各50nM、dNTPs(0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dCTP、0.2mM dTTP、0.2mM dUTP)、4mM MgCl2；
在本发明中，HPV18、33、51、66-PCR反应液中各组分的终浓度还可以为10×PCR缓冲液{(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4)2SO4、(1mM或20mM或50mM或100mM或150mM或200mM)Tris-HCl(pH8或pH8.5或pH9)}、引物各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、探针各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、dNTPs{(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dATP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dGTP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dCTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dUTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dTTP}、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)MgCl2。
其中，HPV45、59、39、56-PCR反应液中各组分的终浓度为1×PCR缓冲液、引物各100nM、探针各50nM、dNTPs(0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dCTP、0.2mM dTTP、0.2mM dUTP)、4mM MgCl2；
在本发明中，HPV45、59、39、56-PCR反应液中各组分的终浓度还可以为10×PCR缓冲液{(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4)2SO4、(1mM或20mM或50mM或100mM或150mM或200mM)Tris-HCl(pH8或pH8.5或pH9)}、引物各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、探针各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、dNTPs{(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dATP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dGTP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dCTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dUTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dTTP}、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)MgCl2。
其中，HPV31、52、68、53-PCR反应液中各组分的终浓度为1×PCR缓冲液、引物各100nM、探针各50nM、dNTPs(0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dCTP、0.2mM dTTP、0.2mM dUTP)、4mM MgCl2；
在本发明中，HPV31、52、68、53-PCR反应液中各组分的终浓度还可以为10×PCR缓冲液{(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)KCl、(1mM或10mM或20mM或50mM或80mM或100mM)(NH4)2SO4、(1mM或20mM或50mM或100mM或150mM或200mM)Tris-HCl(pH8或pH8.5或pH9)}、引物各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、探针各(1nM或10nM或20nM或50nM或80nM或90nM或100nM)、dNTPs{(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dATP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dGTP、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)dCTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dUTP、(1mM或5mM或8mM或10mM或12.5mM)dTTP}、(1mM或10mM或15mM或20mM或25mM)MgCl2。
其中，Taq/UNG酶混合液为72μL(1U/μL或2U/μL或5U/μL或10U/μL)的Taq酶和48μL(1U/μL或10U/μL或20U/μL或30U/μL或40U/μL或48U/μL)的UNG酶的混合液；
其中，阴性对照为200μL含有100mg/μLBSA、25mg/dL粘蛋白的TE缓冲液(pH8.0)；
其中，阳性对照为200μL含有HPV16、18、31、33、35、36、39、45、51、52、53、56、58、66、68、HBB线性化质粒混合液、100mg/μLBSA、25mg/dL粘蛋白的TE缓冲液(pH8.0)。
实施例2：上述实施例1所列试剂盒用于人乳头瘤病毒(15个型)核酸分型检测的使用方法
(1)样本的采集和保存
使用样本类型：可检测的样本为宫颈脱落细胞。
采样方法：用生理盐水浸湿的棉拭子将宫颈口过多的分泌物轻轻擦拭干净，用宫颈取样刷伸入宫颈口稍用力转动4至5周，取出宫颈取样刷，将其放入盛有细胞保存液的样本管中。在管口处折断多余的刷柄，将刷头留在样本管中，旋紧管盖，样本立即送检。
样本保存：采集的样本应尽快送检，建议4℃保存不宜超过12小时，-20℃保存不宜超过15天，避免多次反复冻融。
(2)PCR扩增试剂配制
取出HPV16、58、35、HBB-PCR反应液、HPV18、33、51、66-PCR反应液、HPV45、59、39、56-PCR反应液、HPV31、52、68、53-PCR反应液、Taq/UNG酶混合液室温解冻，混匀后5000转/分钟离心5秒，取出Taq/UNG酶混合液，混匀后5000转/分钟离心5秒。
反应体系需提前计算好所需管数(待测样本+阴性对照+阳性对照)进行配制，每人份的配制用量如表1所示：
表1 每人份PCR扩增试剂配制表
(3)样本、阴性对照和阳性对照的处理
取宫颈脱落细胞样本1mL，12000转/分钟离心5分钟，去上清，加1mL生理盐水漂洗一次，每样本中加入100μL DNA提取液，充分振荡重悬细胞，煮沸10分钟，12000转/分钟离心2分钟，去上清，取5μL进行PCR扩增反应。
吸取阳性对照和阴性对照各20μL，加入100μL DNA提取液，混匀后煮沸10分钟，12000转/分钟离心2分钟，去上清，取5μL进行PCR扩增。
(4)加样
分别向准备好HPV16、58、35、HBB-PCR扩增试剂，HPV18、33、51、66-PCR扩增试剂，HPV45、59、39、56-PCR扩增试剂和HPV31、52、68、53-PCR扩增试剂的PCR反应管中加入已提取的同一个样本的DNA提取液5μL，盖上管盖。如有气泡，可用手指弹击，去除气泡。5000转/分钟离心30秒至管壁无明显液珠，转移至PCR扩增区。
(5)PCR扩增
将PCR管放入ABI7500扩增仪样品槽，按对应顺序设置待检样本、阳性对照、阴性对照。
每个样品选择FAM、JOE、ROX和CY54个通道。参比荧光(Passive Reference)设置为none。其PCR反应程序如下表2所示：
表2 PCR扩增程序
反应体积设定50μL，保存文件，运行程序。
(6)结果分析
将Baseline设为3-15(根据实际情况，Baseline Cycler可在一定范围内变化)，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为undet。对FAM、JOE、ROX和CY54个通道分别进行观察曲线的形状和记录Ct值。
质控对照：阴性对照在4种PCR反应管的4个通道Ct值均显示Undet；阳性对照在4种PCR反应管的4个通道均Ct≤32；样本内对照β-globin在HPV16、58、35、HBB-PCR扩增试剂的CY5荧光通道Ct≤40。同时符合以上三个条件，此反应视为有效。
判断：一种以上PCR扩增试剂中Ct值≤37判定为检测到相应HPV型别；37<Ct≤40时，重复检测一次，仍为37<Ct≤40的判定为检测到相应HPV型别，否则为没有检测到15种HPV；Ct>40或显示为Undet，判定结果为没有检测到15种HPV。4种不同荧光探针标记在4种PCR扩增试剂中检测的HPV型别见表3所示：
表3 4种不同荧光探针标记在4种PCR扩增试剂中检测的HPV型别
如图1所示根据该样本在4种PCR反应液中不同颜色的扩增曲线(在HPV16、58、35、HBB-PCR反应液中ROX和CY5荧光通道Ct值均≤37，其他均undet)，可以看出该样本检测到HPV35。
如图2所示根据该样本在4种PCR反应液中不同颜色的扩增曲线(在HPV16、58、35、HBB-PCR反应液中CY5荧光通道Ct值均≤37，其他均undet)，可以看出该样本没有检测到HPV的感染。
Claims (10)
1.一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：包括DNA提取液，HPV16、58、35、HBB-PCR反应液，HPV18、33、51、66-PCR反应液，HPV45、59、39、56-PCR反应液，HPV31、52、68、53-PCR反应液，Taq/UNG酶混合液，阳性对照，阴性对照。
2.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述DNA提取液包括1-10mM pH为5-9的EDTA、1-10mM pH为5-9的Tris-HCl和体积分数为5-10％的Chexel-100。
3.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述HPV16、58、35、HBB-PCR反应液包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV16的引物和探针、1-100μM的HPV58的引物和探针、1-100μM的HPV35的引物和探针、1-100μM的HBB的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，所述HPV16的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3；
所述HPV58的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的序列；
所述HPV35的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示的序列；
所述HBB的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的序列。
4.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述HPV18、33、51、66-PCR反应液10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV18的引物和探针、1-100μM的HPV33的引物和探针、1-100μM的HPV51的引物和探针、1-100μM的HPV66的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，所述HPV18的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQID NO.15；
所述HPV33的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示的序列；
所述HPV51的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21所示的序列；
所述HPV66的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的序列。
5.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述HPV45、59、39、56-PCR反应液包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV45的引物和探针、1-100μM的HPV59的引物和探针、1-100μM的HPV39的引物和探针、1-100μM的HPV56的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，所述HPV45的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26、SEQID NO.27；
所述HPV59的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30所示的序列；
所述HPV39的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33所示的序列；
所述HPV56的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36所示的序列。
6.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述HPV31、52、68、53-PCR反应液包括10×PCR buffer、MgCl2、dNTPs、1-100μM的HPV31的引物和探针、1-100μM的HPV52的引物和探针、1-100μM的HPV68的引物和探针、1-100μM的HPV53的引物和探针及无菌蒸馏水；
其中，所述HPV31的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.37、SEQ ID NO.38、SEQID NO.39；
所述HPV52的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42所示的序列；
所述HPV68的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45所示的序列；
所述HPV53的引物和探针为如序列表SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48所示的序列。
7.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述的Taq/UNG酶混合液包括耐热DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶。
8.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述的阴性对照为含有黏蛋白和BSA的TE缓冲液。
9.如权利要求1所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性对照包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68和人β-globin的线性化重组质粒的混合液、黏蛋白和BSA的TE缓冲液。
10.如权利要求1-9任一所述的一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410335816.XA CN104073573B (zh) | 2014-07-15 | 2014-07-15 | 一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410335816.XA CN104073573B (zh) | 2014-07-15 | 2014-07-15 | 一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104073573A true CN104073573A (zh) | 2014-10-01 |
| CN104073573B CN104073573B (zh) | 2016-04-27 |
Family
ID=51595176
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410335816.XA Active CN104073573B (zh) | 2014-07-15 | 2014-07-15 | 一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104073573B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132545A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-12-09 | 安徽同科生物科技有限公司 | 用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法 |
| CN105385786A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-03-09 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 |
| CN106987587A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-07-28 | 江苏睿玻生物科技有限公司 | 一种用于荧光定量pcr检测的快速提取核酸方法 |
| CN107828919A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-03-23 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 适用于四荧光通道的单管检测多个高危型hpv的试剂盒 |
| CN107828920A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-03-23 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 对多种高危型人乳头瘤病毒实现分型的试剂盒 |
| CN109234455A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-18 | 上海裕隆神光医学检验实验室有限公司 | 人乳头瘤病毒的dna分型检测试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101035896A (zh) * | 2004-10-04 | 2007-09-12 | 固德基因公司 | 人乳头瘤病毒探针和包含其的dna芯片 |
| CN101082064A (zh) * | 2006-06-02 | 2007-12-05 | 深圳市隆阳生物科技有限公司 | 高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒 |
| CN101503741A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-08-12 | 上海之江生物科技有限公司 | 用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用 |
| CN101864493A (zh) * | 2009-04-17 | 2010-10-20 | 上海生物信息技术研究中心 | 检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒及其制备和使用 |
| CN102994651A (zh) * | 2012-11-28 | 2013-03-27 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒 |
-
2014
- 2014-07-15 CN CN201410335816.XA patent/CN104073573B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101035896A (zh) * | 2004-10-04 | 2007-09-12 | 固德基因公司 | 人乳头瘤病毒探针和包含其的dna芯片 |
| CN101082064A (zh) * | 2006-06-02 | 2007-12-05 | 深圳市隆阳生物科技有限公司 | 高危型人乳头瘤病毒检测方法及试剂盒 |
| CN101503741A (zh) * | 2009-03-04 | 2009-08-12 | 上海之江生物科技有限公司 | 用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用 |
| CN101864493A (zh) * | 2009-04-17 | 2010-10-20 | 上海生物信息技术研究中心 | 检测人乳头瘤病毒的检测试剂盒及其制备和使用 |
| CN102994651A (zh) * | 2012-11-28 | 2013-03-27 | 英科新创(厦门)科技有限公司 | 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105132545A (zh) * | 2015-08-25 | 2015-12-09 | 安徽同科生物科技有限公司 | 用于检测aldh2基因的引物、探针及检测方法 |
| CN105385786A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-03-09 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 |
| CN105385786B (zh) * | 2015-11-27 | 2019-03-15 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种人乳头瘤病毒荧光定量pcr检测试剂盒及其使用方法 |
| CN106987587A (zh) * | 2017-04-11 | 2017-07-28 | 江苏睿玻生物科技有限公司 | 一种用于荧光定量pcr检测的快速提取核酸方法 |
| CN107828919A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-03-23 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 适用于四荧光通道的单管检测多个高危型hpv的试剂盒 |
| CN107828920A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-03-23 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 对多种高危型人乳头瘤病毒实现分型的试剂盒 |
| CN107828920B (zh) * | 2017-12-18 | 2021-08-06 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 对多种高危型人乳头瘤病毒实现分型的试剂盒 |
| CN109234455A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-18 | 上海裕隆神光医学检验实验室有限公司 | 人乳头瘤病毒的dna分型检测试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104073573B (zh) | 2016-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104073573B (zh) | 一种人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒 | |
| Molijn et al. | Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections | |
| Abreu et al. | A review of methods for detect human Papillomavirus infection | |
| Brink et al. | HPV detection methods | |
| CN102367487B (zh) | 一种高精确度检测人类乳头状瘤病毒基因型的方法 | |
| CN102994651B (zh) | 用于18种高危型人乳头瘤病毒荧光pcr检测的引物和探针及其试剂盒 | |
| Huang et al. | Multiple HPV genotypes in cervical carcinomas: improved DNA detection and typing in archival tissues | |
| CN105087827B (zh) | 16种型别hpv病毒的检测引物、探针及试剂盒 | |
| CN105603121B (zh) | 用于检测高危型hpv的方法、寡核苷酸和试剂盒 | |
| Tezcan et al. | Human papillomavirus genotype distribution and E6/E7 oncogene expression in Turkish women with cervical cytological findings | |
| Delgado et al. | Human papillomavirus (HPV) genotype distribution in women with abnormal cervical cytology in the Basque Country, Spain | |
| CN101435002A (zh) | 一种检测人类乳头瘤病毒基因型的方法 | |
| Hong et al. | Distribution of human papillomavirus genotypes in the patients with cervical carcinoma and its precursors in Zhejiang Province, China | |
| CN113508182B (zh) | 用于检测人乳头状瘤病毒(hpv)的测定 | |
| Chan et al. | Genotype spectrum of cervical human papillomavirus infection among sexually transmitted disease clinic patients in Hong Kong | |
| CN101796198A (zh) | 用于改进人乳头瘤病毒基因型检测的包含寡核苷酸混合物的组合物 | |
| CN101503741B (zh) | 用于检测高危型人乳头瘤病毒的试剂盒及其制备和应用 | |
| CN104560962B (zh) | 用于检测人乳头瘤病毒的荧光pcr试剂盒及其专用引物组 | |
| CN111172328A (zh) | 用于hpv核酸分型检测的成套引物、成套探针、试剂盒和hpv核酸分型检测的方法 | |
| Williamson et al. | Detection of genital human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification with degenerate nested primers | |
| CN108728578A (zh) | 在单管反应中同时检测多种高危型人乳头瘤病毒及其亚型的方法及试剂盒 | |
| Nobre et al. | Characterization of common and rare human papillomaviruses in Portuguese women by the polymerase chain reaction, restriction fragment length polymorphism and sequencing | |
| CN106834545A (zh) | 高危人乳头瘤病毒试剂盒及检测方法 | |
| CN103290141A (zh) | 16种高危型和5种低危型hpv检测试剂盒 | |
| CN108085419A (zh) | 探针及引物组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A kit for human papillomavirus nucleic acid typing Effective date of registration: 20201214 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2020320010232 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220105 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2020320010232 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Human papillomavirus nucleic acid typing detection kit Effective date of registration: 20220120 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022320010028 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20230208 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2022320010028 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A human papillomavirus nucleic acid typing detection kit Effective date of registration: 20230221 Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980033156 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2023980033156 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A human papillomavirus nucleic acid typing detection kit Granted publication date: 20160427 Pledgee: Anhui Lida finance guarantee Limited by Share Ltd. Pledgor: JIANGSU TONEKER MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980004025 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |