JP2002524091A - 架橋可能な固定化核酸を用いるアッセイ - Google Patents
架橋可能な固定化核酸を用いるアッセイInfo
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Abstract
(57)【要約】
細胞および細胞レベル下の系および組織片のその場で行うハイブリッド形成アッセイ、および固定化ベースの検定技術、例えばノーザン・ブロッティング、サザーン・ブロッティング、ドット・ブロットなど、およびプローブを基質に結合させるアッセイ技術に関する改良方法が開示されている。本発明は、プローブと標的核酸との間に共有結合を形成し得るクロスリンカー含有ハイブリッド形成プローブを使用する。活性化後、クロスリンカーは、プローブがその本質的に相補的な標的とハイブリダイズした場合、相補鎖と共有結合を形成することにより、標的とプローブを共有結合架橋させる。それに続いて、ストリンジェント洗浄条件を用いることができ、かくしてプローブまたは標的の非特異的吸着により、架橋したプローブ／標的ハイブリッドを全て保持したままでバックグラウンドシグナルを減弱化させ得る。臨床および診断研究室で用いられる診断用キットも開示されている。
Description
【０００１】 （発明の背景） ａ）発明の分野 この発明は、概してプローブまたは標的分子が固体支持体に結合されているア
ッセイにおいて架橋部分を有するオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブの
アレイを用いる核酸配列の検出方法に関するものである。表面結合ＤＮＡまたは
ＲＮＡは、固定化された細胞または細胞レベル下の系、またはＤＮＡまたはＲＮ
Ａ製品の固定化アレイであり得る。
ッセイにおいて架橋部分を有するオリゴヌクレオチドプローブまたはプローブの
アレイを用いる核酸配列の検出方法に関するものである。表面結合ＤＮＡまたは
ＲＮＡは、固定化された細胞または細胞レベル下の系、またはＤＮＡまたはＲＮ
Ａ製品の固定化アレイであり得る。
【０００２】 ｂ）関連技術の記載 生物科学における多様な有用技術には、ある種の固体支持体における生物学的
材料の固定化が含まれる。固定化核酸ハイブリッド形成アッセイは、これらの方
法の重要な部類を構成する。検定されている試料が固定化される核酸に基いたア
ッセイの例には、その場で行う(in situ)ハイブリッド形成およびブロッティン
グアッセイがある。試料を固定化プローブと接触させるアッセイの例には、遺伝
子チップ技術がある。
材料の固定化が含まれる。固定化核酸ハイブリッド形成アッセイは、これらの方
法の重要な部類を構成する。検定されている試料が固定化される核酸に基いたア
ッセイの例には、その場で行う(in situ)ハイブリッド形成およびブロッティン
グアッセイがある。試料を固定化プローブと接触させるアッセイの例には、遺伝
子チップ技術がある。
【０００３】 その場で行うハイブリッド形成技術は、細胞または細胞レベル下の系内におけ
る特異的核酸配列の存在を同定するための貴重な方法である。興味の対象である
核酸が何らかの方法で保持され、試料の残りが分解されることにより定量測定が
行われるインビトロ技術とは異なり、その場で行う 技術は、実質的に無傷の細
胞または細胞レベル下構造間における特異的配列の存在に関する検定を可能にす
る。
る特異的核酸配列の存在を同定するための貴重な方法である。興味の対象である
核酸が何らかの方法で保持され、試料の残りが分解されることにより定量測定が
行われるインビトロ技術とは異なり、その場で行う 技術は、実質的に無傷の細
胞または細胞レベル下構造間における特異的配列の存在に関する検定を可能にす
る。
【０００４】 ブロッティングアッセイでは、膜（または濾紙）に結合されたＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、多くの場合ゲルを通して移動させた後、特異的核酸配列の存在について
プローブされる。ＤＮＡアッセイのための固定化技術は、最初、Southern、 J.
Mol. Biol.、１９７５、９８、５０３により提示された。その時以来、多くの誘
導方法が開発されている。これらの誘導方法には、ＲＮＡが固定化され、ハイブ
リッド形成により検定されるノーザン・ブロット技術、および核酸分子含有溶液
が膜またはフィルターに直接固定され、ハイブリッド形成により検定されるドッ
ト・ブロット技術がある。
ＮＡは、多くの場合ゲルを通して移動させた後、特異的核酸配列の存在について
プローブされる。ＤＮＡアッセイのための固定化技術は、最初、Southern、 J.
Mol. Biol.、１９７５、９８、５０３により提示された。その時以来、多くの誘
導方法が開発されている。これらの誘導方法には、ＲＮＡが固定化され、ハイブ
リッド形成により検定されるノーザン・ブロット技術、および核酸分子含有溶液
が膜またはフィルターに直接固定され、ハイブリッド形成により検定されるドッ
ト・ブロット技術がある。
【０００５】 固定化核酸ベースのアッセイでは、オリゴヌクレオチドプローブを固定化試料
と接触させるか、または試料を固定化プローブと接触させ、プローブがその本質
的に相補的な配列とハイブリダイズしたという証拠を、直接または間接レポータ
ー系からのシグナル発生により測定する。
と接触させるか、または試料を固定化プローブと接触させ、プローブがその本質
的に相補的な配列とハイブリダイズしたという証拠を、直接または間接レポータ
ー系からのシグナル発生により測定する。
【０００６】 望ましいシグナル対ノイズ比を達成することが、固定化核酸ハイブリッド形成
アッセイにとって主要な挑戦である。その場で行うＰＣＲは、その場で行うアッ
セイの感度を改善するために試みられた一方法である。この技術では、細胞、細
胞レベル下または組織試料を製造し、プライマー対を導入する。次いで、試料を
、ＰＣＲが一般的に行なわれる場合と同様にして反復熱循環に付す。標的配列が
存在する場合、ＰＣＲアンプリコンのコピーは増幅されることが予測される。し
かしながら、その場で行うＰＣＲ技術に伴う重大な問題は依然として残っている
。
アッセイにとって主要な挑戦である。その場で行うＰＣＲは、その場で行うアッ
セイの感度を改善するために試みられた一方法である。この技術では、細胞、細
胞レベル下または組織試料を製造し、プライマー対を導入する。次いで、試料を
、ＰＣＲが一般的に行なわれる場合と同様にして反復熱循環に付す。標的配列が
存在する場合、ＰＣＲアンプリコンのコピーは増幅されることが予測される。し
かしながら、その場で行うＰＣＲ技術に伴う重大な問題は依然として残っている
。
【０００７】 溶液ベースＰＣＲに関して直面する問題、例えば酵素阻害、誤ったプライミン
グおよびプライマー二量体化に加えて、矛盾した検定結果の一因となるその場で
行う技術に特異的な他の問題点も存在する。すなわち、 １．細胞透過性化の程度。細孔サイズが小さすぎる場合、ポリメラーゼ酵素は
細胞に入り得ない可能性がある。細孔サイズが大きすぎる場合、アンプリコンは
自由に細胞から脱離し得る。これらの作用は、一試料内および試料間で変動し得
る。 ２．内在性阻害因子。溶液ベースＰＣＲアッセイの場合、試料製造方法の目的
は、核酸を分離し、酵素阻害因子を除去することであるが、その場で行うアッセ
イは必然的に細胞または細胞レベル下の環境内で遂行されるため、阻害因子を除
去する可能性は制限される。 ３．アンプリコンの喪失。透過性にされた膜により、アンプリコンは増幅反応
後の洗浄段階中に細胞から脱離し得る。また、それによって隣接細胞から洗浄さ
れたアンプリコンが入り得ることにより、もともと標的を含まなかった細胞にお
いてシグナルが観察されることになる。 ４．シグナル拡散。標的とハイブリダイズするプローブとは異なり、アンプリ
コンは標的配列部位に局在していない。アンプリコンは自由に試料中を動くため
、検出困難となり得るシグナル核酸を発生し、検定されている配列の位置決定が
難しくなり得る。 総合すると、上記各因子は、その場で行うＰＣＲアッセイにより得られる矛盾
した結果についての理由をある程度説明している。
グおよびプライマー二量体化に加えて、矛盾した検定結果の一因となるその場で
行う技術に特異的な他の問題点も存在する。すなわち、 １．細胞透過性化の程度。細孔サイズが小さすぎる場合、ポリメラーゼ酵素は
細胞に入り得ない可能性がある。細孔サイズが大きすぎる場合、アンプリコンは
自由に細胞から脱離し得る。これらの作用は、一試料内および試料間で変動し得
る。 ２．内在性阻害因子。溶液ベースＰＣＲアッセイの場合、試料製造方法の目的
は、核酸を分離し、酵素阻害因子を除去することであるが、その場で行うアッセ
イは必然的に細胞または細胞レベル下の環境内で遂行されるため、阻害因子を除
去する可能性は制限される。 ３．アンプリコンの喪失。透過性にされた膜により、アンプリコンは増幅反応
後の洗浄段階中に細胞から脱離し得る。また、それによって隣接細胞から洗浄さ
れたアンプリコンが入り得ることにより、もともと標的を含まなかった細胞にお
いてシグナルが観察されることになる。 ４．シグナル拡散。標的とハイブリダイズするプローブとは異なり、アンプリ
コンは標的配列部位に局在していない。アンプリコンは自由に試料中を動くため
、検出困難となり得るシグナル核酸を発生し、検定されている配列の位置決定が
難しくなり得る。 総合すると、上記各因子は、その場で行うＰＣＲアッセイにより得られる矛盾
した結果についての理由をある程度説明している。
【０００８】 固定化核酸の検出を目的とするプローブベースのハイブリッド形成アッセイの
検出感度を改善する必要性が認識されている。例えば、体積排除剤の使用（米国
特許４８８６７４１）またはプローブ濃度増強（米国特許５７０７８０１）によ
るハイブリッド形成速度改善方法が、既に開示されている。米国特許５５２１１
０６１において、Bresserらは、感度を増強する一手段として透過性エンハンサ
ーおよびシグナルエンハンサーの使用について記載している。
検出感度を改善する必要性が認識されている。例えば、体積排除剤の使用（米国
特許４８８６７４１）またはプローブ濃度増強（米国特許５７０７８０１）によ
るハイブリッド形成速度改善方法が、既に開示されている。米国特許５５２１１
０６１において、Bresserらは、感度を増強する一手段として透過性エンハンサ
ーおよびシグナルエンハンサーの使用について記載している。
【０００９】 先行の開示は、固定化核酸アッセイ方法、特にその場で行うハイブリッド形成
アッセイに関する改良に対する要望を示している。
アッセイに関する改良に対する要望を示している。
【００１０】 これらのアッセイにおける長いプローブ（２００〜５０００００ヌクレオチド
長）の使用は、長いハイブリッド形成時間を必要とし、追加的配列により与えら
れる望ましくない非特異的結合性相互作用の機会が無数にあるため、高いバック
グラウンドシグナルの大きな誘因となる。しかしながら、長いプローブは、多く
のレポーター基を含むため、より強力なシグナルを提供し得るという利点を有す
る。短いプローブ（２００未満のヌクレオチド）は、ハイブリッド形成時間を低
減化するという利点をもたらすが、プローブが短いと、洗い流され易くなるため
、シグナルが減弱化される。また、短いプローブは、自動合成方法により製造さ
れるという利点を有するが、重要な洗浄段階中にハイブリッド形成プローブが失
われるため、それらの使用は多くの型のアッセイでは制限されている。
長）の使用は、長いハイブリッド形成時間を必要とし、追加的配列により与えら
れる望ましくない非特異的結合性相互作用の機会が無数にあるため、高いバック
グラウンドシグナルの大きな誘因となる。しかしながら、長いプローブは、多く
のレポーター基を含むため、より強力なシグナルを提供し得るという利点を有す
る。短いプローブ（２００未満のヌクレオチド）は、ハイブリッド形成時間を低
減化するという利点をもたらすが、プローブが短いと、洗い流され易くなるため
、シグナルが減弱化される。また、短いプローブは、自動合成方法により製造さ
れるという利点を有するが、重要な洗浄段階中にハイブリッド形成プローブが失
われるため、それらの使用は多くの型のアッセイでは制限されている。
【００１１】 クロスリンカー含有プローブは、インビトロハイブリッド形成技術で以前に使
用されたことがある（例えば、Yabusakiら、米国特許第４５９９３０３号参照）
。しかしながら、上記プローブがその場で行う ハイブリッド形成またはブロッ
ティング技術に適用可能か否かは未知であった。インビトロ技術において、様々
な生物学的成分は試料製造段階で、典型的にはアルカリ性溶液中で沸騰している
間、プロテイナーゼＫ処理などにより、通常化学分解されてしまう。いずれにし
ても、インビトロアッセイは、典型的には、一連の洗浄段階における上清溶液の
除去を通じて他の成分を除去する間一時的に何らかの固体支持体に核酸物質のみ
を保持するように設計される。ハイブリッド形成段階自体は通常、液中で遂行さ
れる。プローブおよび非核酸および生物学的成分間に非特異的相互作用がある場
合でも、これらの成分は検定において保持されないため、これが誤ったシグナル
の一因となることはない。
用されたことがある（例えば、Yabusakiら、米国特許第４５９９３０３号参照）
。しかしながら、上記プローブがその場で行う ハイブリッド形成またはブロッ
ティング技術に適用可能か否かは未知であった。インビトロ技術において、様々
な生物学的成分は試料製造段階で、典型的にはアルカリ性溶液中で沸騰している
間、プロテイナーゼＫ処理などにより、通常化学分解されてしまう。いずれにし
ても、インビトロアッセイは、典型的には、一連の洗浄段階における上清溶液の
除去を通じて他の成分を除去する間一時的に何らかの固体支持体に核酸物質のみ
を保持するように設計される。ハイブリッド形成段階自体は通常、液中で遂行さ
れる。プローブおよび非核酸および生物学的成分間に非特異的相互作用がある場
合でも、これらの成分は検定において保持されないため、これが誤ったシグナル
の一因となることはない。
【００１２】 しかしながら、特に他の生物学的成分の存在下、標的ＤＮＡまたはＲＮＡがハ
イブリッド形成段階中に固定化される技術では、クロスリンカー含有プローブと
標的ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化される固体支持体を含むこれらの物質のいずれ
かとの間における非特異的相互作用が検定結果に与える損害は大きい。クロスリ
ンカー含有プローブと生物学的試料が固定化されている固体支持体材料との間に
おける非特異的相互作用は特別の関心事である。例えば、固体支持体材料上で正
に荷電した基は標的核酸分子の当初の固定化に有用であるが、それらはまた核酸
プローブの結合をも誘引する。あるいは、固体支持体材料表面に露出されたヒド
ロキシル基は、使用されている核酸プローブと水素結合を形成し得る。クロスリ
ンカー含有プローブの場合、それらは必然的に高度反応性官能部分を含むことか
ら、非特異的結合に関して特に問題を含んでいる。意図するところは架橋部分を
用いて標的核酸へ核酸プローブを共有結合させることであるが、支持体または非
標的核酸分子に非特異的結合しているクロスリンカー含有プローブであればいず
れのプローブでも、潜在的には共有結合し得ることになるため、結果的に過度に
高いバックグラウンドレベルがもたらされる。
イブリッド形成段階中に固定化される技術では、クロスリンカー含有プローブと
標的ＤＮＡまたはＲＮＡが固定化される固体支持体を含むこれらの物質のいずれ
かとの間における非特異的相互作用が検定結果に与える損害は大きい。クロスリ
ンカー含有プローブと生物学的試料が固定化されている固体支持体材料との間に
おける非特異的相互作用は特別の関心事である。例えば、固体支持体材料上で正
に荷電した基は標的核酸分子の当初の固定化に有用であるが、それらはまた核酸
プローブの結合をも誘引する。あるいは、固体支持体材料表面に露出されたヒド
ロキシル基は、使用されている核酸プローブと水素結合を形成し得る。クロスリ
ンカー含有プローブの場合、それらは必然的に高度反応性官能部分を含むことか
ら、非特異的結合に関して特に問題を含んでいる。意図するところは架橋部分を
用いて標的核酸へ核酸プローブを共有結合させることであるが、支持体または非
標的核酸分子に非特異的結合しているクロスリンカー含有プローブであればいず
れのプローブでも、潜在的には共有結合し得ることになるため、結果的に過度に
高いバックグラウンドレベルがもたらされる。
【００１３】 標的核酸分子以外の生物学的材料が潜在的に問題を含みながらも存在すること
に加えて、生物学的試料が固定されるハイブリッド形成プロトコルで使用される
操作の他の局面は、明瞭なハイブリッド形成シグナルを得る努力にとっては有害
のものであり得る。例えば、その場で行うハイブリッド形成操作は、固定液、す
なわち細胞を殺すが長い期間にわたってその形態および／または核酸を保存する
化合物の使用を採用している。しかしながら、これらの固定液は構造を保存して
も、ハイブリッド形成効率を低減化させることが多い。このプロセスでネットワ
ークが形成され得、核酸および抗原を捕捉し、それらをプローブに接近できなく
する。また固定液の中には、共有結合的に核酸を修飾するものもあり、後のハイ
ブリッド形成が阻止され、シグナルを減少させる。
に加えて、生物学的試料が固定されるハイブリッド形成プロトコルで使用される
操作の他の局面は、明瞭なハイブリッド形成シグナルを得る努力にとっては有害
のものであり得る。例えば、その場で行うハイブリッド形成操作は、固定液、す
なわち細胞を殺すが長い期間にわたってその形態および／または核酸を保存する
化合物の使用を採用している。しかしながら、これらの固定液は構造を保存して
も、ハイブリッド形成効率を低減化させることが多い。このプロセスでネットワ
ークが形成され得、核酸および抗原を捕捉し、それらをプローブに接近できなく
する。また固定液の中には、共有結合的に核酸を修飾するものもあり、後のハイ
ブリッド形成が阻止され、シグナルを減少させる。
【００１４】 すなわち、シグナル対ノイズ比が改善された固定化核酸ハイブリッド形成アッ
セイに対する要望が存在する。しかしながら、これらの固定化アッセイへのクロ
スリンカー含有プローブの適用性およびシグナル対ノイズ問題との闘争における
それらの有効性は、依然として不明である。
セイに対する要望が存在する。しかしながら、これらの固定化アッセイへのクロ
スリンカー含有プローブの適用性およびシグナル対ノイズ問題との闘争における
それらの有効性は、依然として不明である。
【００１５】 電場の使用により荷電生物分子の結合を誘導する方法については、米国特許第
５９２９２０８、５６０５６６２、５８４９４８６および５６３２９５７号に開
示されている。この技術はプローブを標的へ一時的に結合させるという欠点をも
つ。さらに、電場誘導ストリンジェント洗浄技術の適用は、プローブが常に洗い
流される状態におかれるため、緩衝ストリンジェント洗浄と同様に妥協した条件
を用いなければならないという欠点をもつ。
５９２９２０８、５６０５６６２、５８４９４８６および５６３２９５７号に開
示されている。この技術はプローブを標的へ一時的に結合させるという欠点をも
つ。さらに、電場誘導ストリンジェント洗浄技術の適用は、プローブが常に洗い
流される状態におかれるため、緩衝ストリンジェント洗浄と同様に妥協した条件
を用いなければならないという欠点をもつ。
【００１６】 （発明の要旨） 本発明の一目的は、クロスリンカー含有プローブを用いてアッセイの感度およ
び再現性を改良した固定化核酸標的の検定方法を提供することである。
び再現性を改良した固定化核酸標的の検定方法を提供することである。
【００１７】 本発明のさらに別の目的は、固定化クロスリンカー含有プローブを用いてアッ
セイの感度および再現性を改良した標的核酸溶液の検定方法を提供することであ
る。
セイの感度および再現性を改良した標的核酸溶液の検定方法を提供することであ
る。
【００１８】 アッセイの感度は、測定する観察可能な対象のシグナル対バックグラウンド比
により決定される。アッセイの再現性は、シグナルレベルまたはバックグラウン
ドレベルに影響を及ぼす因子により決まる。これらのレベルのいずれかの変動に
より、様々なシグナル対バックグラウンド比が誘発され、検定結果の解釈を複雑
にする。
により決定される。アッセイの再現性は、シグナルレベルまたはバックグラウン
ドレベルに影響を及ぼす因子により決まる。これらのレベルのいずれかの変動に
より、様々なシグナル対バックグラウンド比が誘発され、検定結果の解釈を複雑
にする。
【００１９】 本発明は、固定化核酸の改良された検定方法に対する要望を満たす。本発明に
より提供されるこれらの方法は、標準ハイブリッド形成検定技術と比べてシグナ
ル対バックグラウンド比が優れているという利点を提供する。
より提供されるこれらの方法は、標準ハイブリッド形成検定技術と比べてシグナ
ル対バックグラウンド比が優れているという利点を提供する。
【００２０】 本発明は、標的分子または生物学的試料のいずれかが固定されている、生物学
的試料中における標的核酸分子の存在を測定する方法を提供する。この方法では
、核酸プローブと標的核酸との間に共有結合的架橋を形成し得る架橋部分を有す
る核酸プローブを生物学的試料と接触させることにより、標的核酸と核酸プロー
ブとの間にハイブリッド形成を行わせる。次いで、核酸プローブと標的核酸分子
との間に共有結合を形成させる。少なくとも一つの洗浄段階の後、過剰にまたは
非特異的に結合したハイブリッド形成相手を生物学的試料部位から除去する。ま
た、所望によりストリンジェントな変性誘発条件および洗浄を用いることによっ
て、標的核酸に共有結合していない核酸プローブがあればそれらは除去できる。
最終段階では、架橋核酸プローブ標的複合体の量を測定する。
的試料中における標的核酸分子の存在を測定する方法を提供する。この方法では
、核酸プローブと標的核酸との間に共有結合的架橋を形成し得る架橋部分を有す
る核酸プローブを生物学的試料と接触させることにより、標的核酸と核酸プロー
ブとの間にハイブリッド形成を行わせる。次いで、核酸プローブと標的核酸分子
との間に共有結合を形成させる。少なくとも一つの洗浄段階の後、過剰にまたは
非特異的に結合したハイブリッド形成相手を生物学的試料部位から除去する。ま
た、所望によりストリンジェントな変性誘発条件および洗浄を用いることによっ
て、標的核酸に共有結合していない核酸プローブがあればそれらは除去できる。
最終段階では、架橋核酸プローブ標的複合体の量を測定する。
【００２１】 一態様では、生物学的試料は細胞、細胞レベル下構造、体液または組織片であ
る。本発明の別の態様では、生物学的試料は、好ましくはナイロン膜またはニト
ロセルロース紙に固定された核酸分子の試料である。
る。本発明の別の態様では、生物学的試料は、好ましくはナイロン膜またはニト
ロセルロース紙に固定された核酸分子の試料である。
【００２２】 標的核酸分子は、動物、細菌、真菌、ヒト、寄生虫、植物またはウイルス核酸
であり得る。
であり得る。
【００２３】 本発明の一態様では、標識化した核酸プローブの架橋部分は、クマリン、フロ
クマリンおよびベンゾジピロンから成る群から選択される。
クマリンおよびベンゾジピロンから成る群から選択される。
【００２４】 標的核酸と核酸プローブとの間における共有結合の形成は、光化学的または化
学的に行われ得る。
学的に行われ得る。
【００２５】 別の態様において、本発明は、固体支持体と固体支持体に固定化された複数の
異なる核酸プローブとを含むアレイを提供し、その場合各核酸プローブは、標的
核酸分子の特定領域と本質的に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブと標的核
酸分子との間に共有結合的架橋を形成し得る架橋部分を有するものである。標的
核酸分子は、動物、例えばヒト、細菌、真菌、寄生虫、植物またはウイルス核酸
であり得る。アレイで使用される架橋部分は、所望によりクマリン、フロクマリ
ンおよびベンゾジピロンから成る群から選択されてもよい。
異なる核酸プローブとを含むアレイを提供し、その場合各核酸プローブは、標的
核酸分子の特定領域と本質的に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブと標的核
酸分子との間に共有結合的架橋を形成し得る架橋部分を有するものである。標的
核酸分子は、動物、例えばヒト、細菌、真菌、寄生虫、植物またはウイルス核酸
であり得る。アレイで使用される架橋部分は、所望によりクマリン、フロクマリ
ンおよびベンゾジピロンから成る群から選択されてもよい。
【００２６】 生物学的試料における複数の標的核酸分子の存在を決定するためにプローブの
アレイを用いる方法もまた提供される。
アレイを用いる方法もまた提供される。
【００２７】 幾つかの多型性配列が予測され得る特定配列の遺伝子型を測定するためにアレ
イを用いる方法もまた提供される。
イを用いる方法もまた提供される。
【００２８】 本発明の別の態様では、患者における病状の診断方法および本発明方法の実施
に有用なキットもまた提供される。
に有用なキットもまた提供される。
【００２９】 （図面の簡単な記載） 図１ａ−図１ｃは、架橋形成を誘導するためのＵＶ照射を実施および実施せず
に、架橋部分を含むプローブによりヒト乳頭腫ウイルスの存在についてその場で
行うハイブリッド形成によりアッセイした細胞群を示す。
に、架橋部分を含むプローブによりヒト乳頭腫ウイルスの存在についてその場で
行うハイブリッド形成によりアッセイした細胞群を示す。
【００３０】 （発明の詳細な記載） 本発明は、固定化核酸ハイブリッド形成アッセイを遂行するための改良方法を
提供する。それらのアッセイの例には、その場で行うハイブリッド形成、ブロッ
ティングアッセイおよび遺伝子チップの使用があるが、これらに限定されるわけ
ではない。
提供する。それらのアッセイの例には、その場で行うハイブリッド形成、ブロッ
ティングアッセイおよび遺伝子チップの使用があるが、これらに限定されるわけ
ではない。
【００３１】 核酸ハイブリッド形成は、修飾ポリヌクレオチド、例えば「ＰＮＡ」（Nielso
nら、米国特許第５７７３５７１号）ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせにおける２本またはそれ以上の
反対鎖が、互いを認識し、水素結合形成によって一緒に結合するプロセスである
。
nら、米国特許第５７７３５７１号）ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ポ
リヌクレオチドまたはそれらの任意の組み合わせにおける２本またはそれ以上の
反対鎖が、互いを認識し、水素結合形成によって一緒に結合するプロセスである
。
【００３２】 本発明の一態様は、生物学的試料中における標的核酸分子の存在の測定方法を
提供する。この方法では、まず核酸プローブを生物学的試料と接触させることに
より、核酸プローブを標的核酸分子とハイブリダイズさせ得る。標的核酸分子と
ハイブリダイズした核酸プローブは、核酸プローブおよび標的核酸分子間におけ
る共有結合的架橋を形成し得る架橋部分を担う。この方法はまた、核酸プローブ
とハイブリダイズした標的核酸分子との間に共有結合的架橋を形成させ、洗浄に
より過剰のプローブまたは標的を除去することを含む。最終段階では、架橋核酸
プローブ標的複合体の量を測定することを含む。
提供する。この方法では、まず核酸プローブを生物学的試料と接触させることに
より、核酸プローブを標的核酸分子とハイブリダイズさせ得る。標的核酸分子と
ハイブリダイズした核酸プローブは、核酸プローブおよび標的核酸分子間におけ
る共有結合的架橋を形成し得る架橋部分を担う。この方法はまた、核酸プローブ
とハイブリダイズした標的核酸分子との間に共有結合的架橋を形成させ、洗浄に
より過剰のプローブまたは標的を除去することを含む。最終段階では、架橋核酸
プローブ標的複合体の量を測定することを含む。
【００３３】 この生物学的試料における標的核酸分子の存在を測定する方法は、所望により
核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合を形成させ、試料をストリンジェ
ントな変性誘発条件に付すことにより非共有結合核酸を除去することを含み得る
。
核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合を形成させ、試料をストリンジェ
ントな変性誘発条件に付すことにより非共有結合核酸を除去することを含み得る
。
【００３４】 一態様では、生物学的試料を固体支持体に固定化する。別の態様では、プロー
ブを固体支持体に固定化する。
ブを固体支持体に固定化する。
【００３５】 典型的には、標準ハイブリッド形成検定では塩緩衝液などによる比較的穏やか
な洗浄だけが許される。これらの洗浄は、生物学的試料とはいずれの手段によっ
ても結合していない核酸プローブを除去してしまうのに十分である。それらはま
た、結合しているが非特異的にのみ（例えば、限定水素結合およびイオン相互作
用により）結合しているプローブ分子のかなりを除去してしまう。よりストリン
ジェントな洗浄の使用は、それらが核酸プローブと標的核酸分子との間における
重要な二重らせんの変性を誘発し得るため、これらの標準ハイブリッド形成アッ
セイでは問題である。
な洗浄だけが許される。これらの洗浄は、生物学的試料とはいずれの手段によっ
ても結合していない核酸プローブを除去してしまうのに十分である。それらはま
た、結合しているが非特異的にのみ（例えば、限定水素結合およびイオン相互作
用により）結合しているプローブ分子のかなりを除去してしまう。よりストリン
ジェントな洗浄の使用は、それらが核酸プローブと標的核酸分子との間における
重要な二重らせんの変性を誘発し得るため、これらの標準ハイブリッド形成アッ
セイでは問題である。
【００３６】 本発明の方法では、１回またはそれ以上のストリンジェントな変性誘発性洗浄
を実施できる。この発明は、プローブと標的分子とが、一緒になってただ水素結
合しているのではなく、互いに共有結合している二重らせんを提供する。従って
、望ましくない非特異的バックグラウンド結合、さらには標的核酸と核酸プロー
ブとの間における水素結合の多くまたは全てを破壊するが標識プローブをその標
的に結合している共有結合は破壊しない、より厳しい条件を使用できる。例えば
、尿素溶液またはアルカリ性溶液による洗浄が使用され得る。非架橋的結合相手
の電場誘導除去も使用できる。加熱してもよい。従って、この共有結合はアッセ
イのシグナル対ノイズ比を顕著に改善し得る。
を実施できる。この発明は、プローブと標的分子とが、一緒になってただ水素結
合しているのではなく、互いに共有結合している二重らせんを提供する。従って
、望ましくない非特異的バックグラウンド結合、さらには標的核酸と核酸プロー
ブとの間における水素結合の多くまたは全てを破壊するが標識プローブをその標
的に結合している共有結合は破壊しない、より厳しい条件を使用できる。例えば
、尿素溶液またはアルカリ性溶液による洗浄が使用され得る。非架橋的結合相手
の電場誘導除去も使用できる。加熱してもよい。従って、この共有結合はアッセ
イのシグナル対ノイズ比を顕著に改善し得る。
【００３７】 この核酸プローブは、約８〜約２００塩基長またはそれより長い化学合成した
または生物学的に製造されたＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドにより構成さ
れ得る。この核酸プローブは、好ましくは１本鎖状である。この核酸プローブは
、その標的核酸分子の特定領域と本質的に相補的な塩基配列を有する。
または生物学的に製造されたＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドにより構成さ
れ得る。この核酸プローブは、好ましくは１本鎖状である。この核酸プローブは
、その標的核酸分子の特定領域と本質的に相補的な塩基配列を有する。
【００３８】 架橋部分は、適当に修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチド誘導体の使用
により、合成時点で合成ポリヌクレオチドに直接組込むことができる。あるいは
、架橋分子は、光化学的または化学的単付加によりプローブへ導入し得る。場合
によって、架橋部分は、架橋部分を含む適当に修飾されたヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチドを用いることによりポリヌクレオチドプローブへ酵素的に組込
むこともできる。
により、合成時点で合成ポリヌクレオチドに直接組込むことができる。あるいは
、架橋分子は、光化学的または化学的単付加によりプローブへ導入し得る。場合
によって、架橋部分は、架橋部分を含む適当に修飾されたヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチドを用いることによりポリヌクレオチドプローブへ酵素的に組込
むこともできる。
【００３９】 核酸プローブで使用する架橋部分は、核酸プローブと標的核酸分子間に共有結
合的架橋を形成し得るものならいかなる化学的部分でもよい。例えば、架橋部分
の前駆体は、所望によりクマリン、フロクマリンまたはベンゾジピロンであり得
る。本発明で有用な上記クロスリンカーの幾つかは、当業者には周知である。例
えば、米国特許第４５９９３０３および４８２６９６７号は、本発明での使用に
適したフロクマリンに基いた架橋化合物を開示している。また、米国特許第５０
８２９３４号において、Sabaらは、塩基部分を介在せずに、フェニル環によりリ
ボースまたはデオキシリボース糖部分に連結させたクマリン部分を含む光活性化
可能なヌクレオシド類似体について報告している。さらに、並行出願中で共有に
かかる米国特許出願シリアルナンバー０８／４０１６３０は、核酸ハイブリッド
形成アッセイで光架橋性試薬として使用され得る非ヌクレオシドの安定した光活
性化合物を開示している。これらの参考文献およびその他については出典明示に
より本明細書の一部とする。
合的架橋を形成し得るものならいかなる化学的部分でもよい。例えば、架橋部分
の前駆体は、所望によりクマリン、フロクマリンまたはベンゾジピロンであり得
る。本発明で有用な上記クロスリンカーの幾つかは、当業者には周知である。例
えば、米国特許第４５９９３０３および４８２６９６７号は、本発明での使用に
適したフロクマリンに基いた架橋化合物を開示している。また、米国特許第５０
８２９３４号において、Sabaらは、塩基部分を介在せずに、フェニル環によりリ
ボースまたはデオキシリボース糖部分に連結させたクマリン部分を含む光活性化
可能なヌクレオシド類似体について報告している。さらに、並行出願中で共有に
かかる米国特許出願シリアルナンバー０８／４０１６３０は、核酸ハイブリッド
形成アッセイで光架橋性試薬として使用され得る非ヌクレオシドの安定した光活
性化合物を開示している。これらの参考文献およびその他については出典明示に
より本明細書の一部とする。
【００４０】 架橋部分の前駆体は、クマリン、７−ヒドロキシクマリン、６,７−ジヒドロ
キシクマリン、６−アルコキシ−７−ヒドロキシクマリン、ソラレン、８−メト
キシソラレン、５−メトキシソラレン、４,５',,８−トリメチルソラレン、４'
−ヒドロキシメチル−４,５',,８−トリメチルソラレン、および４'−アミノメ
チル−４,５,',８−トリメチルソラレン、ハロアルキルクマリン、ハロアルキル
フロクマリン、ハロアルキルベンゾジピロンまたはそれらの誘導体であり得る。
これらの部分は、上記引用の特許で示された方法により核酸配列へ組込む。クマ
リン−シノリン融合環系を含む化合物もまた、本発明での使用に適している。態
様によっては、架橋部分が単付加フロクマリン：ヌクレオシド付加物の一部であ
ってもよい。
キシクマリン、６−アルコキシ−７−ヒドロキシクマリン、ソラレン、８−メト
キシソラレン、５−メトキシソラレン、４,５',,８−トリメチルソラレン、４'
−ヒドロキシメチル−４,５',,８−トリメチルソラレン、および４'−アミノメ
チル−４,５,',８−トリメチルソラレン、ハロアルキルクマリン、ハロアルキル
フロクマリン、ハロアルキルベンゾジピロンまたはそれらの誘導体であり得る。
これらの部分は、上記引用の特許で示された方法により核酸配列へ組込む。クマ
リン−シノリン融合環系を含む化合物もまた、本発明での使用に適している。態
様によっては、架橋部分が単付加フロクマリン：ヌクレオシド付加物の一部であ
ってもよい。
【００４１】 架橋を含む共有結合形成の性質は、選択した架橋部分により異なる。好ましい
態様では、共有結合の形成は光化学的に行う。別の態様では、共有結合の形成は
化学的に行う。
態様では、共有結合の形成は光化学的に行う。別の態様では、共有結合の形成は
化学的に行う。
【００４２】 核酸プローブにおける標識は、架橋部分に直接結合させ得る。あるいは、標識
をプローブの別の領域に結合させてもよい。標識は検出できるものであればいず
れの分子でもよい。例えば、標識は、放射性核種、色素原、発色団、蛍光源（fl
uorogenic）、発蛍光団(fluorophore)、化学ルミネセンス色素、酵素またはリガ
ンドであり得る。ビオチン標識化ヌクレオチドは、ニック翻訳、酵素的または化
学的手段によりＤＮＡまたはＲＮＡへ組込むことができる。ビオチニル化プロー
ブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光性、酵素性または金コロイドコンジ
ュゲートを用いてハイブリッド形成後に検出し得る。核酸はまた、他の蛍光化合
物、免疫検出性蛍光誘導体またはビオチン類似体により標識してもよい。核酸は
また、タンパク質結合手段により標識することもできる。放射性または蛍光性ヒ
ストンＨ１、酵素類（アルカリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼ）また
は１本鎖結合性（ｓｓＢ）タンパク質に結合またはコンジュゲートさせた核酸も
また使用できる。多様な上記標識方法は、当業者には周知である。
をプローブの別の領域に結合させてもよい。標識は検出できるものであればいず
れの分子でもよい。例えば、標識は、放射性核種、色素原、発色団、蛍光源（fl
uorogenic）、発蛍光団(fluorophore)、化学ルミネセンス色素、酵素またはリガ
ンドであり得る。ビオチン標識化ヌクレオチドは、ニック翻訳、酵素的または化
学的手段によりＤＮＡまたはＲＮＡへ組込むことができる。ビオチニル化プロー
ブは、アビジン／ストレプトアビジン、蛍光性、酵素性または金コロイドコンジ
ュゲートを用いてハイブリッド形成後に検出し得る。核酸はまた、他の蛍光化合
物、免疫検出性蛍光誘導体またはビオチン類似体により標識してもよい。核酸は
また、タンパク質結合手段により標識することもできる。放射性または蛍光性ヒ
ストンＨ１、酵素類（アルカリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼ）また
は１本鎖結合性（ｓｓＢ）タンパク質に結合またはコンジュゲートさせた核酸も
また使用できる。多様な上記標識方法は、当業者には周知である。
【００４３】 典型的なプローブ型およびそれらに関連する検出方法には、標識およびクロス
リンカーを組込んだ短い（８−２００nt）プローブ、クロスリンカーが組込まれ
かつその場で行う伸長および付随的な標識組込みによる検出を伴う短いプローブ
、 およびクロスリンカー含有プライマーの使用、クロスリンカー修飾ヌクレオチド
の酵素的組込み、またはクロスリンカー含有オリゴヌクレオチドの酵素的組込み
によりクロスリンカー（複数も可）を組込んだ長い（＞２００nt）プローブが含
まれる。
リンカーを組込んだ短い（８−２００nt）プローブ、クロスリンカーが組込まれ
かつその場で行う伸長および付随的な標識組込みによる検出を伴う短いプローブ
、 およびクロスリンカー含有プライマーの使用、クロスリンカー修飾ヌクレオチド
の酵素的組込み、またはクロスリンカー含有オリゴヌクレオチドの酵素的組込み
によりクロスリンカー（複数も可）を組込んだ長い（＞２００nt）プローブが含
まれる。
【００４４】 本発明のアッセイにおける標的核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であ
り得る。標的核酸分子は、動物、細菌、真菌、ヒト、寄生虫、植物またはウイル
ス核酸であり得る。ウイルス配列は、ヒト乳頭腫ウイルス、エプスタイン‐バー
ルウイルス、またはサイトメガロウイルスに由来し得る。しかしながら、他にも
多くの可能な標的も存在し、本発明と連係的に使用され得る。例えば、標的核酸
分子は、それが選択された遺伝子産物を生成し、重大な細胞制御機能を遂行する
疑いがあり、反復配列と関係があり、活性遺伝子産物の発現を阻む遺伝的欠陥を
含む疑いがあるか、または地図における位置が既知のマーカープローブ領域と染
色体の位置に関係があり得るため、興味の対象であり得る。その場で行うハイブ
リッド形成アッセイの適用例には、感染症試験（病原体検出）、癌マーカースク
リーニング、突然変異検出、組織型分類、遺伝子プロフィーリング、形質組込み
の分析、多型性遺伝子型分類、および抗生物質耐性遺伝子に関する検定が含まれ
る。
り得る。標的核酸分子は、動物、細菌、真菌、ヒト、寄生虫、植物またはウイル
ス核酸であり得る。ウイルス配列は、ヒト乳頭腫ウイルス、エプスタイン‐バー
ルウイルス、またはサイトメガロウイルスに由来し得る。しかしながら、他にも
多くの可能な標的も存在し、本発明と連係的に使用され得る。例えば、標的核酸
分子は、それが選択された遺伝子産物を生成し、重大な細胞制御機能を遂行する
疑いがあり、反復配列と関係があり、活性遺伝子産物の発現を阻む遺伝的欠陥を
含む疑いがあるか、または地図における位置が既知のマーカープローブ領域と染
色体の位置に関係があり得るため、興味の対象であり得る。その場で行うハイブ
リッド形成アッセイの適用例には、感染症試験（病原体検出）、癌マーカースク
リーニング、突然変異検出、組織型分類、遺伝子プロフィーリング、形質組込み
の分析、多型性遺伝子型分類、および抗生物質耐性遺伝子に関する検定が含まれ
る。
【００４５】 本発明の一態様では、生物学的試料は、細胞、細胞レベル下の系または構造、
例えば核またはミトコンドリア、体液または組織片であり、この方法により、改
良されたその場で行うハイブリッド形成方法が提供される。その場で行うハイブ
リッド形成方法において、標的核酸、典型的には染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡ転
写物を含む細胞または組織片は、固定化され、そしてプローブ溶液に暴露される
。
例えば核またはミトコンドリア、体液または組織片であり、この方法により、改
良されたその場で行うハイブリッド形成方法が提供される。その場で行うハイブ
リッド形成方法において、標的核酸、典型的には染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡ転
写物を含む細胞または組織片は、固定化され、そしてプローブ溶液に暴露される
。
【００４６】 本発明の一態様では、生物学的試料は患者から採取された細胞または組織片で
ある。採取され、固定化され、本発明で使用され得る細胞試料は、例えば、頚部
細胞（一般的にはヒト乳頭腫ウイルスについて試験するため）、頬からの頬細胞
（染色体分析用の簡単な供給源）、中期細胞（染色体散在用）またはリンパ球（
エプスタイン‐バールウイルスまたはリンパ系で見出される他のウイルスについ
て試験するため）である。興味の対象である組織試料は、腫瘍断片またはバイオ
プシー標本であり得、それらは典型的にはウイルスの存在または癌遺伝子または
異常なコピー数の染色体の発現について検定される。
ある。採取され、固定化され、本発明で使用され得る細胞試料は、例えば、頚部
細胞（一般的にはヒト乳頭腫ウイルスについて試験するため）、頬からの頬細胞
（染色体分析用の簡単な供給源）、中期細胞（染色体散在用）またはリンパ球（
エプスタイン‐バールウイルスまたはリンパ系で見出される他のウイルスについ
て試験するため）である。興味の対象である組織試料は、腫瘍断片またはバイオ
プシー標本であり得、それらは典型的にはウイルスの存在または癌遺伝子または
異常なコピー数の染色体の発現について検定される。
【００４７】 その場で行うハイブリッド形成を目的とする生物学的試料の固定化方法は、当
業者には周知である。細胞区画およびＤＮＡ構造は、有機溶媒および酸または二
官能試薬で処理して構造的成分をそれら本来の形態学的関係に固定することによ
り固定化または透過性化され得る。一般的固定化液には、酢酸、塩類、メタノー
ル、ホルマリン、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドがある。組織
試料は、まず試料をろうに埋封するかまたは試料を冷凍した後、それを薄片に切
ることによりハイブリッド形成検定用に製造され得る。次いで組織片をスライド
上に載せ、脱パラフィン処理または解凍する。
業者には周知である。細胞区画およびＤＮＡ構造は、有機溶媒および酸または二
官能試薬で処理して構造的成分をそれら本来の形態学的関係に固定することによ
り固定化または透過性化され得る。一般的固定化液には、酢酸、塩類、メタノー
ル、ホルマリン、パラホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドがある。組織
試料は、まず試料をろうに埋封するかまたは試料を冷凍した後、それを薄片に切
ることによりハイブリッド形成検定用に製造され得る。次いで組織片をスライド
上に載せ、脱パラフィン処理または解凍する。
【００４８】 生物学的材料はまた、典型的には構造を除タンパク質および／または脱脂し得
る若干の薬剤の１種またはそれ以上により処理され得る。上記方法は、プロテア
ーゼ、リパーゼ、酸、アルコール含有有機溶媒、デタージェントまたは熱変性の
使用またはこれらの処理の組み合わせを含み得る。一般的な処理では、メタノー
ル：酢酸による１回またはそれ以上の洗浄が行なわれる。
る若干の薬剤の１種またはそれ以上により処理され得る。上記方法は、プロテア
ーゼ、リパーゼ、酸、アルコール含有有機溶媒、デタージェントまたは熱変性の
使用またはこれらの処理の組み合わせを含み得る。一般的な処理では、メタノー
ル：酢酸による１回またはそれ以上の洗浄が行なわれる。
【００４９】 細胞レベル下構造、例えば核およびミトコンドリアは、慣用的分画方法、例え
ば等密度遠心法により製造され得、細胞レベル下の物質が濃厚化または実質的精
製形態で得られる。その後、濃厚化構造製品を上記要領で透過性化および除タン
パク質し、プローブ試験に備えて乾燥することによりスライドに付着させ得る。
ば等密度遠心法により製造され得、細胞レベル下の物質が濃厚化または実質的精
製形態で得られる。その後、濃厚化構造製品を上記要領で透過性化および除タン
パク質し、プローブ試験に備えて乾燥することによりスライドに付着させ得る。
【００５０】 本発明の好ましい態様において、生物学的試料を、典型的には乾燥することに
よりガラス製スライドに付着させる。ガラス製スライドは、付着を促す物質、例
えばポリ−Ｌ−リシンにより被覆され得る。別法として、生物学的試料は他の型
の支持体、例えばナイロンまたはニトロセルロースに固定化され得る。
よりガラス製スライドに付着させる。ガラス製スライドは、付着を促す物質、例
えばポリ−Ｌ−リシンにより被覆され得る。別法として、生物学的試料は他の型
の支持体、例えばナイロンまたはニトロセルロースに固定化され得る。
【００５１】 クロスリンカー含有プローブを用いてその場で行うハイブリッド形成を遂行す
る典型的な方法は、下記実施例１、２、３および４に詳述されている。ヒト乳頭
腫ウイルスをプローブで調べたその場で行うハイブリッド形成実験の結果は、実
施例２および４に記載されている。
る典型的な方法は、下記実施例１、２、３および４に詳述されている。ヒト乳頭
腫ウイルスをプローブで調べたその場で行うハイブリッド形成実験の結果は、実
施例２および４に記載されている。
【００５２】 本発明の別の態様では、生物学的試料は核酸分子の試料である。核酸分子の試
料は、所望により精製または半精製され得る。試料は、単一配列を伴う核酸分子
のみを含み得る。しかしながら、本発明の好ましい態様において、生物学的試料
は、多くの異なる核酸分子の混合物を含み、混合物は非核酸生物材料から少なく
とも半精製されている。
料は、所望により精製または半精製され得る。試料は、単一配列を伴う核酸分子
のみを含み得る。しかしながら、本発明の好ましい態様において、生物学的試料
は、多くの異なる核酸分子の混合物を含み、混合物は非核酸生物材料から少なく
とも半精製されている。
【００５３】 生物学的試料が核酸分子の半精製または精製混合物である場合、試料は、好ま
しくはナイロン膜またはニトロセルロース紙に固定化される。これらの態様にお
いて、ハイブリッド形成アッセイは修正ブロッティングアッセイである。ブロッ
ティングアッセイにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲルを通して移された後膜
に結合されるかまたは直接膜に結合されており、次いでプローブの溶液に暴露さ
れる。３種の一般的な核酸ベースのブロッティング方法：サザーン・ブロット、
ノーザン・ブロットおよびドット・ブロットが使用されている。
しくはナイロン膜またはニトロセルロース紙に固定化される。これらの態様にお
いて、ハイブリッド形成アッセイは修正ブロッティングアッセイである。ブロッ
ティングアッセイにおいて、ＤＮＡまたはＲＮＡは、ゲルを通して移された後膜
に結合されるかまたは直接膜に結合されており、次いでプローブの溶液に暴露さ
れる。３種の一般的な核酸ベースのブロッティング方法：サザーン・ブロット、
ノーザン・ブロットおよびドット・ブロットが使用されている。
【００５４】 サザーンおよびノーザンブロッティング方法は、様々な適用例に対して有用で
ある。これらの技術では、ＤＮＡ（サザーン）またはＲＮＡ（ノーザン）を、ゲ
ルを通じて移すことにより核酸をバンドに分離した後、プローブ溶液をゲルと接
触させてハイブリッド形成を行わせる。プローブ／標的ハイブリッドが形成され
ているバンドを単に観察することだけでなく、ゲルにおいて分析された他の試料
に対するそれらのバンドの位置からも情報が得られる。サザーン・ブロットの適
用例には、突然変異検出、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ＤＮＡフィンガー
プリンティング、および感染症検出がある。ノーザン・ブロッティングは、細胞
における遺伝子発現分析にとって強力な手段である。ゲルにおける標的バンドの
デンシトメーター分析により、遺伝子発現レベルの評価が行われる。さらに、標
的ＲＮＡバンドの長さを既知標準値と比較すると、不完全プロセシングまたは突
然変異種が検出され得る。
ある。これらの技術では、ＤＮＡ（サザーン）またはＲＮＡ（ノーザン）を、ゲ
ルを通じて移すことにより核酸をバンドに分離した後、プローブ溶液をゲルと接
触させてハイブリッド形成を行わせる。プローブ／標的ハイブリッドが形成され
ているバンドを単に観察することだけでなく、ゲルにおいて分析された他の試料
に対するそれらのバンドの位置からも情報が得られる。サザーン・ブロットの適
用例には、突然変異検出、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）分析、ＤＮＡフィンガー
プリンティング、および感染症検出がある。ノーザン・ブロッティングは、細胞
における遺伝子発現分析にとって強力な手段である。ゲルにおける標的バンドの
デンシトメーター分析により、遺伝子発現レベルの評価が行われる。さらに、標
的ＲＮＡバンドの長さを既知標準値と比較すると、不完全プロセシングまたは突
然変異種が検出され得る。
【００５５】 サザーン・ブロットの場合、ＤＮＡを標準的方法により試料から抽出する。Ｄ
ＮＡを選択された制限酵素により消化し、変性させ、これらのプロセスにより得
られた断片をアガロースゲルにより分離する。ＤＮＡを毛管溶離、エレクトロブ
ロッティングまたは真空移動によりニトロセルロースまたはナイロン膜に移す。
一旦ＤＮＡが固定化されると、膜をクロスリンカー含有プローブの溶液に浸漬し
、放置してインキュベーションすることにより、ハイブリッド形成を行わせる。
膜をすすぐことにより過剰のハイブリッド形成溶液を除去し、使用されている架
橋部分によって、約５〜約３０分間、通常約１０分間、ＵＶまたは可視光源から
の光線を照射して、プローブ‐標的ハイブリッドを架橋させる。膜を洗浄し、架
橋したプローブ／標的ハイブリッドは、例えば蛍光標識がプローブに組込まれた
場合は直接的に、または例えばアルカリ性ホスファターゼをリガンド−レセプタ
ーまたは抗体‐抗原結合により架橋プローブに組込む段階を追加し、それに続い
て結合酵素を基質と反応させることにより着色した、ルミネセンスまたは化学ル
ミネセンス生成物が生成された後に視覚化される。
ＮＡを選択された制限酵素により消化し、変性させ、これらのプロセスにより得
られた断片をアガロースゲルにより分離する。ＤＮＡを毛管溶離、エレクトロブ
ロッティングまたは真空移動によりニトロセルロースまたはナイロン膜に移す。
一旦ＤＮＡが固定化されると、膜をクロスリンカー含有プローブの溶液に浸漬し
、放置してインキュベーションすることにより、ハイブリッド形成を行わせる。
膜をすすぐことにより過剰のハイブリッド形成溶液を除去し、使用されている架
橋部分によって、約５〜約３０分間、通常約１０分間、ＵＶまたは可視光源から
の光線を照射して、プローブ‐標的ハイブリッドを架橋させる。膜を洗浄し、架
橋したプローブ／標的ハイブリッドは、例えば蛍光標識がプローブに組込まれた
場合は直接的に、または例えばアルカリ性ホスファターゼをリガンド−レセプタ
ーまたは抗体‐抗原結合により架橋プローブに組込む段階を追加し、それに続い
て結合酵素を基質と反応させることにより着色した、ルミネセンスまたは化学ル
ミネセンス生成物が生成された後に視覚化される。
【００５６】 ノーザン・ブロット適用法の場合、ＲＮＡを安定させ、内在性リボヌクレアー
ゼ酵素を不活化する条件下でＲＮＡを試料から抽出する。ＲＮＡを穏やかな加熱
により変性させ、アガロースゲルにより分離する。その後、この方法は本質的に
サザーン・ブロッティングの場合と同じである。
ゼ酵素を不活化する条件下でＲＮＡを試料から抽出する。ＲＮＡを穏やかな加熱
により変性させ、アガロースゲルにより分離する。その後、この方法は本質的に
サザーン・ブロッティングの場合と同じである。
【００５７】 ドット・ブロットは、膜における小円形「ドット」に抽出された核酸試料全体
を濃縮する単純な膜ベースの方法である。この技術は、標的配列の存在または非
存在を測定するのに有用であり、試料と平行して既知標的レベルを含む標準物質
を分析し、デンシトメーター技術で検出生成物を定量することにより定量的適用
に適合化され得る。さらに、各試料「ドット」は膜全体の小さな領域を占めるに
すぎないため、多数の試料が一緒に検定され得る。
を濃縮する単純な膜ベースの方法である。この技術は、標的配列の存在または非
存在を測定するのに有用であり、試料と平行して既知標的レベルを含む標準物質
を分析し、デンシトメーター技術で検出生成物を定量することにより定量的適用
に適合化され得る。さらに、各試料「ドット」は膜全体の小さな領域を占めるに
すぎないため、多数の試料が一緒に検定され得る。
【００５８】 ＤＮＡ／ＲＮＡ断片をゲルにより分離した後膜へ移す、サザーンまたはノーザ
ン・ブロットとは異なり、ドット・ブロットの場合上記段階は全く要求されない
。膜に試料全体を固定した後、サザーンおよびノーザン・ブロットに使用したの
と同じ方法を用いて標的配列に特異的な標識クロスリンカー含有プローブをハイ
ブリダイゼーションし、標的に架橋させる。架橋生成物の検出もまた同じ方法で
行なわれる。
ン・ブロットとは異なり、ドット・ブロットの場合上記段階は全く要求されない
。膜に試料全体を固定した後、サザーンおよびノーザン・ブロットに使用したの
と同じ方法を用いて標的配列に特異的な標識クロスリンカー含有プローブをハイ
ブリダイゼーションし、標的に架橋させる。架橋生成物の検出もまた同じ方法で
行なわれる。
【００５９】 本発明の別の態様では、生物学的試料において標識核酸プローブを標的核酸分
子とハイブリダイズさせる方法に改良を加える。この改良では、核酸プローブお
よび標的１本鎖ＤＮＡ間に共有結合的架橋を形成し得る架橋分子を有する核酸プ
ローブを使用し、核酸プローブおよび標的ＤＮＡ分子間に共有結合を形成する追
加段階が行なわれる。
子とハイブリダイズさせる方法に改良を加える。この改良では、核酸プローブお
よび標的１本鎖ＤＮＡ間に共有結合的架橋を形成し得る架橋分子を有する核酸プ
ローブを使用し、核酸プローブおよび標的ＤＮＡ分子間に共有結合を形成する追
加段階が行なわれる。
【００６０】 本発明のさらに別の態様では、核酸プローブを基質に固定された標的核酸分子
とハイブリダイズする方法に改良を加える。この方法では、プローブおよび標的
間に共有結合架橋を形成し得る架橋形成部分を有する核酸プローブを使用し、共
有結合架橋を形成する段階を遂行した後、検出段階前に非結合核酸分子が基質か
らはね返され除去されるように基質全体に電場を適用する。
とハイブリダイズする方法に改良を加える。この方法では、プローブおよび標的
間に共有結合架橋を形成し得る架橋形成部分を有する核酸プローブを使用し、共
有結合架橋を形成する段階を遂行した後、検出段階前に非結合核酸分子が基質か
らはね返され除去されるように基質全体に電場を適用する。
【００６１】 本発明のさらに別の態様では、ナイロン膜またはニトロセルロース紙（または
その他）に固定させた標的核酸分子と核酸プローブをハイブリダイズする方法に
改良を加える。この方法では、核酸プローブおよび標的１本鎖ＤＮＡ間に共有結
合架橋を形成し得る架橋部分を有する核酸プローブを使用し、核酸プローブおよ
び標的ＤＮＡ分子間に共有結合を形成する追加的段階を遂行する。
その他）に固定させた標的核酸分子と核酸プローブをハイブリダイズする方法に
改良を加える。この方法では、核酸プローブおよび標的１本鎖ＤＮＡ間に共有結
合架橋を形成し得る架橋部分を有する核酸プローブを使用し、核酸プローブおよ
び標的ＤＮＡ分子間に共有結合を形成する追加的段階を遂行する。
【００６２】 本発明の別の態様は、患者の病状を診断する方法を提供する。この方法はまた
、核酸プローブおよび標的核酸間に共有結合架橋を形成し得る架橋部分を含む標
識核酸プローブの使用を含む。この方法は、次の段階：患者からの固定化試料に
標識核酸プローブ含有溶液を接触させることにより、標識核酸プローブは病状の
指標である標的核酸分子とハイブリダイズし得、核酸プローブおよび標的核酸分
子間に共有結合を形成させ、固定化生物学的試料を洗浄することにより標的核酸
分子に結合していない標識核酸プローブを除去し、そして固定化生物学的試料部
位に保持された標識核酸プローブの量を測定することを含む。この方法は、所望
によりさらに、最終段階前に、標的核酸分子に共有結合していない標識核酸プロ
ーブを除去する追加段階を含み得る。
、核酸プローブおよび標的核酸間に共有結合架橋を形成し得る架橋部分を含む標
識核酸プローブの使用を含む。この方法は、次の段階：患者からの固定化試料に
標識核酸プローブ含有溶液を接触させることにより、標識核酸プローブは病状の
指標である標的核酸分子とハイブリダイズし得、核酸プローブおよび標的核酸分
子間に共有結合を形成させ、固定化生物学的試料を洗浄することにより標的核酸
分子に結合していない標識核酸プローブを除去し、そして固定化生物学的試料部
位に保持された標識核酸プローブの量を測定することを含む。この方法は、所望
によりさらに、最終段階前に、標的核酸分子に共有結合していない標識核酸プロ
ーブを除去する追加段階を含み得る。
【００６３】 別の態様では、本発明方法実施用キットも提供される。
【００６４】 生物学的試料の標的核酸分子の存在を測定するキットは、標的核酸分子の特定
領域と本質的に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブおよび標的核酸分子間に
共有結合架橋を形成し得る架橋部分を有する核酸プローブおよび非特異的結合し
ている核酸プローブまたは標的を除去する手段を含む。過剰の核酸を除去する手
段は、典型的には製造された洗浄液の１つまたはそれ以上の容器により構成され
る。洗浄液は、水、緩衝低塩溶液、緩衝高塩溶液、尿素溶液、アルカリ性溶液な
どであり得る。かかる洗浄液は、当業者には周知である。
領域と本質的に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブおよび標的核酸分子間に
共有結合架橋を形成し得る架橋部分を有する核酸プローブおよび非特異的結合し
ている核酸プローブまたは標的を除去する手段を含む。過剰の核酸を除去する手
段は、典型的には製造された洗浄液の１つまたはそれ以上の容器により構成され
る。洗浄液は、水、緩衝低塩溶液、緩衝高塩溶液、尿素溶液、アルカリ性溶液な
どであり得る。かかる洗浄液は、当業者には周知である。
【００６５】 ナイロン膜またはニトロセルロース紙に固定された標的核酸分子の存在を測定
するキットもまた提供される。このキットは、標的核酸分子の特定領域と本質的
に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブおよび標的核酸間に共有結合架橋を形
成し得る架橋部分を有する核酸プローブを含む。このキットはまた、標的核酸に
結合していない核酸プローブの除去手段を含む。
するキットもまた提供される。このキットは、標的核酸分子の特定領域と本質的
に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブおよび標的核酸間に共有結合架橋を形
成し得る架橋部分を有する核酸プローブを含む。このキットはまた、標的核酸に
結合していない核酸プローブの除去手段を含む。
【００６６】 このキットはまた、所望によりさらに標的核酸分子に共有結合していない核酸
プローブを除去する手段を含む。ハイブリダイズした核酸分子間の水素結合を破
壊し得る変性（誘発）洗浄液は、標的核酸分子に共有結合していない核酸プロー
ブを除去するのに適した手段である。また、かかる洗浄溶液も当業者にはよく知
られている。
プローブを除去する手段を含む。ハイブリダイズした核酸分子間の水素結合を破
壊し得る変性（誘発）洗浄液は、標的核酸分子に共有結合していない核酸プロー
ブを除去するのに適した手段である。また、かかる洗浄溶液も当業者にはよく知
られている。
【００６７】 別の態様において、このキットはさらに上記核酸プローブ標識手段を含み得る
。
。
【００６８】 本発明はまた、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアレイ適用法にお
ける使用に適している。これらの遺伝子チップ適用法の場合、典型的には短いオ
リゴヌクレオチドまたは長いアンプリコン生成物であり得るプローブは、配列し
たパターンで基質表面に結合しており、試料からの標的ＤＮＡまたはＲＮＡ含有
溶液に暴露される。
ける使用に適している。これらの遺伝子チップ適用法の場合、典型的には短いオ
リゴヌクレオチドまたは長いアンプリコン生成物であり得るプローブは、配列し
たパターンで基質表面に結合しており、試料からの標的ＤＮＡまたはＲＮＡ含有
溶液に暴露される。
【００６９】 遺伝子チップは、主としてハイブリッド形成による配列決定、遺伝子発現プロ
フィーリングおよび単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）分類に使用される。ハイ
ブリッド形成による配列決定技術は、未知領域の配列決定ではなく既知遺伝子配
列内における突然変異分析のための再配列決定に最適である。突然変異およびＳ
ＮＰ分析の場合、僅かな差異、例えば単一ヌクレオチド誤対合を識別することが
必要である。これらのチップはまた、典型的には８〜２０塩基長の短いプローブ
を使用する。これら両理由のため、非特異的結合物質および誤対合ハイブリッド
を洗い流しながら適切なプローブ／標的ハイブリッドを選択的に維持することは
、洗浄ストリンジェンシーの微妙な調節を必要とする。クロスリンカー含有プロ
ーブを用いた場合、一旦ハイブリッドが形成されると、プローブ／標的ハイブリ
ッドを一緒に共有結合させることによりこれらの困難が排除され、かつ依然とし
て単一塩基識別も行われ得る。
フィーリングおよび単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）分類に使用される。ハイ
ブリッド形成による配列決定技術は、未知領域の配列決定ではなく既知遺伝子配
列内における突然変異分析のための再配列決定に最適である。突然変異およびＳ
ＮＰ分析の場合、僅かな差異、例えば単一ヌクレオチド誤対合を識別することが
必要である。これらのチップはまた、典型的には８〜２０塩基長の短いプローブ
を使用する。これら両理由のため、非特異的結合物質および誤対合ハイブリッド
を洗い流しながら適切なプローブ／標的ハイブリッドを選択的に維持することは
、洗浄ストリンジェンシーの微妙な調節を必要とする。クロスリンカー含有プロ
ーブを用いた場合、一旦ハイブリッドが形成されると、プローブ／標的ハイブリ
ッドを一緒に共有結合させることによりこれらの困難が排除され、かつ依然とし
て単一塩基識別も行われ得る。
【００７０】 本発明は、固体支持体および固体支持体に固定された複数の異なる核酸プロー
ブを含むアレイを提供し、各核酸プローブは、標的核酸分子の特定領域と本質的
に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブおよび標的核酸分子間に共有結合架橋
を形成し得る架橋部分を有するものとする。
ブを含むアレイを提供し、各核酸プローブは、標的核酸分子の特定領域と本質的
に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブおよび標的核酸分子間に共有結合架橋
を形成し得る架橋部分を有するものとする。
【００７１】 標的核酸分子は、動物、細菌、真菌、ヒト、寄生虫、植物またはウイルス核酸
であり得る。他の可能な標的配列は上記で列挙されている。
であり得る。他の可能な標的配列は上記で列挙されている。
【００７２】 アレイのプローブで使用される架橋部分の前駆体は、クマリン、フロクマリン
およびベンゾジピロンから成る群から選択され得る。例えば、架橋部分に関して
可能なもとのしては、７−ヒドロキシクマリン、６,７−ジヒドロキシクマリン
、６−アルコキシ−７−ヒドロキシクマリン、ソラレン、８−メトキシソラレン
、５−メトキシソラレン、４,５',,８−トリメチルソラレン、４'−ヒドロキシ
メチル−４,５',,８−トリメチルソラレン、および４'−アミノメチル−４,５',
,８−トリメチルソラレン、ハロアルキルクマリン、およびハロアルキルベンゾ
ジピロンがある。上記引用の米国特許（固定化生物学的試料における標的核酸分
子の存在を測定する方法と連係的）は、本発明アレイでの使用に等しく適した架
橋化合物を開示している。
およびベンゾジピロンから成る群から選択され得る。例えば、架橋部分に関して
可能なもとのしては、７−ヒドロキシクマリン、６,７−ジヒドロキシクマリン
、６−アルコキシ−７−ヒドロキシクマリン、ソラレン、８−メトキシソラレン
、５−メトキシソラレン、４,５',,８−トリメチルソラレン、４'−ヒドロキシ
メチル−４,５',,８−トリメチルソラレン、および４'−アミノメチル−４,５',
,８−トリメチルソラレン、ハロアルキルクマリン、およびハロアルキルベンゾ
ジピロンがある。上記引用の米国特許（固定化生物学的試料における標的核酸分
子の存在を測定する方法と連係的）は、本発明アレイでの使用に等しく適した架
橋化合物を開示している。
【００７３】 架橋分子含有プローブは、チップにおける特異的アレイ位置内で直接的に、ま
たはチップの標準的方法により合成され、次いで特異領域内で結合されることに
より遺伝子チップアレイが作成され得る。本発明に適合可能なオリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドアレイの製造方法の例は、米国特許第５７００６３７
および５７４４３０５号に記載されており、これらは出典明示により本明細書の
一部とする。固体支持体材料は、好ましくはガラス、珪素、ポリアクリレートで
ある。しかしながら、伝導性ポリマーまたはバイオポリマーを含め、例えば様々
な金属およびポリマーといった他の可能性も存在する。
たはチップの標準的方法により合成され、次いで特異領域内で結合されることに
より遺伝子チップアレイが作成され得る。本発明に適合可能なオリゴヌクレオチ
ドおよびポリヌクレオチドアレイの製造方法の例は、米国特許第５７００６３７
および５７４４３０５号に記載されており、これらは出典明示により本明細書の
一部とする。固体支持体材料は、好ましくはガラス、珪素、ポリアクリレートで
ある。しかしながら、伝導性ポリマーまたはバイオポリマーを含め、例えば様々
な金属およびポリマーといった他の可能性も存在する。
【００７４】 チップを標的核酸含有試料溶液に暴露する。所望のストリンジェンシー条件下
でハイブリダイゼーション後、チップにＵＶまたは可視光線を照射することによ
り架橋反応を開始させる。それに続いて、チップを非常に高いストリンジェンシ
ーの溶液で洗浄することにより、架橋プローブ／標的ハイブリッドを失う危険を
伴わずに非特異的結合プローブおよび他の汚染物質が除去され得る。
でハイブリダイゼーション後、チップにＵＶまたは可視光線を照射することによ
り架橋反応を開始させる。それに続いて、チップを非常に高いストリンジェンシ
ーの溶液で洗浄することにより、架橋プローブ／標的ハイブリッドを失う危険を
伴わずに非特異的結合プローブおよび他の汚染物質が除去され得る。
【００７５】 クロスリンカー含有プローブは、液中ハイブリッド形成アッセイで標的配列に
おける単一塩基多型性部位間で識別できることが報告されている。（Zehnderら
、Clinical Chemistry １９９７ ４３：１７０３−１７０８）。
おける単一塩基多型性部位間で識別できることが報告されている。（Zehnderら
、Clinical Chemistry １９９７ ４３：１７０３−１７０８）。
【００７６】 遺伝子発現プロフィーリングは、典型的にはチップ結合プローブとして長いＤ
ＮＡアンプリコンを使用する。発現されたｍＲＮＡはプローブのアレイ内でそれ
らの相補体に結合し、シグナル強度は各ｍＲＮＡの相対量、従ってその遺伝子の
発現レベルを反映する。生成された相対強度地図は、一細胞における遺伝的活性
のプロフィールを説明している。これらの結果の適切な評価にとって重要なのは
、シグナル対ノイズ比およびチップへのｍＲＮＡの非特異的吸着から生じる誤っ
たシグナルが存在しないことである。これらのパラメーターは、固定化核酸アッ
セイの場合と同じである。クロスリンカー含有プローブがその場で行う ハイブ
リッド形成アッセイを改善することが立証されたのと同様に、遺伝子チップ技術
についても類似した改善が為され得る。
ＮＡアンプリコンを使用する。発現されたｍＲＮＡはプローブのアレイ内でそれ
らの相補体に結合し、シグナル強度は各ｍＲＮＡの相対量、従ってその遺伝子の
発現レベルを反映する。生成された相対強度地図は、一細胞における遺伝的活性
のプロフィールを説明している。これらの結果の適切な評価にとって重要なのは
、シグナル対ノイズ比およびチップへのｍＲＮＡの非特異的吸着から生じる誤っ
たシグナルが存在しないことである。これらのパラメーターは、固定化核酸アッ
セイの場合と同じである。クロスリンカー含有プローブがその場で行う ハイブ
リッド形成アッセイを改善することが立証されたのと同様に、遺伝子チップ技術
についても類似した改善が為され得る。
【００７７】 アレイ自体に加えて、本発明はまた、生物学的試料における複数の標的核酸分
子の存在を測定する方法を提供する。かかる一方法は、次の段階：試料をアレイ
と接触させることにより、標的核酸分子を固定化核酸プローブとハイブリダイズ
させ、核酸プローブおよびそれらのハイブリダイズした標的核酸分子間に共有結
合を形成させ、アレイを洗浄して過剰の核酸分子を除去し、そしてアレイに結合
したままの核酸分子の量および位置を測定することを含む。この方法はまた、所
望により共有結合していないかまたは標的核酸分子に非特異的結合している核酸
分子を除去する段階を含み得る。
子の存在を測定する方法を提供する。かかる一方法は、次の段階：試料をアレイ
と接触させることにより、標的核酸分子を固定化核酸プローブとハイブリダイズ
させ、核酸プローブおよびそれらのハイブリダイズした標的核酸分子間に共有結
合を形成させ、アレイを洗浄して過剰の核酸分子を除去し、そしてアレイに結合
したままの核酸分子の量および位置を測定することを含む。この方法はまた、所
望により共有結合していないかまたは標的核酸分子に非特異的結合している核酸
分子を除去する段階を含み得る。
【００７８】 核酸分子の量および位置の測定は、若干の方法により実施され得る。例えば、
アレイに適用される生物学的試料におけるポリヌクレオチドは、当業者にはよく
知られている若干の上記方法のいずれかにより標識され得る。（上記検討参照）
。生物学的試料中のポリヌクレオチド全てが標識された場合、この方法の最後に
アレイに結合されたままである標識ポリヌクレオチドは、標的核酸分子として同
定され得る。
アレイに適用される生物学的試料におけるポリヌクレオチドは、当業者にはよく
知られている若干の上記方法のいずれかにより標識され得る。（上記検討参照）
。生物学的試料中のポリヌクレオチド全てが標識された場合、この方法の最後に
アレイに結合されたままである標識ポリヌクレオチドは、標的核酸分子として同
定され得る。
【００７９】 この方法で使用されている架橋部分の性質により、標的核酸および核酸プロー
ブ間における架橋の形成は、光化学的または化学的であり得る。
ブ間における架橋の形成は、光化学的または化学的であり得る。
【００８０】 本発明アレイを用いて病気を診断する類似方法もまた提供される。患者におけ
る病状の診断方法は、まず患者からの試料をアレイと接触させ、そこで病状の指
標である標的核酸分子は固定化核酸プローブとハイブリダイズし得る。この方法
はまた、核酸プローブおよびハイブリダイズした標的核酸分子間で行なわれる共
有結合の形成を誘発することを含む。また、アレイを洗浄して過剰の核酸分子を
除去することも重要である。最終段階として、アレイに結合したままの標的核酸
分子の量および位置を測定する。この方法はまた、所望によりストリンジェント
洗浄または電場誘導による脱着により、標的核酸分子に共有結合していないかま
たは非特異結合している核酸分子を除去する中間段階を含み得る。
る病状の診断方法は、まず患者からの試料をアレイと接触させ、そこで病状の指
標である標的核酸分子は固定化核酸プローブとハイブリダイズし得る。この方法
はまた、核酸プローブおよびハイブリダイズした標的核酸分子間で行なわれる共
有結合の形成を誘発することを含む。また、アレイを洗浄して過剰の核酸分子を
除去することも重要である。最終段階として、アレイに結合したままの標的核酸
分子の量および位置を測定する。この方法はまた、所望によりストリンジェント
洗浄または電場誘導による脱着により、標的核酸分子に共有結合していないかま
たは非特異結合している核酸分子を除去する中間段階を含み得る。
【００８１】 本発明の別の態様は、患者の遺伝子型の測定方法であって、特に幾つかの多型
性配列またはヌクレオチドのいずれが存在するかを測定することに関する方法を
提供する。多型性配列を含む一連のオリゴヌクレオチドプローブにより構成され
るアレイを製造し、試料をアレイと接触させる。次いで、この方法を上記と同じ
要領で実施する。
性配列またはヌクレオチドのいずれが存在するかを測定することに関する方法を
提供する。多型性配列を含む一連のオリゴヌクレオチドプローブにより構成され
るアレイを製造し、試料をアレイと接触させる。次いで、この方法を上記と同じ
要領で実施する。
【００８２】 以下の実施態様は、本発明の説明を意図しており、請求の範囲を制限するもの
として見なされるべきではない。
として見なされるべきではない。
【００８３】 実施例１。 クロスリンカー含有プローブを用いる細胞のその場で行うハイブ
リッド形成。 細胞を患者から集め、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０００gで沈澱
させる。細胞をＰＢＳに再懸濁して１０６／mLの濃度にし、１０μLアリコート
をスライドに点在させ、次いで風乾する。細胞を室温で２０分間４％パラホルム
アルデヒドに固定し、水で１回すすぐ。細胞を７０％、８０％および１００％エ
タノール中での連続浸漬により脱水し、風乾する。
リッド形成。 細胞を患者から集め、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、１０００gで沈澱
させる。細胞をＰＢＳに再懸濁して１０６／mLの濃度にし、１０μLアリコート
をスライドに点在させ、次いで風乾する。細胞を室温で２０分間４％パラホルム
アルデヒドに固定し、水で１回すすぐ。細胞を７０％、８０％および１００％エ
タノール中での連続浸漬により脱水し、風乾する。
【００８４】 固定化細胞を３７℃で２０分間ＰＢＳ中プロテイナーゼＫにより処理し、水で
すすぐ。次に細胞を室温で１０分間０.１モルトリエタノールアミン（ｐＨ８）
中無水酢酸により処理し、水ですすぐ。細胞を上記要領により、エタノールで脱
水し、次に６５℃で１５分間０.１×クエン酸ナトリウム食塩水（ＳＳＣ）中９
０％ホルムアミドで処理することにより、核酸を変性させる。細胞を水ですすぎ
、再びエタノールで脱水する。
すすぐ。次に細胞を室温で１０分間０.１モルトリエタノールアミン（ｐＨ８）
中無水酢酸により処理し、水ですすぐ。細胞を上記要領により、エタノールで脱
水し、次に６５℃で１５分間０.１×クエン酸ナトリウム食塩水（ＳＳＣ）中９
０％ホルムアミドで処理することにより、核酸を変性させる。細胞を水ですすぎ
、再びエタノールで脱水する。
【００８５】 ２０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ、１０％デキストランスルフェート、２０ミ
リモルＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１×デンハート溶液、２００μg／mL子牛胸腺Ｄ
ＮＡ中３７℃で１時間クロスリンカー含有ＤＮＡプローブによりハイブリッド形
成を行わせる。スライドを３７℃で２×ＳＳＣおよび０.０５％トウィーン（商
標）により簡単に洗浄し、次に３７℃で１５分間ＵＶ光源（３００−３７０nm）
により照射する。架橋後洗浄を１５分間各々２×ＳＳＣ／０.０５％トウィーン
２０により６０℃で３回行う。
リモルＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.４、１×デンハート溶液、２００μg／mL子牛胸腺Ｄ
ＮＡ中３７℃で１時間クロスリンカー含有ＤＮＡプローブによりハイブリッド形
成を行わせる。スライドを３７℃で２×ＳＳＣおよび０.０５％トウィーン（商
標）により簡単に洗浄し、次に３７℃で１５分間ＵＶ光源（３００−３７０nm）
により照射する。架橋後洗浄を１５分間各々２×ＳＳＣ／０.０５％トウィーン
２０により６０℃で３回行う。
【００８６】 架橋したハイブリッドを検出するため、固定化細胞を室温で１５分間０.１モ
ルのトリス（ｐＨ７.４）、０.１５モルのＮａＣｌ、０.０５％トウィーン２０
（ＴＮＴ）において平衡状態にし、次に室温で４５分間０.０５％の遮断性試薬
を含有する０.１モルのトリス（ｐＨ７.４）、０.１５モルのＮａＣｌにより遮
断する。結合したハイブリッドを、室温で３０分インキュベーション中２００μ
Lの抗フルオレセイン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識し、
室温でＴＮＴにより４回洗浄し、次に室温で１０分間１２０μLのビオチニルチ
ラミドとインキュベーションする。スライドをＴＮＴ中で４回洗浄し、室温で３
０分間ＳＡ−ＨＲＰとインキュベーションし、ＴＮＴで４回洗浄し、室温で１０
分間１２０μLのＣｙ３−チラミドとインキュベーションし、再びＴＮＴ中で洗
浄する。細胞を５μg／mLのＤＡＰＩにより対比染色し、ベクタシールド（商標
）により固定し、発蛍光団および対比染色に必要な励起および放射フィルターを
備えた蛍光顕微鏡下で視覚化する。
ルのトリス（ｐＨ７.４）、０.１５モルのＮａＣｌ、０.０５％トウィーン２０
（ＴＮＴ）において平衡状態にし、次に室温で４５分間０.０５％の遮断性試薬
を含有する０.１モルのトリス（ｐＨ７.４）、０.１５モルのＮａＣｌにより遮
断する。結合したハイブリッドを、室温で３０分インキュベーション中２００μ
Lの抗フルオレセイン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）により標識し、
室温でＴＮＴにより４回洗浄し、次に室温で１０分間１２０μLのビオチニルチ
ラミドとインキュベーションする。スライドをＴＮＴ中で４回洗浄し、室温で３
０分間ＳＡ−ＨＲＰとインキュベーションし、ＴＮＴで４回洗浄し、室温で１０
分間１２０μLのＣｙ３−チラミドとインキュベーションし、再びＴＮＴ中で洗
浄する。細胞を５μg／mLのＤＡＰＩにより対比染色し、ベクタシールド（商標
）により固定し、発蛍光団および対比染色に必要な励起および放射フィルターを
備えた蛍光顕微鏡下で視覚化する。
【００８７】 実施例２。 細胞におけるヒト乳頭腫ウイルス１６型の検出。 その場で行うハイブリッド形成実験を行うことにより、架橋可能なプローブの
有用性を立証した。標的生物体はヒト乳頭腫ウイルス１６型であった。プローブ
配列は、表１の配列番号１−１４である。２タイプのセルライン、すなわちＣａ
Ｓｋｉ細胞およびＣ−３３細胞を実験では使用した。ＣａＳｋｉ細胞は、〜５０
０コピーのウイルスゲノムを含み、Ｃ−３３細胞はウイルスゲノムを含まず、陰
性対照として使用された。
有用性を立証した。標的生物体はヒト乳頭腫ウイルス１６型であった。プローブ
配列は、表１の配列番号１−１４である。２タイプのセルライン、すなわちＣａ
Ｓｋｉ細胞およびＣ−３３細胞を実験では使用した。ＣａＳｋｉ細胞は、〜５０
０コピーのウイルスゲノムを含み、Ｃ−３３細胞はウイルスゲノムを含まず、陰
性対照として使用された。
【００８８】 各細胞タイプをスライドに固定し、上記実施例１で詳述したのと同じ予備処理
およびハイブリッド形成プロトコルに従い処理した。次いで、各細胞タイプのう
ち幾つかの試料にはＵＶ光線を照射して上記と同様架橋形成反応を開始させ、他
の試料についてはＵＶ光線に暴露せずにインキュベーションした。それに続いて
、全試料を上記実施例１で詳述したのと同じ洗浄および検出プロトコルに従い処
理した。
およびハイブリッド形成プロトコルに従い処理した。次いで、各細胞タイプのう
ち幾つかの試料にはＵＶ光線を照射して上記と同様架橋形成反応を開始させ、他
の試料についてはＵＶ光線に暴露せずにインキュベーションした。それに続いて
、全試料を上記実施例１で詳述したのと同じ洗浄および検出プロトコルに従い処
理した。
【００８９】 図１の画像は、実験結果を明らかにしている。これらの画像は、ＨＰＶ１６に
特異的な抗原標識オリゴヌクレオチドプローブに関する間接的検出方法により沈
澱した、染料Ｃｙ−３からの蛍光放射を表す。図１ａは、低拡大倍率下、架橋形
成した場合のＣａＳｋｉ細胞を示す。図１ｂは、低拡大倍率下、架橋形成してい
ない場合のＣａＳｋｉ細胞を示す。図１ｃは、低拡大倍率下、架橋形成した場合
のＣ−３３細胞を示す。
特異的な抗原標識オリゴヌクレオチドプローブに関する間接的検出方法により沈
澱した、染料Ｃｙ−３からの蛍光放射を表す。図１ａは、低拡大倍率下、架橋形
成した場合のＣａＳｋｉ細胞を示す。図１ｂは、低拡大倍率下、架橋形成してい
ない場合のＣａＳｋｉ細胞を示す。図１ｃは、低拡大倍率下、架橋形成した場合
のＣ−３３細胞を示す。
【００９０】 ハイブリッド形成方法は、ヒト乳頭腫ウイルスを含む細胞（図１ａおよび１ｂ
）および含まない細胞（図１ｃ）間では明らかに区別されている。図１ｃの画像
における造影閾値を低い値に調節することにより、低レベルのシグナルであって
も見出され、均一なバックグラウンドシグナルのみが観察された。図１ａは、ヒ
ト乳頭腫ウイルス含有細胞ではプローブが核に特異的に局在し、強いシグナルを
提供することを示している。
）および含まない細胞（図１ｃ）間では明らかに区別されている。図１ｃの画像
における造影閾値を低い値に調節することにより、低レベルのシグナルであって
も見出され、均一なバックグラウンドシグナルのみが観察された。図１ａは、ヒ
ト乳頭腫ウイルス含有細胞ではプローブが核に特異的に局在し、強いシグナルを
提供することを示している。
【００９１】 図１ａ（架橋プローブ）および図１ｂ（架橋無し）間のシグナル強度の差異は
非常に明白である。架橋形成している場合、プローブ／標的ハイブリッドは保持
されているため、シグナル発生に寄与するが、架橋形成していない場合ハイブリ
ッドは洗い流されて存在しないため、シグナル発生に寄与することはない。
非常に明白である。架橋形成している場合、プローブ／標的ハイブリッドは保持
されているため、シグナル発生に寄与するが、架橋形成していない場合ハイブリ
ッドは洗い流されて存在しないため、シグナル発生に寄与することはない。
【００９２】 類似実験における上記スライドの画像分析は、１桁を越える全体的シグナル強
度の差異を表していた。
度の差異を表していた。
【００９３】 実施例３。クロスリンカー含有プローブを用いた組織片のその場で行うハイブ
リッド形成。 試料タイプが組織片である場合、まず薄い（５μm）組織片をパラフィン埋封
組織塊から切断し、次いでガラス製スライドに固定する。埋封組織をキシレン中
５分浸漬２回によりパラフィン除去し、１００％エタノール中で２回洗浄し、風
乾する。この後の検定方法は、パラホルムアルデヒド固定段階から出発する、細
胞ベースのその場で行うハイブリッド形成の場合と同じである（上記実施例１参
照）。
リッド形成。 試料タイプが組織片である場合、まず薄い（５μm）組織片をパラフィン埋封
組織塊から切断し、次いでガラス製スライドに固定する。埋封組織をキシレン中
５分浸漬２回によりパラフィン除去し、１００％エタノール中で２回洗浄し、風
乾する。この後の検定方法は、パラホルムアルデヒド固定段階から出発する、細
胞ベースのその場で行うハイブリッド形成の場合と同じである（上記実施例１参
照）。
【００９４】 実施例４。臨床標本におけるヒト乳頭腫ウイルス１６ＤＮＡに関するその場で
行うハイブリッドアッセイ。 ２患者からのパパニコラウスミア試料を集め、緩衝メタノール溶液（プリザー
ブＣｙｔ（商標）溶液、ＣＹＴＹＣコーポレーションから）中へ入れる。この溶
液数滴をポリ−Ｌ−リシン被覆スライド（ニューカマー・サプライ）へ点在させ
、放置乾燥する。
行うハイブリッドアッセイ。 ２患者からのパパニコラウスミア試料を集め、緩衝メタノール溶液（プリザー
ブＣｙｔ（商標）溶液、ＣＹＴＹＣコーポレーションから）中へ入れる。この溶
液数滴をポリ−Ｌ−リシン被覆スライド（ニューカマー・サプライ）へ点在させ
、放置乾燥する。
【００９５】 固定化細胞を、３７℃で２０分間２０ミリモルのＨＣｌ中ペプシン（５０μg
／mL）により処理し、次いで水によりすすいだ。次いで、実施例１記載の検定方
法に従った。１検定につき１０ピコモルの総プローブ量（各プローブ０.５８８
ピコモル）を用いて、１７核酸プローブ、配列番号１、３、４、５、６、７、８
、９、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１により検定
を行った。
／mL）により処理し、次いで水によりすすいだ。次いで、実施例１記載の検定方
法に従った。１検定につき１０ピコモルの総プローブ量（各プローブ０.５８８
ピコモル）を用いて、１７核酸プローブ、配列番号１、３、４、５、６、７、８
、９、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１により検定
を行った。
【００９６】 蛍光顕微鏡を用いた検定試験は、試料１がＨＰＶ１６ＤＮＡについて陽性であ
り、試料２が陰性であることを示した。
り、試料２が陰性であることを示した。
【００９７】 また、ＰＣＲ方法を用いて、スライドに固定していない同じ患者試料からの細
胞をＨＰＶ１６について試験した。ＰＣＲ試験による結果は、その場で行うハイ
ブリッド形成アッセイにより得られた結果と相関関係を示していた。
胞をＨＰＶ１６について試験した。ＰＣＲ試験による結果は、その場で行うハイ
ブリッド形成アッセイにより得られた結果と相関関係を示していた。
【００９８】 上記明細書で引用された文献はすべて、出典明示により本明細書の一部とする
。本発明の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱しない限
り当業者にとっては明白なものである。本発明を好ましい実施態様と関連させて
説明したが、主張されている発明が過度にかかる実施態様に限定されるべきでは
ないものと理解すべきである。事実、当業者にとって明白な上記本発明実施方法
の様々な修正も請求の範囲内に含まれるものとする。
。本発明の様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱しない限
り当業者にとっては明白なものである。本発明を好ましい実施態様と関連させて
説明したが、主張されている発明が過度にかかる実施態様に限定されるべきでは
ないものと理解すべきである。事実、当業者にとって明白な上記本発明実施方法
の様々な修正も請求の範囲内に含まれるものとする。
【００９９】 表１ ヒトパピローマウイルスタイプ １６ Ｅ６およびＥ７遺伝子中の配列のプローブ相補性 実施例２のプローブ：１−１４ 実施例４のプローブ：１,３,４,５,６,７,８,９,１２,１４,１５,１６,１７,１
８,１９,２０,２１
８,１９,２０,２１
【表１】
【表２】 Ｘ=クロスリンカー=３-Ｏ-(７-クマリニル)グリセロール Ｆ=フルオレセイン
【図１Ａ−１Ｃ】 図１ａ−１ｃは、架橋形成を誘導するためのＵＶ照射を
実施および実施せずに、架橋部分を含むプローブによりヒト乳頭腫ウイルスの存
在についてその場で行うハイブリッド形成により検定された細胞を示す。
実施および実施せずに、架橋部分を含むプローブによりヒト乳頭腫ウイルスの存
在についてその場で行うハイブリッド形成により検定された細胞を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年５月１４日（２００１．５．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/566 33/53 33/58 Ａ 33/566 37/00 １０２ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 37/00 １０２ Ａ Ｆ (72)発明者 マイケル・エル・ウッド アメリカ合衆国94043カリフォルニア州マ ウンテン・ビュー、ティレラ・コート36番 (72)発明者 リュール・ビー・バン・アッタ アメリカ合衆国94043カリフォルニア州マ ウンテン・ビュー、サイプレス・ポイン ト・ドライブ・ナンバー224、505番 (72)発明者 ピーター・シー・チェン アメリカ合衆国95132カリフォルニア州サ ンノゼ、ロバロ・コート1162番 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BA13 BA20 BB22 BB29 BB46 CB01 CB17 CB20 CB21 DA12 DA13 DA14 DA80 FA20 FA26 FA27 FB02 FB05 FB07 FB12 FB16 FB17 JA09 JA20 4B024 AA11 AA14 CA01 CA09 CA11 HA14 4B029 AA07 AA21 BB01 BB02 BB06 BB11 BB13 BB20 CC03 CC11 FA01 FA15 4B033 NA02 NA11 NA12 NA13 NA15 NA45 NB12 NB34 NB45 NB63 NC04 ND05 ND20 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ05 QQ06 QQ07 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52 QR32 QR35 QR56 QR66 QR79 QR84 QS34 QS36 QX02
Claims (40)
- 【請求項１】 プローブまたは標的生物学的試料分子の一方が固定化されて
いる、生物学的試料における標的核酸分子の存在を測定する方法であって、 （ａ）核酸プローブを生物学的試料と接触させること、但し、該核酸プローブ
は生物学的試料中の標的核酸分子とハイブリダイズし、そして該核酸プローブは
、核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合架橋を形成し得る架橋部分を含
むものである、 （ｂ）該核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合を形成させること、 （ｃ）洗浄して、過剰の可動プローブまたは標的を除去すること、および （ｄ）架橋した核酸プローブ標的複合体の量を測定すること、 を含む方法。 - 【請求項２】 複数の異なる核酸プローブおよび標的分子を含む、請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 単一標的分子に関し複数の異なる核酸プローブを含む、請求
項１に記載の方法。 - 【請求項４】 生物学的試料が固定化されている、請求項１に記載の方法。
- 【請求項５】 さらに、生物学的試料内で核酸ハイブリダイゼーションを崩
壊させる段階を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 生物学的試料が、細胞、細胞レベル下構造、体液または組織
片である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 生物学的試料をスライドに固定化させる、請求項６に記載の
方法。 - 【請求項８】 生物学的試料が核酸分子の一試料である、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項９】 核酸分子の試料がナイロン膜またはニトロセルロース紙に固
定化されている、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 標的核酸分子が、動物、細菌、真菌、ヒト、寄生虫、植物
およびウイルス核酸から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 架橋部分の前駆体が、クマリン、フロクマリンおよびベン
ゾジピロンから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 架橋部分の前駆体が、クマリン、７−ヒドロキシクマリン
、６,７−ジヒドロキシクマリン、４−メチル−７−ヒドロキシ−クマリン、６
−アルコキシ−７−ヒドロキシクマリン、ソラレン、８−メトキシソラレン、５
−メトキシソラレン、４,５',８−トリメチルソラレン、４'−ヒドロキシメチル
−４,５',８−トリメチルソラレン、および４'−アミノメチル−４,５',８−ト
リメチルソラレン、ハロアルキルクマリン、ハロアルキルフロクマリンおよびハ
ロアルキルベンゾジピロンから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 架橋部分が単付加フロクマリン：ヌクレオシド付加物であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 共有結合の形成が光化学的に行われる、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１５】 共有結合の形成が化学的に行われる、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１６】 生物学的試料中の核酸プローブを標的核酸分子とハイブリ
ダイズさせる方法において、 核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合的架橋を形成し得る架橋分子を
有する標識核酸プローブを用い、そして 核酸プローブおよび標的核酸分子間に共有結合を形成させる ことを含む改良。 - 【請求項１７】 患者における病状の診断方法であって、 （ａ）核酸プローブ含有溶液を患者由来の固定化試料に接触させること、ただ
し該核酸プローブは病状の指標である標的核酸分子とハイブリダイズし、そして 標識核酸プローブは核酸プローブと標的核酸との間に共有結合架橋を形成し得
る架橋部分を含むものである、 （ｂ）該核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合を形成させること、 （ｃ）洗浄して過剰のプローブまたは標的核酸分子を除去すること、および （ｄ）形成した核酸プローブ標的複合体の量を測定すること、 を含む方法。 - 【請求項１８】 さらに最終段階前に、共有結合していない核酸プローブま
たは標的を除去する段階を含む、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 核酸プローブを固定化標的核酸分子とハイブリダイズさせ
る方法において、 核酸プローブと標的１本鎖ＤＮＡとの間に共有結合架橋を形成し得る架橋分子
を有する核酸プローブを用い、そして 核酸プローブと標的ＤＮＡ分子との間に共有結合を形成させる ことを含む改良。 - 【請求項２０】 固定化生物学的試料の標的核酸分子の存在を測定するキッ
トであって、 標的核核酸分子の特定領域と本質的に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブ
と標的核酸との間に共有結合架橋を形成し得る架橋部分を有する核酸プローブ、
および 標的核酸分子に結合していない核酸プローブを除去する手段 を含むキット。 - 【請求項２１】 さらに標的核酸分子に共有結合していない核酸プローブを
除去する手段を含む、請求項２０に記載のキット。 - 【請求項２２】 さらに核酸プローブ標識手段を含む、請求項２０に記載の
キット。 - 【請求項２３】 ナイロン膜またはニトロセルロース紙に固定化されている
標的核酸分子の存在を測定するためのキットであって、 標的核酸分子の特定領域と本質的に相補的な塩基配列を有し、核酸プローブと
標的核酸との間に共有結合架橋を形成し得る架橋部分を有する核酸プローブ、お
よび 標的核酸分子に結合していない核酸プローブを除去する手段 を含むキット。 - 【請求項２４】 さらに標的核酸分子に共有結合していない核酸プローブを
除去する手段を含む、請求項２３に記載のキット。 - 【請求項２５】 さらに核酸プローブの標識手段を含む、請求項２３に記載
のキット。 - 【請求項２６】 固体支持体；および 固体支持体に固定化された複数の異なる核酸プローブを含むアレイであって、各
核酸プローブが標的核酸分子の特定領域と本質的に相補的である塩基配列を有し
、核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合架橋を形成させ得る架橋部分を
有するものである、アレイ。 - 【請求項２７】 核酸プローブの少なくとも一つが、動物、細菌、真菌、ヒ
ト、寄生虫、植物およびウイルス核酸から成る群から選択される標的核酸分子と
相補的である、請求項２６に記載のアレイ。 - 【請求項２８】 架橋部分が、クマリン、フロクマリンおよびベンゾジピロ
ンから成る群から選ばれる、請求項２６に記載のアレイ。 - 【請求項２９】 架橋部分が、クマリン、７−ヒドロキシクマリン、６,７
−ジヒドロキシクマリン、６−アルコキシ−７−ヒドロキシクマリン、ソラレン
、８−メトキシソラレン、５−メトキシソラレン、４,５',８−トリメチルソラ
レン、４'−ヒドロキシメチル−４,５',８−トリメチルソラレン、および４'−
アミノメチル−４,５',８−トリメチルソラレン、ハロアルキルクマリン、ハロ
アルキルフロクマリンおよびハロアルキルベンゾジピロンから成る群から選ばれ
る、請求項２６に記載のアレイ。 - 【請求項３０】 架橋部分が単付加フロクマリン：ヌクレオシド付加物であ
る、請求項２６に記載のアレイ。 - 【請求項３１】 生物学的試料における複数の標的核酸分子の存在を測定す
る方法であって、 （ａ）試料を請求項２６に記載のアレイと接触させること、但し、標的核酸分
子は固定化核酸プローブとハイブリダイズするものである、 （ｂ）核酸プローブとそれらのハイブリダイズした標的核酸分子との間に共有
結合を形成させること、 （ｃ）アレイを洗浄して、過剰の核酸分子を除去すること、および （ｄ）アレイに結合したままの核酸分子の量および位置を測定すること、 を含む方法。 - 【請求項３２】 さらにアレイを洗浄して非特異的に結合している核酸分子
を除去する段階を含む、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 さらに基質全域に電場を適用して、非特異的に結合してい
る核酸分子を脱着する段階を含む、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３４】 さらに固定化した生物学的試料内で核酸ハイブリッド形成
を破壊する段階を含む、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３５】 共有結合の形成が光化学的に行なわれる、請求項３１に記
載の方法。 - 【請求項３６】 共有結合の形成が化学的に行われる、請求項３１に記載の
方法。 - 【請求項３７】 患者における病状の診断方法であって、 （ａ）患者由来の試料を請求項２６に記載のアレイと接触させることにより、
病状の指標である標的核酸分子が固定化核酸プローブとハイブリダイズし得るよ
うにすること、 （ｂ）核酸プローブとハイブリダイズした標的核酸分子との間に共有結合を形
成させること、 （ｃ）アレイを洗浄して、非特異的結合核酸分子を除去すること、および （ｄ）アレイに結合したままの標的核酸分子の量および位置を測定すること、 を含む方法。 - 【請求項３８】 最終段階前に、さらに標的核酸分子に共有結合していない
核酸分子を除去する段階を含む、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 患者における多型性配列の遺伝子型を検査する方法であっ
て、 （ａ）核酸プローブ含有溶液を患者由来の固定化試料に接触させること、但し
、該核酸プローブは病状の指標である標的核酸分子とハイブリダイズするもので
あり、さらに 該標識化核酸プローブが核酸プローブと標的核酸との間に共有結合架橋を形成
し得る架橋部分を含むものである、 （ｂ）核酸プローブと標的核酸分子との間に共有結合を形成させること、 （ｃ）洗浄して過剰のプローブまたは標的核酸分子を除去すること、および （ｄ）形成した核酸プローブ標的複合体の量を測定すること を含む方法。 - 【請求項４０】最終段階前に、さらに共有結合していない核酸プローブまた
は標的を除去する段階を含む、請求項３９記載の方法。
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| US13819598A | 1998-08-21 | 1998-08-21 | |
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| PCT/US1999/018950 WO2000014281A2 (en) | 1998-08-21 | 1999-08-23 | Assays using crosslinkable immobilized nucleic acids |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP2000569021A Pending JP2002524091A (ja) | 1998-08-21 | 1999-08-23 | 架橋可能な固定化核酸を用いるアッセイ |
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