DE3804243A1

DE3804243A1 - Teils einzel- und teils doppelstraengige nukleinsaeuresonde und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3804243A1
Application number: DE3804243A
Authority: DE
Inventors: Guenter Prof Dr Valet; Andreas Dipl Chem Oser
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1988-02-11
Filing date: 1988-02-11
Publication date: 1989-08-24
Also published as: WO1989007606A1

Description

Die Erfindung betrifft teils einzel- und teils doppel strängige Nukleinsäuresonden, die in ihrem einzel strängigen Bereich zu einer nachzuweisenden Nuklein säure komplementär sind und an ihren doppelsträngigen Bereich kovalent gebunden eine quervernetzende Verbin dung enthalten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer solchen Nukleinsäure sonde unter Ausbildung eines Hybriddoppelstrangs.

Die Hybridisierung von Nukleinsäuren ist eine weitver breitete Technik sowohl in der Forschung als auch für klinische Anwendung zum Nachweis von spezifischen Nu kleotidsequenzen in DNA oder RNA. Bisher werden hierfür meist radioaktiv markierte DNA-Sonden verwendet. Nicht radioaktive Detektionssysteme schließen entweder direk te Markierung der DNA-Proben durch Fluorochrome oder Enzyme oder indirekte Markierung nach Anbringen einer Gruppe ein, an die wiederum eine andere markierte Gruppe nach erfolgter Hybridisierung gebunden wird. Alle diese Methoden haben jedoch Nachteile. So stellt sich bei Verwendungg von radioaktiv markierten DNA- Sonden das Problem der Instabilität der radioaktiven Verbindungen und der damit im Laufe der Zeit schwächer werdenden Signale sowie das Problem der Sicherheit im Umgang mit radioaktiven Verbindungen. Fluorchrommar kierte DNA-Sonden sind dagegen nicht sensitiv genug. Enzyme können durch stringente Hybridisierungsbedingun gen inaktiviert werden, und aufgrund einer Immunreaktion nachweisbare Gruppen, die an die hybridisierenden Se quenzen angebracht werden, können die Hybridisierungs reaktion behindern. Indirekte Detektionssysteme können außerdem einen hohen Hintergrund aufgrund von unspezi fischen Bindungen des zweiten Partners Immunreak tion (Antikörper bzw. Avidin/Streptavidin im Falle von Biotin) verursachen.

Es war daher die Aufgabe der Erfindung, ein nicht ra dioaktives Markierungssystem für Nukleinsäuresonden bereitzustellen, das es ermöglicht, mit geringem Hin tergrund und ohne eine Gefahr der Inaktivierung der Markierung sowie ohne die Probleme der Radioaktivität Nukleinsäuren mit hoher Sensitivität nachzuweisen.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine teils einzel- und teils doppelsträngige Nukleinsäuresonde, die an ihrem doppelsträngigen Bereich kovalent gebunden eine quer vernetzende Verbindung enthält und dadurch gekenn zeichnet ist, daß über eine funktionelle Gruppe der quervernetzenden Verbindung ein Chelatbildner für Metallionen an die Nukleinsäuresonde gebunden ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresonde in ihrem einzelsträngigen Bereich zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär. Diese bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde bindet mit ihrem einzelsträngigen Bereich an die nach zuweisende Nukleinsäure und ermöglicht nach Bildung eines Hybriddoppelstrangs aus Nukleinsäuresonde und nachzuweisender Nukleinsäure den Nachweis des Hybrid doppelstrangs über die Bindung von fluorogenen Metall ionen an den Chelatbildner, der über die querver netzende Verbindung an die Nukleinsäuresonde gebunden ist.

In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfin dung enthält der einzelsträngige Bereich der Nuklein säuresonde einen Homopolymer-DNS-Schwanz, über den an diese erfindungsgemäß bevorzugte Sonde jegliche zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäuresequenz, welche einen zum Homopolymer schwanz der Sonde komplementären Homopolymerschwanz aufweist, angekoppelt werden kann. Hierdurch eröffnet sich die Möglichkeit, an Nukleinsäuresequenzen zum Nachweis dazu komplementärer Sequenzen in einfacher Weise eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde anzu koppeln und nach erfolgter Hybridisierung den Hybrid doppelstrang wiederum über die Bindung von fluorogenen Metallionen an den Chelatbildner nachzuweisen.

Die quervernetzende Verbindung ist bevorzugt mit einer Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe als funktio neller Gruppe versehen. Diese funktionelle Gruppe befindet sich zweckmäßigerweise an einem Seitenarm der quervernetzenden Verbindung.

Bevorzugt ist als eine solche quervernetzende Verbin dung eine interkalierende Verbindung, die sich im doppelsträngigen Bereich der Nukleinsäuresonde ein lagert und dann kovalent mit der Nukleinsäuresonde verbunden wird. Bevorzugt sind hierbei Psoralene, Phenanthridiumdiazide, Mitomycin C-Derivate und Carcinophilin A. Bei den Psoralenen, die selektiv und kovalent mit doppelsträngiger DNA reagieren, sind vor allem Verbindungen der allgemeinen Formel I:

geeignet, wobei Y₁, Y₂ und Y₃ H, Alkyl- oder bevorzugt Methyl- darstellen und Y₄ ein Seitenarm ist, der die funktionelle Gruppe trägt. Die Struktur von Y₄ ist hierbei bevorzugt:

wobei
R′=H, Alkyl-, CHO oder bevorzugt H,
m, n=eine Zahl zwischen 1 und 10, bevorzugt 3 und
R′′=ein Anteil von Y₄, der die funktionelle Gruppe enthält, z. b. -NH₂, -SH, -OH, -COOH, -NH-Sp-SH, wobei Sp ein "Spacer" ist, z. B. -CO-(CH₂)_y-, und
y eine Zahl zwischen 0 und 10 ist.

Bei den Phenanthridiumdiaziden sind vor allem Verbindun gen der allgemeinen Formel II

geeignet, wobei S einen Seitenarm darstellt, der eine funktionelle Gruppe trägt. Bevorzugt ist die Struktur von S

wobei R′, R″, m und n die für die allgemeine Formel I der Psoralene definierten Bedeutungen aufweisen. Die Synthese eines solchen bevorzugten Phenanthridiumazids ist nach bekannten Methoden, z. B. durch Alkylierung des Ring-Stickstoffatoms möglich.

Bei den Mitomycin C-Derivaten sind vor allem Verbindun gen der allgemeinen Formel III

geeignet, wobei wiederum S einen Seitenarm darstellt, der eine funktionelle Gruppe trägt. Die Bedeutungen von S, R′, R″, m und n entsprechen den für die Formel I bzw. II genannten.

Bei Carcinophilin A ist bevorzugt ein Seitenarm S oder Y₄ mit den oben erläuterten Bedeutungen an die 19-C- bzw. 19a-C-Carboxygruppe oder an die 20-C- bzw. 20a-C- OH-Gruppe des Moleküls gekoppelt.

Als Chelatbildner für Metallionen sind Verbindungen, wie DTPA [Diethylentriaminpentaacetat), EDTA (Ethylen diamintetraacetat) und andere Polyaminocarboxylate, besonders gut geeignet. Diese Metallchelatoren müssen aktivierte Gruppen tragen, um sie an funktionelle Gruppen binden zu können, beispielsweise

a) intramolekulare cyclische Anhydride von Metallchela toren, wie cyclisches Anhydrid von DTPA (caDTPA),
b) Isothiocyanatgruppen wie in 1-(p-Isocyanatophenyl)- EDTA,
c) Azogruppen wie in 1-(p-Diazophenyl)-EDTA,
d) Azidogruppen wie in 4-Azido-2-nitrophenyl-EDTA,
e) N-Hydroxysuccinimidgruppen oder
f) N-Maleimidogruppen.

Die Komplexbildungskonstante zwischen dem Chelatligan den und einem Metallion muß hierbei groß sein (log K<10). Bevorzugt werden als Chelatbildner caDTPA, das gemischte Anhydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbon säure, 1-(p-Isothiocyanatophenyl)-DTPA, 1-(p-Isothio cyanatophenyl)-EDTA, 1-(p-Diazophenyl)-EDTA oder ein Phenylazid-Derivat von DTPA oder EDTA verwendet. Wei ter wird im Rahmen der Erfindung unter Chelatbildner für Metallionen nicht nur eine Verbindung, wie oben ge nannt, verstanden, sondern auch ein Kryptat, also ein makropolycyclischer Ligand für Metallionen. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Kryptat aus α, α′-Bipyridin oder 1,10-Phenantrolin-Einheiten.

Ein Kryptat kann im Sinne der Erfindung bereits fluoreszente Metallionen enthalten. Bevorzugt verwendete fluoroszente Metallionen sind Ionen der Seltenen Erdmetalle. Besonders bevorzugt sind hierbei die Ionen Eu³⁺, Tb³⁺ oder/und Sm³⁺.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er findung enthält die Nukleinsäuresonde zusätzlich zwi schen der quervernetzenden Verbindung und dem Chelat bildner ein Linkermolekül. Dieses Linkermolekül ist an die funktionelle Gruppe der quervernetzenden Verbindung und an den Chelatbildner gebunden. Bevorzugt ist daher das Linkermolekül ein bifunktionelles Vernetzungsrea gens. Besonders bevorzugt ist das Linkermolekül ein heterobifunktionelles Vernetzungsreagens, wie bei spielsweise 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbon säure-N-hydroxysuccinimidester, wobei die N-Maleimido gruppe thiolgruppen-spezifisch und der N-Hydroxysuccini midester aminogruppen-spezifisch ist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er findung enthält die Nukleinsäuresonde zwischen der quervernetzenden Verbindung bzw. gegebenenfalls dem Linkermolekül und dem Chelatbildner zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit mindestens einer funktionellen Amino- oder Thiolgruppe. Dieses Träger molekül kann eine beliebig große Anzahl funktioneller Gruppen enthalten, die zur Bindung von Chelatliganden und zur Kupplung an die Nukleinsäureprobe über die quervernetzende Verbindung bzw. das Linkermolekül die nen. Als Trägermoleküle geeignet sind homopolymere oder heteropolymere Polypeptide sowie andere chemische und biologische Makromoleküle mit funktionellen Gruppen. Bevorzugt ist das Trägermolekül ein homopolymeres oder heteropolymeres Polypeptid. Besonders bevorzugt ist das Trägermolekül Polylysin oder Polycystein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, welche zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine zu einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz komplementäre DNA-Sequenz in ein doppelsträngiges Plasmid insertiert, mit einer Restriktionsendonuklease im Bereich des Inserts schneidet und dadurch das Plasmid linearisiert, mit einer Exonuklease von beiden Seiten her jeweils selektiv nur einen Strang des linearisierten Doppel strangs im Bereich des Inserts abbaut, an den verblei benden Doppelstrang eine quervernetzende Verbindung kovalent koppelt, die mindestens eine funktionelle Gruppe enthält, und an die funktionellen Gruppen einen Chelatbildner bindet.

Als doppelsträngige Plasmide sind vor allem Plasmide geeignet, die nur wenige Restriktionsschnittstellen enthalten und somit eine Spaltung im Insert erlauben, ohne daß dadurch auch die Plasmidsequenz geschnitten würde, beispielsweise das Plasmid pBR322. Nach der Linearisierung des Plasmids wird kontrolliert beispiels weise mit Exonuklease III an den gegenüberliegenden Seiten des linearisierten Plasmids jeweils ein DNA- Strang vom 5′-Ende her oder mit λ-Exonuklease jeweils der Strang vom 3′-Ende her abgebaut. Hierdurch entsteht im Bereich des Inserts ein einzelsträngiger Bereich, der zur Hybridisierung mit nachzuweisenden Nuklein säuren geeignet ist, und es verbleibt ein doppelsträn giger Bereich, an den eine quervernetzende Verbindung kovalent gebunden werden kann. Abweichend hiervon ist es jedoch auch möglich, Nukleinsäuren in einen einzel strängigen Phagen (beispielsweise M13) zu klonieren und dann doppelsträngige Vektorbereiche nach der Methode von Hu und Messing, Gene 17, 271-277 (1982), oder Courage-Tebbe und Kemper, Biochim. Biophys. A. 697, 1-5 (1982), herzustellen, wobei die Inserts jedoch einzel strängig bleiben.

Nach Vorbereitung des Nukleinsäureteils der Sonde wird die quervernetzende Verbindung, die bevorzugt eine zwi schen einen DNA-Doppelstrang interkalierende Verbindung ist, mit der DNA und dann die kovalente Ver bindung mit der DNA bewirkt. Bevorzugt wird hierfür ein Psoralen oder ein Phenanthridiumdiazid verwendet und die kovalente Bindung an die Nukleinsäuresonde durch Be strahlung mit UV-Licht bewirkt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird hierfür Mitomycin C oder Carcinophilin A verwendet und die kovalente Bin dung an die Nukleinsäuresonde durch Ansäuern der Reak tionslösung bewirkt.

Die quervernetzende Verbindung enthält bevorzugt als funktionelle Gruppe eine Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe. An diese funktionelle Gruppe wird sodann der Chelatbildner, der eine zur Reaktion mit einer funktionellen Gruppe aktivierte Gruppe enthält, ange bracht. Dieser Chelatbildner ist bevorzugt caDPTA, das gemischte Anhydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbon säure, 1-(p-Isothiocyanatophenyl)-DTPA, 1-(p-Isothio cyanatophenyl)-EDTA, 1-(p-Daizophenyl)-EDTA oder ein Phenylazid-Derivat von DTPA oder EDTA.

Weiter wird jedoch unter einem Chelatbildner im Sinne der Erfindung auch ein Kryptat verstanden. Bevorzugt wird hierbei ein Kryptat aus α, α′-Bipyridin- oder 1,10- Phenantrolin-Einheiten eingesetzt. Es ist hierbei ebenfalls bevorzugt, Kryptate zu verwenden, die bereits fluorogene Metallionen enthalten, wobei die fluorogenen Metallionen wiederum bevorzugt Ionen der Seltenen Erd metalle sind. Besonders bevorzugt werden Kryptate ver wendet, die bereits Eu³⁺-, Tb³⁺- oder/und Sm³⁺-Ionen enthalten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bringt man zwischen die quervernetzende Verbindung und den Chelatbildner zusätzlich ein Linkermolekül ein. Dieses Linkermolekül wird mit den funktionellen bzw. aktivier ten Gruppen der quervernetzenden Verbindung und des Chelatbildners umgesetzt. Hierzu ist es bevorzugt, ein Linkermolekül zu verwenden, das ein bifunktionelles Vernetzungsreagens darstellt. Besonders bevorzugt wird als Linkermolekül ein heterobifunktionelles Vernet zungsreagens verwendet, also ein Vernetzungsreagens, das zwei verschiedene funktionelle Gruppen enthält, beispielsweise 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-car bonsäure-N-hydroxysuccinimidester. In noch einer weite ren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bringt man zwischen die quervernetzende Verbindung bzw. gegebe nenfalls das Linkermolekül und den Chelatbildner zu sätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit min destens einer funktionellen Amino- oder Thiolgruppe ein. Hierdurch wird es ermöglicht, mehrere Chelatbild ner an eine quervernetzende Verbindung, die wiederum an die Nukleinsäuresonde gekoppelt ist, zu binden. Hier durch werden vermehrt Chelatbildnermoleküle für fluoro gene Metallionen zur Verfügung gestellt, wodurch das später zu erhaltende Nachweissignal verstärkt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwen det man als Trägermolekül ein homopolymeres oder hetero polymeres Polypeptid, besonders bevorzugt Polylysin oder Polycystein.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein anderes Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde, die eine zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Sequenz enthält, bei dem man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die für die Nachweishybridisierung erforderliche Sequenz und einen homopolymeren Einzelstrang, der zu der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komplementär ist, enthält, hybridisiert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfah ren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hy briddoppelstrangs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde, welche die zu einer nachzuweisenden Nukelinsäure komplementäre Sequenz enthält, verwendet, nach erfolgter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metallionenlösung und Waschen den gebildeten Hybriddoppelstrang über die Fluoreszenz der am Chelatbildner gebundenen Metallionen nachweist.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybrid doppelstrangs, bei dem man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 bis 15 verwendet, diese entweder zuerst mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Sequenz und einen homopolymeren Nukleinsäureschwanz, der mit dem homopolymeren Einzelstrang der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komplementär ist, enthält, und gleichzeitig oder danach mit der nachzuweisenden Nukleinsäuresonde hybridisiert, nach erfolgter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metallionenlösung und Waschen die gebundenen Metall ionen durch eine Verstärkerlösung extrahiert und den gebildeten Hybriddoppelstrang über die Fluoreszenz der Metallionen in der Verstärkerlösung nachweist.

Als fluorogene Metallionen werden bevorzugt Ionen der Seltenen Erden verwendet. Besonders bevorzugt sind hierbei Eu³⁺, Tb³⁺ oder Sm³⁺.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Hybridisierung mit einer auf einem Träger, beispiels weise auf einem Filter, Gel, Mikrotiterplatte, histolo gischen Schnitt, Zelle gebundenen nachzuweisenden Nukleinsäure durchgeführt, nach erfolgter Hybridisie rung die fluorogenen Metallionen zugegeben und nach Waschen zur Entfernung überschüssiger nicht komplexierter Metallionen, die Metallionen durch eine Verstärkerlösung vom Komplex abgelöst und ihre Fluoreszenz in der verstärk ten Lösung bestimmt. Zur optimalen Fluoreszenzanregung ist es nämlich zweckmäßig, die Metallionen aus dem Chelatkomplex mit einer speziellen Verstärkerlösung eines nichtionischen Detergens (0,1-0,05%, v/v, z. B. Triton), einer "synergistischen Base" (10-100 µM, z. B. 50 µM Tri-n-octylphosphinoxid) und einem Energie-Donor (10 µM-100 µM eines β-Diketons, z. B. 15 µM 2-Naphtoyltrifluoroaceton) in einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 2,5 und 4 herauszulösen. Eine bevorzugte Verstärkerlösung enthält 0,1 M Acetat-Phthalat-Puffer, pH 3,2, 0,1% Triton X-100 (v/v), 15 µM 2-Naphthoyltrifluoroaceton und 50 µM Tri-n-octylphosphinoxid.

Bei Anwendung gewöhnlicher Hybridisierungsbedingungen (Temperatur über 60°C bzw. um 40°C in Gegenwart von 50% Formaldehyd) kann die mit den Chelatliganden mar kierte Nukleinsäuresonde nicht bereits metallgebunden eingesetzt werden, da die Metallionen unter diesen Be dingungen vom Chelat abdissoziieren würden. Folglich werden die Metallionen erst nach erfolgter Hybridisie rungsreaktion zugegeben. Eine Ausnahme hierbei sind je doch milde Hybridisierungsbedingungen, bei denen auch eine mit Metallionen vormarkierte Nukleinsäuresonde eingesetzt werden kann.

Die Bestimmung der Fluoreszenz der Metallionen nach Entfernung aus dem markierten Hybriddoppelstrang in Lö sung stellt vor allem dann einen Vorteil dar, wenn bei spielsweise im Rahmen der klinischen und medizinischen Anwendungen das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird. Hierbei können nämlich die nachzuweisenden Nukleinsäuren oft nicht in gereinigter Form benutzt werden, sondern es sind noch Verunreinigungen aus biologischem Begleitmaterial, wie Zellen, Gewebe u. ä., anwesend. Hierdurch kann sich eine Störung der Messung ergeben, die jedoch durch Herauslösen der fluoreszieren den Metallionen aus dem Hybriddoppelstrang und der Bestimmung in dieser Lösung, dem hierzu idealen Medium, vermieden wird. Es wird also auch eine Bestimmung von Nukleinsäuren in Blut, Zellen und Gewebe nach entspre chender Fixierung ermöglicht.

Ein weiterer Vorteil, der sich durch das Herauslösen der Metallionen aus dem markierten Hybriddoppelstrang ergibt, ist, daß man bei kleinen Mengen von am Hybrid strang gebundenen Metallionen die Lösung der Ionen noch konzentrieren und dadurch eine genauere Messung erzielen kann.

Bei der Chelatisierung werden die Metallionen zweck mäßigerweise selbst in Form eines Komplexes zugegeben. Die Komplexbildungskonstante dieses Komplexes sollte auch relativ hoch sein (log K mindestens 5), jedoch wesentlich geringer als diejenige des Metallions gegenüber dem an der Sonde gebundenen Chelatbildner. Dies verhindert eine unspezifische Bindung des Metall ions an andere Bindungsstellen, wie Phsophatgruppen der Nukleinsäuren oder Bindungsstellen auf dem Filter usw.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybrid doppelstrangs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde verwendet, die als Chelatbildner ein Kryptat enthält, das bereits ein fluorogenes Metallion enthält. Bei Kryptaten von Metall ionen ist nämlich nicht zu befürchten, daß die Metalli onen bei den verwendeten Hybridisierungsbedingungen aus dem Kryptat abdissoziieren. Hierbei kann die Fluores zenz der Metallionen nach erfolgter Hybridisierung auch direkt am Hybriddoppelstrang bestimmt werden. Es wird hierdurch also ein in-situ-Nachweis über die Fluores zenz der Metallionen am Hybriddoppelstrang ermöglicht. Dieses Verfahren erscheint daher auch besonders für Hybridisierungen mit zellulärem Material geeignet.

Erfindungsgemäß wird also eine Nukleinsäuresonde und ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitge stellt, das es ermöglicht, ohne Verwendung von radio aktiven Verbindungen bzw. enzymatisch oder immunolo gisch markierten Sonden Nukleinsäuren mit hoher Spezi fität nachzuweisen. Besonders die Verwendung eines Trä germoleküls, an das mehrere Chelatbildner gebunden wer den können, wodurch eine Verstärkung des Signals von fluorogenen Metallionen erhalten wird, bewirkt eine hohe Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Ver bindung mit den Figuren weiter.

Fig. 1 zeigt schematisch die Synthese von Psoralen-SH;

Fig. 2 zeigt das Elutionsprofil einer DEAE-Chromatographie eines DTPA-PLL-pKKHBs34′- Konjugats; und

Fig. 3 zeigt die Fluoreszenzbestimmung von Europium-Ionen nach Ablösung vom Chelatbildner.

Beispiel 1 Synthese eines Thiol enthaltenden Psoralens (PSH)

Psoralen-SH wurde gemäß der Methode von Saffran et al, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79, 4594-4598 (1982), herge stellt. Die einzelnen Reaktionsschritte der Synthese sind in Fig. 1 dargestellt. Alle Reaktionen wurden im Dunklen durchgeführt.

1a) Herstellung von 4′-Chloromethyl-4,5′,8-trimethyl psoralen (2)

Eine Lösung von 2% SOCl₂ in trockenem Chloroform (40 ml) wurde tropfenweise zu 4′-Hydroxymethyl- 4,5′-8-trimethylpsoralen (15 mg, 5,8*10^-5 mol) in nerhalb von 5 Minuten unter Raumtemperatur zugege ben. Nach zusätzlichem Rühren während weiterer drei Stunden bei Raumtemperatur wurde eine Dünnschicht chromatographie (TLC) auf Silicagel durchgeführt und das Ende der Reaktion überprüft. Das Lösungs mittel und die gasförmigen Komponenten wurden unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt 2 mit einem R_f-Wert von 0,41 auf Silicagel TLC (1 : 1, Petrol äther-Ethylacetat) wurde ohne weitere Reinigung weiterverwendet.

1b) Herstellung von 4′-(9″-Amino-2″, 6″-diazanonyl)- 4,5′,8-trimethylpsoralen (3)

Eine Lösung der Verbindung 2 (16 mg, 5,8*10^-5 mol) und N,N-Bis-(diaminopropyl)-aminomethan (150 mg, 180 µl, 9,6*10^-4 mol) in trockenem Toluol (10 ml) wurde unter Rückfluß acht Stunden lang erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum entfernt und der Rest einer Chromatographie auf Aluminiumoxid unter worfen (7 : 2 : 1, Ethylacetat - Methanol - Wasser), woraus sich das Produkt 3 ergab (7,3 mg, 33%), ein orangebraunes Öl mit einem R_f-Wert von 0,16 auf Aluminiumoxid TLC (7 : 2 : 1, Ethylacetat - Methanol - Wasser). ¹H-NMR (90 Mhz, CDCl₃) δ 7,62 (1 H, s, Phenyl), 6,23 (1 H, s, Lacton), 3,86 (2 H, s, Ar-CH₂- NHR), 2,42,55 (14 H, m, 8 H RR′N-CH₂-, 3 H Ar-CH₃, 3 H Furan-CH₃, 3 H Pyron-CH₃, 2,18 (3 H, s, N-CH₃), 1,70 (4 H, m, -CH₂-CH₂-CH₂-).

1c) Herstellung von 4′-(9″-(3′′′-(2″″-Pyridyldithio)- propionamido)-2″,6″-diazanonyl)-4,5′,8-trimethyl psoralen (4)

Eine Lösung von N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat (6 mg, 1,9*10^-5 mol) in trockenem Me thylenchlorid (100 µl) wurde zu der Verbindung 3 (7,4 mg, 1,9*10^-5 mol) in trockenem Methylenchlorid (100 µl) zugegeben. Nach 30minütigem Rühren bei Raumtemperatur in dem Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft und der verbleibende Rest auf Alumini umoxid (Methanol) chromatographiert, wobei sich das Produkt 4 (4,35 mg, 40%) mit einem R_f-Wert von 0,79 (Aluminiumoxid TLC, 7 : 2 : 1, Ethylacetat - Methanol - Wasser) als weißer amopher Feststoff bil dete. ¹H-NMR (90 Mhz, CDCl₃) w 8,45 (1 H, m, Pyri din 3 H), 7,67,7 (3 H, m, 1 Phenyl-H, Pyridin 5,6 H), 7,11 (1 H, m, Pyridin 4 H), 6,52 (1 H, s, Lacton), 3,9 (2 H, s, Ar-CH₂-NHR), 3,11 (2 H, s, COCH₂), 2,84 (2 H, s, -CH₂-S-), 2,452,55 (14 H, m, 8 H R,R′N-CH₂, 3 H Ar- CH₃), 3 H Furan-CH₃, 3 H Pyron-CH₃), 2,17 (3 H, s, N- CH₃), 1,70 (4 H, m, -CH₂-CH₂-CH₂-). UV (Methanol) λ _max (ε) 285 (5,600) 330 (1,900) nm.

1d) Herstellung von 4′-(9″-(3′′′-Mercaptopropionamido)- 2″,6″-diazanonyl)-4,5′,8-trimethylpsoralen (5) (PSH)

PSH (5) wurde für jede Markierungsreaktion frisch hergestellt. 24 µl von einer 1,7 mM-Vorratslösung der Verbindung 4 in Ethanol, 40 µl 100 mM Dithioery thritol (DTE) und 16 µl H₂O wurden in einem Eppen dorf-Gefäß gemischt und eine Stunde bei Raumtempe ratur im Dunklen inkubiert.

Beispiel 2 Modifikation von klonierter DNA

9 µg des Plasmids pKKHBs34 (Wang et al, EMBO J. 1, 1213-1216 (1982), Valenzuela et al., 1980 in Fields, Jaenisch und Fox (Herausgeber), ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology XVIII, Animal Virus Genetics, Academic Press, NY, S. 57-70) wurden mit der Restriktionsendonukle ase Hpa I (10 U) in 25 µl 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM Mercaptoethanol (pH 7,5) eine Stunde bei 37°C inkubiert, um das Plasmid zu linearisieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,5 µl 100 mM EDTA beendet. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 36 µl H₂O resuspendiert. Dazu wurde Exonuklease III (90 U) in 4 µl 10xExo-III-Puffer (660 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCl₂, 10 mM Mercaptoethanol, pH 7,6) zugegeben und die Lösung bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert, um das Plasmid teilweise einzelsträngig zu machen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µl 100 mM EDTA beendet. Das teil weise einzelsträngige pKKHBs34 (im folgenden pKKHBs34′ genannt) wurde von Enzym, Nukleotiden und Puffer über eine NENSORB-20-Nukleinsäure-Reinigungspatrone gemäß den Instruktionen des Herstellers getrennt.

Beispiel 3 Markierung der DNA-Probe mit dem Thiol enthaltenden Psoralen PSH

Psoralen-Moleküle interkalieren in doppelsträngige DNA und unterliegen einer Photocycloaddition mit DNA-Thymi dinresten bei Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (Cimino et al, Ann.Rev.Biochem. 54, 1151-1193 (1985). Querverbindungen zwischen zwei Thymidinresten in einem Doppelstrang werden bei TA/AT-Sequenzen leicht gebil det, Einzelstrang-DNA bleibt unmodifiziert.

Für die Photomarkierungsreaktion wurden 20 µl frisch hergestelltes PSH (Verbindung 5, 0,51 mM in 50 mM DTE) zu einer Lösung von 7,5 µg pKKHBs34′ in 180 µl 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,15) zugegeben. Dies ent spricht einem Verhältnis von Psoralen zu Basenpaaren von ungefähr 1 : 1. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raum temperatur im Dunklen inkubiert, um eine Interkalation zu erreichen, und dann zwei Stunden bei 0°C in einer 3 mm dicken Flüssigschicht mit UV-Licht zwischen 300 und 400 nm bestrahlt (HBO 200 W Hochdruck-Quecksilber lampe, Zeiss, Oberkochen, BRD; UGl-Filter, Schott, Mainz, BRD). Zugabe von neuem PSH und Bestrahlung wur den zweimal durchgeführt, um eine höhere Markierungs rate zu erreichen. Überschüssiges freies Psoralen und Photoabbauprodukte wurden durch Extraktion der Reak tionsmischung einmal in 1 vol Phenol und einmal in 1 vol Chloroform-Isoamylalkohol (24 : 1) entfernt. Schließlich wurde die DNA mit Ethanol gefällt und mit 70%igem Ethanol gewaschen.

Die kovalente Querverbindung der komplementären Stränge in der DNA wurde durch einen Ethidiumbromid-Fluores zenztest gezeigt (Morgan und Peatkau, Can.J.Biochem. 50, 210-217 (1972)).

Die Menge von PSH, die kovalent an die DNA gebunden ist, wurde durch Reaktion der SH-Gruppen mit dem Thiol-spezifischen Fluoreszenz-Farbstoff, 7-Di-ethyl amino-3-(4′-maleimidophenyl)-4-methylcumarin (CPM), bestimmt. Die Fluoreszenz von CPM wird beträchtlich erhöht, wenn es kovalent an Thiol-Gruppen gebunden wird. SH-markiertes pKKHBs34′ (7,5 µg) wurde in 50µl 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,8), enthaltend 200 µM CPM und 1 mM EDTA, gelöst. Die Mischung wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann 10 µl Probe zu nun 990 µl 1% Triton X-100 (v/v in Wasser) zugegeben und die Fluoreszenz in dem LS-5-Spektrofluorometer (Ex 390 nm, Em 465 nm) gemessen. Eine Fluoreszenz-Eich kurve wurde mit N-acetyl-Cystein mit Konzentrationen zwischen 0,1 und 250 µM aufgestellt.

Kontrollreaktionen mit markierter DNA in Anwesenheit von HgCl₂ (100 µM) und unmodifizierter DNA (die mit Ausnahme der Photoreaktion wie die markierte DNA behan delt wurde) ergaben die Background-Fluoreszenz.

Beispiel 4 Herstellung von DTPA-gebundenem Poly-L-Lysin

Das zyklische Anhydrid von DTPA (caDTPA, 2,1 mg, 5,88 µmol) wurde in Aliquoten zu einer Lösung von Poly-L- Lysin (PLL, M _r 17 000, 0,5 mg, 29,4 nmol) in 50 µl 100 mM KHCO₃ (pH 8,2) unter starkem Schütteln zugege ben. Hierzu wurde genügend 3 N NaOH zugegeben, um den pH der Lösung zwischen 7 und 8 zu halten. Es wurde keine Präzipitation von Addukten mit hohem Molekulargewicht beoachtet. Die Färbung mit Ninhydrin zeigte weniger, jedoch noch verbleibende freie Aminogruppen in der Probe.

Der DTPA-Gehalt in PLL wurde durch Gleichgewichtsdia lyse bestimmt. DTPA-PLL-Konjugat (20 µg) wurde zwei Stunden mit 500 µM EuCl₃, 500 µM EDTA in 200 µl 50 mM Nactriumcitrat-Puffer (pH 6,0) inkubiert und dann bis zum Gleichgewicht gegen 5 mM Natriumacetat, 10 mM NaCl (pH 5,5) dialysiert. Der Europium- und dadurch der DTPA-Gehalt wurde durch zeitverzögerte Fluorometrie be stimmt.

Beispiel 5 Herstellung von DTPA-PLL-pKKHBs34′-Konjugat

DTPA-gebundenes PLL [100 µg, 6 nmol) in 100 µl 100 mM KHCO₃ (pH 8,2) wurde auf Eis gekühlt. Das heterobi funktionelle Quervernetzungsmittel, 4-(N-Maleimido methyl)-cyclohexan-1-carbonsäure-N-hydroxy-succinimid ester (10 µgl, 30 nmol, aus einer 1 mg/ml-Lösung in trockenem Dimethylformamid) wurde langsam unter Schütteln zugegeben. Die Lösung wurde weitere 30 Minu ten lang bei Raumtemperatur geschüttelt und nach Ein stellen des pH auf 6,5 mit 0,6 N HCl mit SH-markiertem pKKHBs34′ (7,5 µg) übernacht bei Raumtemperatur inku biert. Das resultierende Konjugat wurde durch DEAE- Chromatographie isoliert (Fig. 2).

Beispiel 6 Dot-Blot-Hybridisierung mit DTPA-PLL-pKKHBs34′

pKKHBs34 als Ziel-DNA in verschiedenen Mengen und pBR322 und Kalbsthymus-DNA als Kontrollen wurden auf Nitrozellulosefilterscheiben (BA 85 NC-Filter, 4-5 mm Durchmesser, Schleicher und Schuell) immobilisiert und nach Standardmethoden denaturiert (Anderson and Young, in Hames B. D. and Higgins (Herausg.), Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Washington, DC, 73-111 (1985)). Die Filter wurden in einzelne Polystyrol-Mikrotiterplatten eingesetzt und bei 42°C vier Stunden lang in 50% deionisiertem Form amid, 5×SSC (pH 7,0, 1×SSC=150 mM NaCl, 15 mM Na triumcitrat), 1% Sarkosyl, 0,1% Rinderserum-Albumin, 0,1% Ficoll 400, 0,1% Polyvinylpyrrolidon und 250 µg/ ml denatuierte, beschallte Heringssperma-DNA vorhybri disiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 42°C mit der DTPA-markierten pKKHBs34′-Probe (500 ng/ml in der Vorhybridisierungslösung, welche 10% Dextransulphat enthielt) durchgeführt. Die Filter wurden zweimal zehn Minuten bei Raumtemperatur in 2× SSC, 0,5% Sarkosyl und drei mal 20 Minuten bei 50°C in 0,1×SSC, 0,1% Sarkosyl gewaschen.

Beispiel 7 Chelatisierung von Europium und Quantifizierung durch zeitverzögerte Fluorometrie

Eine Chelatisierung des hydridgebundenen DTPA mit Euro pium-Ionen wurde durch Inkubation der Filter aus Beispiel 6 in 100 µM EuCl₃, 100 µM EDTA, 1× SSC (pH 7,0, 200 µl pro Mikrotiterplatte) zwei Stunden bei Raumtemperatur erreicht. Die Filter wurden mindestens sechsmal in 2× SSC gewaschen und schließlich 15 Minuten in 1 ml "Verstärkerlösung" (0,1 M Acetat-phthalat-Puf fer, pH 3,2, 0,1% Triton X-100 (v/v), 15 µM 2-Naphtoyltrifluoroaceton, 50 µM Tri- n-octylphosphin oxid) in Polystyrol-Gefäßen geschüttelt, um DTPA-gebun denes Eu³⁺ zu entfernen. Der Überstand wurde abdekan tiert und die Fluorszenz in einem "Arcus 1230"-zeit verzögerten Fluorometer (LKB-Wallac, Turku, Finnland) bestimmt. Excitation und Emission waren jeweils 340 und 613 nm. Verzögerungs- und Zählzeit wurden beide auf 400 µs gesetzt (Fig. 3).

Claims

1. Teils einzel- und teils doppelsträngige Nuklein säuresonde, die an ihrem doppelsträngigen Bereich kovalent gebunden eine quervernetzende Verbindung enthält, dadurch gekennzeich net, daß über eine funktionelle Gruppe der quervernetzenden Verbindung ein Chelatbildner für Metallionen an die Nukleinsäuresonde gebunden ist.

2. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß sie in ihrem einzelsträngigen Be reich zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure kom plementär ist.

3. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß ihr einzelsträngiger Bereich aus einer homopolymeren DNS besteht.

4. Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle Gruppe eine Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe ist.

5. Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die quervernetzende Verbindung eine interkalierende Verbindung ist.

6. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die quervernetzende Verbindung ein Psoralen oder ein Phenanthridiumdiazid ist.

7. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die quervernetzende Verbindung Mitomycin C oder Carcinophilin A ist.

8. Nukleinsäuresonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätz lich zwischen der quervernetzenden Verbindung und dem Chelatbildner ein Linkermolekül enthält.

9. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 8, dadurch gekenn zeichnet, daß das Linkermolekül ein bifunktionel les Vernetzungsreagens ist.

10. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül ein hetero bifunktionelles Vernetzungsreagens ist.

11. Nukleinsäuresonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwi schen der quervernetzenden Verbindung bzw. gegebe nenfalls dem Linkermolekül und dem Chelatbildner zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit mindestens einer funktionellen Amino- oder Thiol gruppe enthält.

12. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet, daß das Trägermolekül mehrere funktionelle Gruppen enthält, an die mehrere Moleküle Chelat bildner gebunden sind.

13. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 12, dadurch ge kennzeichnet, daß das Trägermolekül ein homopoly meres oder heteropolymeres Polypeptid ist.

14. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 13, dadurch ge kennzeichnet, daß das Trägermolekül Polylysin oder Polycystein ist.

15. Nukleinsäuresonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelat bildner für Metallionen caDPTA, das gemischte An hydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbonsäure, 1-(p-Isothiocyanatophenyl)-DTPA, 1-(p-Isothio cyanatophenyl)-EDTA, 1-(p-Diazophenyl)-EDTA oder ein Phenylazid-Derivat von DTPA oder EDTA ist.

16. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner für Metall ionen ein Kryptat ist.

17. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 16, dadurch ge kennzeichnet, daß das Kryptat aus α, α′-Bipyridin- oder 1,10-Phenantrolin-Einheiten besteht.

18. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 16 oder 17, da durch gekennzeichnet, daß das Kryptat bereits fluoreszente Metallionen enthält.

19. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 18, dadurch ge kennzeichnet, daß die fluoreszenten Metallionen Ionen der Seltenen Erden sind.

20. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 19, dadurch ge kennzeichnet, daß die fluoreszenten Metallionen Eu³⁺, Tb³⁺ oder/und Sm³⁺ sind.

21. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man eine zu einer nachzuwei senden Nukleinsäuresequenz komplementäre DNA-Se quenz in ein doppelsträngiges Plasmid insertiert, mit einer Restriktionsendonuklease im Bereich des Inserts schneidet und dadurch das Plasmid lineari siert, mit einer Exonuklease von beiden Enden her jeweils selektiv nur einen Strang des linearisier ten Doppelstrangs im Bereich des Inserts abbaut, an den verbleibenden Doppelstrang eine querver netzende Verbindung kovalent koppelt, die mindes tens eine funktionelle Gruppe enthält, und an die funktionellen Gruppen einen Chelatbildner bindet.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeich net, daß man eine quervernetzende Verbindung ver wendet, die als funktionelle Gruppe eine Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe enthält.

23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch ge kennzeichnet, daß man als quervernetzende Verbin dung eine interkalierende Verbindung verwendet.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich net, daß man ein Psoralen oder ein Phenanthridium diazid verwendet und die kovalente Bindung an die Nukleinsäuresonde durch Bestrahlung mit UV-Licht bewirkt.

25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich net, daß man Mitomycin C oder Carcinophilin A verwendet und die kovalente Bindung an die Nukle insäuresonde durch Ansäuern der Reaktionslösung bewirkt.

26. Verfahren nach Anspruch 21 bis 25, da durch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner für Metallionen caDPTA, das gemischte Anhydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbonsäure, 1-(p-Iso thiocyanatophenyl)-DTPA, 1-(p-Isothiocyanatophenyl)- EDTA, 1-(p-Diazophenyl)-EDTA, ein Phenylazid- Derivat von DTPA oder EDTA oder ein Kryptat ver wendet.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeich net, daß man ein Kryptat aus α, α′-Bipyridin- oder 1,10-Phenantrolin-Einheiten einsetzt.

28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kryptat verwendet, welches bereits fluoreszente Metallionen der Seltenen Erden enthält.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich net, daß man Kryptate von Eu³⁺, Tb³⁺ oder/und Sm³⁺ verwendet.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29, da durch gekennzeichnet, daß man zwischen die quer vernetzende Verbindung und den Chelatbildner zu sätzlich ein Linkermolekül einbringt.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeich net, daß man als Linkermolekül ein bifunktionelles Vernetzungsreagens verwendet.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeich net, daß man als Linkermolekül ein heterobifunk tionelles Vernetzungsreagens verwendet.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 32, da durch gekennzeichnet, daß man zwischen die quer vernetzende Verbindung bzw. gegebenenfalls das Linkermolekül und den Chelatbildner zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit mindestens einer funktionellen Amino- oder Thiolgruppe ein bringt.

34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeich net, daß man ein Trägermolekül verwendet, das meh rere funktionelle Gruppen enthält, und daran meh rere Chelatbildner bindet.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeich net, daß man als Trägermolekül ein homopolymeres oder heteropolymeres Polypeptid verwendet.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeich net, daß man Polylysin oder Polycystein verwendet.

37. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 18, dadurch ge kennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die für die Nachweishybridisierung erforder liche Sequenz und einen homopolymeren Einzelstrang, der zu der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komple mentär ist, enthält, hybridisiert.

38. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybriddoppelstrangs, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 15 verwendet, nach erfolg ter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metall ionenlösung und Waschen die gebundenen Metall ionen durch eine Verstärkerlösung extrahiert und den gebildeten Hybriddoppelstrang über die Fluo reszenz der Metallionen in der Verstärkerlösung nachweist.

39. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybriddoppelstrangs, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 bis 15 verwendet, diese entweder zuerst mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komple mentäre Sequenz und einen homopolymeren Nukleinsäure schwanz, der mit dem homopolymeren Einzelstrang der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komplementär ist, enthält, und danach mit der nachzuweisenden Nukleinsäuresonde hybridisiert oder aber gleichzeitig mit der Einzelstrang-DNS oder der RNS und der nachzuweisenden Nukleinsäuresonde hybridisiert, nach erfolgter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metallionenlösung und Waschen die gebundenen Metallionen eine Verstärker lösung extrahiert und den gebildeten Hybriddoppel strang über die Fluoreszenz der Metallionen in der Verstärkerlösung nachweist.

40. Verfahren nach Anspruch 38 oder 39, dadurch gekenn zeichnet, daß man als fluorogene Metallionen Ionen der Seltenen Erden verwendet.

41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeich net, daß man Eu³⁺, Tb³⁺ oder Sm³⁺ verwendet.

42. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäure unter Aus bildung eines Hybriddoppelstrangs, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nu kleinsäuresonde nach den Ansprüchen 16 bis 18 ver wendet und die Fluoreszenz der Metallionen direkt am Hybriddoppelstrang bestimmt.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 42, da durch gekennzeichnet, daß man die Hybridisierung mit einer auf einem Träger gebundenen nachzuweisen den Nukleinsäure durchführt.