CN101035896A - 人乳头瘤病毒探针和包含其的dna芯片 - Google Patents

人乳头瘤病毒探针和包含其的dna芯片 Download PDF

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Abstract

合成了用于分析40种类型HPV的寡核苷酸探针，用寡核苷酸探针生成了DNA芯片。寡核苷酸探针的合成，除了根据美国和欧洲病例的信息，还建立在从4,898名韩国成年女性的宫颈细胞标本和68例宫颈癌病例的组织标本中得到的35种类型HPV的L1和E6/E7基因的克隆的基础上。DNA芯片能够分析宫颈中发现的40种类型的HPV，诊断复合感染的至少一种类型HPV，并对HPV基因型具有高达100％的优异的灵敏度和特异性以及重现性。而且，DNA芯片优于传统分析方法，并且非常经济，因为它们能在较短时间内分析众多标本。因此，DNA芯片适用于预测宫颈癌和癌前病变。

Description

人乳头瘤病毒探针和包含其的DNA芯片
技术领域
本发明涉及与人乳头瘤病毒(HPV)核酸互补结合的探针，所述HPV是宫颈癌的主要病因并且是最普遍的性传播疾病，本发明还涉及含有所述探针的DNA芯片或微阵列，用其分析HPV基因型的诊断试剂盒，以及检验是否存在HPV感染并分析其基因型的方法。
背景技术
人乳头瘤病毒(HPV)是衣壳包围着基因组双链DNA的病毒，形状类似于高尔夫球。HPV在两点上对人类很重要。首先，HPV是最常见的性传播疾病(STD)。据报告所有50％或以上的成年女性在其一生中至少感染一次HPV。其次，HPV感染人上皮细胞，诱导过度增生。多数情况下，这种过度增生是良性肿瘤如单纯皮肤疣、围绕外生殖器或肛门的尖锐湿疣等。但是，HPV可以是癌症的诱因，事实上几乎所有的宫颈癌、头颈肿瘤的大多数和大量肛门癌是由HPV诱发的(HowleyPM.Virology.VoI 2，1996，2045-2109；Murinoz N等，NEngl JMed，2003，348：518-27)。
HPV可以分为以下两种类型。一种是侵入皮肤的类型，另一种是侵入外生殖器或肛门的皮肤和粘膜交界处的肛门与生殖器类型。根据基因组的碱基序列，即系统发生树或基因型，HPV可以具体分成大约120种类型。其中，包括HPV 16型(HPV-16)，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-52，HPV-58，HPV-67，HPV-40，HPV-43，HPV-7，HPV-32，HPV-42，HPV-6，HPV-11，HPV-74，HPV-44，HPV-55，HPV-13，HPV-61，HPV-72，HPV-62，HPV-2，HPV-27，HPV-57，HPV-3，HPV-28，HPV-29，HPV-10，HPV-54，HPV-18，HPV-39，HPV-45，HPV-59，HPV-68，HPV-70，HPV-26，HPV-69，HPV-51，HPV-30，HPV-53，HPV-56，HPV-66，HPV-34，HPV-64和HPV-73的45种类型HPV侵入外生殖器和肛门。  肛门与外生殖器型HPV根据其诱发宫颈癌的能力，可以分类为高危型和低危型和/或中危型。  高危型HPV包括22类HPV，其为HPV-16，HPV-18，HPV-26，HPV-30，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-52，HPV-53，HPV-56，HPV-57，HPV-58，HPV-59，HPV-61，HPV-67，HPV-68，HPV-70，HPV-73，和HPV-82。虽然在世界范围内有差异，但其中最常见的高危型HPV是HPV-16，其次是HPV-18，HPV-45，HPV-31，HPV-33，HPV-52和HPV-58。低危型HPV包括大约20类HPV，如HPV-2a，HPV-3，HPV-6，HPV-10，HPV-11，HPV-32，HPV-34，HPV-40，HPV-42，HPV-43，HPV-44，HPV-54，HPV-55，HPV-61，HPV-66，HPV-69，HPV-70，HPV-72，HPV-81和HPV-CP6108(Murinoz N等，NEngl JMed，2003，348：518-27)。
HPV的基因组结构可以大致分为早期转录区E(早期基因区)、晚期转录区L(晚期基因区)和非表达区LCR(长控制区)。HPV的基因组结构大大影响了HPV的发病类型、危险度和预后。尤其是，E区的E6和E7基因整合在感染细胞的基因组中，保留并表达，从而在诱发癌症中扮演了重要的角色。高危型HPV如HPV-16、HPV-18等与人类最重要的肿瘤抑制基因如p53，E6AP、视网膜母细胞瘤(Rb，P105RB)、P107和P130等反应，并使肿瘤抑制基因失活。结果是，感染的细胞由于细胞周期调节和凋亡控制机制的紊乱而转化为癌细胞。相反，由于低危型HPV与p53或Rb肿瘤抑制基因的反应和失活肿瘤抑制基因的能力低下，低危型HPV难以诱发宫颈癌。同时，HPV基因的最大基因是L1。L1以与大多数HPV类型相似的保守碱基序列存在。L1蛋白主要由HPV衣壳蛋白组成，其抗原性最高(Schneider A.Science1993；281：263-5；zur Hausen H.Seain Cancer Biol 1999；9：405-11)。
一旦被HPV转化的宫颈细胞通过癌前病变或发育异常、子宫颈上皮内瘤变(CIN)或鳞状上皮内病变(SIL)而发展为所谓原位癌。如果原位癌侵入上皮细胞下的基底层，就成为所谓癌或浸润性癌。90％或以上感染HPV的女性依靠体内免疫系统，天然清除HPV。但是，10％感染了高危型HPV的女性中，HPV潜伏下来，并诱发宫颈癌。大约8％癌前病变会发展为原位癌，大约20％癌前病变发展为癌症。即，高危型HPV在HPV感染的患者中潜伏了10-20年或以上的情况下，高危型HPV诱发宫颈癌，估计发生率大约0.16％。由于宫颈癌的发作需要这样长的时期，并且是阶段性诱发，因此可能通过在发病的中期阶段通过早期检查癌前病变来治疗或预防宫颈癌。就是说，通过保守的医疗手术清除癌前病变，以阻断致癌作用是可能的。最近，关于对抗HPV最大抗原L1的疫苗的临床试验正在进行。还有，通过应用对抗HPV的E6和E7(诱发宫颈癌的主要病因)的疫苗，治疗宫颈癌前病变的尝试也在积极开展。但是，对于HPV疫苗，还需要通过识别各种HPV的基因型，制备固定的疫苗(Bosch FX等，J Clin Pathol，2002，55：244-65.Wallin K等，N Engl J Med，1999，341：1633-8；Koutsky LA等，N Engl J Med，2002，347：1645-51)。
由于HPV非常难以培养，并且非常难以在免疫检查或血清检查中对其诊断，有关HPV的研究是在阶段性病症中进行。但是，随着过去20年来基因检查的发展，检查HPV基因型，进而开发诊断疫苗，并用检查结果预防和治疗HPV并筛查宫颈癌，这种尝试正在积极开展。
特别是，依靠分子生物和电子学的结合，近期开发了基因芯片(或DNA芯片或DNA微阵列)，其能仅仅在一块显微片上，同时检查数十至数万基因。这种DNA芯片是一种新的分析体系，其能用于分析基因表达、基因诊断、基因突变诊断、药物筛选和疾病筛查，并准确诊断细菌和病毒等。因此，开发HPV DNA芯片，以快速和精确地检测与宫颈癌有关的高危型HPV，是全世界范围的尝试。
宫颈癌筛查是常规的检查方法，主要用于筛查宫颈癌及其癌前病变。进行宫颈筛查是通过用头上带有刷子的工具，例如棉签，擦下或刮下宫颈细胞，然后检查细胞的细胞学类型。宫颈筛查的结果分类为正常、意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)、低危型或鳞状上皮内低度病变(LSIL)、高危型或鳞状上皮内高度病变(HSIL)、原位癌或癌。宫颈筛查根据发明者也称作papanicolou涂片检查(巴氏涂片)。巴氏涂片从1940年开始用，在显著降低宫颈癌的死亡率上发挥了重要作用。但是，巴氏涂片的缺点是假阴性率高达30-40％。这种假阴性高发率是由取样者的取样误差或检查人员的读出误差引起。因此，为了避免取样误差并减少读出误差，近来正尝试基于液体的细胞学检查，也称作Thin Prep。然而，假阴性率仍然高。因此，最近十年，通过检查是否存在HPV感染和其基因型来识别高危型HPV并预测宫颈癌发作风险的尝试已经实现。人们相信该HPV检查比巴氏涂片有更高的筛查准确度。
近来据报告只有一种HPV检查能诊断几乎所有的高危型癌前病变，并且一种HPV检查比巴氏涂片或阴道镜检查二者的准确度都高。另外，HPV检查结合巴氏涂片能改进筛查敏感性和特异性，因为组合检查能解决巴氏检查的问题。组合检查还有一个优势是筛查的时间间隔可以从1年(仅作巴氏涂片)延长为3-4年。因此，FDA推荐巴氏涂片和HPV检查的组合检查(Ledger WJ等，Am J Obstet Gynecol，2000，182：860-5；Wright TC Jr等，JAMA，2001，287：2120-9；Wright TC Jr等，New Engl J Med，2003，348：6-7；Sherman ME等，J Natl Cancer Inst，2003，95；46-52)。
目前，HPV基因检查可以分为两种方法。一种方法是检查是否有HPV感染和HPV的大致类型。另一种是基因型方法，检查是否有HPV感染和HPV的大致类型。
前一种方法，即能诊断HPV感染的代表性方法，包括基于PCR的方法和基于杂交的方法。基于PCR的方法的进行是通过用共有引物扩增主要的病毒衣壳L1基因(其在外生殖器型HPV基因组中的碱基序列大多保守)或E6和E7基因，并通过电泳等方法确证结果。但是，该方法只能确定是否存在HPV感染，但不能检查其代表的HPV基因型甚或高危型或低危型。另外，扩增期间有假阳性的风险和污染。代表性的基于杂交的方法是第二代杂交捕获分析法(Digene Diagnostics，Inc.USA)。杂交捕获法的进行是以杂交捕获技术从标本中提取HPVDNA，将HPV DNA用高危HPV鸡尾酒(cocktail)探针和低危HPV鸡尾酒探针杂交，并诊断HPV感染的存在与否。但是，杂交捕获法的缺点是其不可能精确分析HPV的基因型，并由于未经扩增而降低检查的灵敏度。类似的方法包括以下这种方法，其通过用共有引物进行PCR，与高危HPV鸡尾酒探针杂交，并观察酶免反应。该方法相对简单，并适用于识别高危型HPV，但不能识别低危型HPV和HPV的精确类型(Kornegay JR等，J Clin Microbiol，2001，39：3530-6)。
用于识别HPV感染是否存在及其基因型的最标准的方法，是PCR后测序。该方法的进行是通过对外生殖器的L1基因和E6/E7基因中碱基序列保守并且碱基序列根据每种类型有差异的区域进行扩增，并对碱基序列直接或在克隆后进行测序。该方法是最佳标准检验。但是，测序方法的缺点是它通过一或两种检查只能检查一个标本，需要很多时间和成本；是很耗人力的。因此，难以将测序方法用于临床检验。还有，虽然必须用克隆化来识别至少一种类型HPV的复合感染，但是实际上所述过程是不可能的。因此，以后的方法试图替代测序方法。
第一种方法是用根据各个HPV类型的基因型特异性引物进行数个PCR的方法。该方法是要通过对各HPV基因型的电泳法或southern印迹法，识别PCR产物的不同大小。该方法简单，但耗精力并且效率低。还有，该方法的缺点是它只能识别少数HPV类型。
第二种方法是PCR后限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)。该方法的进行是通过用共有引物的PCR，扩增L1基因或E6和E7基因；用限制性酶消化PCR产物；并通过电泳法测定产物长度。该方法是常规方法并耗人力。该方法还有缺点是它只能识别少数HPV类型(Vermon SD等J Clin Microbiol，2000，38：651-5)。
第三种方法是反向杂交线点检测法(reverse hybridization line blotdetection method)，其用于近6-7年间。该方法的进行是制备尼龙膜条带，用于各种HPV类型的基因型特异的寡核苷酸探针附着其上；定位HPV的共有引物PCR产物；通过杂交测定展现最强反应的类型。该方法应用的名称是PGMY线点分析或SFP10线探针分析等(Gravitt PE等，J Clin Microbiol，1998，36：3020-7；van Doorn L等，J Clin Microbiol，2002，40：979-983)。据报告这些方法能最多识别25-27种HPV类型。但是，这些方法很耗人力，难以自动化，并且不能识别所有的HPV类型。另外，由于要测定的靶区域位于L1基因某个区域中的50个碱基，由于基因内变异，PCR扩增不能有效进行。该方法还有的缺点是，难以识别基因变异，并且它不能识别在诱发宫颈癌中发挥决定性作用的E6和E7基因。
最后，近来，发展和应用了寡核苷酸微阵列或DNA芯片。DNA芯片采用了上述反向杂交法的程序，除了用显微玻璃片取代了尼龙膜条带(Cho NH等Am J Obstet Gynecol，2003，188：56-62)。较之上述反向杂交法，DNA芯片易于自动化。但是，DNA芯片具有与反向杂交法同样的缺点。即，DNA芯片不能识别所有类型的外生殖器HPV，只能识别22种类型；由于要测定的靶区域位于L1基因某个区域中的50个碱基，PCR扩增不能有效进行；难以识别基因变异；不能分析E6和E7基因。
理想的HPV基因型检查方法的要求条件如下：
(1)能够诊断所有类型的HPV，包括外生殖器HPV的复合感染；
(2)灵敏度、特异性和重现性均应接近100％；
(3)能够分析L1基因以及E6和E7基因；
(4)能够分析基因的野生型碱基序列和突变碱基序列；
(5)检查程序和检查结果的分析应当简单；
(6)应当能够在短时间内自动分析标本的多样性。
结果是，DNA芯片适合。但是，迄今能满足上述条件的DNA芯片尚未有售。考虑到地域特性，很需要根据通过获取许多韩国女性的宫颈细胞标本建立的数据库来生产DNA芯片；识别宫颈细胞标本中存在的HPV基因型和变体。
[公开]
[技术问题]
完成本发明是为了解决上述问题，并提供能够高选择性和灵敏度、自动准确地诊断性HPV感染的探针，其是宫颈癌的主因，并且是性传播疾病的最普遍原因之一。
本发明的一方面是提供用于探查性HPV或分析其基因型的寡核苷酸微阵列芯片(DNA芯片)。
本发明的另一个方面是提供用于探查性HPV或分析其基因型的一体化(all in one)试剂盒，其包括上述探针、所有与HPV DNA芯片有关的试剂、对照标本等。
本发明的另一个方面是提供分析HPV基因型的探针，以及用包含探针的寡核苷酸微阵列(寡DNA芯片)探查性HPV或分析其基因型的方法。
[技术方案]
本发明现在将在下文中参考附图更充分地说明，其中展示了本发明的优选实施方案。但是，本发明可以用很多不同形式具体表达，并不能解释为受本文提出的实施方案的限制。相反，提供这些实施方案使得该公开完全彻底，并能对本领域技术人员充分传达本发明的范围。
本发明用于分析HPV的探针、DNA、试剂盒和分析方法以如下9个步骤完成：
1.制备标准和对照标本
制备被主要的HPV类型感染的人宫颈癌细胞系、68份从韩国女性取样的宫颈癌组织和4,898份从韩国女性取样的宫颈细胞标本。从中得到阳性对照和阴性对照标本(实施例1)。
2.DNA的分离
从步骤1所得的标本中通过适当的技术分离DNA(实施例2)。
3.PCR
选择和设计扩增HPV的E6/E7基因、L1基因和人β球蛋白基因的寡核苷酸引物，并建立适当的PCR条件。分别建立单重PCR、双重PCR和三重PCR的PCR条件。另外，对HPV的E6/E7基因、L1基因和人β球蛋白基因的PCR用步骤2分离的DNA作为模板进行(实施例3)。
4.序列分析和建立克隆
PCR后，进行测序反应，分析HPV-E6/E7和HPV L1的碱基序列，分选分析信息建立数据库。另外，其HPV类型被确证的PCR产物被克隆进质粒载体。此后，当建立本发明的DNA芯片的反应条件时，这些克隆用作标准和对照标本。保存临床DNA标本，然后用于分析本发明的DNA芯片的精确度(实施例4和5)。
5.DNA芯片的探针设计
根据临床标本建立的HPV的E6/E7和L1的数据库，所述临床标本用于分析在步骤4中从韩国女性取样的宫颈细胞的HPV基因型，还根据国外HPV-相关数据库，寡核苷酸探针在DNA芯片上通过杂交反应能够分别分析外生殖器型HPV的L1和E6/E6以及人β球蛋白(实施例6)。
6.DNA芯片的生产
设计网格来排列或放置步骤5中设计的探针。然后，与适当载体混合的探针排列或放置在用于显微镜的玻片上。在用于稳定性和质量控制的适当处理后，保存玻片用于进一步分析(实施例7)。
7.DNA芯片上的反应和分析条件的建立
用多重PCR使用标准标本扩增HPVE6/E7和L1基因以及人β球蛋白基因，所用的标准标本由步骤4确定的各HPV类型的一、二或三个克隆的各种组合和浓度产生。通过在DNA芯片上定位PCR产物确定适当的条件，进行数次杂交，然后用荧光扫描仪分析(实施例8)。
8.在DNA芯片上进行临床标本分析
对临床标本的DNA进行多重PCR扩增以发现是否存在HPV，如果存在的话，发现其基因型。然后，在PCR产物被放置在步骤6产生的DNA芯片上后，在步骤7确定的条件下进行杂交反应。在清洗后，进行荧光扫描仪分析。DAN芯片的灵敏度、特异性和重现性可用该程序分析。并且，再次确立了本发明的DNA芯片用于诊断HPV基因型的最佳条件(实施例9)。
9.在DNA芯片上进行临床分析后，对分析出的临床数据的相关性分析
步骤8中的PCR后，将运用DNA芯片分析所得的结果与宫颈筛查等得到的临床数据相比较，分析相关性以及DNA芯片是否适用于预测宫颈癌或癌前病变。已发现DNA芯片适用于分析HPV基因型以及筛查宫颈癌(实施例10)。
本发明提供了运用DNA芯片的诊断试剂盒(一体化试剂盒)，包括1)临床标本取样工具，如宫颈拭子等和从标本中提取DNA的试剂，2)扩增HPVE6/E7基因和L1基因以及β球蛋白基因的PCR试剂，3)在HPV基因扩增中用作阳性对照的质粒DNA克隆，4)分析HPV基因型的寡DNA芯片，5)用DNA芯片进行杂交反应的反应液和杂交反应后使用的清洗液。
[附图说明]
通过参考附图详细说明示例性实施方案，本发明的上述和其它特征和优势将更为显见，其中：
图1是HPV的E6和E7基因的电泳照片，通过在2％琼脂糖凝胶上进行电泳获得。通过从阳性对照细胞系分离基因组DNA获得E6和E7基因，然后通过用基因组DNA作为模板的PCR扩增E6和E7基因(泳道1(M)：100bp DNA分子量标记，泳道2(N/C)：阴性对照，泳道3(HPV-16)：HPV-16感染的阳性对照细胞系(Caski，ATCC CRL-1550)，泳道4(HPV-18)：HPV-18感染的阳性对照细胞系(HeLa，ATCCCCL-2)，泳道5(HPV-35)：HPV-35感染的阳性对照细胞系(ATCC40331))。
图2是HPV的L1基因电泳照片，通过在2％琼脂糖凝胶上进行电泳获得。通过从阳性对照细胞系分离基因组DNA获得E6和E7基因，然后通过用基因组DNA作为模板的PCR扩增L1基因(泳道1(M)：100bp DNA分子量标记，泳道2(N/C)：阴性对照，泳道3(HPV-16)：HPV-16感染的阳性对照细胞系(Caski，ATCC CRL-1550)，泳道4(HPV-18)：HPV-18感染的阳性对照细胞系(HeLa，ATCC CCL-2)，泳道5(HPV-35)：HPV-35感染的阳性对照细胞系(ATCC 40331))。
图3是HPV的E6/E7基因和人β球蛋白(HBB)基因的电泳照片，通过在2％琼脂糖凝胶上进行电泳获得。通过从阳性对照细胞系分离基因组DNA获得E6/E7基因和HBB基因，然后通过用基因组DNA作为模板的双重PCR扩增E6/E7和HBB基因(泳道1(M)：100bp DNA分子量标记，泳道2(N/C)：阴性对照，泳道3(HPV-16)：HPV-16感染的阳性对照细胞系(Caski，ATCC CRL-1550)，泳道4(HPV-18)：HPV-18感染的阳性对照细胞系(HeLa，ATCC CCL-2)，泳道5(HPV-35)：HPV-35感染的阳性对照细胞系(ATCC 40331))。
图4是HPV的L1基因和人β球蛋白(HBB)基因的电泳照片，通过在2％琼脂糖凝胶上进行电泳获得。通过从阳性对照细胞系分离基因组DNA获得L1基因和HBB基因，然后通过用基因组DNA作为模板的双重PCR扩增L1和HBB基因(泳道1(M)：100bp DNA分子量标记，泳道2(HPV-16)：HPV-16感染的阳性对照细胞系(Caski，ATCCCRL-1550)，泳道3(HPV-18)：HPV-18感染的阳性对照细胞系(HeLa，ATCC CCL-2))。
图5是HPV的L1基因和E6/E7基因以及人β球蛋白(HBB)基因的电泳照片，通过在2％琼脂糖凝胶上进行电泳获得。通过从阳性对照细胞系分离基因组DNA获得L1和E6/E7基因以及HBB基因，然后通过用基因组DNA作为模板的三重PCR扩增L1、E6/E7和HBB基因(泳道1(M)：100bp DNA分子量标记，泳道2(HPV-16)：HPV-16感染的阳性对照细胞系(Caski，ATCC CRL-1550)，泳道3(HPV-18)：HPV-18感染的阳性对照细胞系(HeLa，ATCC CCL-2))。
图6是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的E6/E7基因的结果。扩增的E6/E7基因通过用从Caski、即HPV-16感染的宫颈癌细胞系提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及人β球蛋白(HBB)基因获得。如图6所示，HPV的基因型是HPV-16。
图7是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的E6/E7基因的结果。扩增的E6/E7基因通过用从HeLa、即HPV-18感染的宫颈癌细胞系提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图7所示，HPV的基因型是HPV-18。
图8是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从Caski、即HPV-16感染的宫颈癌细胞系提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图8所示，HPV的基因型是HPV-16。
图9是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从HeLa、即HPV-18感染的宫颈癌细胞系提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图9所示，HPV的基因型是HPV-18。
图10是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞中提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图10所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-31。
图11是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞中提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图11所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-35。
图12是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞中提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图12所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-39。
图13是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞中提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图13所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-67。
图14是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞中提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图14所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-56。
图15是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查中仅显示阳性反应变化的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图15所示，HPV的基因型是一种低危型HPV-6b。
图16是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查中仅显示阳性反应变化的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图16所示，HPV的基因型是一种低危型HPV-11。
图17是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查中仅显示意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图17所示，HPV的基因型是HPV-58。
图18是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查和活组织检查中表现出微浸润性鳞状细胞癌的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图18所示，HPV的基因型是HPV-16。
图19是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查和活组织检查中表现出鳞状上皮内高度病变的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图19所示，HPV的基因型是HPV-31。
图20是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查和活组织检查中表现出HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图20所示，HPV的基因型是HPV-18。
图21是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查和活组织检查中表现出HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图21所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-58。
图22是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查和活组织检查中表现出HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图22所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-34。
图23是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈活组织检查中显示为原位癌的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图23所示，HPV的基因型是HPV-68。
图24是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查中表现出鳞状上皮内低度病变(LSIL)的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图24所示，HPV的基因型是HPV-56。
图25是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查中表现出LSIL的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图25所示，HPV的基因型是HPV-35。
图26是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因通过用在宫颈筛查中表现出LSIL并之后复合感染HPV-18和HPV-70的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。
图27是电泳峰图谱，显示以ABI prism 377自动测序仪分析的扩增的L1基因的结果。扩增的L1基因，通过用在宫颈筛查中表现出微浸润性鳞状细胞癌并之后复合感染HPV-16和HPV-52的韩国女性的宫颈拭子标本所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。
图28是根据本发明的实施方案，举例说明放置在DNA芯片上的类型和位置的示意图。
图29是根据本发明的实施方案，诊断HPV基因型的DNA芯片的正面照片。
图30是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从Caski、即宫颈癌细胞系所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图30所示，HPV的基因型是HPV-16。
图31是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从HeLa、即宫颈癌细胞系所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图31所示，HPV的基因型是HPV-18。
图32是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从K562、即非感染性阴性对照细胞系所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。
图33是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图33所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-16。
图34是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图34所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-18。
图35是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图35所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-31。
图36是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图36所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-35。
图37是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图37所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-39。
图38是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图38所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-67。
图39是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用从韩国女性的宫颈癌组织中些微切取的宫颈癌细胞所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图39所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-56。
图40是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中只出现阳性反应变化韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图40所示，HPV的基因型是一种低危型HPV-6b。
图41是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中只出现阳性反应改变的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图41所示，HPV的基因型是一种低危型HPV-11。
图42是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现意义不明的非典型鳞状细胞(ASCUS)的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图42所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-58。
图43是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查和活组织检查中出现微浸润性鳞状细胞癌的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图43所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-16。
图44是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现鳞状上皮内高度病变的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图44所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-31。
图45是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图45所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-18。
图46是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图46所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-58。
图47是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图47所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-34。
图48是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现原位癌的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图48所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-68。
图49是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现鳞状上皮内低度病变(LSIL)的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图49所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-56。
图50是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现LSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图50所示，HPV的基因型是一种高危型HPV-35。
图51是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图51所示，发现是HPV-18和HPV-70的复合感染。
图52是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中出现HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图52所示，发现是HPV-16和HPV-52的复合感染。
图53是荧光扫描器摄下的照片，显示了根据本发明的实施方案，用诊断HPV基因型的DNA芯片分析的扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过用在宫颈筛查中表现为正常的韩国女性的宫颈拭子标本中所提取的DNA，以三重PCR扩增HPV的L1基因和E6/E7基因以及HBB基因获得。如图53所示，没有任何HPV感染。
[最佳实施方式]
本发明在后文中将以实施例说明。但是，下述实施例仅用于示范本发明，本发明不受下列实施例的限制。
实施例1：制备标准和对照标本
首先，制备将在未来的基因型检查和分析中用作标准或参考和对照的标本。
第一个标本是人宫颈癌细胞系，其已被证实了是否存在HPV并证实了其类型，已广泛地用于HPV基因型的研究中。人宫颈癌细胞系购自ATCC(Manassas，VA20108，USA)和韩国细胞系库(Korea Cell LineBank)(KCLB)(Seoul University Medical center cancer institute，KOREA)，在单层培养后使用。细胞系的具体说明总结于表1。
第二个标本来自被确诊为宫颈癌或原位癌病变并经历了手术的女性的宫颈组织。标本经福尔马林固定后，在石蜡包埋状态保存的组织被切成6-10片10μm厚的显微切片，沾在显微镜玻片上，仅仅显微切割癌细胞。在68例宫颈癌病变中，61例为宫颈鳞状上皮癌，7例为宫颈上皮内瘤变CIN。女性的平均年龄分布为32-69岁，平均年龄49岁。
第三，4,898份宫颈标本来自4,898名女性，其均去过韩国的产科诊所，并从2003年起，接受Hamchun Diagnosis Center(韩国首尔)和Korea Gynecologic Cancer Foundation(韩国首尔)的拭子和宫颈筛查。女性的平均年龄分布为16-19岁占0.2％；二十几岁占18％；三十几岁占38％；四十几岁占32％；五十几岁占7％；六十几岁占1％和其它占3％。4,898例中的4,741例，细胞学和病理学诊断结果通过进行HPV检查以及宫颈筛查和/或活组织检查来提供。宫颈细胞的取样是通过将巴氏刷(Sanga Medical；songpaku Seoul Korea)或棉签插入子宫颈，并转动刷或棉签以良好收集宫颈细胞。然后，巴氏刷或棉签的顶端放入含有无菌转移缓冲液的带螺旋盖的试管中，保存。主要使用3ml CytoLyt液(CYTYC Corporation，MA 01719，USA)作为转移缓冲液。
表1对照细胞系的具体说明
    细胞系     HPV感染    感染的HPV类型
    ATCC 45022     +    HPV-2a
    ATCC 45150     +    HPV-6b
    ATCC 45151     +    HPV-11
    ATCC 45113     +    HPV-16
    ATCC CRL-1500(CaSki)     +    HPV-16
    ATCC 45152     +    HPV-18
    ATCC CCL-2(Hela)     +    HPV-18
    ATCC 65446     +    HPV-31
    ATCC 40331     +    HPV-35
    ATCC 40338     +    HPV-43
    ATCC 45353     +    HPV-44
    ATCC 45548     +    HPV-56
    KCLB-10243*     -
实施例2：分离DNA
从实施例取样的不同标本中，用如下的适当方法分离DNA：
为了从细胞系分离DNA，分离单层培养的细胞系，放进50ml离心管中，在3500rpm下离心30分钟，倒出上清液，用500μl PBS分散沉淀，转移到1.5ml离心管中，在12,000rpm下离心2分钟，除去残留的介质液。之后，加入200μl的PBS液和20μl的蛋白酶K(20μg/μl)到细胞沉淀中，用振动的磁力搅拌器混合。加入200μl GC溶液，混合，并在60℃加热块上增溶20分钟。反应完全后，标本中加入100μl异丙醇，充分混合。所有溶液加到过滤柱上，10,000rpm下离心1分钟。弃去通过柱子的滤出液后，加入500μl W1缓冲液。然后，加入500μl W2缓冲液并再次离心。空柱子以12,000rpm离心2分钟，完全除去乙醇。之后，加入60μl无菌蒸馏水，静置10分钟，在1,200rpm下离心2分钟，得到DNA。
还有，为了从石蜡包埋的宫颈组织中分离DNA，用Pin point SlideDNA Isolation System(Zymo Research，CA，USA)，从附着在显微镜玻片上的10μm厚的宫颈组织中，只分离癌细胞。每个玻片得到大约1,000-2,000个液态细胞，所有的细胞转移到微离心管中，用1ml二甲苯处理两次以除去石蜡，用无水乙醇过量的二甲苯处理，用100μl DNA提取和细胞溶解缓冲液(50mM KCl，10mM Tris-HCl[pH 8.3]，2.5mMMgCl2，明胶，0.45％IGEPAL，0.45％tween 20，蛋白酶K[60μg/ml])处理，在55℃下反应3小时，加热至95℃10分钟以灭活蛋白酶K。离心后，上清液用于PCR。
为了从宫颈拭子标本中提取DNA，DNA用Accuprep GenomicDNA提取试剂盒(Cat.No.K-3032，Bioneer co.，Ltd.Korea)浓缩和纯化。该过程如下：1.5ml宫颈细胞涂片标本在12,000rpm下离心沉淀2分钟，加入1.5ml磷酸盐缓冲液(PBS)，清洗，加入适量蛋白酶K和细胞裂解缓冲液，在60℃培养20分钟。完成反应后，反应液用离心机通过DNA结合柱，用离心机以清洗缓冲液1和2清洗以收集DNA。
实施例3：PCR扩增
为了检查HPV的基因型，首先HPV的E6/E7基因和L1基因用PCR扩增，人β球蛋白基因作为PCR扩增的内部对照。
首先，选择和设计寡核苷酸引物用于这些PCR扩增。引物由能检测HPV的E6/E7基因的HPCF/HPCR引物、能检测L1基因的MY11和GP6-1引物(SEQ ID NO.1)、以及用于证实DNA提取和PCR的效率的人β球蛋白基因的HBBF/HBBR引物组成。GP6-1引物是新设计的，另外两个引物选自已知引物。HPV的E6/E7基因的PCR扩增大约225bp长度的产物，HPV的L1基因的PCR扩增182bp长度的产物，β球蛋白基因的PCR扩增182bp长度的产物。每种基因的PCR引物的碱基序列总结在表2中，PCR的条件如下：
为单重PCR、双重PCR和三重PCR建立各自适当的PCR条件。相应地，HPV的E6/E7基因、HPV的L1基因和人β球蛋白基因的PCR用实施例2分离的DNA作为模板进行。PCR的过程如下：
1.单重PCR
检测HPV感染的PCR反应组合物的制备如表2所述，是将MY11/GP6-1、HPCF/HPCR和HBBF/HBBR引物每种1μl(10pmol/μl)加入到购自Super Bio Co.，Ltd(韩国首尔)的SuperTaq plus pre mix(10xbuffer 2.5/μl，10mM MgCl2 3.75μl，10mM dNTP 0.5μl，Taq聚合酶0.5μl)15μl中，再加入4.0μl(150ng/μl)标本的模板DNA，最后加入蒸馏水调节总反应液的体积至30μl。
人β球蛋白的PCR的进行，是在95℃下对含有HBB引物的反应液预变性5分钟，在95℃，30秒、50℃，30秒、72℃，30秒下重复40个循环，并在72℃延伸5分钟。
HPV的E6/E7的PCR的进行是通过在95℃下对含有HPCF/HPCR引物的反应液预变性5分钟，在95℃，30秒、56℃，30秒、72℃，30秒下重复40个循环，并在72℃延伸5分钟。
HPV的L1的PCR的进行是通过在95℃下对含有MY11和GP6-1引物的反应液预变性5分钟，在95℃，30秒、56℃，30秒、72℃，30秒下重复40个循环，并在72℃延伸5分钟。
2.双重PCR
确定HPV感染的双重PCR的引物组合的组成是：(1)检测HPV的E6/E7基因的HPCF/HPCR引物和检测β球蛋白基因的HBBF/HBBR引物的组合与(2)检测HPV的L1基因的MY11/GP6-1引物和β球蛋白引物的组合物。
HPV E6/E7和HBB基因的双重PCR的进行如下：检测HPV感染的PCR反应组合物的制备是通过，将HPCF/HPCR和HBBF/HBBR引物每种1μl(10pmol/μl)加入到15μl SuperTaq plus premix中，再加入4.0μl(150ng/μl)标本的模板DNA，最后加入蒸馏水调节总反应液的体积至30μl。PCR的进行是通过在95℃下预变性反应液5分钟，在95℃，1分钟、72℃，1分钟、72℃，1分钟下重复30个循环，并在72℃延伸5分钟。
HPV L1和HBB基因的双重PCR的进行如下：检测HPV感染的PCR反应组合物的制备是通过，将MY11/GPG-1和HBBF/HBBR引物每种1μl(10pmol/μl)加入到15μl SuperTaq plus premix中，再加入4.0μl(150ng/μl)标本的模板DNA，最后加入蒸馏水调节总反应液的体积至30μl。PCR的进行是通过在95℃下预变性反应液5分钟，在95℃1分钟、72℃1分钟、72℃1分钟下重复10个循环，在95℃，1分钟、50℃，1分钟、72℃，1分钟下重复30个循环，并在72℃延伸5分钟。
3.三重PCR
HPV E6/E7、L1和HBB基因的三重PCR的进行如下：
检测HPV感染的PCR反应组合物的制备是通过，将MY11/GPG-1、HPCF/HPCR和HBBF/HBBR引物每种1μl(10pmol/μl)加入到15μlSuperTaq plus premix中，再加入4.0μl(150ng/μl)标本的模板DNA，最后加入蒸馏水调节总反应液的体积至30μl。PCR的进行是通过在95℃下预变性反应液5分钟，在95℃，1分钟、72℃，1分钟、72℃，1分钟下重复10个循环，在95℃为时1分钟、50℃，1分钟和72℃，1分钟下再重复30个循环，并在72℃延伸5分钟。
实验结果展示在图1至图5中。如图1-5所示，HPV的单重、双重和三重PCR的条件已适当建立，并且宫颈拭子标本和石蜡包埋的宫颈癌组织标本也执行良好。
在4,898份宫颈细胞临床标本上进行的HPV L1和E6/E7基因的PCR结果表示在表3中。1,414例的结果是阳性的。尤其是，其中通过L1检测出的病例约50％，通过E6/E7检测出的病例约66％，被L1或E6/E7检测出的病例分别为50.2％和34.7％。这明显提示当在临床检验中检查宫颈细胞进行HPV检测时，如果检查只查L1，如市售的HPV反向线杂交试剂盒和等同的DNA芯片，则多数HPV会遗漏。这还表明扩增L1以及E6/E7并证实其碱基序列对于精确筛查HPV是必须的。这是设计本发明的特征性HPV基因型DNA芯片的重要基础。
表2
PCR引物
  基因     SEQ.ID.No.   名称   碱基序列(5’-3’)   长度
  HPV L1     1   MY11(正向)   GCMCAGGGWCATAAYAATGG   20mer
    2   GP6-1(反向)   AATAAACTGTAAATCATATTCCTC   24mer
  HPV E6/E7     3   HPCF(正向)   TGTCAAAAACCGTTTGTGTTC   21mer
    4   HPCR(反向)   GAGCTGTCGCTTAATTGTCC   20mer
  β球蛋白     5   HBBF(正向)   ACACAACTTGTGTTCACTAGC   21mer
    6   HBBR(反向)   CAAACTTCATCCACGTTCACC   21mer
表3
韩国宫颈细胞标本的HPV PCR的结果(总共4,898例)
   感染DNA    PCR结果阳性(％)   测序结果阳性(％)
   HPV-E6/E7    924(65.3)   649(64.1)
   HPV-L1    704(49.8)   553(54.6)
   二者    214(15.1)   96(9.5)
   L1或E6/E7之一    1200(84.9)   917(90.5)
   合计    1414(100)   1013(100)
实施例4：序列分析和数据库建立
实施例3的PCR后，进行PCR产物的自动序列分析以分析HPV-E6/E7和HPV L1的碱基序列，并分选分析的信息建立数据库。另外，保存证实了HPV基因型的临床DNA标本，然后用于分析本发明的DNA芯片的精确度。
测序反应的过程如下：
用试剂盒(ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction kit，Perkin Elmer Biosystems，USA)进行PCR产物的测序反应后，以ABI Prism 377自动化测序仪(Perkin Elmer，USA)分析碱基序列。
过程如下：
(1)采用从实施例4中每个标本得到的PCR产物作为测序反应的模板，适当调整PCR产物的浓度。例如，如果长度为100-200bp，则需要1-3ng/μl，如果长度为200-500bp，则需要3-10ng/μl。
(2)向薄壁微离心管中加入每种PCR和引物3.2pmole产物、8μl的terminator ready反应混合物和无菌蒸馏水(最高可达20μl)，轻柔而彻底混合。
(3)用GeneAmp 2700(PE Biosystems，USA)对步骤(2)得到的混合物以96℃，10秒、50℃，5秒和60℃，6分钟循环测序25个循环。
(4)反应产物用乙醇沉淀，并离心除去terminator ready反应混合物中的游离引物和荧光标记的ddNTPs，并干燥。
(5)步骤(4)得到的DNA与甲酰胺：25mM EDTA(pH 8.0)：蓝色右旋糖苷(bluedextran)混合物以及10μl上样缓冲液混合。产生的混合物在沸水中变性5分钟后，标本保存在冰箱里。
(6)变性的DNA标本加样到用5.5％Long Ranger凝胶(BMA，CatNo.50611，USA)平板的每一孔上，电泳2-4小时，并以测序仪测序。
根据分析结果，在总数68例的全部68例中发现了HPV。发现的类型均为所谓高危型。其中分别为，HPV-16型33例，58型12例，31型11例，18型和35型4例；33型3例，这7种类型占了99％。PCR测序不能发现复合感染。
得自4,898例取样自去妇产科诊所进行宫颈癌早期医学检查的韩国女性的宫颈拭子标本中，分析在PCR后出现阳性反应的1,414例宫颈拭子标本的HPV类型和碱基序列结果标本，总结于表4，她们的具体例子展示于图7-27。
最终，在从韩国普通成年女性中采集的4,898例宫颈细胞标本中，其中1,013例发现有HPV感染，发生率为20.6％。发现的HPV类型包括35种，其中15种是高危型，11种是低危型，4种是中危型，5种未知。发现的高危型有838例(82.7％)，发生率为整体的17.1％。结果倾向于高危型HPV。原因是为什么所有接受宫颈癌早期医学检查的HPV检验的女性，而这些女性中大多数为具有宫颈病变的高危型。我们相信这种情况与该研究的主要目的是准确识别高危型HPV对应得很好。关于发现的HPV类型，出现频率顺序是HPV-16，HPV-58，HPV-31，HPV-52，HPV-33，HPV-53，HPV-35和HPV-18。HPV-16最常见。该出现顺序与美国和欧洲很有差异。在美国和欧洲，出现频率依次是HPV-16，HPV-18，HPV-45，HPV-52，HPV-31，HPV-33和HPV-58(Murinoz N et al.，NEngl JMed，2003，348：518-27)。
还有一个独特之处在于，在研究中发现的HPV E6/E7碱基序列中，有众多与美国和欧洲数据库的野生型碱基序列不同的突变碱基序列，并且在此之前在韩国没有报告。我们相信这些HPV类型在宫颈癌发病中发挥着重要作用。
另外，如实施例3所述，应当了解当在PCR后用测序分析宫颈细胞拭子标本时，只用HPV L1分析，发现HPV感染的可能性为50％或更低，但是提请注意，可能通过联合分析HPV L1和HPV E6/E7进一步发现HPV感染。还有，韩国女性独特的碱基序列也应考虑。这些关于韩国女性HPV基因型的详细的预试验结果将成为以下重要基础：(1)联合分析HPV的L1和E6/E7，(2)考虑到韩国女性碱基序列的本发明的DNA芯片的本土观念。
表4
  总标本数     4898
  发现HPV的标本(％)     1414(28.9％)
  HPV类型和发现HPV的标本(％)     1013(20.7％)
  危险性     HPV类型     例数     ％
  高危     16     351     35
    18     27     3
    31     83     8
    33     52     5
    34     1     0
    35     35     3
    39     8     1
    52     52     6
    53     40     4
    56     5     0
    58     131     13
    66     22     2
    67     8     1
    68     10     1
    70     6     1
  低危     6     25     2
    11     15     1
    54     2     0
    61     28     3
  62   13   1
  63   1   0
  64   1   0
  72   3   0
  74   1   0
  83/MM7   6   1
  LVX160   19   2
  中危   82/MM4   2   0
  84/MM8   14   1
  CP4173   6   1
  Cp8304   19   2
  未知   71   8   1
  87   1   0
  CP8061   6   1
  IS887   4   0
  JC9710   1   0
  总数   1013   100
图26和27，电泳峰图谱中的峰是重叠的。这种现象是当分析数个不同模板DNA时出现的，即当混合各种HPV类型时出现。这种情况下，只有其一部分能通过blast比对程序(blast search)确定。这意味着PCR产物被克隆，许多克隆应当以测序进行分析。这种情况下，能分析复合的HPV感染的DNA芯片是非常有用的。事实上，对于上述的情况，本发明的DNA芯片能够发现HPV-18和HPV-70的复合感染(见图51)以及HPV-16和HPV-52复合感染(见图52)的存在。
实施例5：用于HPV分析的克隆的建立
在实施例4的PCR后，通过测序方法确定了HPV类型的PCR产物，采用质粒载体和大肠杆菌(E.coli)进行克隆。此后，当建立本发明的DNA芯片的反应条件时，这些克隆被用作标准和对照标本。克隆方法如下：
1)在用凝胶回收试剂盒(Zymo Research，USA)获得琼脂糖凝胶中的通过PCR扩增E6/E7基因和L1基因得到的PCR产物后，，以分光计或在琼脂糖凝胶上进行测定浓度。2)融化保存在-20℃下的pGEMTM-T Easy载体(Promega，A1360，USA)和2x快速连接缓冲液，用手指轻微摇动试管混合，低速离心，按照表5所述的比例与待克隆的插入DNA混合，放入0.5ml试管，从而准备连接反应。
表5
  标准反应   阳性对照   背景对照
  2x快速连接缓冲液，T4 DNA连接酶   5μl   5μl   5μl
  pGEMTM-T Easy载体(50ng)   1μl   1μl   1μl
  PCR产物   Xμl*   -   -
  对照插入DNA   -   2μl   2μl
  T4 DNA连接酶(3Wess单位/μl)   1μl   1μl   1μl
  终体积   10μl   10μl   10μl
 *PCR产物和质粒载体控制在3∶1的比率。即。3.0kb的载体50ng(长度3.0kb)分别与12.4ng的PCR产物(长度0.25kb)和22.5ng的PCR产物(长度0.45kb)混合。
3)用移液管完全混合每种反应液后，在室温下进行连接反应约一小时。如果需要许多产物，则连接反应在4℃下进行过夜。
4)所述的连接标本用保存在-70℃的50μl JM109感受态细胞(≥1×108cfu/μg DNA)转化。
5)首先，在1.5ml的试管中加入2μl连接产物和50μl在用前于冰浴中即刻融化的感受态细胞。混合物被彻底混合，反应在冰中进行20分钟。
6)在42℃的孵育水浴中热刺激40-50秒后，试管立即静置在冰浴中2分钟
7)向试管中加入调整到室温的SOC培养基950μl后，试管在摇床中于37℃孵育大约一个半小时。
8)大约100μl培养物施加到LB/氨比西林/IPTG/X-Gal平板上。将平板倒转并在摇床中于37℃孵育16-24小时后，进行克隆计数。然后，只选择白色克隆培养在3ml LB/氨比西林液体培养基中。小规模抽提质粒DNA。插入的DNA在载体上的正确插入被PCR或限制性酶所确定。这种方法得到的所有克隆用自动化测序仪分析，进行更精确的分析。
实施例6：DNA芯片的探针设计
本实施例说明了要放置在DNA芯片上的寡核苷酸的设计方法。这是本发明的核心。
在通过按照实施例4和5的描述，从韩国女性的良性和恶性宫颈标本中分离DNA和通过PCR进行确认后获得的包含1,013份临床标本的关于HPV的E6/E7和L1的碱基序列信息的大型数据库后，以及美国的HPV相关数据库后，根据每个人种中HPV基因型和其发生率，还要分析各种基因中存在的内在变异。通过这种方法，选出了40种侵犯宫颈的HPV生殖器类型，分析HPV类型的基因型的寡核苷酸探针和碱基序列总结于表5。
根据本发明的目的，设计探针以制作寡核苷酸探针作为基因型特异性探针，其能与L1基因和E6/E7基因的DNA特异结合。
首先，归总所有数据库，即(1)美国国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information，NCIB)的HPV数据库，(2)美国LOS ALAMOS的HPV数据库，和(3)于实施例4的韩国女性宫颈中发现的35种HPV的数据库，建立从总共76种HPV得到的基因组DNA的碱基序列，包括HPV-1a，-2a，-3，-4，-5，-6b，-7，-8，-9，-10，-11，-12，-13，-15，-16，-16r，-17，-18，-19，-20，-21，-22，-23，-24，-25，-26，-27，-28，-29，-30，-31，-32，-33，-34，-35，-35h，-36，-37，-38，-39，-40，-41，-42，-44，-45，-47，-48，-49，-50，-51，-52，-53，-54，-55，-56，-57，-58，-59，-60，-61，-63，-65，-66，-67，-68，-70，-72，-73，-75，-76，-77，-80，MM4，MM7，MM8，和CP8304。在获得的DNA序列上(两两比对和多重序列比对)以ClustalW方法执行计算机程序DNASTAR(MegAlignTM5，DNASTAR Inc.)后，绘制了系统发生树。筛选每组的基因型特异性碱基序列后，用计算机程序primer premier 5(PREMIER Biosoft International Co.)设计基因型特异的探针。这种情况下，设定探针长度为20Ap和18Ap bb的寡核苷酸，首先设计了110种基因型特异的探针。诊断HPV基因型的DNA芯片和诊断试剂盒的特征在于，DNA探针的分析靶是包括8种高危HPVE6/E7基因、20种高危HPV L1基因、17种低危HPV L1基因和3种中危HPV L1基因的总共40种L1基因，其中高危HPV类型包括HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-52，HPV-58，HPV-67，HPV-26，HPV-30，HPV-34，HPV-39，HPV-45，HPV-51，HPV-53，HPV-56，HPV-57，HPV-66，HPV-68，和HPV-70；低危HPV类型包括HPV-6，HPV-7，HPV-10，HPV-11，HPV-27，HPV-32，HPV-40，HPV-42，HPV-44，HPV-54，HPV-55，HPV-59，HPV-61，HPV-62，HPV-72，HPV-73和HPV-83；中危HPV类型包括HPV-MM4/82，HPV-MM8/84和HPV-CP8304/81。
针对所得的总共76种不同类型的HPV，通过计算机程序Amplify1.2(University of Wisconsin)分析上述程序设计的总计110种探针的结合力。在本实施例中，设计在韩国常见的、并且与宫颈癌密切相关的HPV-16、HPV-58、HPV-31和HPV-33的探针。接下来，根据其与HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-56、HPV-59、HPV-61、HPV-68、HPV-70、HPV-73、HPV-74、HPV-6、HPV-7、HPV-11、HPV-32、HPV-34、HPV-40、HPV-42、HPV-44、HPV-55和HPV-66基因型特异结合的能力，选择探针。名称、序列标识号(SEQ ID Nos)和类型汇总于表6和7。
表6
寡核苷酸探针的碱基序列
  SEQ.ID.No   名称   序列(5’-3’)   长度
  7   16W   TTGTTGCAGATCATCAAGAA   20mer
  8   18W   CACGACAGGAACGACTCC   18mer
  9   31W   CAAGTGTAAACATGCGTGG   19mer
  10   33W   CTGTGACGTGTAAAAACGCC   20mer
  11   35W   GTCCTGTTGGAAACCAAC   18mer
  12   52W   GACCCCGACCTGTGACC   17mer
  13   58W   CCGACGTAGACAAACAC   17mer
  14   67W   GAAGCCATGCGTGGAG   16mer
  15   16L1   TGCCATATCTACTTCAGAAACT   22mer
  16   18L1   TGTTTGCTGGCATAATCAATTA   22mer
  17   31L1   GTCTGTTTGTGCTGCAATT   19mer
  18   33L1   CAGTACTAATATGACTTTATGCACA   25mer
  19   35L1   TCTGCTGTGTCTTCTAGTGACAGTA   25mer
  20   52L1   TGACTTTATGTGCTGAGGTTAAA   23mer
  21   58L1   GCACTGAAGTAACTAAGGAAGGTAC   25mer
  22   67L1   AAAATCAGAGGCTACATACAAAA   23mer
  23   26L1   CCTTACCATTAGTACATTATCTGCA   25mer
  24   30L1   AACCACACAAACGTTATCCA   20mer
  25   34L1   CCACAAGTACAACTGCACC   19mer
  26   39L1   ACCTCTATAGAGTCTTCCATACCTTCTAC   29mer
  27   45L1   CACAAAATCCTGTGCCAAG   19mer
  28   51L1   GGTTTCCCCAACATTTACTC   20mer
  29   53L1   GCAACCACACAGTCTATGTCTACA   24mer
  30   56L1   GACTATTAGTACTGCTACAGAACAGTTAAGTAAA   34mer
表7
寡核苷酸探针的碱基序列
  SEQ.ID.No   名称   序列(5’-3’)   长度
  31   57L1   CCACTGTAACCACAGAAACTAATT   24mer
  32   66L1   AATGCAGCTAAAGCACATTAACTAA   26mer
  33   68L1   CTACTACTACTGAATCAGCTGTACCAAATAT   31mer
  34   70L1   CCGAAACGGCCATACCT   17mer
  35   MM4L1/82   CATTTGCTGGAATAATCAGC   20mer
  36   MM8L1/81   TATATGCTGGTTTAATCAATTGTT   24mer
  37   CP8304L1/81   GCTACATCTGCTGCTGCAGA   20mer
  38   6L1   TTTGTTGGGGTAATCAACTG   20mer
  39   7L1   ACACCAACACCATATGACAATA   22mer
  40   10L1   GCAGTACCAATATGTGCTGTG   21mer
  41   11L1   ATTTGCTGGGGAAACCAC   18mer
  42   27L1   CAGCTGAGGTGTCTGATAATACTAAT   26mer
  43   32L1   GACACATACAAGTCTACTAACTTTA   25mer
  44   40L1   AGTCCCCCACACCAAC   16mer
  45   42L1   CACTGCAACATCTGGTGA   18mer
  46   44L1   TACACAGTCCCCTCCGTC   18mer
  47   54L1   TACAGCATCCACGCAGG   17mer
  48   55L1   CTACAACTCAGTCTCCATCTACAA   24mer
  49   59L1   TCTATTCCTAATGTATACACACCTACCAG   29mer
  50   61L1   TGCTACATCCCCCCCTGTAT   20mer
  51   62L1   ACTATTTGTACCGCCTCCAC   20mer
  52   72L1   CACAGCGTCCTCTGTATCAGA   21mer
  53   73L1   AGGTACACAGGCTAGTAGCTCTACTAC   27mer
  54   MM7L1/83   TGCTGCTACACAGGCTAATGA   21mer
  55   HBB   GAGGAGAAGTCTGCCG   16mer
实施例7：DNA芯片的生产
根据实施例6中设计的探针设计网格后，与适当的缓冲液混合的探针被点样到显微镜玻片上。然后，用适当的处理稳定玻片，进行质量控制，并保存至检查时。
产生DNA芯片的方法如下：
制备放置在DNA芯片上的有序网格(order grid)
在本发明中，为了便捷地测定分析的基因型是否为高危型、中危型或低危型，制备分组网格。网格的顺序示于图28。根据图28，8类HPV高危型E6/E7探针和20类HPV高危型L1探针点样到左边，HPV中危型L1探针点样到中央，17类HPV低危型L1探针点样到右边。还有，角标(corner marker)和对人β球蛋白基因特异的、用于确定DNA分离和PCR扩增的适合性的寡核苷酸探针点样在左边顶端(2个探针)、中央的顶部和底部(2个探针)以及右边顶端(1个探针)。
除了人β球蛋白基因，肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因等也能用作标准的标记探针。
各种寡核苷酸探针用点样仪(arrayer)点样。这种情况下，同样的探针双份点样，以便各基因型的HPV能最少出现两次，最多出现四次。在本发明中，加入8种HPV E6/E7基因的寡核苷酸探针的原因如下。首先，8种HPV类型在世界上包括韩国的出现频率最高。其次，8种HPV类型代表着高危类型并且与宫颈癌的发病密切相关。第三，在施用疫苗对抗高危型HPV的情况下，准确识别E6/E7的基因型很重要。第四，因为在这些类型存在的情况下，由于PCR方法期间的基因内变异，L1基因不能通过PCR扩增，所以通过扩增E6/E7基因解决该问题并校正结果是必需的。这些观点成为本发明DNA芯片的重要基础，并对改进本发明DNA芯片的HPV基因型的分析准确度发挥着重要作用。
本发明DNA芯片的重要特征之一是，图28示例的网格在一个DNA芯片的6-8个分开的区室上重复存在(见图29)。因此，DNA芯片能在单独一个芯片上分析6-8个不同的标本，对于节省时间、人力和成本非常有用。
2.制备用于点样合成的寡核苷酸探针的溶液并分配到主板中
根据实施例合成的C6部分连接有胺的寡核苷酸，以HPLC提纯，溶解在三蒸水中，调节终浓度为200pmole/μl。这样制备的寡核苷酸探针与点样溶液micro spotting solution Plus(Telechem，TC-MSP，USA)混合，调整浓度为38pmole/μl。就是说，7.7μl的200pmole/μl寡核苷酸探针与32.4μl点样溶液混合，形成终体积40μl。产生的混合物依次分配到96孔主板中。
3.用点样仪在玻片上点样寡核苷酸探针
含有寡核苷酸探针的点样溶液，用点样仪从96孔主板上双份(双击，double hit)点样(排列)到特别涂层的玻片上。一次点样含有平均约0.005μl的探针溶液。优选玻片是DNA芯片的基本材料，如涂有特级醛的BMT醛玻片(Biometrix technology，Korea)。优选的点样仪如GMS 417点样仪(Pin-Ring Type，Affymetrix，USA)、MGII(BioroboticsInc，MA01801，USA)、或相当的仪器。
4.诱发点样的寡核苷酸探针与玻片的醛基的希夫(Schiff)碱反应以及后处理
如上所述将探针点样到玻片上产生的DNA芯片被放在湿度保持在80％的广口玻璃瓶中，在室温下反应15分钟。反应完成后，固定好的玻片放进烘干炉中，在120℃烘烤1小时30分，用十二烷基硫酸钠(SDS)溶液清洗2次，每次2分钟，在95℃下浸入三蒸水3分钟，变性固定的寡核苷酸探针，再次用三蒸水清洗1分钟。清洗后，玻片用封闭液(1g NaBH4，300ml磷酸盐缓冲液(PBS)，100ml乙醇)还原15分钟，在0.2％十二烷基硫酸钠溶液中清洗2次，每次2分钟，在三蒸水中清洗2次，每次2分钟，800rpm离心1分30秒除去水分，放入玻片盒，保存于干燥器中。
产生的本发明DNA芯片通过下面实施例8的方法进行质控。
实施例8在DNA芯片上的杂交反应和分析条件的建立
HPV E6/E7和HPV L1基因以及β球蛋白基因通过多重PCR扩增，所述PCR采用实施例5确定的HPV类型的一个、两个或三个克隆的不同组合和浓度而产生的100个人工标准样品。通过在DNA芯片上放置PCR产物建立适当的条件，进行三次以上的杂交反应，然后用荧光扫描器分析。过程如下：
1.PCR
HPV的E6/E7和L1基因以及人β球蛋白基因的PCR用实施例3所述的方法进行，条件是对于引物组合物中的反向引物，即GP6-1、HPCR和HBBR，要用Cy-5荧光标记的寡核苷酸。
Cy-3、生物素结合的材料、5-2’-(氨乙基)氨基-1-萘硫酸盐(EDANS)、四甲基罗丹明(TMR)、四甲基罗丹明异氰酸盐(TMRITC)、x-罗丹明和TEXAS RED能用作标记物。
2.杂交反应
在各种寡核苷酸探针固定于其上的玻片基材上，通过放置PCR扩增的HPV PCR产物进行杂交反应。100μl充满的8孔区室(Schleicher &Schuell BioScience，German)用作杂交反应区室。
混合E6/E7基因、HBB基因和L1基因的扩增产物各10μl，混合物中加入三蒸水，产生50μl终体积。95℃下变性5分钟后，混合物立刻放置在冰中3分钟。然后，加入50μl杂交反应液(混合2ml 20 X SSC、1.7ml 90％甘油和6.3ml 50mM PBS，调节终体积至10ml)，产生100μl终体积后，将其与玻片上固定的探针在45℃下反应30分钟。
3.清洗
杂交反应后，将孔的覆盖物从DNA芯片上除去，用3X SSPE溶液在环境温度下清洗玻片2分钟，再用1X SSPE溶液在环境温度下清洗玻片2分钟，然后在环境温度下800rpm离心玻片1分30秒，并使其干燥。
4.扫描
杂交后，通过清洗和离心除去非特异信号的干燥玻片用共焦激光荧光扫描器扫描，分析荧光信号和图像。用于扫描的扫描器包括Affymetrix 428 Array Scanner(Affymetrix，USA)或ScanArray Lite(Packard Bioscience，USA)，或与其相当的仪器。
实施例9：在DNA芯片上分析临床标本
对存在或不存在HPV的临床标本的DNA上进行多重PCR扩增，如果存在HPV的话，PCR后通过测序发现其基因型。然后，将PCR产物放置在实施例6和7生成的DNA芯片上后，通过实施例8的方法进行杂交反应。清洗后，进行荧光扫描分析。DNA芯片的灵敏度、特异性和重现性通过该方法分析。并且，再次确立诊断HPV基因型的本发明DNA芯片的最适条件。结果显示于图30至图53。
图30-32是采用了分别以Caski、HeLa和K-562合成的30对HPV类型探针的DNA微阵列杂交反应结果的照片。在这些图中，圆圈代表着位置，取决于探针种类。如这三个图所示，没有发生不同探针之间的交叉杂交，并且杂交反应分别在HPV-16和HPV-18中特异发生。
图33至52是采用了在本发明的DNA芯片上分别点样的48对寡核苷酸探针的DNA微阵列杂交反应结果的照片。在这些图中，圆圈代表着位置，取决于探针种类。这些图分别表示，由质粒DNA扩增产物导致的杂交反应的结果说明了没有交叉杂交，并且类型特异性的表达仅发生在固有探针(inherent probes)中。
也就是说，本发明产生的DNA芯片中的48对各HPV类型的探针与某种类型的HPV DNA特异结合，并且没有交叉杂交。另外，准确诊断了与至少一种类型HPV混合的复合感染标本。即，对于诊断单一或复合感染的HPV基因型，本发明的DNA芯片表现出100％的灵敏度和100％的特异性。此外，就不同检查人员间隔一段时间进行的3次或更多次重复检验的同样结果而言，DNA芯片的重现性为100％。就这些结果而言，可以相信，本发明合成的48对探针能准确分析DNA微阵列杂交反应的实施例所没有考虑到的HPV类型的众多组合。
具体地，图51是荧光扫描分析仪摄下的照片，显示了以根据本发明的实施方案、用于诊断HPV基因型的DNA芯片，分析扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过使用在宫颈筛查中显示HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中提取的DNA，以三重PCR扩增L1基因、E6/E7基因和HBB基因而得。如图51所示，发现了HPV-18和HPV-70的复合感染。在这种情况下，第一个直接测序分析只发现了HPV-70，HPV-18是在克隆后的第二次测序分析中另外发现的。但是，本发明分析HPV基因型的DNA芯片能仅用一次分析就轻易而迅速地分析HPV-18和HPV-70的复合感染。
还有，图52是宫颈原位癌的存在被后续活组织检查所证实的情况，它是荧光扫描仪摄下的照片，显示了以根据本发明的实施方案、用于诊断HPV基因型的DNA芯片分析扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因的结果。扩增的L1基因、E6/E7基因和HBB基因，通过使用在宫颈筛查中显示HSIL的韩国女性的宫颈拭子标本中提取的DNA，以三重PCR扩增L1基因、E6/E7基因和HBB基因而得。如图52所示，发现了HPV-16和HPV-52的复合感染。在这种情况下，第一个直接测序分析不能识别，HPV-18和HPV-52是在克隆后的第二次测序分析中一起发现的。但是，本发明分析HPV基因型的DNA芯片能仅用一次分析就轻易而迅速地分析HPV-18和HPV-70的复合感染。
也就是说，可以认为本发明生产的DNA芯片能在临床检验中准确区别宫颈拭子标本中的各种HPV类型。各种HPV类型的探针与某种类型的HPV DNA特异结合，并且没有交叉杂交。另外，能准确诊断与至少一种类型HPV混合的复合感染标本，该复合感染标本难以通过直接测序诊断，但能够通过克隆后的许多测序分析而准确诊断。亦即，对于诊断单一或复合感染的HPV基因型，本发明的DNA芯片表现出100％的灵敏度和100％的特异性。此外，就不同检查人员间隔一段时间进行的3次或更多次重复检验的同样结果而言，DNA芯片的重现性为100％。
实施例10：在DNA芯片上分析临床标本后，临床数据的相关性分析
将实施例9中PCR后用DNA芯片分析得到的结果，与宫颈筛查等得到的临床数据相比较，分析相关性以及DNA芯片是否适用于预测宫颈癌和癌前病变。证实了DNA芯片适用于分析HPV基因型和筛查宫颈癌。过程如下：
首先，通过本发明的DNA芯片和测序方法分析石蜡包埋的68份宫颈癌组织和49份正常宫颈组织标本的HPV类型。结果表明在全部68份宫颈癌组织中发现了高危型HPV。相反，在正常宫颈组织中，没有任何高危型HPV，只有低发生率(5例；10.2％)的低危型HPV。该结果证明了，DNA芯片能预测宫颈癌的状况，尤其适用于选择性分析宫颈癌和宫颈原位癌。另外，与韩国基因学癌症基因会(KoreanGenecologic Cancer Foundation，KGCF)合作，在20名去国内产科的女性中得到的宫颈拭子标本上，用本发明的DNA芯片和测序方法进行分析试验(前瞻性盲法研究)，同时还进行宫颈阴道镜、宫颈扫描、宫颈涂片筛查和宫颈活组织检查，并分析研究结果。志愿者宫颈筛查和活组织检查所得的结果，与HPV DNA芯片分析和测序法所得的结果的相关性示于表8。
结果表明，在宫颈癌以及包括HSIL和LSIL二者的癌前病变中，均发现了单一或复合感染形式的高危型HPV。相反，正常宫颈组织中没有任何高危型HPV。该结果还证实，DNA芯片能预测宫颈癌的状况，特别适用于选择性分析宫颈癌和癌前病变，包括HSIL和ISIL。另外，再次证实了DNA芯片分析能识别不能通过测序法识别的复合HPV感染。
尽管本发明参考其示例性实施方案已经具体地展示和说明时，本领域技术人员应当体会，其中可以做出形式和细节的各种改变，而不背离由后面的权力要求限定的本发明的内涵和外延。
表8
前驱性(antegrade)盲法检验的结果与DNA芯片诊断结果的比较
  标本   病理结果   DNA芯片结果   测序结果
  1   原位癌   HPV-16   HPV-16
  2   鳞状上皮内高度病变(HSIL)   HPV-31   HPV-31
  3   HSIL   HPV-58   HPV-58
  4   HSIL   HPV-34   HPV-34
  5   原位癌   HPV-68   HPV-68
  6   HSIL   HPV-56   HPV-56
  7   鳞状上皮内低度病变(LSIL)   HPV-35   HPV-35
  8   HSIL   HPV-18&70   HPV-18
  9   鳞状上皮癌   HPV-16&52   未知
  10   HSIL   HPV-18   HPV-18
  11   正常   阴性   阴性
  12   正常   阴性   阴性
  13   正常   阴性   阴性
  14   正常   阴性   阴性
  15   正常   阴性   阴性
  16   正常   阴性   阴性
  17   正常   阴性   阴性
  18   正常   阴性   阴性
  19   正常   阴性   阴性
  20   正常   阴性   阴性
[工业实用性]
寡核苷酸探针、包含探针的DNA芯片和包含DNA芯片的诊断试剂盒，以及用它分析HPV基因型的方法，能准确诊断宫颈中发现的作为各种病症如宫颈癌、生殖器疣等主要病因的40类HPV，并预测其风险。由于根据本发明的诊断通过分析HPV的L1基因以及HPV的E6/E7基因进行，解决了只分析HPV的L1基因导致的问题，诊断的准确度明显提高。而且，本发明的DNA芯片和诊断方法能分析各种类型HPV的复合感染，具有接近100％的诊断灵敏度、诊断特异性和重现性。最后，检查过程和结果分析很简单，检查成本不昂贵。
尤其是，我们相信HPV基因型诊断DNA芯片和使用该芯片的诊断试剂盒能在标本如宫颈细胞、尿液等中，迅速、准确和大量地自动分析是否存在HPV感染及其基因型。此外，DNA芯片能单独使用，或与巴氏宫颈筛查合用，筛查宫颈癌和癌前病变，取代现有的HPV检查，并节约检查时间、人力和成本。而且，DNA芯片通过准确分析HPV感染的E6/E7基因型，适合应用于适合的类型的疫苗。因此，本发明由于降低了宫颈癌的发生率和死亡率，对提高国民的健康和福利有重大贡献，具有非常有用的工业实用性。
当本发明参考其示例性实施方案特别展示和说明时，本领域技术人员应当体会，其中可以做出形式和细节的各种改变，而不背离由后面的权力要求限定的本发明的精神和范围。
[序列表]
SEQ ID Nos.1-6由用于扩增HPV或β球蛋白的核酸的引物碱基序列组成，SEQ ID NO.7-55由HPV或β球蛋白的探针碱基序列组成。序列表随附本发明。

Claims (22)

1.一种探针，选自具有碱基序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.54的寡核苷酸和具有与所述寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸，并且与人乳头瘤病毒(HPV)的核酸互补结合。
2.一种扩增HPV L1 DNA的引物，包含碱基序列SEQ ID NO.2。
3.一种扩增HPV L1 DNA的引物，其是具有碱基序列SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的引物组。
4.一种用于对HPV进行探查和基因型分析的DNA芯片，包括至少一种探针，该探针选自具有碱基序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.54的寡核苷酸和具有与所述寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸。
5.一种用于对HPV进行探查和基因型分析的DNA芯片，包括具有碱基序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.14的寡核苷酸。
6.一种用于对HPV进行探查和基因型分析的DNA芯片，包括具有碱基序列SEQ ID NO.15至SEQ ID NO.54的寡核苷酸。
7.一种用于对HPV进行探查和基因型分析的DNA芯片，包括具有碱基序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.54的寡核苷酸。
8.根据权利要求4所述的DNA芯片，其中DNA芯片包括选自β球蛋白、肌动蛋白和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的标准标记探针。
9.根据权利要求8所述的DNA芯片，其中β球蛋白探针具有碱基序列SEQ ID NO.55。
10.根据权利要求4所述的DNA芯片，其中探针DNA的5’端胺基通过与DNA芯片固体表面上的醛基进行希夫碱反应而被固定。
11.一种用于对HPV进行探查和基因型分析的试剂盒，包括根据权利要求4-10任一项所述的用于对HPV进行探查和基因型分析的DNA芯片、用于通过PCR法扩增HPV DNA样品的引物组、以及用于探查与DNA芯片杂交的扩增的DNA的标记物。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其中标记物选自Cy-5、Cy-3、生物素结合材料、5-2’-氨乙基氨基-1-萘硫酸(EDANS)、四甲基罗丹明(TMR)、四甲基罗丹明异氰酸(TMRITC)、x-罗丹明和TEXAS RED。
13.根据权利要求11所述的试剂盒，其中引物组包括含有碱基序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的用于扩增HPV L1 DNA的引物组。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中引物组还包括含有碱基序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的用于扩增HPV E6/E7 DNA的引物组，以及含有碱基序列SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的用于扩增β球蛋白DNA的引物组。
15.一种探查HPV或分析HPV基因型的方法，包括：(a)用扩增HPV的DNA的引物，多重PCR扩增DNA样品；(b)将扩增的DNA与包括至少一种探针的DNA芯片杂交，所述探针选自具有碱基序列SEQ ID NO.7至SEQ ID NO.54的寡核苷酸和具有与所述寡核苷酸互补的碱基序列的寡核苷酸；和(c)检测与探针杂交的反应物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中多重PCR扩增使用具有碱基序列SEQ ID NO.2的用于扩增HPV L1 DNA的引物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中多重PCR扩增使用具有碱基序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、以及SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6的用于扩增HPV L1 DNA的引物组。
18.根据权利要求15所述的方法，其中当基因以Cy-5标记时，检测通过以共焦激光分析荧光信号进行。
19.根据权利要求18所述的方法，其中Cy-5荧光材料包括在反向引物中。
20.根据权利要求18所述的方法，还包括在杂交反应后用SSPE溶液清洗的步骤。
21.一种探查HPV或分析HPV基因型的多重PCR扩增方法，其中选自HPV L1基因和HBB基因的双重PCR扩增，HPV E6/E7基因和HBB基因的双重PCR扩增，以及HPV L1基因、HPV E6/E7基因和HBB基因的三重PCR扩增中的任何一种多重PCR扩增，用包括下述步骤的方法进行：(a)以5∶7.5∶1∶1的体积比，混合10□缓冲液、MgCl2(10mM)、dNTP(10mM)和Taq聚合酶；
(b)混合物中加入引物和模板DNA；
(c)用无菌蒸馏水稀释混合物，制备反应液；和
(d)反应液在95℃变性5分钟后，在95℃，1分钟、47℃，1分钟、和72℃，1分钟重复10次，并在72℃下反应5分钟。
22.根据权利要求4-10任一项所述的DNA芯片，其中DNA芯片具有6-8个区室，每个区室能结合一种样品。
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